Summary
細胞カルシウムイメージングは、ユニークな機能的シグネチャを与えるカルシウム透過性チャネル/受容体の発現に基づいて、培養中の混合集団、または覚醒した動物でさえも、個々の細胞の動的シグナル伝達を研究するための汎用性の高い方法論です。
Abstract
ここでは、カルシウムシフトの観点から動的に研究されたグリア(アストロサイト、希突起膠細胞、ミクログリア)および/または末梢(後根神経節)および中枢組織(皮質、脳室下帯、オルガノイド)からのニューロンに基づく回路の選択的in vitroモデルについて報告する。結果を説明するために選択されたモデルは網膜であり、複雑な細胞相互作用を有する単純な組織である。カルシウムは、重要な細胞の役割のほとんどに関与する普遍的なメッセンジャーです。我々は、培養中の網膜ニューロングリア細胞がどのように調製され、評価され、カルシウムシフトを想定することができるかを段階的なプロトコルで説明する。このモデルでは、KClおよびATPに対する選択的応答に基づいてニューロンをグリアと区別する。カルシウム透過性受容体およびチャネルは、異なる区画において選択的に発現される。カルシウム応答を分析するために、我々はFura-2のようなレシオメトリック蛍光ダイスを使用する。このプローブは、Ca2+非含有およびCa2+結合形態に基づいて遊離Ca2+濃度を定量し、2つの波長で知覚される蛍光強度に基づいて2つの異なるピークを提示する。
Introduction
セカンドメッセンジャーとしてのカルシウムの普遍的な特性のために、このイオンは、遺伝子転写、誕生と死、増殖、遊走と分化、シナプス伝達、可塑性など、膨大な数のシグナル伝達活動に関与しています。したがって、カルシウム活性化ダイナミクスを忠実度と敏捷性で追跡できる方法は、ユニークな空間 - 時間応答を観察する方法を提供するでしょう。このような方法は、細胞カルシウムイメージング技術であり、カルシウムシフト機能データを、それらの別個の応答に基づいて特定の細胞表現型と相関させる。
Ca2+プローブは1980年代に初めて開発され、後に改良され、これらの分子を生細胞アッセイで使用できるようになりました1。化学的指標として、Fura-2は定量的[Ca2+]i測定の標準であると考えられています。この指標のアセトキシメチル(AM)エステル(すなわち、Fura-2AM)は、細胞膜を容易に透過し、インキュベーション希釈液の20倍大きい細胞内濃度(例えば、[5μM]o/[100μM]i)に達することができる。Fura-2のもう1つの利点は、良好なフォトブリーチング耐性を有することである。したがって、このインジケータを長期間イメージングしても、蛍光能力に大きく影響することはありません。最後に、Fura-2は、〜100nM〜〜100μMの広範囲のカルシウムレベルに感受性であり、〜145nMのKdを有し、これは静止[Ca2+]i2に匹敵する。 その後、細胞カルシウムイメージングは、色素負荷の影響を受けないレシオメトリックプローブとともに、より優れた蛍光顕微鏡と計算方法で開発されました。
すべての細胞は、特定のシグネチャとして最終応答に寄与する異なるカルシウムデバイス(ポンプ、トランスポーター、受容体、およびチャネル)を発現する。重要なヒントは、表現型発現と相関する異なるタイプの細胞の選択的応答を見つけることである。したがって、カルシウムシフトを介して作動する少なくとも2つの異なる受容体が存在する:速いモードでCa2+を透過するイオントロピック受容体およびシグナル伝達経路に結合された遅い代謝指向性受容体およびイノシトール三リン酸および環状ADP-リボース3などのセカンドメッセンジャーによって活性化されたCa2+を放出する細胞内ストック。
例えば、前駆細胞は未熟な網膜でネスチンを発現し、GABA(またはムシモール)によって脱分極されたGABAA受容体を示す4。これは、細胞内の高いCl-レベルを有するCl-電気化学的勾配のために起こる。組織が発達するにつれて、KCC2トランスポーターは、前駆細胞の興奮から成熟GABA作動性ニューロンの阻害に切り替わります5。一方、出生後のげっ歯類の未熟な脳室下帯(SVZ)でsox-2を発現する幹細胞も、ヒスタミンがCa2+をゆっくりと増加させることによって活性化された代謝性H1受容体を提示する6。トロンビンによって活性化され、下流のG(q/11)およびホスホリパーゼC(PLC)に活性化されたプロテアーゼ活性化受容体-1(PAR-1)ファミリーの第2の代謝型受容体は、多能性SVZ神経幹細胞から生成された希突起膠細胞(O4およびPLPを発現する)にゆっくりとしたCa2+シフトを与える7。
一般に、ニューロンは、電位依存性カルシウムチャネルならびにCa2+に透過性の主要な神経伝達物質受容体を、グルタミン酸作動性(AMPA、NMDA、カイネート)および末梢および中枢ニコチン性受容体として発現する。塩化カリウムは、通常、末梢ニューロンを活性化するための脱分極剤として、後根神経節ニューロン8または中枢ニューロンとして、脳室下帯9または網膜10からのように使用される。一方、ATPは、P2X7およびP2X4として、選択的Ca2+透過性P2Xメンバーを活性化する主要なグリオトランスミッタ(D-セリンに加えて)として認められている。両方の受容体は同等のCa2+電流を呈し、伝達物質11によって活性化される最大のCa2+電流として認識されているNMDA受容体によって示されるものと同様である。P2X7受容体はミクログリア上では高発現するが、アストロサイトおよび希突起膠細胞上ではより低い密度で、炎症誘発性サイトカインの放出に役割を有する12。P2X7受容体は網膜のシュワン細胞13とミュラーグリアにも発現しています14,15。
網膜は、脳内に見られるほとんどすべての伝達物質を示すことが知られています。例えば、縦軸(光受容体、双極性および網膜神経節細胞)は主にグルタミン酸作動性であり、カルシウム透過性AMPAまたはカイニン酸塩受容体はOFFバイポーラ細胞で発現し、mgluR6はONバイポーラ細胞で発現する16。奇妙なことに、3つの受容体はすべてミュラーグリアにも見られ、カルシウムとイノシトールの三リン酸経路に結合されています17,18。水平阻害軸は、水平およびアマクリン細胞によって作られ、GABAだけでなく、ドーパミン、アセチルコリン、および他の古典的な神経伝達物質も分泌する。アマクリン細胞は、鳥網膜培養物に見られる細胞の主なタイプであり、グルタミン酸作動性、プリン作動性、ニコチン性および電圧依存性カルシウムチャネルとして、いくつかのタイプのカルシウム操作チャネルを示す。このため、これはニューロンとグリアの間でカルシウムシフトの異なる特性を評価するための優れたモデルである。
したがって、異なる受容体およびチャネルの組み合わせは、異なるアゴニスト応答パターンを有する発生中に選択的表現型マーカーに合計され、選択的シグナル伝達装置を介して作動するステム、前駆細胞、ニューロン、アストロサイト、希突起膠細胞、およびミクログリアにおけるユニークなシグネチャを可能にする。
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Protocol
動物を含むすべての実験は、「実験動物ケアの原則」(NIH、ベセスダ、米国)に従って、リオデジャネイロ連邦大学の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインによって承認され、それに従って実施されました。受精ホワイトレグホーン鶏の卵のための許可番号IBCCF-035。
1. 溶液の調製
- クレブス溶液(132 mM NaCl、4 mM KCl、1.4 mM MgCl2、2.5 mM CaCl2、6 mM グルコース、10 mM HEPES、pH 7.4、373 mOsm)を調製する。
- 生理食塩水緩衝液(Ca2+およびMg2+遊離溶液 - CMF)を調製する:76.55 g/L NaCl、3.05 g/L KCl、1.65 g/L Na2HPO4、0.610 g/L KH2PO4、21.95 g/L グルコース、および 7.90 g/L NaHCO3。
- インキュベート溶液を調製する(クレブス溶液中のFura-2と共に:)5μMフラ-2-アセトキシメチルエステル(フラ-2)、0.1%脂肪酸非含有ウシ血清アルブミン(BSA)、および0.02%ポロクサマー407。
- 混合集団またはグリア培養の場合は、10%ウシ胎児血清(FCS)と40mg/Lゲンタマイシンを培地としたDMEM/F12を調製する。
- ニューロン富化培養のために、1%FCS、神経細胞培養サプリメント、40mg/Lおよびゲンタマイシンを培地として含むDMEM/F12を調製する。
網膜解剖および細胞培養製剤
- 空気細胞がある8日齢のひよこの胚(E8)の卵を開きます。
- 卵の内容物をペトリ皿に取り出し、一対のピンセットで断頭して胚安楽死を進める。
- 頭を清潔なペトリ皿に持ってきて、カルシウムとマグネシウムを含まない溶液(CMF)を注いで洗ってください。
- その過程で目を傷つけないように注意しながら、目を取り除きます。
メモ:眼腔から取り出す前に、眼の層を切断または細断しないでください。 - CMFを含むきれいなペトリ皿に目を持ってきてください。
- レンズを取り外して眼の解剖を開始します。
- レンズが残した穴から始めて、目に3〜4個の縦方向の切り込みを入れます。ピンセットを引っ張り、目の強膜を反対方向に保持して切り取ります。
- 透明な硝子体を慎重に取り除き、網膜がそれに束縛されていないことを確認してください。
- 色素沈着した上皮から網膜を剥離し、残りの組織を除去する。
- 透明な網膜を細かく切る。
- 網膜を別のレシピエントに移し、それを短時間遠心分離(〜1,800 x gで1分間)してCMFを除去した。
- 1mLの0.25%トリプシンで網膜を酵素的に解離させ、37°Cで10分間インキュベートする。
- 10%FCSを含む培地1mLを加えて反応を停止する。
- 網膜を培地で2〜3回洗う。洗浄は、培地を添加し、遠心分離(約1,800 x gで1分間)によってそれを除去するサイクルからなる。
- 網膜あたり2mLの完全培地を加え、上下にピペッティングすることによって網膜を穏やかに機械的に解離させる。
注:ここでは、研究者はどのタイプの培養物を準備するかを選択できます。強化されたニューロン培養のために、DMEM-F12 +ニューロンサプリメント+ 1%FCS +抗生物質を使用してください。混合集団または精製グリアについては、DMEM-F12 + 10%FCS +抗生物質を使用してください。 - 細胞を数え、所望の密度に希釈する。
注:理想的には、これは〜2 x 106 細胞以下の低密度培養物であるべきです。 - 50 μLの細胞懸濁液を各カバースリップに加える。
- カバースリップトリートメント
- カバースリップを37°Cの滅菌精製水中の10-50μg/mLポリ-L-リジン1mL中で少なくとも1時間(理想的には一晩)インキュベートする。
- ポリ-L-リジン溶液を取り出し、滅菌精製水でカバーグラスを2~3回洗浄する。
- UVライトが点灯した状態で安全キャビネット内でカバースリップを乾かします。この時点で、それらを4°Cの密閉容器に最大1ヶ月間保管してください。
- オプションのステップ:ニューロン強化培養の場合、PBSまたは培地中の10-20ng/mLラミニン50μLを各カバースリップに37°Cで2時間加える。 インキュベーション後、過剰のラミニン溶液を除去し、カバースリップを使用する準備が整います。
- 細胞をガラスに付着するまで、5%CO2 雰囲気で37°Cでインキュベートする。これには約1〜2時間かかります。
- 各ウェルに1mLの完全培地を加え、実験日までプレートをインキュベーターに戻した。必要に応じて、2〜3日ごとに培地を交換してください。
3. Fura-2 AMでセルをロードする
- Fura-2 AMの50μgバイアルを50μLのDMSOで再構成する。
- 作動中のFura-2 AM溶液を調製するために、3 μLの10%ポロクサマー407、7.5 μLのFura-2 AMをDMSOおよびクレブス溶液q.s.p.に1.5mL加える。
- 水浴中で7分間混合物を超音波処理する。
- 細胞培養物3xでカバースリップをクレブス溶液で洗浄してから、Fura-2でインキュベートする。
- 37°Cと5%CO2 で30分間インキュベートする。
- インキュベーション後、それを再び3倍に洗浄し、クレブスを含む別のレシピエントに移し、光から保護する。
注:作業中のFura-2 AMソリューションは、光から保護されていれば24時間安定したままです。
4. 細胞のカルシウムイメージング
- 各実行の前に、実験中の漏れを避けるために、カバースリップサポートとチャンバーにシリコンを加えてください。
- 顕微鏡レンズの塩の結晶化を避けるために、カバースリップの底を蒸留水で洗ってください。
- カバースリップを支持体の上に置き、境界線を静かに押します。
- 支持体とチャンバーを顕微鏡に取り付け、Krebs溶液で細胞を灌流し始める。
注:単一細胞カルシウムイメージング実験中の細胞灌流は、0.5mL/minの流速に較正され、プラットフォーム溶液が完全に交換されるまでに8〜10秒かかります。 - セルを見て、適切な視野を選択します。
- 細胞体は、その明確な形態に基づいて手動で選択する。
- 刺激を加える前に、ベースラインの安定化を待ちます。各刺激には約30秒かかります。
注: 各実験の直前にすべての溶液を準備します。 - 340および380nmでの交互励起(750ミリ秒)後の510nmで放出される蛍光の比を定量化することによって、[Ca2+]i の変動を評価する。
- 蛍光解析ソフトを用いて取得した値を処理します。
- 実験結果を、各行が個々のセルを表し、各行が時点を表す表で表します。
5. データ処理
- 表計算ソフトを用いて、特異細胞のFura-2蛍光比値の変動を別々に、またはそれらの全てを同時にプロットする。
- 決定された刺激に対する反応性細胞の数を定量化するために、カルシウムベースラインレベルの30%増加のカットオフを設定する
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Representative Results
ここでは、胚発生8日目のひよこからの培養中の網膜細胞を用いて、ニューロンとグリアのシグナルがカルシウムシフトでどのように変化するかを調べた。培養物は、本質的に記載されているように15,19を混合ニューロングリア細胞として(≥1 x 106細胞/ディッシュの密度で)インビトロで7日間の段階で調製した(図1A)。あるいは、低密度で調製した濃縮ニューロン細胞(5 x 105細胞/ディッシュ)を、インビトロで3日間の段階で処理したポリ-L-リジン(10 μg/mL)カバーグラス上に播種する(図1B)。さらに、精製ミュラーグリアは、ニューロンが除去された時点で、10%FCSを含むDMEM中で10日間維持された。ニューロンおよびグリアの応答を機能的に定量するために、細胞を50mM KClまたは1mM ATPで刺激した。図に示すように(図1A)、302個の細胞のうち、50%がKClに応答し、53%がATPにシグナル伝達した。この意味で、富化ニューロン細胞培養物は、ATPに応答した17%と比較して、KClに対するカルシウム応答の89%を有した(図1B)。実際、培養10日後にニューロンが除去される精製ミュラーグリア培養物は、ATPによってのみ活性化された(図1C)。
図1.混合培養物、ニューロン富化培養物またはグリア精製培養物として調製された網膜細胞は、カルシウムイメージングに対して異なる応答パターンを示す。 (A)培養中の混合胚性網膜細胞の明るい蛍光場。同じ顕微鏡視野を5μMフラ−2AM蛍光下で示した。50 mM KClは細胞の半分(ニューロン表現型)を活性化し、一方、1 mM ATPは残りの半分(グリア表現型)を活性化し、細胞内カルシウム([Ca2+]i)レベルの増加に対応する高いF340/380比を有する。(B)濃縮された神経細胞培養物は、ATPに応答した17%と比較して、KClに対して89%のカルシウム応答を有した。(c)一方、培養10日後にニューロンが除去される精製ミュラーグリア培養物は、ATPによってのみ活性化された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は網膜組織を用いて、KClまたはATPによって媒介されるカルシウム応答が、それぞれニューロン応答およびグリア応答に明確に区画化されていることを示した(図1)。文献中のいくつかのデータは、P2X7受容体がニューロンに発現しており、ニューロン活性およびシナプス神経伝達物質の放出を調節することを示唆しているが20、他の著者らはニューロンP2X7受容体の存在に疑問を呈している。実際、現在の結果は、初代グリアP2X7受容体が、不健康な組織に見られる高い細胞外ATP濃度に合計されたニューロン効果を媒介するという考えを支持している21。
我々は以前、KClまたはAMPA(グルタミン酸アゴニスト)によって活性化される[Ca2+]iシフトの変異が成熟ニューロンのマーカーである微小管関連タンパク質(MAP-2)を発現するように、網膜細胞の機能分化を表現型ディスプレイと結びつけた。あるいは、ATPによって活性化された細胞は、典型的なミュラーグリアマーカーであるグルタミン合成酵素を発現する。
私たちは、グルタミン酸作動性22、ドーパミン作動性19、GABAergic23、カンナビノイド9,10、プリン作動性14,24、セロトニン作動性25などの異なる神経化学系に関連する多くの質問に答えるために、ニューロスフェア由来4に加えて、ここに示すようなさまざまな種類の細胞培養物(混合、ニューロン濃縮または精製グリア細胞)を使用してきました。、とりわけ神経グリア網膜通信を理解する。ミュラーグリアは多数の神経伝達物質受容体26を発現し、グリオ伝達物質をD-セリン、ATP、グルタミン酸として分泌し、小胞性Ca2+依存的に放出される可能性がある27。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
助成金、スポンサー、資金源:MHは博士号CNPqフェローシップの受給者です。HRFは、CNPq(HRF助成金番号152071/2020-2)が支援するポスドクフェローシップの受領者です。RAMRはCNPqとFAPERJ(助成金番号E-26/202.668/2018、E-26/010.002215/2019、426342/2018-6、312157/2016-9)およびINCT-INNT(国立トランスレーショナル神経科学研究所)によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
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