Summary
L’imagerie calcique cellulaire est une méthodologie polyvalente pour étudier la signalisation dynamique de cellules individuelles, sur des populations mixtes en culture ou même sur des animaux éveillés, basée sur l’expression de canaux /récepteurs perméables au calcium qui donne des signatures fonctionnelles uniques.
Abstract
Ici, nous rapportons des modèles sélectifs in vitro de circuits basés sur la glie (astrocytes, oligodendrocytes et microglies) et / ou les neurones des tissus périphériques (ganglions de la racine dorsale) et centraux (cortex, zone sous-ventriculaire, organoïde) qui sont étudiés dynamiquement en termes de changements calciques. Le modèle choisi pour illustrer les résultats est la rétine, un tissu simple aux interactions cellulaires complexes. Le calcium est un messager universel impliqué dans la plupart des rôles cellulaires importants. Nous expliquons dans un protocole étape par étape comment les cellules neuronales-gliales rétiniennes en culture peuvent être préparées et évaluées, en envisageant des changements de calcium. Dans ce modèle, nous différencions les neurones de la glie en fonction de leur réponse sélective au KCl et à l’ATP. Les récepteurs et les canaux perméables au calcium sont exprimés sélectivement dans différents compartiments. Pour analyser les réponses calciques, nous utilisons des matrices fluorescentes ratiométriques telles que Fura-2. Cette sonde quantifie la concentration de Ca2+ libre sur la base de formes sans Ca2+ et liées à Ca2+, présentant deux pics différents, fondés sur l’intensité de fluorescence perçue sur deux longueurs d’onde.
Introduction
En raison des propriétés universelles du calcium en tant que deuxième messager, cet ion est impliqué dans un grand nombre d’activités de signalisation: transcription des gènes, naissance et mort, prolifération, migration et différenciation, transmission synaptique et plasticité. Par conséquent, une méthode capable de suivre la dynamique d’activation du calcium avec fidélité et agilité fournirait un moyen d’observer des réponses spatio-temporelles uniques. Une telle méthode est la technique d’imagerie cellulaire du calcium, qui met en corrélation les données fonctionnelles des décalages calciques avec des phénotypes cellulaires spécifiques en fonction de leurs réponses distinctes.
Les sondes Ca2+ ont été développées pour la première fois dans les années 1980, avec des améliorations ultérieures permettant à ces molécules d’être utilisées dans des tests de cellules vivantes1. En tant qu’indicateur chimique, fura-2 est considéré comme la norme pour les mesures quantitatives [Ca2+]i. L’ester acétoxyméthyl (AM) de cet indicateur (c.-à-d. Fura-2 AM) pénètre facilement dans la membrane cellulaire et peut atteindre des concentrations intracellulaires 20 fois supérieures à la dilution d’incubation (p. ex., [5 μM]o/[100 μM]i). Un autre avantage de Fura-2 est qu’il a une bonne résistance au photoblanchiment; ainsi, l’imagerie de cet indicateur pendant de plus longues périodes n’affectera pas grandement ses capacités de fluorescence. Enfin, Fura-2 est sensible à une large gamme de niveaux de calcium, de ~100 nM à ~100 μM, et a un Kd de ~145 nM, ce qui est comparable au repos [Ca2+]i2. Plus tard, l’imagerie du calcium cellulaire a été développée avec de meilleurs microscopes fluorescents et méthodes de calcul, ainsi que des sondes ratiométriques qui ne sont pas affectées par la charge en colorant.
Chaque cellule exprime différents dispositifs calciques (pompes, transporteurs, récepteurs et canaux) qui contribuent à la réponse finale en tant que signature particulière. L’astuce importante est de trouver des réponses sélectives de différents types de cellules corrélées à leur expression phénotypique. En conséquence, il existe au moins deux récepteurs différents qui fonctionnent par décalage calcique : les récepteurs ionotropes qui imprègnent le Ca2+ en mode rapide et les récepteurs métabotropiques lents couplés aux voies de signalisation et aux stocks intracellulaires qui libèrent du Ca2+ activé par des seconds messagers, tels que l’inositol triphosphate et l’ADP-ribose3 cyclique.
Par exemple, les cellules progénitrices expriment la nestine dans la rétine immature et montrent des récepteurs GABAA dépolarisés par GABA (ou muscimol)4. Cela se produit en raison du gradient électrochimique Cl- avec des niveaux intracellulaires élevés de Cl−; au fur et à mesure que le tissu se développe, les transporteurs KCC2 passent de l’excitation sur les progéniteurs à l’inhibition sur les neurones GABAergiques matures5. D’autre part, les cellules souches qui expriment le sox-2 dans la zone sous-ventriculaire immature (SVZ) des rongeurs postnatals présentent également des récepteurs H1 métabotropes activés par l’histamine augmentant lentement le Ca2+6. Un deuxième récepteur métabotropique de la famille des récepteurs 1 activés par la protéase (PAR-1), activé par la thrombine et en aval de G(q/11) et de phospholipase C (PLC), donne des changements lents de Ca2+ dans les oligodendrocytes (qui expriment O4 et PLP) générés à partir de cellules souches neurales SVZ multipotentes7.
En général, les neurones expriment des canaux calciques voltage-dépendants ainsi que des récepteurs neurotransmetteurs majeurs perméables au Ca2+, comme les récepteurs glutamatergiques (AMPA, NMDA, kainate) et les récepteurs nicotiniques périphériques et centraux. Le chlorure de potassium est généralement utilisé comme agent dépolarisant pour activer les neurones périphériques, comme les neurones ganglionnaires de la racine dorsale8 ou les neurones centraux, comme à partir de la zone sous-ventriculaire9 ou de la rétine10. D’autre part, l’ATP est reconnu comme le principal gliotransmetteur (en plus de la D-sérine), qui active les membres P2X perméables sélectifs Ca2+, comme P2X7 et P2X4. Les deux récepteurs présentent des courants Ca2+ équivalents, similaires à ceux montrés par les récepteurs NMDA reconnus comme les plus grands courants Ca2+ activés par les émetteurs11. Les récepteurs P2X7 sont fortement exprimés sur la microglie, mais à une densité plus faible sur les astrocytes et les oligodendrocytes, ayant un rôle dans la libération de cytokines pro-inflammatoires12. Les récepteurs P2X7 sont également exprimés sur les cellules de Schwann13 et la glie de Müller dans la rétine14,15.
La rétine est connue pour montrer presque tous les transmetteurs vus dans le cerveau. Par exemple, l’axe vertical (photorécepteurs, cellules bipolaires et ganglionnaires rétiniennes) est principalement glutamatergique, avec des récepteurs AMPA ou kainate perméables au calcium exprimés dans les cellules OFF-bipolaires et mgluR6 exprimés dans les cellules ON-bipolaires16. Curieusement, les trois récepteurs se trouvent également dans la glie de Müller, qui sont couplés aux voies du calcium et de l’inositol triphosphate17,18. L’axe inhibiteur horizontal, fabriqué par les cellules horizontales et amacrines, sécrète non seulement du GABA, mais aussi de la dopamine, de l’acétylcholine et d’autres neurotransmetteurs classiques. Les cellules amacrines sont les principaux types de cellules trouvées dans les cultures rétiniennes aviaires, montrant plusieurs types de canaux opérés par le calcium, comme les canaux calciques glutamatergiques, purinergiques, nicotiniques et dépendants de la tension. Pour cette raison, il s’agit d’un excellent modèle pour évaluer différentes propriétés des changements de calcium parmi les neurones et la glie.
Par conséquent, la combinaison de différents récepteurs et canaux additionnés à des marqueurs phénotypiques sélectifs au cours du développement avec des modèles de réponse agoniste distincts permet des signatures uniques dans la tige, le progéniteur, le neurone, l’astrocyte, l’oligodendrocyte et la microglie qui fonctionnent à travers des dispositifs de signalisation sélective.
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Protocol
Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées et réalisées conformément aux directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université fédérale de Rio de Janeiro, conformément aux « Principes de soins aux animaux de laboratoire » (NIH, Bethesda, États-Unis); numéro de permis IBCCF-035 pour les œufs de poule fécondés de Livourne blanche.
1. Préparation des solutions
- Préparer la solution de Krebs : (132 mM naCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM de glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
- Préparer un tampon salin (solution sans Ca2+ et Mg2+ - CMF) : 76,55 g/L de NaCl, 3,05 g/L de KCl, 1,65 g/L de Na2HPO4, 0,610 g/L de KH2PO4, 21,95 g/L de glucose et 7,90 g/L de NaHCO3.
- Préparer la solution d’incubation (avec Fura-2 dans la solution Krebs :) 5 μM d’ester de fura-2-acétoxyméthyle (Fura-2), 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) sans acides gras et 0,02 % de poloxamère 407.
- Pour la culture mixte de population ou de glie, préparer le DMEM/F12 avec 10 % de sérum de veau fœtal (SCF) et 40 mg/L de gentamicine comme milieu.
- Pour la culture enrichie en neurones, préparer DMEM / F12 avec 1% FCS, supplément de culture cellulaire neuronale, 40 mg / L et gentamicine comme milieu.
2. Dissection de la rétine et préparation de culture cellulaire
- Ouvrez l’œuf d’embryon de poussin (E8) de 8 jours où se trouve la cellule d’air.
- Retirez le contenu de l’œuf dans une boîte de Pétri et procédez à l’euthanasie de l’embryon par décapitation avec une pince à épiler.
- Apportez la tête dans une boîte de Petri propre et versez une solution sans calcium et magnésium (CMF) pour la laver.
- Retirez les yeux en prenant soin de ne pas l’endommager dans le processus.
REMARQUE: Essayez d’éviter de couper ou de déchiqueter les couches de l’œil avant de le retirer de la cavité oculaire. - Amenez les yeux à une boîte de Petri propre contenant du CMF.
- Commencez la dissection oculaire en retirant la lentille.
- Faites 3 ou 4 coupes longitudinales dans l’œil, en commençant par le trou laissé par la lentille. Faites des coupures en tirant sur la pince à épiler, en tenant la sclérotique oculaire dans des directions opposées.
- Retirez le corps vitré transparent avec prudence, en vous assurant que la rétine n’y est pas liée.
- Détachez la rétine de l’épithélium pigmenté et retirez tout tissu restant.
- Coupez la rétine claire en petits morceaux.
- Transférer la rétine à un autre receveur et centrifuger brièvement (~1 800 x g pendant 1 min) pour enlever le CMF.
- Dissocier enzymatiquement la rétine avec 1 mL de trypsine à 0,25 %, en l’incubant à 37 °C pendant 10 min.
- Arrêtez la réaction en ajoutant 1 mL de milieu contenant 10% de FCS.
- Lavez la rétine 2 ou 3 fois avec du médium. Le lavage consiste en des cycles d’ajout de milieu et d’élimination par centrifugation (~1 800 x g pendant 1 min).
- Ajouter 2 mL de milieu complet par rétine et dissocier mécaniquement doucement la rétine en la pipetant de haut en bas.
REMARQUE: Ici, les enquêteurs peuvent choisir le type de culture qui sera préparé. Pour une culture neuronale enrichie, utilisez DMEM-F12 + supplément neuronal + 1% FCS + antibiotiques. Pour la population mixte ou la glie purifiée, utilisez DMEM-F12 + 10% FCS + antibiotiques. - Comptez les cellules et diluez-les à la densité souhaitée.
REMARQUE: Idéalement, il devrait s’agir d’une culture de faible densité avec ~ 2 x 106 cellules ou moins. - Ajouter 50 μL de la suspension cellulaire à chaque couvercle.
- Traitement Coverslip
- Incuber les couvercles pendant au moins 1 h (idéalement pendant la nuit) dans 1 mL de 10-50 μg/mL de poly-L-lysine dans de l’eau purifiée stérilisée à 37 °C.
- Retirez la solution de poly-L-lysine et lavez les couvercles avec de l’eau purifiée stérilisée 2 à 3 fois.
- Laissez sécher les couvercles dans une armoire de sécurité avec les lumières UV allumées. À ce stade, conservez-les dans un récipient scellé à 4 °C pendant 1 mois maximum.
- Étape facultative : Pour les cultures enrichies en neurones, ajouter 50 μL de laminine 10-20 ng/mL dans du PBS ou un milieu à chaque couvercle pendant 2 h à 37 °C. Après l’incubation, retirez l’excès de solution de laminine et le couvercle est prêt à l’emploi.
- Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % jusqu’à ce qu’elles se fixent au verre. Cela devrait prendre environ 1-2 h.
- Ajouter 1 mL de milieu complet à chaque puits et remettre la plaque à l’incubateur jusqu’au jour de l’expérience. Si nécessaire, changez le support tous les 2-3 jours.
3. Capteurs de chargement avec Fura-2 AM
- Reconstituer un flacon de 50 μg de Fura-2 AM avec 50 μL de DMSO.
- Pour préparer la solution fura-2 AM de travail, ajouter 3 μL de Poloxamer 407 à 10 %, 7,5 μL de Fura-2 AM dans la solution de DMSO et Krebs q.s.p. à 1,5 mL.
- Soniquer le mélange pendant 7 min au bain-marie.
- Lavez le couvercle avec la culture cellulaire 3x avec la solution de Krebs avant de l’incuber dans Fura-2.
- Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min.
- Après l’incubation, lavez-le à nouveau 3x et transférez-le à un autre récipient contenant krebs et à l’abri de la lumière.
REMARQUE: La solution de travail Fura-2 AM reste stable pendant 24 heures si elle est protégée de la lumière.
4. Imagerie calcique des cellules
- Avant chaque exécution, ajoutez du silicium au support et à la chambre du couvercle pour éviter les fuites pendant l’expérience.
- Lavez le fond du couvercle avec de l’eau distillée pour éviter la cristallisation du sel sur la lentille du microscope.
- Placez le couvercle sur le support, en appuyant doucement sur les bordures.
- Fixez le support et la chambre au microscope et commencez à infuser les cellules avec la solution de Krebs.
REMARQUE: La perfusion cellulaire au cours des expériences d’imagerie calcique unicellulaire est calibrée à un débit de 0,5 mL / min, et il faut 8 à 10 s pour que la solution de plate-forme soit complètement remplacée. - Jetez un coup d’œil aux cellules et sélectionnez un champ de vision approprié.
- Sélectionnez manuellement les corps cellulaires en fonction de leur morphologie distincte.
- Avant d’appliquer un stimulus, attendez la stabilisation de base. Chaque stimulus devrait prendre environ 30 secondes.
REMARQUE: Préparez toutes les solutions immédiatement avant chaque expérience. - Évaluer les variations de [Ca2+]i en quantifiant le rapport de la fluorescence émise à 510 nm après une excitation alternative (750 millisecondes) à 340 et 380 nm.
- Traiter les valeurs acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse de fluorescence.
- Exprimez les résultats expérimentaux dans un tableau où chaque ligne représente une cellule individuelle et chaque ligne un point temporel.
5. Traitement des données
- À l’aide d’un tableur, tracez la variation des valeurs du rapport de fluorescence Fura-2 des cellules singulières séparément ou de toutes en même temps.
- Pour quantifier le nombre de cellules réactives au stimulus déterminé, fixez un seuil d’augmentation de 30 % des niveaux de calcium de base
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Representative Results
Ici, nous avons utilisé des cellules de rétine en culture à partir de poussins embryonnaires de jour 8 pour étudier comment les neurones et le signal glie en termes de changement de calcium. Les cultures ont été préparées essentiellement comme décrit15,19 comme des cellules mixtes neurones-gliales (à une densité de ≥ 1 x 106 cellules/plat) à un stade de 7 jours in vitro (Figure 1A). Alternativement, des cellules neuronales enrichies préparées en basse densité (5 x 105 cellules/plat), ensemencées sur des couvertures de poly-L-lysine traitée (10 μg/mL) à un stade de 3 jours in vitro (Figure 1B). En outre, la glie de Müller purifiée a été maintenue pendant 10 jours dans du DMEM contenant 10% de FCS, lorsque les neurones ont été retirés. Afin de quantifier fonctionnellement les réponses des neurones et de la glie, les cellules ont été stimulées avec 50 mM KCl ou 1 mM ATP. Comme le montre la figure 1A, sur 302 cellules, 50 % ont répondu au KCl tandis que 53 % ont fait signe à l’ATP. En ce sens, la culture cellulaire neuronale enrichie avait une réponse de 89% du calcium au KCl contre 17% qui répondaient à l’ATP (Figure 1B). En effet, une culture gliale de Müller purifiée, où les neurones sont retirés après 10 jours de culture, a été activée uniquement par l’ATP (Figure 1C).
Graphique 1. Les cellules rétiniennes préparées sous forme de cultures mixtes, enrichies en neurones ou purifiées par la glie présentent des modèles de réponse différents sur l’imagerie calcique. (A) Champs lumineux et de fluorescence de cellules rétiniennes embryonnaires mélangées en culture. Le même champ de microscope montré sous 5 μM fura-2 AM fluorescence. 50 mM KCl active la moitié des cellules (phénotype neuronal), tandis que 1 mM ATP active l’autre moitié (phénotype glial), avec des rapports F340/380 élevés correspondant à des augmentations des taux intracellulaires de calcium ([Ca2+]i). (B) La culture de cellules neuronales enrichies avait une réponse calcique de 89% au KCl contre 17% qui répondaient à l’ATP. (C) D’autre part, une culture gliale de Müller purifiée, où les neurones sont retirés après 10 jours de culture, a été activée uniquement par l’ATP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous avons utilisé le tissu rétinien pour montrer que les réponses calciques médiées par le KCl ou l’ATP sont clairement compartimentées en réponses neuronales et gliales, respectivement (Figure 1). Bien que certaines données dans la littérature impliquent que les récepteurs P2X7 sont exprimés dans les neurones, qui régulent l’activité neuronale et la libération de neurotransmetteurs synaptiques20, d’autres auteurs remettent en question l’existence de récepteurs P2X7 neuronaux. En effet, les résultats actuels soutiennent l’idée que les récepteurs P2X7 gliaux primaires médient les effets neuronaux additionnels à des concentrations élevées d’ATP extracellulaires trouvées dans les tissus malsains21.
Nous avons précédemment lié la différenciation fonctionnelle des cellules rétiniennes à leur affichage phénotypique, de manière à ce que les variations des décalages [Ca2+]i activés par KCl ou AMPA (un agoniste du glutamate) expriment la protéine associée aux microtubules (MAP-2), marqueur d’un neurone mature1. Alternativement, les cellules activées par l’ATP expriment la glutamine synthétase, un marqueur de la glie de Muller typique.
Nous avons utilisé différents types de cultures cellulaires comme indiqué ici (cellules gliales mixtes, enrichies en neurones ou purifiées), en plus des neurosphères dérivées4 pour répondre à de nombreuses questions liées à différents systèmes neurochimiques tels que glutamatergic22, dopaminergique19, GABAergic23, cannabinoid9,10, purinergic14,24, serotoninergic25 , entre autres pour comprendre la communication rétinienne neuro-gliale. La glie de Müller exprime un grand nombre de récepteurs de neurotransmetteurs26 et sécrète des gliotransmetteurs sous forme de D-sérine, d’ATP et de glutamate, qui peuvent être libérés de manière vésiculeuse, dépendante du Ca2+27.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Subventions, commanditaires et sources de financement : MH est récipiendaire d’une bourse de doctorat CNPq. HRF est récipiendaire d’une bourse postdoctorale soutenue par le CNPq (numéro de subvention HRF 152071/2020-2). RAMR est soutenu par CNPq et FAPERJ (numéros de subvention E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 et 312157/2016-9 et INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
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