Summary
Cellkalciumavbildning är en mångsidig metod för att studera dynamisk signalering av enskilda celler, på blandade populationer i kultur eller till och med på uppvaknade djur, baserat på uttryck av kalciumgenomsläppliga kanaler/receptorer som ger unika funktionella signaturer.
Abstract
Här rapporterar vi om selektiva in vitro-modeller av kretsar baserade på glia (astrocyter, oligodendrocyter och mikroglia) och/eller nervceller från perifera (dorsala rot ganglier) och centrala vävnader (cortex, subventrikulära zonen, organoid) som studeras dynamiskt när det gäller kalciumskiften. Den modell som valts för att illustrera resultaten är näthinnan, en enkel vävnad med komplexa cellulära interaktioner. Kalcium är en universell budbärare som är involverad i de flesta av de viktiga cellulära rollerna. Vi förklarar i ett steg-för-steg-protokoll hur retinala neuron-gliaceller i kultur kan förberedas och utvärderas, föreställa sig kalciumskiften. I denna modell skiljer vi nervceller från glia baserat på deras selektiva svar på KCl och ATP. Kalciumgenomsläppliga receptorer och kanaler uttrycks selektivt i olika fack. För att analysera kalciumsvar använder vi ratiometriska fluorescerande matriser som Fura-2. Denna sond kvantifierar fri Ca2+ koncentration baserad på Ca2+-fria och Ca2+-bundna former, som presenterar två olika toppar, grundade på fluorescensintensiteten som uppfattas på två våglängder.
Introduction
På grund av de universella egenskaperna hos kalcium som en andra budbärare är denna jon involverad i ett stort antal signaleringsaktiviteter: gen transkription, födelse och död, spridning, migration och differentiering, synaptisk överföring och plasticitet. Därför skulle en metod som kan spåra kalciumaktiveringsdynamik med återgivning och smidighet ge ett sätt att observera unika rumsliga-temporala svar. En sådan metod är den cellulära kalciumavbildningstekniken, som korrelerar kalcium skiftar funktionella data med specifika cellfenotyper baserat på deras distinkta svar.
Ca2+ sonder utvecklades först på 1980-talet, med senare förbättringar som gör att dessa molekyler kan användas i levande cellanalyser1. Som kemisk indikator anses Fura-2 vara standard för kvantitativa [Ca2+]i-mätningar. Acetoximetylestern (AM) för denna indikator (dvs. Fura-2 AM) genomsyrar lätt cellmembranet och kan nå intracellulära koncentrationer som är 20 gånger större än inkubationsutspädningen (t.ex. [5 μM]o/[100 μM]i). En annan fördel med Fura-2 är att den har bra fotobleaching motstånd; Således kommer avbildning av denna indikator under längre tidsperioder inte att påverka dess fluorescensförmåga i någon större utsträckning. Slutligen är Fura-2 känslig för ett brett spektrum av kalciumnivåer, från ~ 100 nM till ~ 100 μM, och har en Kd på ~ 145 nM, vilket är jämförbart med vila [Ca2 +]i2. Senare utvecklades cellkalcium imaging med bättre fluorescerande mikroskop och beräkningsmetoder, tillsammans med ratiometriska sonder som inte påverkas av färgbelastning.
Varje cell uttrycker olika kalciumenheter (pumpar, transportörer, receptorer och kanaler) som bidrar till det slutliga svaret som en viss signatur. Det viktiga tipset är att hitta selektiva svar av olika typer av celler korrelerade med deras fenotypiska uttryck. Följaktligen finns det minst två olika receptorer som verkar genom kalciumförskjutningar: jonotropa receptorer som genomsyrar Ca2 + i ett snabbt läge och långsamma metabotropiska receptorer kopplade till signalvägar och intracellulära lager som frigör Ca2 + aktiverat av andra budbärare, såsom inositoltrifosfat och cyklisk ADP-ribose3.
Till exempel, stamceller uttrycker nestin i den omogna näthinnan och visar GABAA-receptorer depolariserade av GABA (eller muscimol)4. Detta händer på grund av cl- elektrokemisk gradient med höga intracellulära Cl− nivåer; när vävnaden utvecklas växlar KCC2-transportörer från excitation på stamceller till hämning på mogna GABAergic nervceller5. Å andra sidan presenterar stamceller som uttrycker sox-2 vid den omogna subventrikulära zonen (SVZ) av postnatala gnagare också metabotropiska H1-receptorer som aktiveras av histamin ökar Ca2 + på ett långsamt sätt6. En andra metabotropisk receptor från den proteasaktiverade receptorn-1 (PAR-1) familjen, aktiverad av trombin och nedströms till G(q/11) och fosfolipas C (PLC), ger långsamma Ca2+ skiftningar i oligodendrocyter (som uttrycker O4 och PLP) som genereras från multipotenta SVZ neurala stamceller7.
I allmänhet uttrycker nervceller spänningsberoende kalciumkanaler samt stora signalsubstansreceptorer som är genomsläppliga för Ca2+, som glutamatergiska (AMPA, NMDA, kainate) och perifera och centrala nikotinreceptorer. Kaliumklorid används vanligtvis som ett depolariserande medel för att aktivera perifera nervceller, som dorsala rot ganglion nervceller8 eller centrala nervceller, från subventrikulära zon9 eller näthinnan10. Å andra sidan erkänns ATP som den stora gliotransmitter (förutom D-serin), som aktiverar selektiv Ca2 + genomsläppliga P2X-medlemmar, som P2X7 och P2X4. Båda receptorerna uppvisar motsvarande Ca2+ strömmar, liknande de som visas av NMDA-receptorer som erkänns som de största Ca2 + strömmarna som aktiveras av sändare11. P2X7-receptorer uttrycks starkt på mikroglia, men vid en lägre densitet på astrocyter och oligodendrocyter, med en roll i frisättningen av proinflammatoriska cytokiner12. P2X7-receptorer uttrycks också på Schwannceller13 och Müller glia i näthinnan14,15.
Näthinnan är känd för att visa nästan alla sändare som ses i hjärnan. Till exempel är den vertikala axeln (fotoreceptorer, bipolära och retinala ganglionceller) huvudsakligen glutamatergisk, med kalciumgenomsläppliga AMPA- eller kainatereceptorer uttryckta i OFF-bipolära celler och mgluR6 uttryckt i ON-bipolära celler16. Märkligt nog finns alla tre receptorerna också i Müller glia, som är kopplade till kalcium- och inositoltrifosfatvägar17,18. Den horisontella hämmande axeln, gjord av horisontella och amacrine celler, utsöndrar inte bara GABA, men också dopamin, acetylkolin, och andra klassiska signalsubstanser. Amacrine celler är de viktigaste typerna av celler som finns i fågel retinal kulturer, visar flera typer av kalciumdrivna kanaler, som glutamatergic, purinergic, nikotin och spänning beroende kalcium kanaler. Av denna anledning är detta en utmärkt modell för att utvärdera olika egenskaper hos kalciumskiften bland nervceller och glia.
Därför tillåter kombinationen av olika receptorer och kanaler som summeras till selektiva fenotypiska markörer under utveckling med distinkta agonistiska svarsmönster unika signaturer i stam, stamceller, neuron, astrocyt, oligodendrocyt och mikroglia som fungerar genom selektiva signalanordningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkändes och utfördes i öljande av riktlinjerna från den institutionella kommittén för djuromsorg och användning vid Det federala universitetet i Rio de Janeiro, i följd av "Principerna för laboratoriedjurvård" (NIH, Bethesda, USA). tillståndsnummer IBCCF-035 för befruktade vita benhornshönsägg.
1. Utarbetande av lösningar
- Förbered Krebs lösning: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM glukos, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
- Förbered saltlösningsbuffert (Ca2+ och Mg2+ fri lösning - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L Na2HPO4, 0,610 g/L KH2PO4, 21,95 g/L glukos och 7,90 g/L NaHCO3.
- Förbered inkubationslösning (med Fura-2 i Krebs lösning:) 5 μM Fura-2-acetoxymetyleser (Fura-2), 0,1% fettsyrafritt bovin serumalbumin (BSA) och 0,02% Poloxamer 407.
- För blandad population eller gliakultur, förbered DMEM/F12 med 10% fetala kalvserum (FCS) och 40 mg/L gentamicin som medium.
- För neuron berikad kultur, förbereda DMEM/F12 med 1% FCS, neuronal cell kultur tillägg, 40 mg/L och gentamicin som medium.
2. Näthinne dissekering och cellodlingsberedning
- Öppna det 8 dagar gamla kycklingembryon (E8) ägget där luftcellen finns.
- Ta bort ägginnehållet till en Petri-maträtt och fortsätt med embryots dödshjälp genom halshuggning med ett par pincett.
- Ta huvudet till en ren Petri-skål och häll lite kalcium- och magnesiumfri lösning (CMF) för att tvätta den.
- Ta bort ögonen, var försiktig så att du inte skadar det i processen.
OBS: Försök att undvika att skära eller strimla ögats lager innan du tar bort det från ögonhålan. - Ta ögonen till en ren Petri-maträtt som innehåller CMF.
- Börja ögonförskjutningen genom att ta bort objektivet.
- Gör 3 eller 4 längsgående snitt i ögat, med början vid hålet som lämnas av linsen. Gör snitt genom att dra pincetterna, hålla ögonsclera i motsatta riktningar.
- Ta bort den genomskinliga glaskroppen med försiktighet och se till att näthinnan inte är bunden till den.
- Lossa näthinnan från det pigmenterade epitelet och ta bort eventuell återstående vävnad.
- Skär den klara näthinnan i små bitar.
- Överför näthinnan till en annan mottagare och centrifugera kort (~ 1 800 x g i 1 min) för att ta bort CMF.
- Enzymatiskt dissociera näthinnan med 1 ml 0,25% trypsin, genom att inkubera den vid 37 °C i 10 min.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 1 ml medium som innehåller 10% FCS.
- Tvätta näthinnan 2 eller 3 gånger med medium. Tvätten består av cykler av att tillsätta medium och ta bort det genom centrifugering (~ 1 800 x g i 1 min).
- Tillsätt 2 ml komplett medium per näthinna och separera försiktigt näthinnan mekaniskt genom att pipettera den upp och ner.
OBS: Här kan utredare välja vilken typ av kultur som ska förberedas. För en berikad neuronal kultur, använd DMEM-F12 + neuronal tillägg + 1% FCS + antibiotika. För blandad population eller renad glia, använd DMEM-F12 + 10% FCS + antibiotika. - Räkna cellerna och späd dem till önskad densitet.
OBS: Helst bör detta vara en lågdensitetskultur med ~ 2 x 106 celler eller mindre. - Tillsätt 50 μL av cellfjädringen till varje täckslip.
- Täckslipsbehandling
- Inkubera täckslipar i minst 1 h (helst över natten) i 1 ml 10-50 μg/ml poly-L-lysin i steriliserat renat vatten vid 37 °C.
- Ta bort poly-L-lysinlösningen och tvätta täcken med steriliserat renat vatten 2-3 gånger.
- Låt täckena torka i ett säkerhetsskåp med UV-lampor tända. Förvara dem i en förseglad behållare vid 4 °C i upp till 1 månad.
- Valfritt steg: För neuronberikade kulturer, tillsätt 50 μL 10-20 ng/mL laminin i PBS eller medium till varje täckslip i 2 h vid 37 °C. Efter inkubation, ta bort lamininlösning överskott och täcket är klart att användas.
- Inkubera celler vid 37 °C i en 5% CO2-atmosfär tills de fästs på glaset. Detta bör ta ca 1-2 h.
- Tillsätt 1 ml komplett medium till varje brunn och returnera plattan till inkubatorn fram till experimentets dag. Om det behövs, byt medium var 2-3 dag.
3. Ladda celler med Fura-2 AM
- Rekonstituera en 50 μg flaska Fura-2 AM med 50 μL DMSO.
- För att förbereda fungerande Fura-2 AM-lösning, tillsätt 3 μL 10% Poloxamer 407, 7,5 μL Fura-2 AM i DMSO och Krebs lösning q.s.p. till 1,5 ml.
- Sonicate blandningen i 7 min i ett vattenbad.
- Tvätta täcket med cellkulturen 3x med Krebs lösning innan du inkuberar det i Fura-2.
- Inkubera vid 37 °C och 5% CO2 i 30 min.
- Efter inkubation, tvätta den 3x igen och överför den till en annan mottagare som innehåller Krebs och skyddas från ljuset.
OBS: Fungerande Fura-2 AM-lösning förblir stabil i 24 timmar om den skyddas från ljuset.
4. Kalciumavbildning av celler
- Innan varje körning, tillsätt kisel till täckslipsstödet och kammaren för att undvika läckage under experimentet.
- Tvätta botten av täcksläcket med destillerat vatten för att undvika saltkristallisering på mikroskoplinsen.
- Sätt täcket på stödet och tryck försiktigt på kanterna.
- Fäst stödet och kammaren på mikroskopet och börja persyrera celler med Krebs lösning.
OBS: Cellperfusion under encelliga kalciumavbildningsexperiment kalibreras till en flödeshastighet på 0,5 ml/min, och det tar 8-10 s för plattformslösningen att bytas ut helt. - Ta en titt på cellerna och markera ett lämpligt synfält.
- Välj cellkropparna manuellt baserat på deras distinkta morfologi.
- Innan du applicerar någon stimulans, vänta på baslinjestabilisering. Varje stimulans bör ta cirka 30 sekunder.
OBS: Förbered alla lösningar omedelbart före varje experiment. - Utvärdera variationerna i [Ca2+]i genom att kvantifiera förhållandet mellan fluorescensen vid 510 nm efter alternativ excitation (750 millisekunder) vid 340 och 380 nm.
- Bearbeta förvärvade värden med hjälp av en fluorescensanalysprogramvara.
- Express experimentella resultat i en tabell där varje rad representerar en enskild cell och varje rad en tidspunkt.
5. Databehandling
- Använd ett kalkylbladsprogram och rita upp variationen av Fura-2 fluorescensförhållandevärden för singularceller separat eller av dem alla samtidigt.
- För att kvantifiera antalet reaktiva celler till bestämd stimulans, ställ in en cutoff på 30% ökning av kalciumbaslinjen nivåer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här använde vi näthinneceller i kultur från embryonala dag 8 kycklingar för att undersöka hur nervceller och glia signalerar när det gäller kalciumskiften. Kulturer framställdes i huvudsak som beskrivit15,19 som blandade neuron-glia celler (vid en densitet av ≥ 1 x 106 cell/maträtt) i ett stadium av 7 dagar in vitro (figur 1A). Alternativt, berikade neuronala celler beredda i låg densitet (5 x 105 cell/maträtt), sådda på behandlade poly-L-lysin (10 μg/ml) täckslipar i ett skede av 3 dagar in vitro (figur 1B). Dessutom bibehölls renad Müller glia i 10 dagar i DMEM som innehåller 10% FCS, när nervceller togs bort. För att funktionellt kvantifiera svaren från nervceller och glia stimulerades cellerna med 50 mM KCl eller 1 mM ATP. Som visas (figur 1A), av 302 celler, svarade 50% på KCl medan 53% signalerade till ATP. I den meningen hade berikad neuronal cellkultur en 89% av kalciumsvaren på KCl jämfört med 17% som svarade på ATP (figur 1B). Faktum är att en renad Müller glia-kultur, där nervceller avlägsnas efter 10 dagar i kultur, aktiverades endast av ATP (figur 1C).
Figur 1. Retinal celler beredda som blandade, neuronal-berikade eller glia-renade kulturer visar olika svarsmönster på kalcium imaging. (A) Ljusa och fluorescensfält av blandade embryonala näthinneceller i kulturen. Samma mikroskopfält som visas under 5 μM fura-2 AM fluorescens. 50 mM KCl aktiverar hälften av cellerna (neuronal fenotyp), medan 1 mM ATP aktiverar den andra hälften (gliafenotyp), med höga F340/380-förhållanden som motsvarar ökningar av intracellulära kalciumnivåer ([Ca2+]i). (B) Den berikade neuronal cellkulturen hade ett 89% kalciumsvar på KCl jämfört med 17% som svarade på ATP. (C) Å andra sidan aktiverades en renad Müller glia-kultur, där nervceller avlägsnas efter 10 dagar i kulturen, endast av ATP. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har använt näthinnan vävnad för att visa att kalcium svar medieras av KCl eller ATP är tydligt uppdelade i neuronal och glia svar, respektive (figur 1). Även om vissa data i litteraturen innebär att P2X7-receptorer uttrycks i nervceller, som reglerar neuronal aktivitet och synaptisk neurotransmittor release20, ifrågasätter andra författare förekomsten av neuronala P2X7-receptorer. Faktum är att nuvarande resultat upprätthåller tanken att primära glia P2X7-receptorer förmedlar neuronala effekter som summeras till höga extracellulära ATP-koncentrationer som finns i ohälsosamma vävnader21.
Vi har tidigare kopplat den funktionella differentieringen av retinala celler med deras fenotypiska display, på ett sätt som variationer av [Ca2 +]i skift som aktiveras av KCl eller AMPA (en glutamatagonist) express microtubule associerat protein (MAP-2), markör för en mogen neuron1. Alternativt, celler som aktiveras av ATP express glutamin synthetase, en typisk Muller glia markör.
Vi har använt olika typer av cellkulturer som visas här (blandade, neuronala berikade eller renade gliaceller), förutom neurosfärer härledda4 för att svara på många frågor relaterade till olika neurokemiska system som glutamatergic22, dopaminergic19, GABAergic23, cannabinoid9,10, purinergic14,24, serotoninergic25 , bland annat för att förstå neuro-glia retinal kommunikation. Müller glia uttrycker ett stort antal signalsubstansreceptorer26 och utsöndrar gliotransmitters som D-serin, ATP och glutamat, som kan släppas ut på ett vesikulärt, Ca2 + beroende sätt27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Bidrag, sponsorer och finansieringskällor: MH är mottagare av ett phd CNPq-stipendium. HRF är mottagare av ett postdoktorstipendium som stöds av CNPq (HRF-bidragsnummer 152071/2020-2). RAMR stöds av CNPq och FAPERJ (bidragsnummer E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 och 312157/2016-9 och INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
- Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
- De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
- Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
- Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
- Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
- Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
- Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
- Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
- Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
- Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
- Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
- López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
- Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
- Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
- Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
- Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
- Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscience. 281, 208-215 (2014).
- Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
- Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
- de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).
