Summary
A imagem celular de cálcio é uma metodologia versátil para estudar a sinalização dinâmica de células individuais, em populações mistas na cultura ou mesmo em animais despertados, com base na expressão de canais/receptores permeáveis de cálcio que dão assinaturas funcionais únicas.
Abstract
Aqui, relatamos modelos in vitro seletivos de circuitos baseados em glia (astrócitos, oligodendrócitos e microglia) e/ou neurônios de tecidos periféricos (gânglios raiz dorsal) e centrais (córtex, zona subventricular, organoide) que são estudados dinamicamente em termos de mudanças de cálcio. O modelo escolhido para ilustrar os resultados é a retina, um tecido simples com interações celulares complexas. O cálcio é um mensageiro universal envolvido na maioria dos papéis celulares importantes. Explicamos em um protocolo passo-a-passo como as células neuron-glial da retina na cultura podem ser preparadas e avaliadas, imaginando mudanças de cálcio. Neste modelo, diferenciamos neurônios da glia com base em sua resposta seletiva ao KCl e ATP. Receptores e canais permeáveis de cálcio são expressos seletivamente em diferentes compartimentos. Para analisar as respostas de cálcio, usamos mortes fluorescentes racionmétricas como fura-2. Esta sonda quantifica a concentração gratuita de Ca2+ com base em formas ligadas a Ca2+e Ca2+, apresentando dois picos diferentes, fundadas na intensidade de fluorescência percebida em dois comprimentos de onda.
Introduction
Devido às propriedades universais do cálcio como segundo mensageiro, este íon está envolvido em um grande número de atividades de sinalização: transcrição genética, nascimento e morte, proliferação, migração e diferenciação, transmissão sináptica e plasticidade. Assim, um método capaz de rastrear a dinâmica de ativação de cálcio com fidelidade e agilidade forneceria uma maneira de observar respostas espaciais-temporais únicas. Tal método é a técnica de imagem de cálcio celular, que correlaciona dados funcionais de cálcio com fenótipos celulares específicos com base em suas respostas distintas.
As sondas Ca2+ foram desenvolvidas pela primeira vez na década de 1980, com melhorias posteriores permitindo que essas moléculas fossem usadas em ensaios de células vivas1. Como indicador químico, a Fura-2 é considerada o padrão para medições quantitativas [Ca2+]i. O éster de acetoximilo (AM) deste indicador (ou seja, Fura-2 AM) permeia facilmente a membrana celular e pode atingir concentrações intracelulares 20 vezes maiores que a diluição de incubação (por exemplo, [5 μM]o/[100 μM]i). Outra vantagem da Fura-2 é que ele tem boa resistência fotobleaching; assim, a imagem deste indicador por períodos mais longos de tempo não afetará muito suas capacidades de fluorescência. Finalmente, a Fura-2 é sensível a uma ampla gama de níveis de cálcio, de ~100 nM a ~100 μM, e tem um Kd de ~145 nM, que é comparável ao repouso [Ca2+]i2. Posteriormente, a imagem de cálcio celular foi desenvolvida com melhores microscópios fluorescentes e métodos de computação, juntamente com sondas racionmétricas que não são afetadas pelo carregamento de corantes.
Cada célula expressa diferentes dispositivos de cálcio (bombas, transportadores, receptores e canais) que contribuem para a resposta final como uma assinatura particular. A dica importante é encontrar respostas seletivas de diferentes tipos de células correlacionadas com sua expressão fenotípica. Assim, existem pelo menos dois receptores diferentes que operam através de mudanças de cálcio: receptores ionotróricos que permeiam o Ca2+ em um modo rápido e receptores metabotrópicos lentos acoplados a vias de sinalização e estoques intracelulares que liberam Ca2+ ativados por terceiros, como triphosfato inositol e ADP-ribose3 cíclico.
Por exemplo, as células progenitoras expressam nestin na retina imatura e mostram receptores GABAA despolarizados por GABA (ou muscimol)4. Isso acontece devido ao gradiente cl-eletroquímico com altos níveis de Cl intracelular; à medida que o tecido se desenvolve, os transportadores KCC2 mudam de excitação em progenitores para inibição em neurônios GABAérgicos maduros5. Por outro lado, células-tronco que expressam sox-2 na imatura zona subventricular (SVZ) de roedores pós-natais também apresentam receptores metabotrópicos H1 ativados pela histamina aumentando Ca2+ de forma lenta6. Um segundo receptor metabotrópico da família receptor-1 (PAR-1) ativado por trombina e rio abaixo para G (q/11) e fosfolipase C (PLC), dá mudanças lentas de Ca2+ em oligodendrocytes (que expressam O4 e PLP) gerados a partir de células-tronco neurais SVZ multipotentes7.
Em geral, os neurônios expressam canais de cálcio dependentes de tensão, bem como os principais receptores neurotransmissores permeáveis ao Ca2+, como glutamatergicos (AMPA, NMDA, kainate) e receptores nicotínicos periféricos e centrais. Cloreto de potássio é geralmente usado como um agente despolarizador para ativar neurônios periféricos, como os neurônios gânglios raiz dorsal8 ou neurônios centrais, a partir de zona subventricular9 ou retina10. Por outro lado, a ATP é reconhecida como o principal gliotransmissor (além do D-serine), que ativa membros P2X permeáveis seletivos Ca2+, como P2X7 e P2X4. Ambos os receptores apresentam correntes ca2+equivalentes, semelhantes às mostradas pelos receptores NMDA reconhecidas como as maiores correntes Ca2+ ativadas pelos transmissores11. Os receptores P2X7 são altamente expressos em microglia, mas em uma densidade menor em astrócitos e oligodendrócitos, tendo um papel na liberação de citocinas proinflamatórias12. Os receptores P2X7 também são expressos nas células Schwann13 e Müller glia na retina14,15.
A retina é conhecida por mostrar quase todos os transmissores vistos no cérebro. Por exemplo, o eixo vertical (fotorreceptores, células gânglios bipolares e retina) é principalmente glutamatergicos, com receptores AMPA permeáveis de cálcio ou kainate expressos em células OFF-bipolar e mgluR6 expressos em células ON-bipolar16. Curiosamente, todos os três receptores também são encontrados em Müller glia, que são acoplado a caminhos triptosfato de cálcio e inositol17,18. O eixo inibitório horizontal, feito por células horizontais e amacrinas, secretam não apenas gaba, mas também dopamina, acetilcolina e outros neurotransmissores clássicos. As células amacrinas são os principais tipos de células encontradas nas culturas de retina aviária, mostrando vários tipos de canais operados por cálcio, como canais glutamatericos, purinérgicos, nicotinicos e de cálcio dependentes de tensão. Por essa razão, este é um excelente modelo para avaliar diferentes propriedades de mudanças de cálcio entre neurônios e glia.
Portanto, a combinação de diferentes receptores e canais resumidos a marcadores fenotípicos seletivos durante o desenvolvimento com padrões de resposta agonista distintos permite assinaturas únicas em haste, progenitor, neurônio, astrócito, oligodendrocyte e microglia que operam através de dispositivos de sinalização seletiva.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados e realizados seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Federal do Rio de Janeiro, seguindo os "Princípios do Cuidado Animal Laboratorial" (NIH, Bethesda, EUA); permitir o número IBCCF-035 para ovos de galinha leghorn branco fertilizados.
1. Preparação de soluções
- Prepare a solução Krebs: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM de glicose, 10 mM HEPES, pH 7.4, 373 mOsm).
- Prepare o tampão salino (solução livre Ca2+ e Mg2+ - CMF): 76,55 g/L NaCl, 3,05 g/L KCl, 1,65 g/L Na2HPO4, 0,610 g/L KH2PO4, 21,95 g/L de glicose e 7,90 g/L NaHCO3.
- Prepare a solução de incubação (com Fura-2 na solução Krebs:) 5 μM Fura-2-acetoximethyl ester (Fura-2), 0,1% gárquico livre de ácidos graxos albumina de soro bovino (BSA) e 0,02% Poloxamer 407.
- Para a população mista ou cultura glia, prepare o DMEM/F12 com soro de bezerro fetal 10% (FCS) e 40 mg/L de gentamicina como médio.
- Para a cultura enriquecida com neurônios, prepare o DMEM/F12 com 1% de FCS, suplemento de cultura celular neuronal, 40 mg/L e gentamicina como médio.
2. Dissecção de retina e preparação da cultura celular
- Abra o ovo de 8 dias de embrião de filhotes (E8) onde a célula de ar está localizada.
- Remova o conteúdo do ovo para uma placa de Petri e prossiga com a eutanásia embrião por decapitação com um par de pinças.
- Leve a cabeça para uma placa de Petri limpa e despeje um pouco de solução livre de cálcio e magnésio (CMF) para lavá-la.
- Remova os olhos, tomando cuidado para não danificá-lo no processo.
NOTA: Tente evitar cortar ou triturar as camadas dos olhos antes de removê-lo da cavidade ocular. - Leve os olhos para uma placa de Petri limpa contendo CMF.
- Inicie a dissecção dos olhos removendo a lente.
- Faça 3 ou 4 cortes longitudinais no olho, começando pelo orifício deixado pela lente. Faça cortes puxando a pinça, segurando a esclera dos olhos em direções opostas.
- Remova o corpo vítreo transparente com cuidado, certificando-se de que a retina não está ligada a ele.
- Retire a retina do epitélio pigmentado e remova qualquer tecido restante.
- Corte a retina clara em pequenos pedaços.
- Transfira a retina para outro receptor e centrífuga brevemente (~1.800 x g por 1 min) para remover o CMF.
- Dissociar enzimaticamente a retina com 1 mL de trippsina de 0,25%, incubando-a a 37 °C por 10 min.
- Pare a reação adicionando 1 mL de meio contendo 10% de FCS.
- Lave a retina 2 ou 3 vezes com o meio. A lavagem consiste em ciclos de adição de meio e remoção por centrifugação (~1.800 x g por 1 min).
- Adicione 2 mL de meio completo por retina e dissociar suavemente a retina, escaneando-a para cima e para baixo.
NOTA: Aqui, os investigadores podem escolher qual tipo de cultura será preparada. Para uma cultura neuronal enriquecida, use DMEM-F12 + suplemento neuronal + 1% FCS + antibióticos. Para população mista ou glia purificada, use DMEM-F12 + 10% fcs + antibióticos. - Conte as células e dilui-as à densidade desejada.
NOTA: Idealmente, esta deve ser uma cultura de baixa densidade com ~ 2 x 106 células ou menos. - Adicione 50 μL da suspensão da célula a cada deslizamento de tampa.
- Tratamento de deslizamento de cobertura
- Incubar tampas por pelo menos 1 h (idealmente durante a noite) em 1 mL de 10-50 μg/mL poli-L-lisina em água purificada esterilizada a 37 °C.
- Remova a solução de poli-L-lisina e lave as tampas com água purificada esterilizada 2-3 vezes.
- Deixe as tampas secarem em um armário de segurança com luzes UV acesas. Neste ponto, armazene-os em um recipiente lacrado a 4 °C por até 1 mês.
- Etapa opcional: Para culturas enriquecidas por neurônios, adicione 50 μL de 10-20 ng/mL laminina em PBS ou médio para cada deslizamento de cobertura por 2 h a 37 °C. Após a incubação, remova o excesso da solução de laminina e o deslizamento de cobertura esteja pronto para uso.
- Incubar células a 37 °C a uma atmosfera de CO2 de 5% até que se anexem ao vidro. Isso deve levar cerca de 1-2 h.
- Adicione 1 mL de meio completo a cada poço e devolva a placa à incubadora até o dia do experimento. Se necessário, troque o meio a cada 2-3 dias.
3. Células de carregamento com Fura-2 AM
- Reconstitua um frasco de 50 μg de Fura-2 AM com 50 μL de DMSO.
- Para preparar a solução Fura-2 AM de trabalho, adicione 3 μL de 10% Poloxamer 407, 7,5 μL de Fura-2 AM em DMSO e solução Krebs q.s.p. a 1,5 mL.
- Sonicar a mistura por 7 minutos em um banho de água.
- Lave o deslizamento com a cultura celular 3x com a solução Krebs antes de incuba-lo em Fura-2.
- Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min.
- Após a incubação, lave-o 3x novamente e transfira-o para outro receptor contendo Krebs e protegido da luz.
NOTA: A solução Fura-2 AM de trabalho permanece estável por 24 horas se protegida da luz.
4. Imagem de cálcio das células
- Antes de cada corrida, adicione silicone ao suporte de deslizamento de cobertura e câmara para evitar vazamentos durante o experimento.
- Lave o fundo da tampa com água destilada para evitar a cristalização do sal na lente do microscópio.
- Coloque a tampa no suporte, pressionando suavemente as bordas.
- Conecte o suporte e a câmara ao microscópio e comece a perfundar células com a solução Krebs.
NOTA: A perfusão celular durante experimentos de imagem de cálcio de célula única é calibrada para uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, e leva de 8 a 10 s para que a solução da plataforma seja totalmente substituída. - Veja as células e selecione um campo de visão apropriado.
- Selecione manualmente os corpos celulares com base em sua morfologia distinta.
- Antes de aplicar qualquer estímulo, aguarde a estabilização da linha de base. Cada estímulo deve levar cerca de 30 segundos.
NOTA: Prepare todas as soluções imediatamente antes de cada experimento. - Avalie as variações em [Ca2+]i quantificando a razão da fluorescência emitida em 510 nm após excitação alternativa (750 milissegundos) a 340 e 380 nm.
- Processar valores adquiridos usando um software de análise de fluorescência.
- Expresse resultados experimentais em uma tabela onde cada linha representa uma célula individual, e cada linha um ponto de tempo.
5. Processamento de dados
- Usando um software de planilha, plote a variação dos valores da razão de fluorescência Fura-2 de células singulares separadamente ou de todas elas ao mesmo tempo.
- Para quantificar o número de células reativas a estímulos determinados, defina um corte de 30% nos níveis de linha de base de cálcio
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Representative Results
Aqui, usamos células de retina na cultura a partir de filhotes embrionários do dia 8 para investigar como neurônios e glia sinal em termos de mudanças de cálcio. As culturas foram preparadas essencialmente como descritas15,19 como células neurônio-glial mistas (a uma densidade de ≥ 1 x 106 célula/prato) em um estágio de 7 dias in vitro (Figura 1A). Alternativamente, células neuronais enriquecidas preparadas em baixa densidade (5 x 105 células/prato), semeadas em poli-L-lisina tratada (10 μg/mL) cobrem deslizamentos em um estágio de 3 dias in vitro (Figura 1B). Além disso, müller glia purificado foram mantidos por 10 dias em DMEM contendo 10% de FCS, quando os neurônios foram removidos. Para quantificar funcionalmente as respostas dos neurônios e da glia, as células foram estimuladas com 50 mM KCl ou 1 mM ATP. Como mostrado (Figura 1A), de 302 células, 50% responderam ao KCl, enquanto 53% sinalizaram para a ATP. Nesse sentido, a cultura celular neuronal enriquecida teve 89% das respostas de cálcio ao KCl em comparação com 17% que responderam ao ATP (Figura 1B). De fato, uma cultura purificada de Müller glia, onde os neurônios são removidos após 10 dias na cultura, foram ativadas exclusivamente pela ATP (Figura 1C).
Figura 1. As células da retina preparadas como culturas mistas, enriquecidas com neurônios ou purificadas por glia mostram diferentes padrões de resposta na imagem de cálcio. (A) Campos brilhantes e fluorescência de células de retina embrionárias mistas na cultura. O mesmo campo de microscópio mostrado sob fluorescência de 5 μM fura-2 AM. 50 mM KCl ativa metade das células (fenótipo neuronal), enquanto 1 mM ATP ativa a outra metade (fenótipo glial), com altas razões F340/380 correspondentes a aumentos nos níveis de cálcio intracelular ([Ca2+]i). (B) A cultura celular neuronal enriquecida teve uma resposta de 89% de cálcio ao KCl em comparação com 17% que responderam ao ATP. (C) Por outro lado, uma cultura purificada de Müller glia, onde os neurônios são removidos após 10 dias na cultura, foi ativada exclusivamente pela ATP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usamos o tecido da retina para mostrar que as respostas de cálcio mediadas por KCl ou ATP são claramente compartimentadas em respostas neuronais e gliais, respectivamente (Figura 1). Embora alguns dados na literatura impliquem que os receptores P2X7 sejam expressos em neurônios, que regulam a atividade neuronal e a liberação de neurotransmissores sinápticos20, outros autores questionam a existência de receptores P2X7 neuronais. De fato, os resultados atuais sustentam a ideia de que os receptores primários glial P2X7 mediam os efeitos neuronais somados a altas concentrações de ATP extracelulares encontradas em tecidos insalubres21.
Anteriormente, associamos a diferenciação funcional das células da retina com seu display fenotípico, de forma que variações de [Ca2+]i mudam que são ativadas por KCl ou AMPA (agonista de glutamato) proteína expressa associada a microtúbulos (MAP-2), marcador de um neurônio maduro1. Alternativamente, as células ativadas pela ATP express glutamine synthetase, um típico marcador muller glia.
Temos usado diferentes tipos de culturas celulares como mostrado aqui (células gliais mistas, neuronais enriquecidas ou purificadas), além das neurosferas derivadas4 para responder a muitas perguntas relacionadas a diferentes sistemas neuroquímicos como glutamatergic22, dopaminérgico19, GABAergic23, canaoidbina9,10, purinérgica14,24, serotonina25 , entre outros, para entender a comunicação neuro-glial da retina. Müller glia expressa um grande número de receptores neurotransmissores26 e secreta gliotransmissores como D-serine, ATP e glutamato, que podem ser liberados de forma vesicular, dependente de Ca2+,27.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Bolsas, patrocinadores e fontes de financiamento: A MS é beneficiária de uma bolsa de doutorado do CNPq. A HRF é beneficiária de uma bolsa pós-doutorado apoiada pelo CNPq (número de bolsas do HRF 152071/2020-2). O RAMR conta com o apoio do CNPq e da FAPERJ (números de bolsas E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 e 312157/2016-9 e INCT-INNT (Instituto Nacional de Neurociências Translacionais).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
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