Summary
提出了一种用于检查小脑灰质形态测量的标准化管道。该管道结合了高分辨率，最先进的方法，用于优化和自动化的小脑包裹和基于体素的小脑配准，以进行体积量化。
Abstract
多项研究为小脑在各种认知和情感功能中的作用提供了令人信服的证据，远远超出了其与运动控制的历史关联。结构和功能性神经影像学研究进一步完善了对小脑功能性神经解剖学的理解，超越了其解剖划分，突出了检查健康变异性和神经系统疾病中单个小脑亚基的必要性。本文提出了一种用于检查小脑灰质形态测量的标准化管道，该管道结合了高分辨率，最先进的方法，用于优化和自动化小脑包裹（使用U-Net局部约束优化的自动小脑解剖包裹;ACAPULCO）和基于体素的小脑注册（空间无偏倚的下层模板;SUIT）用于体积定量。
该管道广泛适用于一系列神经系统疾病，并且是全自动的，仅对输出进行质量控制所需的手动干预。该管道是免费提供的，并附有大量文档，并且可以在Mac，Windows和Linux操作系统上运行。该管道应用于Friedreich共济失调（FRDA）患者的队列，并提供代表性结果以及组水平推断统计分析的建议。该管道可以促进整个领域的可靠性和可重复性，最终为表征和跟踪神经系统疾病中的小脑结构变化提供强大的方法学方法。
Introduction
小脑是大脑的一部分，历史上与运动控制1，2，3有关，并且被认为仅与一小部分罕见疾病（例如遗传性共济失调4）整体相关。然而，来自非人类灵长类动物解剖学追踪研究以及人类病变和神经影像学研究的趋同研究，为小脑在各种认知5，6，7，情感8，9，10，11和其他非运动功能中的作用提供了令人信服的证据7，12（见6 以供审查）。此外，小脑异常越来越多地与广泛的神经和精神疾病有关，包括帕金森病13，阿尔茨海默病14，15，癫痫16，17，精神分裂症18和自闭症谱系障碍19.因此，将小脑纳入人类脑部疾病和规范行为变异的功能和结构模型中变得至关重要。
在解剖学上，小脑可以沿其上下轴分为三个叶：前叶，后叶和絮状硬叶。波瓣进一步细分为10个小叶，用罗马数字I-X20，21表示（图1）。小脑也可以分为中线（蚯蚓）和侧（半球）区域，分别接收来自脊髓和大脑皮层的输入。前叶，包括小叶I-V，传统上与运动过程相关，并且与脑运动皮层22具有相互连接。后叶，包括小叶VI-IX，主要与非运动过程11相关，并且与前额叶皮层，后壁和颞上脑皮层8，23具有相互连接。最后，由小叶X组成的絮状硬核与前庭核具有相互连接，前庭核在姿势和步态21期间控制眼球运动和身体平衡。
最近越来越多的使用功能性神经影像学的工作进一步完善了对小脑功能性神经解剖学的理解，超越了其解剖结构。例如，静息状态功能性磁共振成像（fMRI）技术已被用于绘制小脑和大脑之间功能相互作用的模式24。此外，使用基于任务的包裹方法，King及其同事7证明小脑在其广度上显示出丰富而复杂的功能特化模式，这与各种运动，情感，社交和认知任务相关的不同功能边界证明了这一点。总的来说，这些研究强调了检查单个小脑亚基的重要性，以发展小脑参与健康变异性和以小脑结构和/或功能改变为特征的神经系统疾病的完整生物学特征。
本研究的重点是使用结构MRI在人体中量化小脑体积局部变化的方法。一般来说，使用MRI数据量化区域脑体积有两种基本方法：基于特征 的分割 和 基于体素的配准。基于特征的分割方法使用解剖学特征和标准化地图集来自动确定次区域之间的边界。用于细分的主流软件包包括FreeSurfer25，BrainSuite26和 FSL-FIRST27。然而，这些包仅提供小脑的粗包裹（例如，标记每个半球的整个灰质和整个白质），从而忽略了单个小脑小叶。这些方法也容易出现误断，特别是周围脉管系统的过度整合。
已经开发了新的机器学习和多图集标记算法，它们提供了更准确和更细粒度的小脑包裹，包括使用隐式多边界进化的小脑小脑自动分类算法（ACCLAIM28，29），小脑分析工具包（CATK30），多个自动生成的模板（MAGeT31），人类小脑及其小脑的快速自动分割（RASCAL32）），图形切割分割33和小脑分割（CERES34）。在最近的一篇论文中，比较了最先进的全自动小脑包裹方法，发现CERES2相对于小脑叶的黄金标准手动分割35优于其他方法。最近，Han及其同事36开发了一种名为ACAPULCO（使用U-Net进行局部约束优化的自动小脑解剖包裹）的深度学习算法，该算法与CERES2相当，对健康和萎缩的小脑具有广泛的适用性，以开源Docker和Singularity容器格式用于“现成”实现，并且比其他方法更具时效性。ACAPULCO自动将小脑包裹成28个解剖区域。
与基于特征的分割相比，基于体素的配准方法是将MRI精确映射到模板图像。要实现此映射，原始图像中的体素必须在大小和形状上失真。这种失真的幅度有效地提供了相对于黄金标准模板的每个体素的体积度量。这种形式的体积评估被称为“基于体素的形态测量”37。基于全脑体素的配准方法，如FSL-FLIRT38/FNIRT39、SPM统一分割40和CAT1241，通常用于基于体素的形态测量。然而，这些方法不能很好地解释小脑，导致在颅下区域（小脑，脑干42）的可靠性和有效性较差。为了解释这些局限性，开发了SUIT（空间无偏倚下层模板）算法来优化小脑配准并提高基于体素的形态测量42，43的准确性。
基于特征的分割和基于体素的配准方法用于估计区域小脑体积具有基本的优缺点。分割方法对于量化解剖学上定义的区域（例如，小叶35）的体积要准确得多。然而，小脑不同功能模块之间的边界不会映射到其解剖叶和裂缝上（相当于大脑的回和沟7）。由于基于配准的方法不受解剖学特征的约束，因此可以对小脑进行更细粒度的空间推断和高维结构功能映射44。总而言之，细分和注册方法是相辅相成的，可用于回答不同的研究问题。
在这里，提出了一个新的标准化管道，它集成了这些现有的，经过验证的方法，以提供优化和自动化的小脑包裹（ACAPULCO）和基于体素的配准（SUIT），用于体积量化（图2）。该管道建立在既定方法的基础上，包括质量控制协议，使用定性可视化和定量异常值检测，以及使用Freesurfer获得颅内体积（ICV）估计的快速方法。管道是完全自动化的，只需检查质量控制输出就需要手动干预，并且可以在Mac，Windows和Linux操作系统上运行。该管道是免费提供的，没有限制其用于非商业目的，并且可以在完成简短的注册表45后从ENIGMA联盟成像协议网页（在“ENIGMA小脑体积管道”下）访问。
所有必需的软件都列在 材料表中，除了下面描述的协议外，下载管道时还可以获得详细的教程，包括现场演示。最后，提供了代表性的结果，来自Friedreich共济失调（FRDA）患者队列和年龄和性别匹配的健康对照组的管道实施，以及组级统计推断分析的建议。
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Protocol
注：本研究中使用的数据是莫纳什大学人类研究伦理委员会批准的项目（项目7810）的一部分。与会者提供了书面知情同意书。虽然管道可以在Mac，Windows或Linux操作系统上运行，但ACAPULCO，SUIT和QC管道已经在Linux（Ubuntu）和Mac（Catalina，Big Sur v11.0.1）操作系统上进行了明确的测试。
1. 模块 1： ACAPULCO （解剖学包裹）
- 数据采集
- 以1 mm 3或更低的分辨率收集整个大脑的3D T1 加权MRI图像。建议使用各向同性体素尺寸（通常为 1 mm x 1 mm x 1 mm）和 3-Telsa（或更大）扫描仪。请咨询其放射成像中心的成像专家，以设置和获取符合这些规范的数据。
注意：T2加权图像有时可用于体积分析;但是，此处介绍的管道仅依赖于 T1 加权数据，并且所使用的某些工具是此类数据所独有的。因此，不能使用 T2 加权图像。 - 对图像进行视觉质量评估，以排除大额小脑畸形（例如，大病变）或大量运动伪影，这些运动伪像无法识别主要小脑标志物（例如，主要解剖裂）。不要自动排除萎缩的脑膜，即使很大。
- 对于小组研究，还要考虑使用免费提供的标准化工具（如MRISTHC46）进行定量质量评估，以进一步识别有问题的数据。
- 使用 dcm2niix47 等工具将所有数据转换为 NIFTI-GZ 格式。
- 以1 mm 3或更低的分辨率收集整个大脑的3D T1 加权MRI图像。建议使用各向同性体素尺寸（通常为 1 mm x 1 mm x 1 mm）和 3-Telsa（或更大）扫描仪。请咨询其放射成像中心的成像专家，以设置和获取符合这些规范的数据。
- 建议的数据组织
- 获取 材料表中列出的所有必要软件。确保在运行管道之前安装了 Docker48 或 Singularity49、Matlab50 和SPM12 51。
注意：还提供了描述管道的大量书面和视频教程（请参阅 材料表）。 - 安装所有必要的软件后，在工作目录中创建文件夹，并将它们标记为“acapulco”，“suit”和“freesurfer”。从命令行使用 mkdir 命令执行此操作。
- 在“acapulco”目录中，创建一个 输出 文件夹。在 输出 文件夹中，为研究中的每个受试者创建一个目录，其中包含NIFTI-GZ格式的T1加权图像。
注意：建议在其他位置保留原始数据的副本。
- 获取 材料表中列出的所有必要软件。确保在运行管道之前安装了 Docker48 或 Singularity49、Matlab50 和SPM12 51。
- 使用ACAPULCO解剖小脑包裹术
- 转到 材料表 并下载运行 ACAPULCO 所需的相关脚本和容器（在 acapulco 管道文件下）。在“acapulco”目录中，放置（i）ACAPULCO Docker OR Singularity容器（分别acapulco_0.2.1.tar.gz“或”.sif“），（ii）QC_scripts存档的内容（3个文件：”QC_Master.R“，”QC_Plots.Rmd“和”QC_Image_Merge.Rmd“），以及（iii）”R.sif“（奇点） 或”calculate_icv.tar“（docker）文件。
- 打开终端，然后从命令行在单个映像上运行 ACAPULCO 容器（替换<<主题>>如下所示）。等待约 5 分钟以完成处理。
- 使用 Docker，键入命令：
docker load --input acapulco_0.2.1.tar.gz
docker run -v $PWD：$PWD -w $PWD -t --user $（id -u）：$（id -g） --rm acapulco：latest -i output/<>/< >.nii.gz -o output/< > - 使用奇点，键入命令：
奇点运行 --cleanenv -B $PWD：$PWD acapulco-0.2.1.sif -i output/<>/< >.nii.gz -o output/< >
- 使用 Docker，键入命令：
- 循环访问队列中的所有受试者/扫描。请参阅 材料表 ，获取用于下载管道的 ENIGMA 成像协议网站的链接（在 ENIGMA 小脑体积管道下）和教程手册，其中包含如何创建用于连续处理多个主题的 for-loop 的示例。
- 处理后，查找在特定于主题的文件夹中生成的以下文件：
- 识别“<主>_n4_mni_seg_post_inverse.nii.gz”：原始（主题空间）中的包裹小脑面罩。
- 识别“<主>_n4_mni_seg_post_volumes.csv”：阿卡普尔科产生的28个亚基中每个亚基的体积（以mm 3为单位）;
- 识别代表性图像（在“pics”目录中）：矢状，轴向和冠状。
- 统计异常值检测和质量控制 （QC）
- 从终端和“acapulco”目录中，确保QC_scripts的内容位于“acapulco”目录中。运行 QC 脚本：
- 使用 Docker，键入命令：
docker load calculate_icv.tar
docker run -v $PWD：$PWD -w $PWD --rm -it luhancheng/calculate_icv：latest Rscript
QC_Master.R输出/ - 使用奇点，键入命令：
奇点执行 -B $PWD：$PWD R.sif Rscript /path/to/QC_Master.R /path/to/acapulco/output
- 使用 Docker，键入命令：
- 从终端和“acapulco”目录中，确保QC_scripts的内容位于“acapulco”目录中。运行 QC 脚本：
- 检查由ACAPULCO生成的QC图像
注意：ACAPULCO 包裹图像的质量检查有一个 3 步流程。- 在Web浏览器中打开“QC_Images.html”，然后快速（每个受试者约10秒）滚动图像以识别明显的故障或系统性问题。记下失败或可疑的包裹图像的主题 ID，以便进行后续检查。
注意：有关小脑小脑神经解剖学的指南，请参阅 图 3 ;有关“良好”包裹、“细微误包裹”和“全局故障”包裹的示例，请参见下面代表性结果部分中的图 4、 图 5 和 图 6 。 - 打开“Plots_for_Outliers.html”以选中定量统计异常值的复选框图。查找位于箱形图的胡须上方或下方的异常值（高于或低于平均值的 2.698 s.d）。将鼠标悬停在数据点上以显示“使用者 ID”。在“异常值”文件的相关列中，标识由“1”表示的异常值.csv，并记下“异常值.csv”中最后一列中标识为每个主题的异常值的段总数。
- 手动检查具有一个或多个异常值的每个图像。关键：使用标准的NIFTI图像查看器（例如，FSLEyes或MRICron），将ACAPULCO蒙版叠加到原始T1w图像上，以逐片检查包裹的质量。
- 要使用FSLEyes从命令行生成详细的QC的覆盖，i）将目录更改为“acapulco”目录，ii）指定要查看的主题（替换 <主题>）：
subj= - 将以下代码复制/粘贴到终端（无需手动更改 {subj}，因为这是由上一行设置的：
t1_image=output/${subj}/${subj}.nii.gz
acapulco_image=output/${subj}/${subj}_n4_mni_seg_post_inverse.nii.gz
fsleyes ${t1_image} ${acapulco_image} --overlayType label --lut random_big --outline --outlineWidth 3 ${acapulco_image} --overlayType volume --alpha 50 --cmap random
注意：需要确定是否包括异常片段，即是否存在包裹错误，或者只是个体解剖结构中的正常变异性？每个包裹区域都是单独考虑的，因此可以为图像排除几个区域，而如果正确，可以保留其余区域。 -
是否需要从最终数据集中排除一个或多个宗地区域？
如果是（已确认异常值），则通过在该主题的“Cerebel_vols.csv”文件的相应单元格中将体积估计值替换为 NA ，将此宗地从分析中排除。 -
包裹错误是否会导致某些小脑被排除在面罩之外？
如果是（例如，如果面罩上缺少特定的小脑叶或出现“切断”），请立即将受试者排除在进一步的分析之外（即，不要继续对这些受试者运行SUIT模块）。
- 要使用FSLEyes从命令行生成详细的QC的覆盖，i）将目录更改为“acapulco”目录，ii）指定要查看的主题（替换 <主题>）：
- 在Web浏览器中打开“QC_Images.html”，然后快速（每个受试者约10秒）滚动图像以识别明显的故障或系统性问题。记下失败或可疑的包裹图像的主题 ID，以便进行后续检查。
2. 模块 2： SUIT 小脑优化体素形态测量
- 使用 SUIT 进行基于体素的形态测量分析
关键：该管道要求ACAPULCO模块已经运行，因为它依赖于生成特定于主题的小脑面罩来优化小脑的配准和归一化到SUIT模板。如果ACA普尔科生成的特定受试者面罩不包括整个小脑，则有必要从SUIT模块中排除。有关单独运行 SUIT 的说明，请参阅52。- 获取 材料表中列出的所有必要软件。确保 SPM12 文件夹和所有子文件夹都在 MATLAB 路径中。确保enigma_suit脚本保存在 “spm12/toolbox” 目录中，并添加到 MATLAB 路径中。要检查 MATLAB 路径，请在 MATLAB 命令窗口中键入 pathtool ，然后单击 使用子文件夹添加 以添加相关文件夹。
- 为一个或多个主题运行 SUIT 管道。等待 ~15-20 分钟（如果使用图形用户界面 [GUI]）和 ~5-7 分钟（如果从终端（bash/shell）运行）以完成处理。
- 要使用 GUI（主题将串行运行），请在 MATLAB 命令窗口中键入命令：
suit_enigma_all - 在第一个弹出窗口中，从“acapulco/output”目录中选择要包含在分析中的主题文件夹。单击窗口右侧的各个文件夹，或右键单击并 全选。按 完成。在第二个弹出窗口中，选择将写入分析的 SUIT 目录。
- 或者，从 MATLAB 命令行为单个主题调用函数，键入以下命令：
suit_enigma_all（'/path/to/acapulco/output/subjdir'，'/path/to/suitoutputdir'） - 或者，通过键入以下命令，从 MATLAB 外部的终端窗口为单个主题调用函数：
matlab -nodisplay -nosplash -r “suit_enigma_all（'/path/to/acapulco/output/subjdir'，'/path/to/suitoutputdir'）， exit”
- 要使用 GUI（主题将串行运行），请在 MATLAB 命令窗口中键入命令：
- 请参阅 材料表 ，获取用于下载管道的 ENIGMA 成像协议网站的链接（在 ENIGMA 小脑体积管道下）和教程手册，其中包含如何创建用于连续处理多个主题的 for-loop 的示例。
- 查找有关脚本的以下几点。
- 确保脚本将 N4 偏置校正、MNI 对齐（刚体）T1 图像和 ACAPULCO 小脑掩模复制到输出目录中。
- 确保脚本分割小脑的灰质和白质。
- 确保脚本使用 ACAPULCO 掩码更正包裹中的过度包含错误。
- 确保脚本 DARTEL 使用 Jacobian 调制将数据规范化并重新切片到 SUIT 空间中，以便每个体素的值与其原始体积成正比。
- 检查每个主题的文件夹中是否有以下最终输出：“wd<主>_seg1.nii”（灰质）和“wd<主>_seg2.nii”（白质）。
- 统计异常值检测和质量控制
- 目视检查归一化、调制图像 （wd*） 是否存在重大故障。在 MATLAB 中，键入以下命令：
spm_display_4D - 从套装子文件夹中手动选择“wd*seg1”图像，或导航到“suit”目录;在过滤器框中插入“^wd.*seg1”（无引号），然后按“ Rec ”按钮。按 完成。
- 滚动浏览图像以确保它们都对齐。参见 图7 ，了解来自健康对照组（A，B）和小脑严重萎缩个体（D）的正确归一化图像。
注意：在这个阶段，受试者之间的解剖结构非常相似（因为它们已被注册到同一模板中），并且体积差异是通过不同的体素强度编码的。主要的失败将是显而易见的，例如，空白图像，大面积的缺失组织，不寻常的强度梯度（即，明亮的体素全部位于顶部，深色体素全部位于底部）。应从后续步骤中排除这些映像。 - 检查异常值的空间协方差。在 MATLAB 中，键入以下命令：
check_spatial_cov- 按照上一步选择“wd*seg1”图像。出现提示时，选择以下选项： 属性缩放： 是;要共变的变量：否;切片（毫米）： - 48 ， 间隙： 1.
- 查看显示每个影像相对于样本中所有其他影像的平均空间协方差的箱线图。识别在 MATLAB 命令窗口中均值下方>2s.d. 的数据点。对于这些，请检查 SUIT 文件夹中的“
_n4_mni.nii.gz”图像是否存在伪影（运动、解剖异常）、图像质量问题或预处理错误。 - 如果图像质量和预处理是可以接受的，并且上一步中对调制图像的目视检查并不表示分割和归一化存在问题，请将这些数据保留在样本中。否则，请排除这些数据。
- 目视检查归一化、调制图像 （wd*） 是否存在重大故障。在 MATLAB 中，键入以下命令：
3. 模块 3（可选）：使用 FreeSurfer 估算颅内体积 （ICV）
注意：此模块将使用 FreeSurfer 管道来计算 ICV。如果同期群（任何版本）存在现有的自由冲浪者输出，则无需重新运行。
- 设置免费冲浪者
- 确保免费冲浪者已下载并安装53.转到材料 表 并下载相关脚本以运行此模块（在 ICV管道文件下）。使用 FreeSurfer 时，请设置以下变量：
导出FREESURFER_HOME =
source $FREESURFER_HOME/SetUpFreeSurfer.sh - 将 <路径> 替换为以下内容：
导出SUBJECTS_DIR=<路径>/谜/自由冲浪者
- 确保免费冲浪者已下载并安装53.转到材料 表 并下载相关脚本以运行此模块（在 ICV管道文件下）。使用 FreeSurfer 时，请设置以下变量：
- 运行自由冲浪者自动回复1
- 对于单个主题，从“freesurfer”目录（处理时间约20分钟）中，键入命令：
cd <路径>/谜/自由冲浪者
侦察所有 -i ../input/.nii.gz -s -autorecon1 - 有关如何创建用于连续处理多个主题的 for 循环的示例，请参阅教程手册。
- 对于单个主题，从“freesurfer”目录（处理时间约20分钟）中，键入命令：
- 智能网联汽车的计算
- 数据组织
- 在“freesurfer”目录中，放置（i）模块1中使用的Docker OR Singularity容器（分别为“calculate_icv.tar”或“R.sif”）和（ii）xfm2det脚本（参见 材料表）。然后，执行 git 克隆以克隆所需的 ICV 脚本：
git clone https://github.com/Characterisation-Virtual-Laboratory/calculate_icv
- 在“freesurfer”目录中，放置（i）模块1中使用的Docker OR Singularity容器（分别为“calculate_icv.tar”或“R.sif”）和（ii）xfm2det脚本（参见 材料表）。然后，执行 git 克隆以克隆所需的 ICV 脚本：
- 运行ICV提取（处理时间〜5分钟）
- 从“freesurfer”目录，使用奇点（'R.sif'）容器，键入：
singularity exec --cleanenv -B $PWD：$PWD R.sif calculate_icv/calculate_icv.py --freesurfer_dir=/path/to/freesurfer --acapulco_dir=/path/to/acapulco/QC/Cerebelvolsfile --output_csv_name=Cerebel_vols.csv calculate_icv - 从“freesurfer”目录，使用 Docker 容器，键入：
docker run -v $PWD：$PWD -w $PWD -rm -it luhancheng/calculate_icv：latest
calculate_icv/calculate_icv.py --freesurfer_dir=/path/to/Freesurfer --
acapulco_dir=/path/to/acapulco/QC/Cerebelvolsfile --output_csv_name=Cerebel_vols.csv
calculate_icv - 在没有容器的情况下运行脚本 - 请参阅 材料表 ，了解其他必需的软件和依赖项。从“免费冲浪者”目录中，键入：
./calculate_icv/ calculate_icv.py ---freesurfer_dir=/path/to/freesurfer --
acapulco_dir=/path/to/acapulco/QC/Cerebelvolsfile --
output_csv_name=Cerebel_vols.csv calculate_icv
注意：这将计算每个受试者的ICV，并在“Cerebel_vols.csv”文件的末尾附加一列ICV。
- 从“freesurfer”目录，使用奇点（'R.sif'）容器，键入：
- 数据组织
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Representative Results
小脑包裹术
小脑包裹面罩的质量控制：
以下示例演示了 ACAPULCO 包裹输出，并指导了有关 a） 包裹式掩模在单个级别的质量以及 b） 随后在统计分析中包含或排除特定小叶的决策。归根结底，包括或排除一个主题的决定是主观的;这里提供了来自各种健康和临床群体的“良好包裹”，“微妙的包裹错误”和“全球失败”的例子。
图4给出了“良好包裹”的例子，包括健康和严重萎缩的大脑。在图5中，描绘了单个小脑小脑叶的微妙的上囊和包涵体不足。这些是最常见的包裹误差类型，在定量QC协议中可能无法检测为统计异常值。这些类型的错误通常需要排除受影响的单个小叶，而包裹小脑的其余部分不受影响并且可以保留。相反，如图 6 所示的“全局故障”需要完全排除该主题。
统计异常值检测：
为了说明管道，ACAPULCO对31名FRDA患者（平均年龄= 36.5岁;SD = 13.0岁，14名女性）和37名年龄和性别匹配的健康对照（HC）（平均年龄= 37.1岁;SD= 12.8岁，17名女性），如前所述55。在整个样本中，检测到18个小叶作为统计异常值（占总样本的<1%）。在对图像进行详细的QC后，通过从组级小脑体积文件（即“Cerebel_vols.csv”文件）中删除相应受试者的单个小叶体积，从组级分析中移除17个异常小叶。剩余的异常值被认为不是分割误差，而是由于个体小脑解剖结构的变异性，因此保留在分析中。还有两次全球包裹失败（1名FRDA患者）。所有小脑叶的基本排斥率为1.5%（即整体包裹失败）。 表 1显示了28种解剖学投资回报率中每种的排除率。左小叶IX和右小叶Crus I的排除率最高。
集团层面的统计分析：
共纳入组水平分析66名受试者（30名FRDA患者）。进行双尾曼-惠特尼独立样本测试，以测试FRDA和HC之间小脑小叶体积的显着差异。结果显示，FRDA与HC相比，髓质中的白质显着减少（p <0.05，Bonferroni校正了28个比较）。组间没有其他显著差异。参见 补充表S1，了解样品中所有28个小脑亚基的体积。
基于小脑体素的形态测量分析（SUIT）
质量管理：
图7显示了对齐良好的图像示例以及健康对照组和临床组（包括FRDA和脊髓小脑共济失调病）的排除示例。对上述样本中的64名受试者（28名FRDA;36名HC）进行了SUIT分析，之后由于小脑面罩中整个小脑覆盖不完全而排除了另外两名受试者。
在测试样本中所有归一化图像相对于彼此的空间协方差后，根据两个扫描与样本其余部分的平均空间协方差，将两个扫描检测为统计异常值（图8）。然而，对原始和归一化图像的目视检查表明，尽管这些人具有一些独特的神经解剖学，但两幅图像中都没有明显的伪影，并且处理步骤正常完成。因此，这两个主题都保留在分析中。
集团层面的统计分析：
使用全宽为3 mm的半最大值高斯核（FWHM）对图像进行平滑处理。在SnPM中进行非参数排列测试，以测试小脑灰质体积的显着组间差异。为此，运行了 5，000 个排列，聚类形成阈值为 p < 0.001。使用SUIT灰质图集明确遮盖图像，以限制对灰质区域的推断。为了校正头部大小，在模型中输入颅内体积作为协变量。在 p <0.05处对组结果进行最终推断，并纠正了家族误差（FWE）聚类水平。
与HC相比，FRDA在双侧前叶I-V中显示出灰质体积显着减少（左：x= -10，y= -46，z= -26;T= 5.61;Ke= 754;右： x= 10， y= -38， z= -21;T= 6.83;Ke= 569）;在内侧后叶区域，包括Vermis VI，双侧延伸至小叶VI（x= 3，y= -65，z= -20;T= 7.25），和 Vermis IX 双侧延伸至小叶 IX （x= 3， y= -65， z= -20;T= 6.46;Ke= 3974; 图 9）。
图1：人类小脑 （A）小脑及其主要裂隙，肺叶和小叶的扁平表示。红色 = 前叶 （小叶 I-V）;乳膏=后叶（小叶IV-IX）;紫色=絮状硬核叶。小脑可分为中线“虱”区和侧线“半球”区。所有小叶都在蚯和半球中被识别出来。在小叶VII中，蛀虫中的VIIAf在半球中扩展为Crus I，小叶VIAt在蛀虫处成为西半球的Crus II，小叶VIIB在蚯和半球中都保留了其标签。（B）顶部：小脑平面图，以不同颜色显示小脑的解剖亚基。底部：小脑的后视图。这个数字是根据 56和 57改编的。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：管道示意图。 需要高分辨率 T1 MPRAGE 图像。有三个模块：ACAPULCO，SUIT和ICV。管道是完全自动化的（除了输出QC所需的手动干预），以Docker和Singularity容器格式提供，并且每个主题从开始到结束大约需要20分钟。 请点击此处查看此图的大图。
图3：ACAPULCO包裹显示 28 个解剖亚基中的每一个。 这个数字是根据36改编而来的。缩写：CM = 髓质语料库;Ver = vermis;R/L = 右/左。 请点击此处查看此图的大图。
图4： “良好” 小脑包裹的例子。 显示矢状（x = 0）和冠状（y = -57）切片。（一、二）矢状面膜和冠状切片显示来自两个健康小脑的包裹面罩。该算法已正确定位了单个亚基边界，并且没有将横窦过度包含在Crus I.（C）SCA2患者严重萎缩的小脑的标记和定量中。在这里，萎缩沿着小脑的整个范围是明显的，沟很宽，并且有很多缺失的组织。后叶的脉管系统轻微过度覆盖，在右侧更明显（黄色箭头）。除了这种过度包容之外，ACAPULCO还运作良好。缩写：CM = 髓质语料库;Ver = vermis;L/R = 左/右。 请点击此处查看此图的大图。
图5：小脑 “错误包裹”的例子。' （A） 矢状切片 （x= 0） 和冠状切片 （y = -57），显示 FRDA 患者出现包裹错误。该算法在中线效果不佳，Crus I和II（红色箭头）的欠包含沿着后范围很明显。这些小叶将被排除在随后的组水平分析之外。（B）矢状切片（x = 8），冠状切片（y = -47）显示健康小脑的包裹错误。该算法完全错过了左小叶VIIB（红色箭头）。该小叶将从随后的组水平分析中排除。（C）矢状切片（x= -24）和冠状切片（y= -47），显示健康小脑包裹错误。存在一些小脑萎缩，并且包括Crus I（红色箭头）不足。缩写：FRDA = Friedreich ataxia;CM = 髓质体;Ver = vermis;L/R = 左/右。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：小脑包裹的“全局故障”示例。（A） 矢状切片 （x= 0） 和冠状切片 （y= -57） 显示包裹失败。在这里，小脑只是部分分割，枕叶的一部分被错误地标记为小脑。这些类型的故障可能是由于原始图像的标题有问题，这将影响图像到世界坐标的ACAPURCO仿射转换以及随后的小脑定位。（B）矢状切片（x = 0）和冠状切片（x = -57），显示FRDA患者包裹失败。在这里，CM已经完全被错误地分割了。该算法在大脑外部的头部后部（红色椭圆形）标记了CM。白质的边界尚未被捕获，并被错误地标记为灰质，特别是影响左小叶VIIIb和IX。左小叶X也被遗漏了（日冕片上的红色箭头）。这些例子需要立即从ACAPULCO和SUIT分析的组级分析中排除。缩写：CM = 髓质语料库;Ver = vermis;L/R = 左/右。请点击此处查看此图的大图。
图7：基于体素的扭曲和调制形态图。 （A，B）来自两个HC的对齐良好的小脑灰质。（C）来自HC的小脑，被检测为统计异常值，但在分析中保留。（D）FRDA患者小脑萎缩。小脑已正确翘曲到模板;因此，这不值得排除在外。（E） 排除。从图像的顶部到底部有一个渐变，反映了处理中的错误。（F）来源不明的图像右下角的超智能平面伪影需要排除。（G） SCA2患者小脑严重萎缩的一个例子。小脑已正确翘曲到模板;然而，有很多缺失的组织，导致低对比度。这不会是一种排除。（H） 掩蔽不良，需要排除的例子。缩写：VBM = 基于体素的形态测量;HC = 健康控制;FRDA = 弗里德赖希共济失调;SCA2 = 脊髓小脑共济失调 2. 请点击此处查看此图的大图。
图 8：基于 SUIT 体素的形态测量图的空间协方差。 箱形图，用于说明基于体素的形态测量图的空间协方差，适用于 64 （28 FRDA） 受试者的队列。空间协方差是衡量每个图像相对于样本中其他每个图像的对齐程度。数据紧密聚类在一起，平均空间协方差相关性约为 0.95。在这里，检测到两个异常值（1 FRDA，1 HC），因为平均值以下>2个SD。缩写：FRDA = Friedreich ataxia;HC = 健康控制;SD = 标准偏差;cont = 控制。 请点击此处查看此图的大图。
图 9.基于体素的小脑灰质形态测量分析的组间结果。 （A）矢状面，（B）日冕，和（C）体素水平统计图的盐图表示，在FRDA与对照组的个体中，控制ICV。仅显示存活 p < 0.05 FWE 聚类级别校正的体素。颜色条表示 T 统计量。缩写：FRDA = Friedreich ataxia;ICV = 颅内容积;FWE = 家庭明智的错误。 请点击此处查看此图的大图。
| 小叶 | 已排除 % |
| 厘米 | 1.5 |
| 左克鲁斯 I | 2.9 |
| 左克鲁斯二世 | 2.9 |
| 左一三 | 2.9 |
| 左四 | 1.5 |
| 左九 | 4.51 |
| 左 V | 2.9 |
| 左六 | 1.5 |
| 左 VIIB | 1.5 |
| 左 VIIIA | 1.5 |
| 左 VIIIB | 2.9 |
| 左 X | 2.9 |
| 右克鲁斯 I | 6.02 |
| 右克鲁斯 II | 2.9 |
| 右一 三 | 2.9 |
| 右四 | 1.5 |
| 右九 | 2.9 |
| 右五 | 1.5 |
| 右六 | 1.5 |
| 右维贝 | 1.5 |
| 右 VIIIA | 2.9 |
| 右 VIIIB | 1.5 |
| 右 X | 1.5 |
| Vermis IX | 1.5 |
| 维尔米斯六世 | 2.9 |
| 维尔米斯七世 | 1.5 |
| 维尔米斯八世 | 1.5 |
| 维尔米斯 X | 1.5 |
表1：来自ACAPULCO的小脑解剖小叶和31名FRDA患者和37个HC样本的排除率（%）。HC = 健康的对照组。
补充表 S1：Friedreich 共济失调和健康对照个体中 28 个小脑解剖小叶的体积（mm 3）。 请单击此处下载此表。
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Discussion
小脑对广泛的人类运动3，认知58，情感10和语言7，59功能至关重要，并且与许多神经和精神疾病有关。用于量化区域小脑体积的标准化且易于实施的方法的可用性将有助于越来越详细的“全脑”结构功能映射，完整的疾病建模以及改善定义和跟踪小脑对脑疾病的贡献的机会。这里描述的这种标准化管道结合了最先进的方法，用于自动小脑包裹和更细粒度的小脑灰质形态测量的空间分析在健康和疾病中。
这里介绍的使用ACAPULCO的横截面小脑包裹分析结果表明，患有FRDA（与HC）的人的白质体积显着减少。这些发现支持了先前的FRDA研究，这些研究始终显示FRDA中早期，稳健和进行性的白质体积损失，特别是在齿状核中。此外，上小脑和下小脑蒂以及齿状核进行性神经变性的模式和程度已被证明是FRDA44发病年龄的一个因素。SUIT分析的结果揭示了其他发现。具体而言，在对应于双侧小叶I-IV和右V的前叶区域的FRDA（与HC相比）中存在显着的体素水平体积损失，延伸至小叶VI。此外，SUIT分析显示，内侧后叶区域（包括小叶IX，X和Vermis）的FRDA（与HC相比）的体积损失显着。这种组间差异的模式与先前在同一队列FRDA患者中发表的工作相当，使用全脑VBM方法55。
定义神经系统和精神疾病中的小脑异常是具有转化影响的高度优先研究领域。追踪和治疗神经系统疾病（特别是那些小脑是神经变性主要部位的神经系统疾病）是小脑受累的完整生物学特征的发展。本文介绍的管道允许个体小脑小叶灰质形态测量与临床测量之间的关系，这些测量被用作探索疾病临床终点的“金标准”。这样的研究可以产生重大的转化影响。例如，在罕见的小脑疾病领域，识别一个亚组患者小脑灰质萎缩的特定特征，该特征映射到或预测临床症状，这将对指导临床实践产生影响。SUIT模块的包含进一步允许解决有趣的研究问题，例如小脑的结构 - 功能映射或小脑60的功能梯度分析。
组级统计分析的一般建议
ACAPULCO：每个受试者的每个小脑小叶（以3毫米为单位）的体积记录在 Cerebel_vols.csv中。在对群体水平效应进行统计推断期间，应控制颅内体积（ICV;也记录在 Cerebel_vols.csv中），以考虑头部大小的变异性。应校正 α 显著性阈值，以考虑跨多个小叶的推断。
套装：灰质小脑VBM可以使用标准MRI处理软件（如SPM或FSL）在wd<主题>seg1.nii图像上进行。请参阅 CAT12 手册，了解使用 SPM1254 的 VBM 的精彩介绍。应控制ICV，以考虑头部尺寸的变化。
对于小脑中的 VBM，通常建议使用全宽不超过 3 mm 的半最大值 （FWHM） 的高斯空间平滑核。必须应用适当的统计校正来考虑体素之间的多重比较。通常，建议使用非参数方法（例如，SnPM或FSL-Randomise）。
使用ACAPULCO成功包裹小脑的最关键步骤是在处理前和处理后对T1图像进行一般质量检查。强烈建议用户检查对比度不好的图像（例如，图像上的梯度不一致）以及头部的严重倾斜和运动伪像，所有这些都会影响算法的性能。此外，虽然ACAPULCO算法已经在萎缩的小脑上进行了训练，但它还没有在病变数据上进行训练。预计大脑皮层中的病变预计不会影响算法的性能和随后的包裹准确性;然而，小脑的大梗死可能会产生包裹错误。对小脑面罩进行质量检查后处理至关重要。轻微的包裹错误（例如，小脑小脑小脑的轻微下计和过度内含）有时不被检测为统计异常值;相反，尽管存在明显的包裹错误，但如果数据在正常范围内，则可能会发生不正确的非异常值实例。如果受试者被确定为异常值，则必须逐片对小脑面罩进行后续的详细质量检查，以指导是否包括或排除该受试者的小叶的决策。运行 SUIT 管道（模块 2）时的另一个关键步骤是，它需要 ACAPULCO 模块已经运行。具体而言，SUIT要求在ACAPULCO中生产的小脑面罩进行小脑分离和分割。重要的是要对小脑面罩进行质量检查，以确保小脑完全覆盖。
该协议存在一些限制。首先，虽然ACAPURCO在小脑灰质包裹方面实现了最先进的精度，但它并没有针对白质包裹进行优化;髓质体覆盖了白质的主体，但不能提供所有白质的量度。其次，用于在ACAPULCO中定位和分割小脑的卷积神经网络不能很好地推广到具有不同对比度的图像或未在训练中使用的图像。例如，由于在训练中仅使用3T图像，因此使用在1.5 T扫描仪上获取的图像的包裹质量通常不如3T图像;此外，没有关于对这些图像进行的基本事实的统计数字。最后，通过提供ICV的估计值来控制头部大小对小脑体积估计的混杂效应的管道控制，该估计可以作为在组水平统计分析中没有兴趣的回归量。然而，理想的方法是在进行QC之前在个体水平上计算ICV校正的小脑体积，这样检测到的异常值反映了真正的包裹误差，而不是受试者神经解剖学中的自然变异性（例如，具有大头）。
总之，我们提出了一种用于检查小脑灰质形态测量的标准化管道，该管道对一系列神经系统疾病具有广泛的适用性。该管道的建立是为了允许进行大型，多站点研究和“大型分析”，并公开供研究小组使用，以促进整个领域的可靠性和可重复性。最终，该管道提供了一种强大的方法学方法，用于进一步表征和跟踪神经系统疾病进展的小脑结构变化。目前正在开发一条纵向管道。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
本手稿中介绍的工作由澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）创意补助金资助：APP1184403。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACAPULCO pipeline files | 0.2.1 | http://enigma.ini.usc.edu/protocols/imaging-protocols/ | Please make sure to use acapulco version 0.2.1 |
| Docker for Mac | https://docs.docker.com/desktop/mac/install/ | macOS must be version 10.14 or newer Docker requires sudo priviledges Docker imposes a memory (RAM) constraint on Mac OS. To increase the RAM, open Docker Desktop, go to Preferences and click on resources. Increase the Memory to the maximum |
|
| Docker for Windows | https://docs.docker.com/docker-for-windows/install/ | ||
| ENIGMA SUIT scripts | http://enigma.ini.usc.edu/protocols/imaging-protocols/ | ||
| FreeSurfer | 7 | https://surfer.nmr.mgh.harvard.edu/fswiki/DownloadAndInstall | Following variables need to be set everytime you work with Freesurfer: export FREESURFER_HOME=  freesurfer _installation_directory source $FREESURFER_HOME/SetUpFreeSurfer.sh |
| export SUBJECTS_DIR=path/enigma/Freesurfer |
|||
| FSL (for FSLeyes). Optional | 6 | https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation | |
| ICV pipeline files | http://enigma.ini.usc.edu/protocols/imaging-protocols/ | ICV pipeline can be run in two ways: 1) with docker/singularity. You will not require additionl software; 2) without docker/singularity- this involves running the ICV script (calculate_icv.py) manually. You will require the following additional software: Python version =3.5Python module pandas Python module fire Python module tabulate Python module Colorama |
|
| https://github.com/Characterisation-Virtual-Laboratory/calculate_icv | |||
| MATLAB* | 2019 or newer | https://au.mathworks.com/ | An academic license is required |
| Singularity | 3.7 or newer | https://www.sylabs.io/docs/ | Prefered for high performance computing (HPC) clusters |
| SPM | 12 | http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm12/ | Make sure spm12 and all subfolders are in your MATLAB path |
| SUIT Toolbox | 3.4 | http://www.diedrichsenlab.org/imaging/suit_download.htm | Make sure you place SUIT toolbox in spm12/toolbox directory |
| Troubleshooting manual and segmentation output examples | http://enigma.ini.usc.edu/protocols/imaging-protocols/ | ||
| Tutorial manual and video | http://enigma.ini.usc.edu/protocols/imaging-protocols/ | Manual and accompanying live demonstration provide detailed step-by-step instructions on how to run the pipeline from start to finish. | |
| *Not freely available; an academic license is required | |||
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