Summary
يزيد إجراء ما بعد التثبيت المعدل من تباين جزيئات الجليكوجين في الأنسجة. توفر هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة يصف كيفية التعامل مع الأنسجة وإجراء التصوير واستخدام الأساليب المجسمة للحصول على بيانات كمية وغير متحيزة حول توزيع الجليكوجين تحت الخلوي الخاص بنوع الألياف في العضلات الهيكلية.
Abstract
باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل ، يمكن الحصول على صور عالية الدقة لعينات ثابتة تحتوي على ألياف عضلية فردية. وهذا يتيح تحديد كميات الجوانب فوق الهيكلية مثل كسور الحجم ، ونسب المساحة السطحية إلى الحجم ، و morphometry ، ومواقع الاتصال المادي للهياكل تحت الخلوية المختلفة. في 1970s ، تم تطوير بروتوكول لتعزيز تلطيخ الجليكوجين في الخلايا ومهد الطريق لسلسلة من الدراسات حول التوطين تحت الخلوي لحجم جسيمات الجليكوجين والجليكوجين باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. في حين أن معظم التحليلات تفسر الجليكوجين كما لو كان موزعا بشكل متجانس داخل ألياف العضلات ، مما يوفر قيمة واحدة فقط (على سبيل المثال ، متوسط التركيز) ، فقد كشف المجهر الإلكتروني الناقل أن الجليكوجين يتم تخزينه كجزيئات جليكوجين منفصلة تقع في مقصورات دون خلوية متميزة. هنا ، يتم وصف البروتوكول خطوة بخطوة من جمع الأنسجة إلى التحديد الكمي للجزء الحجمي وقطر الجسيمات من الجليكوجين في المقصورات تحت الخلوية المميزة لألياف العضلات الهيكلية الفردية. اعتبارات حول كيفية 1) جمع عينات الأنسجة ووصمها ، 2) إجراء تحليلات الصور ومعالجة البيانات ، 3) تقييم دقة التقديرات ، 4) التمييز بين أنواع الألياف العضلية ، و 5) يتم تضمين المزالق والقيود المنهجية.
Introduction
تتكون جزيئات الجليكوجين من بوليمرات متفرعة من الجلوكوز ومختلف البروتينات المرتبطة بها1 وتشكل وقودا مهما خلال المتطلبات الأيضية العالية2. على الرغم من عدم الاعتراف بها على نطاق واسع، إلا أن جزيئات الجليكوجين تشكل أيضا وقودا محليا، حيث تستخدم بعض العمليات دون الخلوية الجليكوجين بشكل تفضيلي على الرغم من توافر أنواع وقود أخرى طويلة الأمد مثل جلوكوز البلازما والأحماض الدهنية3,4.
نوقشت أهمية تخزين الجليكوجين كوقود موضعي محدد تحت الخلية في العديد من المراجعات5,6 استنادا أساسا إلى بعض الوثائق المبكرة للتوزيع تحت الخلوي للجليكوجين عن طريق المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)7,8. استخدمت الدراسات الأولى بروتوكولات مختلفة لزيادة تباين الجليكوجين من تقنيات التلطيخ الكيميائي النسيجي إلى البقع السلبية والإيجابية9,10. كان التطور المنهجي المهم هو بروتوكول ما بعد التثبيت المكرر مع الأوزميوم المخفض بفيروسيانيد البوتاسيوم 11،12،13،14 ، مما أدى إلى تحسين كبير في تباين جزيئات الجليكوجين. لم يستخدم هذا البروتوكول المكرر في بعض الأعمال الرائدة حول استنفاد الجليكوجين الناجم عن التمرين15 ولكن أعيد تقديمه من قبل غراهام وزملاؤه16،17.
استنادا إلى الصور ذات الأبعاد 2 ، غالبا ما يوصف التوزيع تحت الخلوي للجليكوجين بأنه جزيئات جليكوجين تقع في ثلاثة تجمعات: تحت القصبة (تحت الغشاء السطحي مباشرة) ، intermyofibrillar (بين myofibrils) ، أو intramyofibrillar (داخل myofibrils). ومع ذلك، يمكن أيضا وصف جزيئات الجليكوجين بأنها مرتبطة مثلا بالشبكة الساركوبلازمية7 أو النوى18. بالإضافة إلى التوزيع تحت الخلوي ، فإن ميزة محتوى الجليكوجين المقدر من TEM هي أيضا أنه يمكن إجراء القياس الكمي على مستوى الألياف المفردة. وهذا يسمح بالتحقيق في التباين من الألياف إلى الألياف والتحليلات المرتبطة بأنواع الألياف والمكونات الخلوية مثل الميتوكوندريا وقطرات الدهون.
هنا ، يتم وصف بروتوكول المحتوى الحجمي الخاص بنوع الألياف المقدر من TEM للمجمعات تحت الخلوية الثلاثة الشائعة من الجليكوجين (تحت الساركوليمال ، intermyofibrillar ، و intramyofibrillar) في ألياف العضلات الهيكلية. تم تطبيق هذه الطريقة على عضلات الهيكل العظمي من البشر19 والجرذان20 والفئران21. وكذلك الطيور والأسماك22 ؛ والخلايا العضلية القلبية من الفئران23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول الحالي باستخدام عينات العضلات الهيكلية البشرية الخزعة من قبل اللجان الإقليمية المعنية بأخلاقيات البحوث الصحية لجنوب الدنمارك (S-20170198). تم الحصول على خزعات العضلات من خلال شق في الجلد من العضلة الجانبية الواسعة باستخدام إبرة Bergström مع الشفط بعد إعطاء التخدير الموضعي تحت الجلد (1-3 مل من ليدوكائين 2٪ لكل شق). إذا تم استخدام عضلات الفئران الكاملة المعزولة ، التضحية بالحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم قبل الحصول على خزعات العضلات ، وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان في مستشفى جامعة أودنسه ، الدنمارك.
1. التثبيت الأساسي ، ما بعد التثبيت ، التضمين ، التقسيم ، والتباين
- قم بإعداد 1.6 مل من محلول التثبيت الأولي (2.5٪ glutaraldehyde في 0.1 M مخزن مؤقت لكاكوديلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.3)) في أنبوب طرد مركزي دقيق 2 مل. قم بتخزينه في 5 درجات مئوية لمدة أقصاها 14 يوما.
- من خزعة العضلات أو العضلات بأكملها ، اعزل عينة صغيرة ، يبلغ قطرها الأقصى 1 مم في أي اتجاه وهي أطول قليلا في اتجاه الألياف الطولية من المقطع العرضي (لأغراض التوجيه).
- ضع العينة في الأنبوب الذي يحتوي على محلول التثبيت الأولي البارد. تخزينها في 5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- اغسل العينة أربع مرات (15 دقيقة بين كل غسلة) في مخزن مؤقت كاكوديلات الصوديوم 0.1 متر (الرقم الهيدروجيني 7.3). باستخدام ماصات النقل ، قم بإزالة المخزن المؤقت المستخدم من الأنبوب تاركا العينة دون مساس ، ثم أضف المخزن المؤقت الطازج.
ملاحظة: بعد الغسيل النهائي، يمكن تخزين العينة في مخزن كاكوديليت الصوديوم المخزن المؤقت 0.1 M عند 5 درجات مئوية لعدة أشهر11. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - Postfix مع 1٪ من رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) و 1.5٪ من فيروسيانيد البوتاسيوم (K4Fe (CN) 6) في مخزن مؤقت كاكوديلات الصوديوم 0.1 M (الرقم الهيدروجيني 7.3) لمدة 120 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يعد استخدام فيروسيانيد البوتاسيوم بنسبة 1.5٪ (K4Fe(CN)6) ضروريا للحصول على تباين مثالي لجزيئات الجليكوجين11،12،13. - شطف مرتين في الماء المقطر المزدوج في درجة حرارة الغرفة (RT).
- الجفاف عن طريق الغمر في سلسلة متدرجة من الكحول (الإيثانول) في RT باستخدام التركيزات التالية: 70٪ (10 دقائق) ، 70٪ (10 دقائق) ، 95٪ (10 دقائق) ، 100٪ (10 دقائق) ، و 100٪ (10 دقائق).
ملاحظة: في كل خطوة ، يتم غمر العينة في الإيثانول ، والذي يتم إزالته لاحقا جزئيا فقط لتجنب تجفيف العينة. أخيرا ، يتم التخلص من الإيثانول المتبقي. - تسلل مع مخاليط متدرجة من أكسيد البروبيلين والراتنج الإيبوسيدي في RT باستخدام نسب الحجم التالية (أكسيد البروبيلين / راتنج الإيبوسيديك): 1/0 (10 دقائق) ، 1/0 (10 دقائق) ، 3/1 (45 دقيقة) ، 1/1 (45 دقيقة) ، 1/3 (45 دقيقة) ، 0/1 (بين عشية وضحاها). في اليوم التالي ، قم بتضمين العينات في راتنج epossidic طازج بنسبة 100٪ في قوالب وبلمرة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: هذه الطريقة المقدرة وفقا للبروتوكولات السابقة11،12. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. - قطع أقسام رقيقة للغاية (60-70 نانومتر) من الألياف الموجهة طوليا وجمعها على شبكات نحاسية من ثقب واحد على النحو التالي.
- قم بتركيب كتلة عينة على حامل ultramicrotome.
- قم بتقليم الكتلة على السطح باستخدام شفرة حلاقة للوصول إلى مستوى الأنسجة.
- قم بتركيب سكين الماس (ultracut 45) أمام العينة ومحاذاة سطح العينة بالتوازي مع السكين.
- قم بإنتاج مقطع شبه رفيع (1 ميكرومتر) بسكين الماس للتحقق من اتجاه العينة. قم بتلطيخ القسم شبه الرقيق باللون الأزرق تولويدين للمراقبة باستخدام المجهر الضوئي.
- قم بتقليم الكتلة بشكل أكبر لتقليل مساحة الاهتمام من أجل الحصول على أقسام رقيقة للغاية مناسبة.
- قطع أقسام رقيقة للغاية (60-70 نانومتر) بسكين الماس الثاني (ultracut 45).
- اجمع 1-2 أقسام على شبكات نحاسية ذات ثقب واحد باستخدام حلقة مثالية.
ملاحظة: تحتوي الشبكة النحاسية ذات الثقب الواحد على ثقب واحد في الوسط مع غشاء دعم Formvar.
- تباين الأقسام مع خلات اليورانيل وسيترات الرصاص عن طريق غمر الشبكات المذكورة أعلاه في محلول خلات اليورانيل (0.5٪ في الماء المقطر المزدوج) لمدة 20 دقيقة ، ثم في محلول سترات الرصاص (1٪ في الماء المقطر المزدوج) لمدة 15 دقيقة. اغسل الشبكات في ماء مقطر مزدوج بين اللطختين وبعدهما.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
2. التصوير
- قم بتشغيل المجهر الإلكتروني الناقل (الذي يعمل بجهد متسارع يبلغ 80 كيلو فولت) والكمبيوتر وبرنامج تسجيل الصور. سجل الصور الرقمية باستخدام كاميرا CCD رقمية بطيئة المسح الضوئي 2 k × 2 k وبرامج التصوير المرتبطة بها.
- أدخل الشبكة ذات الأقسام المتعددة في مرحلة المجهر.
- قم بفحص الشبكة في البداية عند تكبير منخفض (على سبيل المثال ، x100) لتحديد جودة الأقسام (أي الثقوب في الغشاء الداعم ، والحطام ، وما إلى ذلك) واختيار أفضل الأقسام جودة. عند التكبير المنخفض ، حدد اتجاه ألياف العضلات.
- بعد ذلك ، قم بزيادة التكبير باستخدام الشعاع المتمركز على ألياف طرفية في القسم. ركز الصورة عند التكبير فوق 30 ك لضمان الحصول على تفاصيل دقيقة كافية في الصورة، مسترشدا بتحويل فورييه السريع في الوقت الفعلي، إن وجد. أخيرا ، قم بتسجيل الصور مع وقت التعرض 1 ثانية عند التكبير المطلوب.
- احصل على ما مجموعه 24 صورة لألياف مختارة عشوائيا ، أي 12 صورة لفضاء myofibrillar و 12 صورة للفضاء تحت الساركولمي ، عند تكبير يتراوح بين 10 k و 40 k. تأكد من توزيع الصور عبر طول وعرض الألياف بترتيب عشوائي ولكن منهجي للحصول على نتائج غير متحيزة (الشكل 1A).
ملاحظة: يعتمد التكبير الأمثل على دقة الكاميرا المتوفرة وحجم الصور المجهرية. الهدف هو تحقيق دقة نهائية ، حيث يمكن قياس أقطار جسيمات الجليكوجين في غضون خطوات 1 نانومتر ، وتضمين مساحة إجمالية لمنطقة myofibrillar لا تقل عن 70 ميكرومتر 2 وطول إجمالي للألياف لا يقل عن 25 ميكرومتر موزعة على 12 صورة من الفضاء myofibrillar و 12 صورة للفضاء تحت الساركوليمال لكل ألياف ، على التوالي. من المرجح أن تعطي الصور ال 24 لكل ألياف دقة (معامل خطأ) للمحتوى الحجمي لتجمعات مختلفة من الجليكوجين بين 0.1 و 0.2 في الألياف الفردية من العضلات الهيكلية للإنسان والجرذان والفئران20،21،24 (الشكل 2E). - كرر الخطوتين 2.4 و2.5 حتى يتم تصوير ما مجموعه 6-10 ألياف. إذا لزم الأمر، قم بقص أقسام إضافية (مفصولة بما لا يقل عن 150 ميكرومتر لتجنب تداخل الألياف المصورة بالفعل) وكرر الخطوات من 1.9 إلى 2.5.
3. تحليل الصور
- استيراد الصور إلى ImageJ بالنقر فوق ملف > فتح.
- قم بتعيين مقياس عمومي لمطابقة الحجم الأصلي للصورة بالنقر فوق تحليل > تعيين مقياس.
- قم بالتكبير بنسبة 100٪ من خلال النقر على الصورة > التكبير > الإدخال.
- قم بقياس سمك قرص Z واحد لكل صورة من مساحة myofibrillar (12 لكل ألياف) باستخدام أداة الخط المستقيم من قائمة الأدوات (الشكل 1D). احسب متوسط سمك القرص Z لكل من الألياف 6-10.
- حدد 2-3 ألياف مع أسمك متوسط قرص Z كألياف من النوع 1 و 2-3 ألياف مع أنحف متوسط قرص Z كألياف من النوع 2. تجاهل الألياف الوسيطة 2-4 لمزيد من التحليلات (الشكل 1E).
ملاحظة: يتم تكرار الخطوات التالية لكل من 4-6 ألياف من العينة. يتم تقدير كسور حجم الجليكوجين عن طريق حساب النقاط كما هو موضح في مكان آخر25,26. يتم اختيار حجم الشبكات للحصول على دقة عالية مرضية للتقديرات. غالبا ما يتم الحصول على هذا عن طريق تحقيق 250 ضربة ، والتي تملي بعد ذلك العدد الإجمالي للنقاط المطلوبة ، وبالتالي المساحة لكل نقطة. - استخدم أداة الخط المجزأ لقياس طول العضلة العضلية الخارجية المرئية أسفل المنطقة تحت الساركوليمالية مباشرة (الشكل 2A).
ملاحظة: يستخدم هذا الطول للتعبير عن الجليكوجين تحت الساركوليمال لكل مساحة سطح (أي طول الميوفيبريل الخارجي مضروبا في سمك المقطع (60 نانومتر)؛ انظر الخطوة 4.5). لذلك ، يتم تضمين المنطقة تحت الساركوليمالية فقط ، والتي يمثلها هذا الطول ، في التحليل. - قم بإدراج شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 32,400 nm2. احسب عدد الضربات ضمن الطول المتاح في 12 صورة تحت الساركوليمال، حيث يضرب الصليب الجليكوجين تحت الساركوليمال (الشكل 2A). يتم تعريف الضربة على أنها جسيم جليكوجين موجود في الزاوية العلوية اليمنى من الصليب.
- قم بإدراج شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 160000 نانومتر مربع 2. احسب عدد الزيارات في 12 صورة من صور myofibrillar ، حيث يضرب الصليب الفضاء داخل myofibrillar (الشكل 2B).
- أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 3600 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات في صور myofibrillar ال 12 ، حيث يضرب الصليب الجليكوجين داخل myofibrillar (الشكل 2C).
- قم بإدراج شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 32,400 nm2. احسب عدد الزيارات في 12 صورة myofibrillar ، حيث يضرب الصليب الجليكوجين intermyofibrillar (الشكل 2D).
- باستخدام أداة الخط المستقيم ، قم بقياس قطر خمسة جزيئات جليكوجين مختارة عشوائيا لكل تجمع لكل صورة من الصور ال 12 للحصول على متوسط 60 جسيما لكل تجمع لكل ألياف.
ملاحظة: يغطي متوسط 60 جسيما إلى حد كبير التباين داخل الألياف (الشكل 2F).
4. الحسابات
- احسب كسر المساحة الظاهري (AA) للفضاء داخل العضلة العضلية لكل فضاء myofibrillar كمجموع جميع الضربات مقسوما على مجموع جميع النقاط من الصور ال 12 (من الخطوة 3.8).
- احسب جزء المساحة الظاهر من الجليكوجين داخل الميوفيبريلار لكل منطقة ميوفيبريلار، والجليكوجين بين الميوفيبريلار لكل منطقة ميوفيبريلار، والجليكوجين تحت الساركوليمال لكل منطقة صورة كمجموع جميع الزيارات مقسوما على مجموع جميع النقاط من الصور ال 12 (من الخطوات 3.7 و 3.9 و 3.10).
- احسب الكسر الحجمي (VV) للجليكوجين داخل العضلة العضلية و intermyofibrillar و subsarcolemal ، على التوالي ، ككسر المساحة الظاهري (AA) مطروحا منه ناتج كثافة السطح (SV) بسماكة المقطع (t) ، حيث تكون كثافة السطح هي الكثافة العددية للجسيمات مضروبة في متوسط سطح الجسيمات:
Vv = AA - (1 / 4) · إس في · t
أين
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · ح)2)) · (ر + ح))
t = 0.06 ميكرومتر
H = متوسط قطر الجسيمات (ميكرومتر)
ملاحظة: الكسر الحجمي أصغر من كسر المساحة الظاهر بسبب مساهمة الأغطية من الجسيمات مع مركزها خارج الشريحة25. - للتعبير عن الجليكوجين داخل myofibrillar لكل مساحة intramyofibrillar ، قسم جزء المنطقة من الجليكوجين intramyofibrillar (الخطوة 4.2) على جزء المنطقة من الفضاء intramyofibrillar (الخطوة 4.1). يتم التعبير عن الجليكوجين intermyofibrillar لكل مساحة myofibrillar كما تم حسابها في الخطوة السابقة (الخطوة 4.3).
- للتعبير عن الجليكوجين تحت الساركوليمال لكل مساحة سطح من الألياف (VS) (myofibril الخارجية) ، قم بتحويل الجزء الحجمي من الجليكوجين إلى كمية مطلقة عن طريق الضرب مع حجم الصورة (ناتج سمك المساحة والمقطع) والقسمة على ناتج متوسط الطول المتاح (من الخطوة 3.6) مع سمك المقطع (t).
- قدر إجمالي محتوى الجليكوجين الحجمي باستخدام القيم من الخطوات 4.1 و 4.4 و 4.5 ، كما يلي:
الجليكوجين Myofibrillar = الجليكوجين Intermyofibrillar + (الجليكوجين داخل myofibrillar · جزء من مساحة داخل myofibrillar)
بافتراض أن متوسط نصف قطر الألياف 40 ميكرومتر 27 ، فإن نسبة الحجم إلى السطح هي 20: 1 ، وبالتالي فإن إجمالي الجليكوجين هو:
مجموع الجليكوجين (VV) = الجليكوجين Myofibrillar + (الجليكوجين تحت الساركوليمال (VS) / 20)
ملاحظة: يمكن أن تختلف نسبة الحجم إلى السطح 20: 1 من الألياف إلى الألياف اعتمادا على حجم الألياف الفعلي وحجم المنطقة تحت الساركولومالية. ولا يؤخذ ذلك في الحسبان مع هذا البروتوكول. - من هذا ، يتم حساب المساهمة النسبية من كل تجمع ككسور من إجمالي الجليكوجين:
الجليكوجين Intermyofibrillar / الجليكوجين الكلي = الجليكوجين Intermyofibrillar / إجمالي الجليكوجين
الجليكوجين داخل myofibrillar / الجليكوجين الكلي = (الجليكوجين داخل myofibrillar · جزء من مساحة intramyofibrillar) / إجمالي الجليكوجين
الجليكوجين تحت الساركوليمال / الجليكوجين الكلي = الجليكوجين تحت الساركوليمال / 20 / إجمالي الجليكوجين - لكل تجمع جليكوجين، احسب معامل الخطأ (CE)، الذي يعبر عن عدم اليقين في تقدير الجليكوجين على مستوى الألياف، استنادا إلى عدد الصور (n)، والعدد الإجمالي للتقاطعات في كل صورة (x)، وعدد الصلبان التي تصطدم بالجليكوجين في التجمع ذي الصلة في كل صورة (y) على النحو التالي28:
م = ن-1 · ∑x2 · (∑س) -2 + ∑y2 · (∑ذ) -2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑ص-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول ، تظهر جزيئات الجليكوجين سوداء ومتميزة (الشكل 1 والشكل 2). يتم توضيح القيم الطبيعية للجليكوجين في الشكل 3. تستند هذه البيانات إلى ما مجموعه 362 من الألياف من 41 شابا سليما كما تم جمعها في دراسات سابقة مختلفة19،24،29،30،31. هنا ، يمكن ملاحظة أن قيم الجليكوجين intermyofibrillar موزعة بالقرب من المعدل الطبيعي ، في حين أن كلا من الجليكوجين داخل myofibrillar و subsarcolemmal يظهر توزيعا منحرفا ، حيث تحتوي الألياف في بعض الأحيان على كمية زائدة من الجليكوجين. من المهم ملاحظة أنه في ألياف العضلات ذات الحجم الطبيعي (قطرها 60-80 ميكرومتر) ، فإن الجليكوجين intermyofibrillar هو أكبر تجمع يشكل حوالي 80٪ من إجمالي محتوى الجليكوجين. يشكل كل من الجليكوجين داخل العضلة العضلية والجليكوجين تحت الساركوليمال حوالي 10٪ من إجمالي المحتوى.
الشكل 1: التصوير وكتابة الألياف . (أ) يتم تصوير كل ألياف بترتيب منهجي عشوائي. (ب) مثال لصورة من الفضاء تحت الساركوليمال. (ج) مثال على صورة من الفضاء العضلي العضلي. (D) في كل صورة من صور myofibrillar ، يتم قياس عرض قرص Z واحد (خطوط حمراء). تعطي قياسات ما مجموعه 12 قرصا Z (قرص واحد لكل صورة) معامل خطأ يبلغ 0.03 تقريبا. (ه) التوزيع النموذجي لمتوسط عرض القرص Z الليفي في 6-10 ألياف لكل من الخزعات ال 10. من كل خزعة ، يتم تعريف 2-3 ألياف على أنها الأنواع 1 و 2 بناء على توزيع الخزعة الداخلية. تنشأ الصور من خزعة من m. vastus lateralis لرافع الأثقال المدرجة في دراسة سابقة29. م: الميتوكوندريا و Z: Z-القرص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليلات الجليكوجين. (أ) يقدر حجم الجليكوجين تحت الساركوليمال لكل مساحة سطح عن طريق عد النقاط باستخدام حجم شبكة يبلغ 180 نانومتر × 180 نانومتر داخل منطقة محددة بطول الميوفيبريل الخارجي والمنطقة تحت الساركوليمية العمودية على هذا الطول (خطوط زرقاء منقطة). (ب) يقدر الكسر الحجمي للريفان العضلي عن طريق عد النقاط باستخدام حجم شبكة 400 نانومتر × 400 نانومتر. (ج) يقدر الجزء الحجمي من الجليكوجين داخل الميفي إيبريلار عن طريق عد النقاط باستخدام حجم شبكة يبلغ 60 نانومتر × 60 نانومتر. (د) يقدر الكسر الحجمي للجليكوجين intermyofibrillar عن طريق عد النقاط باستخدام حجم شبكة 180 نانومتر × 180 نانومتر. في A-D ، تشير الدوائر الحمراء إلى الضربات (صليب يضرب جسيم جليكوجين). (هاء) معامل الخطأ المقدر لنسبة مجسمة تقديرية24 ل 2 إلى 12 صورة تم تحليلها. يتم تقدير معامل الخطأ بناء على عدد الأعداد وبالتالي يختلف بين العينات بناء على تركيز الجليكوجين. غالبا ما يكون منخفضا نسبيا عندما يكون محتوى الجليكوجين مرتفعا والعكس صحيح. (و) معامل تباين قطر جسيم الجليكوجين بعد قياس 2-99 جسيما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القيم الطبيعية للمجمعات تحت الخلوية الثلاثة للجليكوجين في العضلات الهيكلية. تعتمد مؤامرات الكمان على 362 من الألياف من 41 شابا أصحاء (18-39 عاما). تنشأ الألياف من دراسات سابقة ، حيث تم الحصول على خزعات من m. vastus lateralis في حالة راحة أو تحكم 19،24،29،30،31. يتم عرض القيم كمخطط مربع مع علامة للوسيط ومربع يشير إلى النطاق الربيعي. تمثل الخطوط القيم المجاورة العلوية والسفلية. يتم تراكب الصناديق بواسطة قطع كثافة النواة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوة الحاسمة لهذه الطريقة هي استخدام الأوزميوم المنخفض بواسطة فيروسيانيد البوتاسيوم أثناء التثبيت التالي. لا يمكن تفسير انتقائية هذا المثبت المعدل للكشف عن الجليكوجين بشكل كامل من خلال الكيمياء، ولكنه يشمل أيضا النتائج التجريبية التي تظهر عدم اكتشاف مثل هذه الجسيمات في الأنسجة المعروفة بأنها خالية من الجليكوجين أو في الفضاء خارج الخلية11.
المعلمات الحرجة هي دقة التقديرات والتباين من الألياف إلى الألياف. باتباع البروتوكول الحالي للتصوير ، يتم الحصول على معامل خطأ يتراوح بين 0.1 و 0.2 من تقديرات التجمعات المختلفة للجليكوجين لكل ألياف. هذا المستوى من الخطأ أقل بكثير من التباين بين الألياف الفردية (الشكل 3). ويشجع على الإبلاغ عن مثل هذه التقديرات الدقيقة عند تقدير المحتوى الحجمي للجليكوجين. يتم التحقق من صحة طريقة كتابة الألياف المقدمة ضد الميوسين ATPase isoform29. يمكن أيضا استخدام سمك القرص Z وجزء حجم الميتوكوندريا معا للإشارة إلى نوع الألياف ، ولكن ليس جزء حجم الميتوكوندريا وحده32.
تتمثل القيود الرئيسية لهذه الطريقة في عدم القدرة على اكتشاف جزيئات الجليكوجين الصغيرة جدا وأن ملامح جزيئات الجليكوجين قد تتداخل في الصورة المتوقعة28. القيد الأول يبطل مقياسا حقيقيا لمتوسط حجم الجسيمات. يصبح هذا تحيزا شديدا عندما تتحلل جزيئات الجليكوجين أثناء المتطلبات الأيضية العالية ، في حين أن التحيز قد يكون ضئيلا عندما تنمو جزيئات الجليكوجين من حجم متوسط إلى أكبر أثناء إعادة تخليق الجليكوجين أو التعويض الفائق. في حين أن هذا قد يكون له آثار ضخمة على تقدير متوسط حجم جسيمات الجليكوجين عند مستويات منخفضة من الجليكوجين ، فإن تقديرات تركيزات الجليكوجين الحجمي قوية ، لأن جزيئات الجليكوجين الصغيرة غير المرصودة تساهم قليلا جدا في إجمالي محتوى الجليكوجين. ينشأ القيد الثاني من الحالة ، حيث تكون جزيئات الجليكوجين أصغر بكثير من سمك الأقسام. هذا التحيز موجود في الغالب بتركيزات عالية جدا من الجليكوجين ويمكن التحقيق فيه عن طريق مقارنة أجزاء حجم الجليكوجين من الأقسام ذات السماكات المختلفة. إذا لم يكن القسم الأكثر سمكا موازيا لجزء كبير من حجم الجليكوجين ، فيجب أن يكون ذلك بسبب التقليل من شأنه بسبب المزيد من الجسيمات المتداخلة في القسم الأكثر سمكا. في الدراسات السابقة ، يرتبط جزء حجم الجليكوجين بتركيز الجليكوجين ضمن النطاق من 50 إلى 600 مليمول كجم dw-1 مما يشير إلى عدم وجود تداخل واضح للجسيمات. ومع ذلك ، إذا زاد تركيز الجليكوجين فوق هذا المستوى ، فلا توجد زيادة في الجليكوجين intermyofibrillar مما يشير إلى التداخل33. يمكن حل هذا عن طريق استقراء العلاقة بين جزء حجم الجليكوجين والتركيز عند تركيزات الجليكوجين المنخفضة.
استنادا إلى دقة نانومتر التي تقدمها TEM ، يعد هذا البروتوكول في الوقت الحالي الطريقة الوحيدة لتقدير التوزيع دون الخلوي للجليكوجين. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح المنهجية أيضا باتباع نهج كمي واسع النطاق (كما هو موضح هنا) ، حيث يمكن الحصول على قيم كمية على مستوى الألياف الواحدة. هذا له أهمية كبيرة في عضلات الهيكل العظمي ذات التجانس العالي في توظيف الألياف خلال أنواع مختلفة من التمارين 2 ، حيث تحدث آليات التعب المعتمدة على الجليكوجين فقط في بعض الألياف. هذه الطريقة لديها أيضا القدرة على الأنسجة الأخرى المثيرة مثل الخلايا العضلية القلبية، حيث من المعروف أن الجليكوجين ضروري لوظيفة القلب الطبيعية وحرج أثناء نقص التروية23،34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
وقد دعمت اللجنة الأولمبية السويدية هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
