Summary
Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.
Abstract
Met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie kunnen afbeeldingen met hoge resolutie van vaste monsters met individuele spiervezels worden verkregen. Dit maakt kwantificeringen mogelijk van ultrastructurele aspecten zoals volumefracties, oppervlakte-volumeverhoudingen, morfometrie en fysieke contactlocaties van verschillende subcellulaire structuren. In de jaren 1970 werd een protocol voor verbeterde kleuring van glycogeen in cellen ontwikkeld en de weg vrijgemaakt voor een reeks studies over de subcellulaire lokalisatie van glycogeen en glycogeendeeltjesgrootte met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Terwijl de meeste analyses glycogeen interpreteren alsof het homogeen verdeeld is in de spiervezels en slechts een enkele waarde oplevert (bijvoorbeeld een gemiddelde concentratie), heeft transmissie-elektronenmicroscopie aangetoond dat glycogeen wordt opgeslagen als discrete glycogeendeeltjes in verschillende subcellulaire compartimenten. Hier wordt het stapsgewijze protocol beschreven van weefselverzameling tot de kwantitatieve bepaling van de volumefractie en deeltjesdiameter van glycogeen in de verschillende subcellulaire compartimenten van individuele skeletspiervezels. Overwegingen over hoe 1) weefselmonsters te verzamelen en te kleuren, 2) beeldanalyses en gegevensverwerking uit te voeren, 3) de precisie van schattingen te evalueren, 4) onderscheid te maken tussen spiervezeltypen en 5) methodologische valkuilen en beperkingen zijn inbegrepen.
Introduction
Glycogeendeeltjes zijn samengesteld uit vertakte polymeren van glucose en verschillende bijbehorende eiwitten1 en vormen een belangrijke brandstof tijdens hoge metabolische eisen2. Hoewel niet algemeen erkend, vormen glycogeendeeltjes ook een lokale brandstof, waar sommige subcellulaire processen bij voorkeur glycogeen gebruiken ondanks de beschikbaarheid van andere en duurzamere brandstoffen zoals plasmaglucose en vetzuren3,4.
Het belang van het opslaan van glycogeen als een subcellulaire specifieke gelokaliseerde brandstof is besproken in verschillende beoordelingen5,6 voornamelijk gebaseerd op enkele van de vroegste documentaties van de subcellulaire verdeling van glycogeen door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)7,8. De eerste studies gebruikten verschillende protocollen om het contrast van glycogeen van histochemische kleuringstechnieken naar negatieve en positieve kleuringen9,10 te verhogen. Een belangrijke methodologische ontwikkeling was het verfijnde postfixatieprotocol met het kaliumferrocyanide-gereduceerde osmium11,12,13,14, dat het contrast van glycogeendeeltjes aanzienlijk verbeterde. Dit verfijnde protocol werd niet gebruikt in een deel van het pionierswerk aan door inspanning geïnduceerde glycogeendepletie15, maar werd opnieuw geïntroduceerd door Graham en collega's16,17.
Op basis van de 2-dimensionale afbeeldingen wordt de subcellulaire verdeling van glycogeen meestal beschreven als glycogeendeeltjes in drie pools: subsarcolemmaal (net onder het oppervlaktemembraan), intermyofibrillair (tussen de myofibrillen) of intramyofibrillair (binnen de myofibrillen). Glycogeendeeltjes kunnen echter ook worden beschreven als geassocieerd met bijvoorbeeld sarcoplasmatisch reticulum7 of kernen18. Naast de subcellulaire verdeling is het voordeel van het tem-geschatte glycogeengehalte ook dat kwantificering kan worden uitgevoerd op het niveau van één vezel. Dit maakt onderzoek van vezel-naar-vezel variabiliteit en correlatieve analyses met vezeltypen en cellulaire componenten als mitochondriën en lipidedruppels mogelijk.
Hier wordt het protocol beschreven voor het TEM-geschatte vezeltypespecifieke volumetrische gehalte van de drie gemeenschappelijke subcellulaire pools van glycogeen (subsarcolemmaal, intermyofibrillair en intramyofibrillair) in skeletspiervezels. De methode is toegepast op skeletspieren van mensen19, ratten20 en muizen21; evenals vogels en vissen22; en cardiomyocyten van ratten23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het huidige protocol met behulp van menselijke gebiopteerde skeletspiermonsters werd goedgekeurd door de regionale commissies voor gezondheidsonderzoeksethiek voor Zuid-Denemarken (S-20170198). Spierbiopten werden verkregen door een incisie in de huid van de spier vastus lateralis met behulp van een Bergström-naald met zuiging nadat lokale anesthesie subcutaan was toegediend (1-3 ml Lidocaïne 2% per incisie). Als geïsoleerde hele rattenspieren werden gebruikt, werden de dieren geofferd door cervicale dislocatie voordat de spierbiopten werden verkregen, in overeenstemming met de richtlijnen van de dierethiekcommissie in het universitair ziekenhuis van Odense, Denemarken.
1. Primaire fixatie, postfixatie, inbedding, sectie en contrasteren
- Bereid 1,6 ml primaire fixatieve oplossing (2,5% glutaaraldehyde in 0,1 m natriumcactrodaatbuffer (pH 7,3)) in een microcentrifugatiebuis van 2 ml. Bewaar het bij 5 °C gedurende maximaal 14 dagen.
- Isoleer uit de spierbiopsie of hele spier een klein monster, dat een maximale diameter van 1 mm in elke richting heeft en iets langer is in de longitudinale vezelrichting dan dwarsdoorsnede (voor oriëntatiedoeleinden).
- Plaats het monster in de buis met de koude primaire fixatieoplossing. Bewaar het bij 5 °C gedurende 24 uur.
- Was het monster viermaal (15 min tussen elke wasbeurt) in een natriumcacellodaatbuffer van 0,1 M (pH 7,3). Verwijder met behulp van transferpipetten de gebruikte buffer uit de buis en laat het monster onaangeroerd en voeg vervolgens de verse buffer toe.
OPMERKING: Na de laatste wasbeurt kan het monster gedurende enkele maanden worden bewaard in de natriumkacellodaatbuffer van 0,1 M bij 5 °C11. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Postfix met 1% osmiumtetroxide (OsO4) en 1,5% kaliumferrocyanide (K4Fe(CN)6) in 0,1 M natriumkactrodinebuffer (pH 7,3) gedurende 120 min bij 4 °C.
OPMERKING: Het gebruik van 1,5% kaliumferrocyanide (K4Fe(CN)6) is essentieel voor een optimaal contrast van glycogeendeeltjes11,12,13. - Tweemaal spoelen in dubbel gedestilleerd water bij kamertemperatuur (RT).
- Droog uit door onderdompeling in een gesorteerde reeks alcohol (ethanol) bij RT met behulp van de volgende concentraties: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) en 100% (10 min).
OPMERKING: In elke stap wordt het monster ondergedompeld in ethanol, dat vervolgens slechts gedeeltelijk wordt verwijderd om uitdroging van het monster te voorkomen. Ten slotte wordt de overgebleven ethanol weggegooid. - Infiltreer met gesorteerde mengsels van propyleenoxide en epossidische hars bij RT met behulp van de volgende volumeverhoudingen (propyleenoxide / epossidische hars): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (overnight). De volgende dag, integreer monsters in 100% verse epossidische hars in mallen en polymeriseer bij 60 °C gedurende 48 uur.
OPMERKING: Deze gegradeerde methode is volgens de vorige protocollen11,12. Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Snijd ultradunne (60-70 nm) secties van langswaarts georiënteerde vezels en verzamel ze als volgt op koperen roosters met één gat.
- Monteer het blok van een monster op de ultramicrotomehouder.
- Snijd het blok op het oppervlak bij met een scheermesje om het niveau van het weefsel te bereiken.
- Monteer een diamantmes (ultracut 45) voor het monster en lijn het monsteroppervlak parallel aan het mes uit.
- Maak een halfdunne (1 μm) sectie met het diamantmes om de oriëntatie van het monster te controleren. Kleur het halfdunne gedeelte met toluidineblauw voor observatie met lichtmicroscopie.
- Snijd het blok verder in om het interessegebied te verkleinen om de juiste ultradunne secties te krijgen.
- Snijd ultradunne (60-70 nm) secties met een tweede diamantmes (ultracut 45).
- Verzamel 1-2 secties op koperen roosters met één gat met behulp van een Perfect Loop.
OPMERKING: Een gat koperen rooster heeft een enkel gat in het midden met Formvar ondersteunend membraan.
- Contrasteer secties met uranylacetaat en loodcitraat door de bovenstaande roosters gedurende 20 minuten onder te dompelen in uranylacetaatoplossing (0,5% in dubbel gedestilleerd water) en vervolgens gedurende 15 minuten in loodcitraatoplossing (1% in dubbel gedestilleerd water). Was de roosters in dubbel gedestilleerd water tussen en na de twee vlekken.
OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
2. Beeldvorming
- Schakel de transmissie-elektronenmicroscoop (bediend op een versnellende spanning van 80 kV), computer- en beeldopnamesoftware in. Neem digitale beelden op met een digitale slow-scan 2 k x 2 k CCD-camera en de bijbehorende beeldbewerkingssoftware.
- Plaats het raster met meerdere secties in de microscoopfase.
- Scherm het raster in eerste instantie bij lage vergroting (bijv. x100) om de kwaliteit van secties te bepalen (d.w.z. gaten in het ondersteunende membraan, vuil, enz.) en kies de secties van de beste kwaliteit. Bepaal bij lage vergroting de richting van de spiervezels.
- Verhoog vervolgens de vergroting met de straal gecentreerd op een perifere vezel in de sectie. Stel het beeld scherp bij een vergroting van meer dan 30 k om voldoende fijne details in de afbeelding te garanderen, geleid door een real-time snelle fouriertransformatie, indien beschikbaar. Neem ten slotte beelden op met 1 s belichtingstijd bij de gewenste vergroting.
- Verkrijg in totaal 24 afbeeldingen van een willekeurig geselecteerde vezel, d.w.z. 12 afbeeldingen van de myofibrillaire ruimte en 12 afbeeldingen van de subsarcolemmale ruimte, bij een vergroting tussen 10 k en 40 k. Zorg ervoor dat de afbeeldingen in een gerandomiseerde maar systematische volgorde over de lengte en breedte van de vezel worden verdeeld om onbevooroordeelde resultaten te verkrijgen (figuur 1A).
OPMERKING: De optimale vergroting is afhankelijk van de beschikbare cameraresolutie en de grootte van de microfoto's. Het doel is om een definitieve resolutie te bereiken, waarbij glycogeendeeltjesdiameters binnen stappen van 1 nm kunnen worden gemeten, en om een totale oppervlakte van het myofibrillaire gebied van ten minste 70 μm2 en een totale lengte van de vezel van ten minste 25 μm verdeeld in 12 afbeeldingen van de myofibrillaire ruimte en 12 afbeeldingen van de subsarcolemmale ruimte per vezel, respectievelijk. De 24 afbeeldingen per vezel geven hoogstwaarschijnlijk een precisie (foutcoëfficiënt) van het volumetrische gehalte van de verschillende poelen glycogeen tussen 0,1 en 0,2 in individuele vezels van menselijke, ratten- en muizenskeletspieren20,21,24 (figuur 2E). - Herhaal stap 2.4 en 2.5 totdat er in totaal 6-10 vezels zijn afgebeeld. Snijd indien nodig extra secties (gescheiden door ten minste 150 μm om overlapping van reeds afgebeelde vezels te voorkomen) en herhaal stap 1.9-2.5.
3. Beeldanalyses
- Importeer afbeeldingen naar ImageJ door op Bestand > Openen te klikken.
- Stel de algemene schaal in op de oorspronkelijke grootte van de afbeelding door op Analyseren > Schaal instellen te klikken.
- Zoom 100% in door op Afbeelding > Zoom in > In te klikken.
- Meet de dikte van één Z-schijf per afbeelding van de myofibrillaire ruimte (12 per vezel) met het gereedschap Rechte lijn in het menu Extra (Afbeelding 1D). Bereken de gemiddelde Z-schijfdikte van elk van de 6-10 vezels.
- Definieer 2-3 vezels met de dikste gemiddelde Z-schijf als type 1-vezels en 2-3 vezels met de dunste gemiddelde Z-schijf als type 2-vezels. Negeer de tussenliggende 2-4 vezels voor verdere analyses (figuur 1E).
OPMERKING: De volgende stappen worden herhaald voor elk van de 4-6 vezels uit het monster. De glycogeenvolumefracties worden geschat door puntentelling zoals elders beschreven25,26. De grootte van de roosters wordt gekozen om een bevredigende hoge nauwkeurigheid van de schattingen te verkrijgen. Dit wordt vaak verkregen door het behalen van 250 treffers, die vervolgens het totaal aantal benodigde punten en op zijn beurt het gebied per punt dicteren. - Gebruik het gereedschap Gesegmenteerde lijn om de lengte van de buitenste myofibril te meten die net onder het subsarcolemmale gebied zichtbaar is (figuur 2A).
OPMERKING: Deze lengte wordt gebruikt om subsarcolemmaal glycogeen per oppervlak uit te drukken (d.w.z. lengte van de buitenste myofibril vermenigvuldigd met de dikte van de sectie (60 nm); zie stap 4.5). Daarom wordt alleen het subsarcolemmale gebied, dat wordt weergegeven door deze lengte, in de analyse opgenomen. - Voeg een raster in door te klikken op Hulpmiddelen analyseren > > raster en stel Oppervlakte per punt in op 32.400 nm2. Tel het aantal treffers binnen de beschikbare lengte in de 12 subsarcolemmale afbeeldingen, waarbij een kruis het subsarcolemmale glycogeen raakt (figuur 2A). Een treffer wordt gedefinieerd als een glycogeendeeltje dat aanwezig is in de rechterbovenhoek van een kruis.
- Voeg een raster in door te klikken op Hulpmiddelen analyseren > > raster en stel Gebied per punt in op 160.000 nm2. Tel het aantal treffers in de 12 myofibrillaire beelden, waarbij een kruis de intramyofibrillaire ruimte raakt (figuur 2B).
- Voeg een raster in door te klikken op Hulpmiddelen analyseren > > raster en stel Gebied per punt in op 3.600 nm2. Tel het aantal treffers in de 12 myofibrillaire beelden, waarbij een kruis het intramyofibrillaire glycogeen raakt (figuur 2C).
- Voeg een raster in door op > tools > raster analyseren te klikken en gebied per punt in te stellen op 32.400 nm2. Tel het aantal treffers in de 12 myofibrillaire beelden, waarbij een kruis het intermyofibrilllar glycogeen raakt (figuur 2D).
- Meet met behulp van de Straight Line-tool de diameter van vijf willekeurig gekozen glycogeendeeltjes van elk zwembad voor elk van de 12 afbeeldingen om een gemiddelde van 60 deeltjes per pool per vezel te verkrijgen.
OPMERKING: Het gemiddelde van 60 deeltjes dekt grotendeels de variatie binnen de vezel (figuur 2F).
4. Berekeningen
- Bereken de schijnbare oppervlaktefractie (AA) van de intramyofibriele ruimte per myofibrillaire ruimte als de som van alle treffers gedeeld door de som van alle punten uit de 12 afbeeldingen (uit stap 3.8).
- Bereken de schijnbare gebiedsfractie van intramyofibrillair glycogeen per myofibrillair gebied, intermyofibrillair glycogeen per myofibrillair gebied en subsarcomoletaal glycogeen per beeldgebied als de som van alle treffers gedeeld door de som van alle punten uit de 12 afbeeldingen (uit stappen 3.7, 3.9 en 3.10).
- Bereken de volumefractie (VV) van respectievelijk intramyofibrillair, intermyofibrillair en subsarcolemmaal glycogeen als de schijnbare oppervlaktefractie (AA) minus het product van oppervlaktedichtheid (SV) met sectiedikte (t), waarbij oppervlaktedichtheid de numerieke dichtheid van deeltjes is vermenigvuldigd met het gemiddelde deeltjesoppervlak:
Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
waar
Sv (μm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H))
t = 0,06 μm
H = gemiddelde diameter van de deeltjes (μm)
OPMERKING: De volumefractie is kleiner dan de schijnbare oppervlaktefractie vanwege de bijdrage van doppen van deeltjes met hun midden buiten de plak25. - Om intramyofibrillair glycogeen per intramyofibrillaire ruimte tot expressie te brengen, deelt u de gebiedsfractie van intramyofibrillair glycogeen (stap 4.2) door de gebiedsfractie van de intramyofibriele ruimte (stap 4.1). Het intermyofibrillaire glycogeen wordt uitgedrukt per myofibrillaire ruimte zoals berekend in de vorige stap (stap 4.3).
- Om subsarcolemmaal glycogeen per oppervlak van de vezel (VS) (buitenste myofibril) uit te drukken, converteert u de volumefractie van glycogeen naar een absolute hoeveelheid door te vermenigvuldigen met het volume van het beeld (product van oppervlakte en sectiedikte) en te delen door het product van de gemiddelde beschikbare lengte (vanaf stap 3.6) met sectiedikte (t).
- Schat het totale volumetrische glycogeengehalte met behulp van de waarden uit stap 4.1, 4.4 en 4.5, als volgt:
Myofibrillair glycogeen = Intermyofibrillair glycogeen + (intramyofibrillair glycogeen · gebiedsfractie van intramyofibrillaire ruimte)
Door uit te gaan van een gemiddelde straal van 40 μm27 is de verhouding tussen volume en oppervlak 20:1, dus totaal glycogeen is:
Totaal glycogeen (VV) = Myofibrillair glycogeen + (subsarcolemmaal glycogeen (VS) / 20)
OPMERKING: De verhouding tussen volume en oppervlak van 20: 1 kan variëren van vezel tot vezel, afhankelijk van de werkelijke vezelgrootte en de grootte van het subsarcolemmale gebied. Daar wordt bij dit protocol geen rekening mee gehouden. - Hieruit wordt de relatieve bijdrage van elke pool berekend als fracties van totaal glycogeen:
Intermyofibrillair glycogeen / Totaal glycogeen = Intermyofibrillair glycogeen / Totaal glycogeen
Intramyofibrillair glycogeen / Totaal glycogeen = (Intramyofibrillair glycogeen · gebiedsfractie van intramyofibrillaire ruimte) / Totaal glycogeen
Subsarcolemmaal glycogeen / Totaal glycogeen = Subsarcolemmaal glycogeen / 20 / Totaal glycogeen - Bereken voor elke glycogeenpool de foutcoëfficiënt (CE), die de onzekerheid van de glycogeenschatting op vezelniveau uitdrukt, op basis van het aantal afbeeldingen (n), het totale aantal kruisingen in elke afbeelding (x) en het aantal kruisingen dat glycogeen raakt in de relevante pool in elke afbeelding (y) als volgt28:
CE = n-1 · ∑x2 · (∑x) -2 + ∑y2 · (∑y) -2 - 2∑ (xy) · ∑x-1 · ∑y-1
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol lijken glycogeendeeltjes zwart en duidelijk (figuren 1 en figuur 2). De normale waarden van glycogeen zijn weergegeven in figuur 3. Deze gegevens zijn gebaseerd op een totaal van 362 vezels van 41 gezonde jonge mannen zoals verzameld in verschillende eerdere studies19,24,29,30,31. Hier is te zien dat intermyofibrillaire glycogeenwaarden dicht bij normaal worden verdeeld, terwijl zowel intramyofibrillair als subsarcospecletaal glycogeen een scheve verdeling vertonen, waarbij vezels soms een overmatige hoeveelheid glycogeen hebben. Het is belangrijk op te merken dat in spiervezels van normale grootte (diameter van 60-80 μm), intermyofibrillair glycogeen de grootste pool is die ongeveer 80% van het totale glycogeengehalte vormt. Intramyofibrillair en subsarcolemmaal glycogeen vormen elk ongeveer 10% van het totale gehalte.
Figuur 1: Beeldvorming en vezeltypering. (A) Elke vezel wordt afgebeeld in een gerandomiseerde systematische volgorde. (B) Voorbeeld van een afbeelding uit de subsarcolemmale ruimte. (C) Voorbeeld van een afbeelding uit de myofibrillaire ruimte. (D) In elk myofibrillair beeld wordt de breedte van één Z-schijf gemeten (rode lijnen). De metingen van in totaal 12 Z-schijven (één per beeld) geven een foutcoëfficiënt van ongeveer 0,03. (E) De typische verdeling van de gemiddelde vezel Z-schijfbreedte in 6-10 vezels van elk van de 10 biopsieën. Van elke biopsie worden 2-3 vezels gedefinieerd als type 1 en 2 op basis van de binnen-biopsieverdeling. De beelden zijn afkomstig van een biopsie van m. vastus lateralis van een powerlifter die in een eerdere studie29 is opgenomen. m: mitochondriën en Z: Z-schijf. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Glycogeenanalyses. (A) Het subsarcolemmale glycogeenvolume per oppervlak wordt geschat door puntentelling met behulp van een rastergrootte van 180 nm x 180 nm binnen een gebied dat wordt gedefinieerd door de lengte van de buitenste myofibrill en het subsarcolemmale gebied loodrecht op deze lengte (blauwe stippellijnen). (B) De myofibrillaire volumefractie wordt geschat door puntentelling met behulp van een rastergrootte van 400 nm x 400 nm. (C) De volumefractie van intramyofibrillair glycogeen wordt geschat door puntentelling met behulp van een rastergrootte van 60 nm x 60 nm. (D) De volumefractie van intermyofibrillair glycogeen wordt geschat door puntentelling met behulp van een rastergrootte van 180 nm x 180 nm. In A-D duiden de rode cirkels op treffers (een kruis dat een glycogeendeeltje raakt). (E) De geschatte foutcoëfficiënt voor een stereologische verhoudingsschatting24 voor 2 tot 12 geanalyseerde beelden. De foutcoëfficiënt wordt geschat op basis van het aantal tellingen en varieert daarom tussen monsters op basis van de glycogeenconcentratie. Het is vaak relatief laag wanneer het glycogeengehalte hoog is en vice versa. (F) De variatiecoëfficiënt van de diameter van glycogeendeeltjes na het meten van 2-99 deeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Normale waarden van de drie subcellulaire glycogeenpools in de skeletspieren. De vioolpercelen zijn gebaseerd op 362 vezels van 41 gezonde jonge mannen (18-39 jaar oud). De vezels zijn afkomstig uit eerdere studies, waarbij biopten van m. vastus lateralis in een rust- of controleconditie werden verkregen19,24,29,30,31. Waarden worden weergegeven als een kaderplot met een markering voor de mediaan en een vak dat het interkwartielbereik aangeeft. De lijnen vertegenwoordigen de bovenste en onderste aangrenzende waarden. De dozen worden bedekt door kerneldichtheidsdiagrammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritieke stap van de methode is het gebruik van gereduceerd osmium door kaliumferrocyanide tijdens postfixatie. De selectiviteit van dit gemodificeerde fixatief voor glycogeendetectie kan niet volledig worden verklaard door chemie, maar omvat ook experimentele bevindingen die aantonen dat dergelijke deeltjes niet worden gedetecteerd in weefsels waarvan bekend is dat ze vrij zijn van glycogeen of in de extracellulaire ruimte11.
Kritische parameters zijn de precisie van de schattingen en de vezel-naar-vezelvariatie. Door het huidige protocol voor beeldvorming te volgen, wordt een foutcoëfficiënt tussen 0,1 en 0,2 van de schattingen van de verschillende pools glycogeen per vezel verkregen. Dit foutenniveau ligt ver onder de variatie tussen individuele vezels (figuur 3). Het wordt aangemoedigd om dergelijke nauwkeurige schattingen te rapporteren bij het schatten van het volumetrische gehalte aan glycogeen. De gepresenteerde vezeltyperingsmethode is gevalideerd tegen myosine ATPase isoform29. De Z-schijfdikte en mitochondriale volumefractie kunnen ook in combinatie worden gebruikt om het vezeltype aan te geven, maar niet alleen mitochondriale volumefractie32.
De belangrijkste beperkingen van de methode zijn het onvermogen om de zeer kleine glycogeendeeltjes te detecteren en dat profielen van glycogeendeeltjes elkaar kunnen overlappen in het geprojecteerde beeld28. De eerste beperking maakt een echte maat voor de gemiddelde deeltjesgrootte ongeldig. Dit wordt een ernstige bias wanneer de glycogeendeeltjes worden afgebroken tijdens hoge metabolische eisen, terwijl de bias onbeduidend kan zijn wanneer de glycogeendeeltjes van gemiddelde naar een grotere omvang groeien tijdens glycogeenhersynthese of supercompensatie. Hoewel dit enorme implicaties kan hebben voor de schatting van de gemiddelde glycogeendeeltjesgrootte bij lage glycogeenniveaus, zijn de schattingen van volumetrische glycogeenconcentraties robuust, omdat kleine, niet-geobserveerde glycogeendeeltjes zeer weinig bijdragen aan het totale glycogeengehalte. De tweede beperking komt voort uit de aandoening, waarbij de glycogeendeeltjes veel kleiner zijn dan de dikte van de secties. Deze bias is meestal aanwezig bij zeer hoge glycogeenconcentraties en kan worden onderzocht door de glycogeenvolumefracties van secties met verschillende diktes te vergelijken. Als een dikker gedeelte niet wordt geparallelliseerd door een hoge glycogeenvolumefractie, moet dit te wijten zijn aan een onderschatting als gevolg van meer overlappende deeltjes in het dikste gedeelte. In eerdere studies correleert de glycogeenvolumefractie met de glycogeenconcentratie binnen het bereik van 50 tot 600 mmol kg dw-1 , wat aangeeft dat er geen uitgesproken overlapping van deeltjes is. Als de glycogeenconcentratie echter boven dit niveau stijgt, is er geen toename van intermyofibrillair glycogeen, wat wijst op overlap33. Dit kan worden opgelost door de relatie tussen de glycogeenvolumefractie en de concentratie bij de lagere glycogeenconcentraties te extrapoleren.
Op basis van de nm-resolutie van TEM is dit protocol momenteel de enige methode om de subcellulaire verdeling van glycogeen te schatten. Daarnaast maakt de methodologie ook een grootschalige kwantitatieve benadering mogelijk (zoals hier beschreven), waarbij kwantitatieve waarden kunnen worden verkregen op het niveau van één vezel. Dit is van immens belang in skeletspieren met een hoge heterogeniteit in vezelrekrutering tijdens verschillende soorten oefeningen2, waar glycogeenafhankelijke vermoeidheidsmechanismen alleen in sommige vezels voorkomen. De methode heeft ook potentieel voor andere prikkelbare weefsels zoals cardiomyocyten, waarvan bekend is dat glycogeen essentieel is voor een normale hartfunctie en kritisch tijdens ischemie23,34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Zweeds Olympisch Comité.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
References
- Prats, C., Graham, T. E., Shearer, J. The dynamic life of the glycogen granule. Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7089-7098 (2018).
- Gollnick, P. D., Piehl, K., Saltin, B. Selective glycogen depletion pattern in human muscle fibres after exercise of varying intensity and at varying pedalling rates. Journal of Physiology. 241 (1), 45-57 (1974).
- James, J. H., et al. Stimulation of both aerobic glycolysis and Na+-K+-ATPase activity in skeletal muscle by epinephrine or amylin. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 277 (1), 176-186 (1999).
- Jensen, R., Nielsen, J., Ørtenblad, N. Inhibition of glycogenolysis prolongs action potential repriming period and impairs muscle function in rat skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (4), 789-803 (2020).
- Green, H. J. How important is endogenous muscle glycogen to fatigue in prolonged exercise. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 69 (2), 290-297 (1991).
- Fitts, R. H.
- Wanson, J. C., Drochmans, P. Role of the sarcoplasmic reticulum in glycogen metabolism. Journal of Cellular Biology. 54 (2), 206-224 (1972).
- Schmalbruch, H., Kamieniecka, Z. Fiber types in the human brachial biceps muscle. Experimental Neurology. 44 (2), 313-328 (1974).
- Drochmans, P. Morphology of glycogen. Electron microscopic study of the negative stains of particulate glycogen. Journal of Ultrastructure Research. 6, 141-163 (1962).
- Thiery, J. -P. Demonstration of polysaccharides on thin sections by electron microscopy. Journal of Microscopy. 6, 987-1018 (1967).
- De Bruijn, W. C. Glycogen, its chemistry and morphologic appearance in the electron microscope. I. A modified OsO4 fixative which selectively contrasts glycogen. Journal of Ultrastructural Research. 42 (1), 29-50 (1973).
- Robinson, J. M., Karnovsky, M. L., Karnovsky, M. J. Glycogen accumulation in polymorphonuclear leukocytes, and other intracellular alterations that occur during inflammation. The Journal of Cell Biology. 95 (3), 933-942 (1982).
- Rybicka, K. K. Glycosomes - the organelles of glycogen metabolism. Tissue and Cell. 28 (3), 253-265 (1996).
- Gadisseux, J. F., Evrard, P. Glial-neuronal relationship in the developing central nervous system. A histochemical-electron microscope study of radial glial cell particulate glycogen in normal and reeler mice and the human fetus. Developmental Neuroscience. 7 (1), 12-32 (1985).
- Fridén, J., Seger, J., Ekblom, B. Implementation of periodic acid-thiosemicarbazide-silver proteinate staining for ultrastructural assessment of muscle glycogen utilization during exercise. Cell Tissue Research. 242 (1), 229-232 (1985).
- Marchand, I., et al. Quantification of subcellular glycogen in resting human muscle: granule size, number, and location. Journal of Applied Physiology. 93 (5), 1598-1607 (2002).
- Marchand, I., et al. Quantitative assessment of human muscle glycogen granules size and number in subcellular locations during recovery from prolonged exercise. Journal of Physiology. 580, 617-628 (2007).
- Sun, R. C., et al. Nuclear Glycogenolysis Modulates Histone Acetylation in Human Non-Small Cell Lung Cancers. Cell Metabolism. 30 (5), 903-916 (2019).
- Jensen, R., et al. Heterogeneity in subcellular muscle glycogen utilisation during exercise impacts endurance capacity in men. Journal of Physiology. 598 (19), 4271-4292 (2020).
- Nielsen, J., Schrøder, H. D., Rix, C. G., Ørtenblad, N. Distinct effects of subcellular glycogen localization on tetanic relaxation time and endurance in mechanically skinned rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 587 (14), 3679-3690 (2009).
- Nielsen, J., Cheng, A. J., Ørtenblad, N., Westerblad, H. Subcellular distribution of glycogen and decreased tetanic Ca2+ in fatigued single intact mouse muscle fibres. Journal of Physiology. 592 (9), 2003-2012 (2014).
- Mead, A. F., et al. Fundamental constraints in synchronous muscle limit superfast motor control in vertebrates. eLife. 6, 29425 (2017).
- Nielsen, J., Johnsen, J., Pryds, K., Ørtenblad, N., Bøtker, H. E. Myocardial subcellular glycogen distribution and sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling: effects of ischaemia, reperfusion and ischaemic preconditioning. Journal of Muscle Research and Cellular Motility. 42 (1), 17-31 (2021).
- Nielsen, J., Holmberg, H. C., Schrøder, H. D., Saltin, B., Ørtenblad, N. Human skeletal muscle glycogen utilization in exhaustive exercise: role of subcellular localization and fibre type. Journal of Physiology. 589 (11), 2871-2885 (2011).
- Weibel, E. R. Stereological Methods. Vol. 2: Theoretical Foundations. , Academic Press. London. (1980).
- Gundersen, H. J., et al. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. APMIS. 96 (5), 379-394 (1988).
- Saltin, B., Gollnick, P. D. Skeletal muscle adaptability: significance for metabolism and performance. Handbook of Physiology. Skeletal Muscle. 10, American Physiological Society. Bethesda, MD. 555-632 (1983).
- Howard, C. V., Reed, M. G. Unbiased Stereology. Three-dimensional Measurement in Microscopy. , Bios Scientific Publishers. Oxford. (2005).
- Nielsen, J., et al. Subcellular localization-dependent decrements in skeletal muscle glycogen and mitochondria content following short-term disuse in young and old men. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism. 299 (6), 1053-1060 (2010).
- Hokken, R., et al. Subcellular localization- and fibre type-dependent utilization of muscle glycogen during heavy resistance exercise in elite power and Olympic weightlifters. Acta Physiologica (Oxford). 231 (2), 13561 (2021).
- Nielsen, J., Farup, J., Rahbek, S. K., de Paoli, F. V., Vissing, K. Enhanced glycogen storage of a subcellular hot spot in human skeletal muscle during early recovery from eccentric contractions. PLoS One. 10 (5), 0127808 (2015).
- Sjöström, M., et al. Morphometric analyses of human muscle fiber types. Muscle Nerve. 5 (7), 538-553 (1982).
- Gejl, K. D., et al. Local depletion of glycogen with supramaximal exercise in human skeletal muscle fibres. Journal of Physiology. 595 (9), 2809-2821 (2017).
- Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
