Summary
改进的固定后程序增加了组织中糖原颗粒的对比度。本文提供了一个分步方案，描述了如何处理组织，进行成像，并使用立体学方法获得骨骼肌中纤维类型特异性亚细胞糖原分布的无偏和定量数据。
Abstract
通过使用透射电子显微镜，可以获得含有单个肌肉纤维的固定样品的高分辨率图像。这样可以量化超微结构方面，例如体积分数，表面积与体积比，形态测量和不同亚细胞结构的物理接触位点。在20世纪70年代，开发了一种用于增强细胞中糖原染色的方案，并为使用透射电子显微镜对糖原和糖原粒度的亚细胞定位的一系列研究铺平了道路。虽然大多数分析将糖原解释为它均匀分布在肌肉纤维内，仅提供单个值（例如，平均浓度），但透射电子显微镜显示糖原作为离散糖原颗粒储存在不同的亚细胞区室中。在这里，描述了从组织收集到定量测定单个骨骼肌纤维的不同亚细胞区室中糖原的体积分数和粒径的分步方案。考虑如何1）收集和染色组织标本，2）执行图像分析和数据处理，3）评估估计的精度，4）区分肌肉纤维类型，以及5）方法学陷阱和局限性。
Introduction
糖原颗粒由葡萄糖和各种相关蛋白的支化聚合物1 组成，在高代谢需求期间构成重要燃料2。虽然糖原颗粒尚未得到广泛认可，但它也构成了一种局部燃料，其中一些亚细胞过程优先利用糖原，尽管还有其他更持久的燃料如血浆葡萄糖和脂肪酸3，4。
几篇综述5，6主要基于透射电子显微镜（TEM）7，8对糖原亚细胞分布的一些最早文献，讨论了将糖原储存为亚细胞特异性局部燃料的重要性。第一项研究使用不同的方案来增加糖原从组织化学染色技术到阴性和阳性染色的对比度9，10。一个重要的方法论发展是用亚铁氰化钾还原锇11，12，13，14改进了固定后方案，显著改善了糖原颗粒的对比度。这种改进的方案并未用于一些关于运动诱导的糖原消耗的开创性工作15，但由Graham及其同事重新引入16，17。
基于二维图像，糖原的亚细胞分布最常被描述为位于三个池中的糖原颗粒：构膜下（就在表面膜下），肌原间（肌原纤维之间）或肌原纤维内（肌原纤维内）。然而，糖原颗粒也可以被描述为与例如肌质网7 或细胞核18相关。除了亚细胞分布外，TEM估计的糖原含量的优点还在于可以在单纤维水平上进行定量。这允许研究纤维间的变异性，并对纤维类型和细胞成分（如线粒体和脂滴）进行相关性分析。
这里，描述了TEM估计的骨骼肌纤维中三种常见的糖原亚细胞池（构膜下，肌原间和肌原内）的纤维类型特异性体积含量的方案。该方法已应用于人类19，大鼠20和小鼠21的骨骼肌;以及鸟类和鱼类22;和来自大鼠的心肌细胞23。
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Protocol
使用人类活检骨骼肌样本的本方案已获得南丹麦卫生研究伦理区域委员会（S-20170198）的批准。在皮下给予局部麻醉（每个切口1-3mL利多卡因2%）后，使用Bergström针从 蚴蚴外侧 肌的皮肤切口进行肌肉活检。如果使用孤立的整只大鼠肌肉，根据丹麦欧登塞大学医院动物伦理委员会的指导方针，在获得肌肉活检之前，通过颈椎脱位处死动物。
1. 原发性固定、后固定、嵌入、切片和对比
- 在2mL微量离心管中制备1.6mL初级固定溶液（2.5%戊二醛在0.1M二甲羟丁酸钠缓冲液（pH 7.3）中）。将其储存在5°C最多14天。
- 从肌肉活检或整个肌肉中分离出一个小样本，该标本在任何方向上的最大直径为1 mm，并且在纵向纤维方向上比横截面长一点（用于定向目的）。
- 将试样放入含有冷初级固定溶液的管中。将其储存在5°C下24小时。
- 在0.1M二甲羟甲酸钠缓冲液（pH 7.3）中洗涤标本四次（每次洗涤之间15分钟）。使用转印移液器，从试管中取出用过的缓冲液，使试样保持原样不变，然后加入新鲜的缓冲液。
注意：在最后一次洗涤后，样品可以在5°C的0.1M卡地啶甲酸钠缓冲液中储存数月11。该协议可以在此处暂停。 - 用1%四氧化锇（OsO4）和1.5%亚铁氰化钾（K4Fe（CN）6）在0.1M二甲钒酸钠缓冲液（pH 7.3）中后缀，在4°C下120分钟。
注：使用1.5%亚铁氰化钾（K4Fe（CN）6）对于糖原颗粒的最佳对比度至关重要11，12，13。 - 在室温（RT）下用双蒸馏水冲洗两次。
- 通过在室温下浸没在一系列分级酒精（乙醇）中，使用以下浓度脱水：70%（10分钟），70%（10分钟），95%（10分钟），100%（10分钟）和100%（10分钟）。
注意：在每个步骤中，试样都浸没在乙醇中，随后仅部分除去以避免试样干燥。最后，剩余的乙醇被丢弃。 - 使用以下体积比（环氧丙烷/巯二酸树脂）在室温下浸润环氧丙烷和环己二酸树脂的分级混合物：1/0（10分钟），3/1（45分钟），1/1（45分钟），1/3（45分钟），0/1（过夜）。第二天，将试样嵌入模具中100%新鲜的乳辛树脂中，并在60°C下聚合48小时。
注意：此分级方法符合以前的协议11，12。该协议可以在此处暂停。 - 切割超薄（60-70 nm）纵向光纤部分，并按如下方式将它们收集在单孔铜网格上。
- 将标本块安装在超薄切片机支架上。
- 用剃须刀片修剪表面上的块，以达到组织的水平。
- 将金刚石刀（超切 45）安装在样品前方，并将样品表面平行于刀对齐。
- 用金刚石刀制作半薄（1μm）切片，以检查样品的方向。用甲苯胺蓝染色半薄切片，以便用光学显微镜观察。
- 进一步修剪块以减少感兴趣的区域，以获得适当的超薄部分。
- 用第二把金刚石刀（超切 45）切割超薄 （60-70 nm） 截面。
- 使用完美循环在单孔铜网格上收集1-2个部分。
注：单孔铜格栅中间有一个孔，带有Formvar支撑膜。
- 将上述网格浸入乙酸铀酰溶液（在双蒸馏水中0.5%）20分钟，然后在柠檬酸铅溶液（在双蒸馏水中浸出1%）15分钟，将切片与乙酸铀酰和柠檬酸铅进行对比。在两个污渍之间和之后的双蒸馏水中洗涤网格。
注意：协议可以在此处暂停。
2. 成像
- 打开透射电子显微镜（在80 kV的加速电压下操作）、计算机和图像记录软件。使用2 k x 2 k CCD数字慢扫描相机和相关成像软件记录数字图像。
- 在显微镜载物台中插入具有多个切片的网格。
- 最初以低倍率（例如x100）筛选网格以确定截面的质量（即支撑膜上的孔，碎屑等），并选择最高质量的截面。在低放大倍率下，确定肌肉纤维的方向。
- 接下来，增加放大倍率，使光束以该部分的外围光纤为中心。将图像聚焦在30 k以上的放大倍率，以确保图像中有足够的精细细节，并由实时快速傅里叶变换（如果可用）指导。最后，以所需的放大倍率录制曝光时间为1秒的图像。
- 以10 k至40 k的放大倍率，共获取随机选择的纤维的24张图像，即肌纤维空间的12张图像和12张构下空间的图像。确保图像以随机但系统的顺序分布在光纤的长度和宽度上，以获得无偏的结果（图1A）。
注：最佳放大倍率取决于可用的相机分辨率和显微照片的大小。目标是实现最终分辨率，其中糖原粒径可以在1nm步长内测量，并且包括至少70μm2的肌原区域总面积和至少25μm的纤维总长度，分布成肌原间隙的12个图像和每个纤维的12个下构体空间图像， 分别。每根纤维的24张图像最有可能给出来自人类，大鼠和小鼠骨骼肌的单个纤维中0.1至0.2之间不同糖原池的体积含量的精度（误差系数）20，21，24（图2E）。 - 重复步骤2.4和2.5，直到总共对6-10根光纤进行成像。如果需要，切割其他部分（间隔至少150μm，以避免已经成像的纤维重叠）并重复步骤1.9-2.5。
3. 图像分析
- 通过单击“ 文件”>“打开”将图像导入 ImageJ。
- 通过单击“分析”>设置比例“，将全局 比例设置为与图像的原始大小匹配。
- 通过单击“图像”>缩放>放大100%。
- 使用“工具”菜单中的 直线 工具测量肌原纤维空间每个图像一个Z盘的厚度（每根纤维12个）（图1D）。计算 6-10 根光纤中每根纤维的平均 Z 盘厚度。
- 将平均 Z 盘最厚的 2-3 条纤维定义为 1 型纤维，将 2-3 根平均 Z 盘最薄的光纤定义为 2 型光纤。忽略中间的2-4根纤维进行进一步分析（图1E）。
注：对样品中的4-6根纤维中的每根重复以下步骤。糖原体积分数通过点计数估计，如其他地方所述25，26。选择网格的大小以获得令人满意的高精度估计值。这通常是通过达到250次命中来获得的，然后决定所需的总点数，进而决定每点的面积。 - 使用 分段线 工具测量在构肌层下区域正下方可见的最外层肌原纤维的长度（图2A）。
注意：该长度用于表示每个表面积的构体下糖原（即，最外层肌原纤维的长度乘以切片的厚度（60nm）;参见步骤4.5）。因此，分析中仅包括由此长度表示的子构体区域。 - 通过单击“ 分析>工具”插入网格>网格 ，并将 “每点面积 ”设置为 32，400 nm2。在12个附属构象图像中，计算可用长度内的命中次数，其中十字击中下构体糖原（图2A）。命中被定义为存在于十字架右上角的糖原颗粒。
- 通过单击“ 分析>工具”>网格插入网格 ，并将 “每点面积 ”设置为 160，000 nm2。计算12个肌原纤维图像中的命中次数，其中十字击中肌纤维内空间（图2B）。
- 通过单击“ 分析>工具”插入网格>， 并将 “每点面积 ”设置为 3，600 nm2。计算12个肌原纤维图像中的命中次数，其中交叉击中肌原内糖原（图2C）。
- 通过单击“ 分析>工具”>网格 “插入网格，并将 ”每点面积“ 设置为 32，400 nm2。计算12个肌原纤维图像中的命中次数，其中十字击中肌原（图2D）。
- 使用 直线 工具，为12个图像中的每张图像测量每个池中随机选择的五个糖原颗粒的直径，以获得每根光纤每个池平均60个颗粒。
注：60个颗粒的平均值在很大程度上涵盖了纤维内部的变化（图2F）。
4. 计算
- 计算每个肌原纤维空间的肌纤维内空间的表观面积分数（AA），作为所有命中的总和除以12个图像中所有点的总和（从步骤3.8开始）。
- 计算每个肌原区域肌原的表观面积分数，每个肌原区域的肌原和每个图像区域的肌原的视面积分数，作为所有命中的总和除以12个图像中所有点的总和（来自步骤3.7，3.9和3.10）。
- 分别计算肌原内、肌原间和构膜下糖原的体积分数（VV），作为表观面积分数（AA）减去表面密度（SV）与截面厚度（t）的乘积，其中表面密度是颗粒的数值密度乘以平均颗粒表面：
Vv = AA - （1 / 4） ·Sv ·t
哪里
Sv （μm-1） = AA / （ （π ·(((1 / 2) ·H）2）） ·（吨+ H）
t = 0.06 μm
H = 颗粒的平均直径（μm）
注：体积分数小于表观面积分数，因为其中心在切片外且颗粒的盖子的贡献25。 - 为了在每个肌原纤维间隙表达肌原，将肌原的面积分数（步骤4.2）除以肌原的面积分数（步骤4.1）。肌原根据上一步（步骤4.3）计算的肌原在肌原纤维间隙中表示。
- 为了表达纤维每表面积（VS）（最外层的肌原纤维），通过将糖原的体积乘以图像的体积（面积和截面厚度的乘积）并除以平均可用长度（从步骤3.6开始）与截面厚度（t）的乘积，将糖原的体积分数转换为绝对量。
- 使用步骤 4.1、4.4 和 4.5 中的值估计总体积糖原含量，如下所示：
肌原=肌原+（肌原）（肌原-肌原·肌原间隙的面积分数）
通过假设平均纤维半径为40μm27，体积与表面的比例为20：1，因此总糖原为：
总糖原 （VV） = 肌原 + （构件下糖原 （VS） / 20）
注：20：1 的体积与表面之比可能因光纤而异，具体取决于实际光纤尺寸和穹窿下区域的大小。本议定书没有考虑到这一点。 - 由此，每个池的相对贡献计算为总糖原的分数：
肌原/总糖原=肌原间糖原/总糖原
肌原内糖原/总糖原=（肌原内糖原·肌原间隙面积分数）/总糖原
构件下糖原/总糖原=构体下糖原/20/总糖原 - 对于每个糖原池，计算误差系数（CE），该系数表示纤维水平上糖原估计的不确定性，基于图像数（n），每个图像中的交叉总数（x）以及每个图像中相关池中击中糖原的交叉数（y），如下所示28：
CE = n-1 ·∑x2 ·（∑x）-2 + ∑y2 ·（∑y）-2 - 2∑ （∑x-1 ·∑y-1
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Representative Results
使用该协议，糖原颗粒看起来是黑色和不同的（图1 和 图2）。糖原的正常值如图 3所示。这些数据基于在不同的先前研究中收集的来自41名健康年轻男性的362种纤维19，24，29，30，31。在这里，可以看出肌原间糖原值的分布接近正常，而肌原和构肌下糖原均呈现偏斜分布，纤维有时具有过量的糖原。重要的是要注意，在正常大小的肌肉纤维（直径为60-80μm）中，肌原是最大的池，约占总糖原含量的80%。肌原和构体下糖原各占总含量的10%左右。
图 1：成像和纤维分型。 （A） 每根纤维都按随机系统顺序成像。（B）来自附属层空间的图像示例。（C）来自肌原纤维空间的图像示例。（D）在每个肌原纤维图像中，测量一个Z盘的宽度（红线）。总共12个Z盘（每个图像一个）的测量值给出的误差系数约为0.03。（E）平均纤维Z盘宽度在10个活检中每个6-10个纤维中的典型分布。从每次活检中，根据活检内分布，2-3根纤维被定义为1型和2型。这些图像来自先前研究中包含的举重运动员的 侧 支原体活检29。m：线粒体和Z：Z盘。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：糖原分析。（A）每个表面积的构体下糖原体积是通过点计数来估计的，网格尺寸为180 nm x 180 nm，该区域由最外层肌原的长度和垂直于该长度的构体下区域（蓝色虚线）定义。（B）肌原纤维体积分数通过使用400nm x 400nm的网格尺寸的点计数来估计。（C）肌原内乙糖原的体积分数通过使用60nm×60nm的网格大小的点计数来估计。（D）肌原的体积分数通过使用180nm×180nm的网格大小的点计数来估计。在A-D中，红色圆圈表示命中（击中糖原颗粒的十字架）。（E） 2 至 12 个分析图像的立体学比率估计值的估计误差系数24。误差系数是根据计数次数估计的，因此根据糖原浓度在样品之间变化。当糖原含量高时，它通常相对较低，反之亦然。（F）测定2-99个颗粒后糖原粒径的变化系数。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：骨骼肌中糖原的三个亚细胞池的正常值。 小提琴图基于来自41名健康年轻男性（18-39岁）的362根纤维。这些纤维起源于以前的研究，其中在休息或对照条件下从 m. vastus lateralis 获得了活检19，24，29，30，31。值显示为箱形图，其中中位数标记和指示四分位数间范围的框。这些线表示上部和下部的相邻值。这些框由核密度图覆盖。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
该方法的关键步骤是在固定后使用亚铁氰化钾还原锇。这种修饰的固定剂用于糖原检测的选择性不能用化学完全解释，但也包括实验结果，表明在已知不含糖原的组织中或细胞外空间中没有检测到这种颗粒11。
关键参数是估计值的精度和光纤间的变化。通过遵循本成像方案，获得每根纤维不同糖原池估计值的0.1至0.2之间的误差系数。此误差水平远低于单个光纤之间的变化（图3）。鼓励在估计糖原的体积含量时报告这种精确的估计值。所提出的纤维分型方法针对肌球蛋白ATP酶同种型29进行了验证。Z盘厚度和线粒体体积分数也可以组合使用，以指示纤维类型，但不能单独使用线粒体体积分数32。
该方法的主要局限性是无法检测到非常小的糖原颗粒，并且糖原颗粒的轮廓可能在投影图像中重叠28。第一个限制使平均粒径的真实测量无效。当糖原颗粒在高代谢需求期间被降解时，这成为一个严重的偏差，而当糖原颗粒在糖原再合成或超级补偿期间从中等大小增长到更大尺寸时，偏差可能微不足道。虽然这可能对低糖原水平下平均糖原粒径的估计产生巨大影响，但体积糖原浓度的估计是稳健的，因为小的，未观察到的糖原颗粒对总糖原含量的贡献很小。第二个限制源于这种情况，其中糖原颗粒比切片的厚度小得多。这种偏倚主要存在于非常高的糖原浓度下，可以通过比较不同厚度切片的糖原体积分数来研究。如果较厚的部分没有与高糖原体积分数平行，则一定是由于最厚的部分中有更多的重叠颗粒而被低估。在以前的研究中，糖原体积分数与糖原浓度在50至600 mmol kg dw-1 范围内相关，表明颗粒没有明显的重叠。然而，如果糖原浓度高于该水平，则肌原间糖原没有增加，表明重叠33。这可以通过外推糖原体积分数与较低糖原浓度下的浓度之间的关系来解决。
基于TEM提供的nm分辨率，该协议是目前估计糖原亚细胞分布的唯一方法。此外，该方法还允许大规模定量方法（如此处所述），其中可以在单根光纤级别获得定量值。这在各种类型的运动期间纤维募集具有高异质性的骨骼肌中非常重要2，其中糖原依赖性疲劳机制仅发生在某些纤维中。该方法还具有作为心肌细胞的其他可兴奋组织的潜力，其中糖原已知对正常心脏功能至关重要，并且在缺血期间至关重要23，34。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项工作得到了瑞典奥林匹克委员会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-Propylene oxide | Merck | 75-56-9 | |
| Embedding 812 resin medium kit | Taab | T031 | |
| Glutaraldehyde solution 25% | Merck | 1.04239.0250 | |
| ITEM | Olympus | Imaging software | |
| Leica EM AC20 | Leica | Automatic contrasting system | |
| OSIS Veleta digital camera | Olympus | ||
| Osmium tetroxide 4% solution | Polysciences | 0972A | |
| Philips CM 100 Transmission EM | Philips | ||
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 455989-245G | |
| Sodium cacodylatbuffer 0,2 M ph 7.4 | Ampliqon.com | AMPQ40989.0500 | |
| Ultra-microtome Leica UC7 | Leica | ||
| Ultrostain lead citrate 3%, stabilised solution | Leica | 16707235 | |
| Uranyl acetate dihydrate | Polysciences | 6159-44-0 |
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