Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Langendorff Preparatında Yenidoğan Murin Kalplerinin Kullanımı için Modifiye Tekniği

Published: March 4, 2022 doi: 10.3791/63349
Automatic Translation
1, 2
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Anesthesiology, Columbia University Medical Center

Summary

Mevcut protokol ex-vivo neonatal murin kalbin aort kanülasyonunu ve retrograd perfüzyonunu tanımlamaktadır. Diseksiyon mikroskobu ve körelmiş küçük çaplı bir iğne kullanan iki kişilik bir strateji, güvenilir kanülasyona izin verir. Uzunlamasına kontraktil gerilimin miktarı, sol ventrikülün tepesine bağlı bir kuvvet dönüştürücü kullanılarak elde edilir.

Abstract

Ex-vivo retrograd perfüze kalbin kullanımı, Oskar Langendorff tarafından bir asırdan fazla bir süre önce geliştirilmesinden bu yana iskemi-reperfüzyon araştırmasının temel taşı olmuştur. Bu teknik son 25 yılda farelere uygulanmış olmasına rağmen, bu türdeki kullanımı yetişkin hayvanlarla sınırlı kalmıştır. Yenidoğan murin aortunu tutarlı bir şekilde kanüle etmek için başarılı bir yöntemin geliştirilmesi, genetik olarak değiştirilebilir ve düşük maliyetli bir türde kritik bir kardiyak gelişim döneminde izole retrograd perfüze kalbin sistematik olarak incelenmesine izin verecektir. Langendorff preparatının modifikasyonu, iskemik zamanı en aza indirirken yenidoğan murin kalbinde kanülasyon ve reperfüzyonun kurulmasını sağlar. Optimizasyon, yenidoğan fare aortunun diseksiyon mikroskobu ve modifiye edilmiş ticari olarak temin edilebilen bir iğne kullanılarak başarılı bir şekilde kanülasyonuna izin vermek için iki kişilik bir teknik gerektirir. Bu yaklaşımın kullanımı 3 dakika içinde retrograd perfüzyonu güvenilir bir şekilde kuracaktır. Yenidoğan fare kalbinin kırılganlığı ve ventrikül boşluğu boyutu, bir balon kullanılarak üretilen intraventriküler basıncın doğrudan ölçülmesini engellediğinden, uzunlamasına kontraktil gerilimi ölçmek için sol ventrikülün tepesine bir dikişle bağlanmış bir kuvvet dönüştürücünün kullanılması gerekir. Bu yöntem, araştırmacıların izole edilmiş sabit akışlı retrograd-perfüze yenidoğan murin kalp hazırlığını başarılı bir şekilde kurmalarına izin vererek, gelişimsel kardiyak biyolojinin ex-vivo bir şekilde incelenmesine izin verir. Önemli olarak, bu model yenidoğan kalbindeki iskemi-reperfüzyona fizyolojik ve farmakolojik yanıtları araştırmak için güçlü bir araç olacaktır.

Introduction

Ex-vivo kalp preparatları, bir yüzyılı aşkın bir süredir fizyolojik, patofizyolojik ve farmakolojik çalışmaların temel bir unsuru olmuştur. 1860'larda Elias Cyon'un çalışmalarından kaynaklanan Oskar Langendorff, izole kurbağa modelini retrograd perfüzyon için uyarladı ve oksijenli bir perfüzyon1 ile koroner akış sağlamak için aort kökünü basınçlandırdı. Langendorff, adaptasyonunu kullanarak koroner dolaşım ve mekanik fonksiyon2 arasında bir korelasyon gösterebildi. Daha sonra Langendorff tekniği olarak adlandırılan ex-vivo retrograd perfüze kalp, fizyolojik araştırmanın temel taşı olarak kaldı ve potansiyel karışıklıkların yokluğunda izole kalbi güçlü bir şekilde incelemek için basitliğinden yararlandı. Langendorff preparatı, kalbin ("çalışan kalp" olarak adlandırılır) dışarı çıkmasına izin vermek ve perfüzyonun yeniden dolaşmasına izin vermek için daha da modifiye edilmiştir3. Bununla birlikte, ilginin birincil fizyolojik bitiş noktaları değişmeden kalmıştır. Bu son noktalar arasında kontraktil fonksiyon, elektriksel iletim, kardiyak metabolizma ve koroner direnç ölçümleribulunur 4.

Orijinal kurbağa kalp preparatında kardiyak fonksiyonu değerlendirmek için Langendorff, kalbin tepesi ile bir kuvvet dönüştürücü arasına bağlı bir sütür kullanarak uzunlamasına eksende ventriküler kasılmanın yarattığı gerginliği ölçtü. 5 İzometrik kasılma, ventrikül dolgusu yokluğunda kalbe uygulanan bazal gerilim ile bu şekilde ölçüldü. Yaklaşımın iyileştirilmesi, izovolumik kontraksiyon sırasında miyokard performansını değerlendirmek için sol atriyum yoluyla sol ventriküle sıvı dolu balonların yerleştirilmesine yol açmıştır6. Kardiyak ritmi ve kalp atış hızını değerlendirmek için, araştırmacıların elektrokardiyogramı kaydetmelerini sağlamak için kalbin kutuplarına yüzey uçları yerleştirilebilir. Bununla birlikte, zorunlu denervasyon göz önüne alındığında, göreceli bradikardi beklenebilir. Dışsal pacing bunun üstesinden gelmeye ve deneyler arasındaki kalp atış hızı değişkenliğini ortadan kaldırmaya hizmet edebilir1. Bir diğer sonuç ölçütü olan miyokard metabolizması, koroner perfüzyon ve atık sudaki oksijen ve metabolik substrat içeriğinin ölçülmesi ve aralarındaki farkın hesaplanması ile değerlendirilebilir7. Koroner atık sudaki laktat miktarı, hipoksi, hipoperfüzyon, iskemi-reperfüzyon veya metabolik pertürbasyonlarda görüldüğü gibi anaerobik metabolizma dönemlerinin karakterize edilmesine yardımcı olabilir7.

Langendorff'un orijinal çalışması, kedileri birincil denek olarak kullanarak ex-vivo memeli kalbinin incelenmesini sağladı5. İzole sıçan kalbinin değerlendirilmesi, 1900'lerin ortalarında, 1967'de 'çalışan kalp' sıçan modelini detaylandıran Howard Morgan ile popülerlik kazandı5. Farelerin kullanımı, teknik karmaşıklık, doku kırılganlığı ve nispeten küçük murin kalp boyutu nedeniyle sadece 25 yıl önce başladı. Farelerin incelenmesiyle ilgili zorluklara rağmen, düşük maliyetler ve genetik manipülasyon kolaylığı, bu tür murin ex-vivo preparatlarının çekiciliğini ve talebini arttırmıştır. Ne yazık ki, tekniğin uygulanması yetişkin hayvanlarla sınırlıydı, 4 haftalık yavru fareler yakın zamana kadar ex-vivo çalışma için kullanılan en genç deneklerdi 8,9. Genç fareler yetişkinlerle karşılaştırıldığında "nispeten olgunlaşmamış" olsa da, gelişimsel biyoloji çalışmaları için denek olarak faydaları sınırlıdır, çünkü büyük ölçüde doğum barajlarından sütten kesilmişlerdir ve yakında ergenliğe başlayacaklar10. Ergenlik, glukoz ve laktattan yağ asitlerine miyokard substrat kullanımında doğum sonrası geçişin çok ötesinde gerçekleşir11. Bu nedenle, yenidoğan kalbindeki metabolik değişiklikler hakkındaki çoğu bilgi, tarihsel olarak tavşanlar ve kobay11 gibi daha büyük türlerdeki ex-vivo çalışmalardan kaynaklanmaktadır.

Gerçekten de, Langendorff hazırlığına alternatif yaklaşımlar mevcuttur. Bunlar, tüm organ fonksiyonel verilerinden ve bağlamından yoksun olan in vitro deneyleri veya in vivo çalışmaları içerir. Bu, gerekli bir anestezik ajanın kardiyovasküler ve solunum etkileri, nörohumoral girdinin etkisi, çekirdek sıcaklığının sonuçları, hayvanın beslenme durumu ve substrat mevcudiyeti12,13 gibi kafa karıştırıcı değişkenlerle teknik olarak zor ve karmaşık olabilir. Langendorff yaklaşımı, izole edilmiş perfüze edilmiş kalbin, bu tür karışıklıkların yokluğunda daha kontrollü bir şekilde ex-vivo bir şekilde incelenmesine izin verdiği için, güçlü bir araştırma aracı olarak kabul edilmiştir ve edilmeye devam etmektedir. Bu nedenle, burada sunulan teknik, araştırmacılara yenidoğan murin kalbinin ex-vivo çalışması için deneysel bir yaklaşım sunar ve reperfüzyon süresini sınırlar.

Gelişim dönemlerinde kalbin araştırılması, miyokard olgunlaşması sırasında meydana gelen geniş kapsamlı biyokimyasal, fizyolojik ve anatomik geçişler göz önüne alındığında önemli bir husustur. Anaerobik metabolizmadan oksidatif fosforilasyona geçişler, substrat kullanımındaki değişiklikler ve hücre proliferasyonundan hipertrofiye ilerleme, olgunlaşmamış kalpte benzersiz bir şekilde meydana gelen dinamik süreçlerdir11,14. Gelişmekte olan kalbin bir diğer kritik yönü, gerekli dönemlerde karşılaşılan stresörlerin yenidoğan kalbinde yüksek tepkiler üretebilmesi ve yetişkinlikte hakaretlere karşı gelecekteki duyarlılığı değiştirebilmesidir15. Önceki çalışmalar, Langendorff perfüze edilmiş yenidoğan kalbini incelemek için yeni doğmuş sıçanları, kuzuları ve tavşanları kullanmış olsa da, bu türün gelişimsel biyoloji araştırmalarına verdiği önem göz önüne alındığında, farelerin kullanımına izin veren ilerlemeler gereklidir16. Bu ihtiyacı karşılamak için, 10 günlük hayvanları kullanan ilk murin Langendorff perfüze yenidoğan kalp modeli yakın zamanda kurulmuştur6. Burada başarılı aort kanülasyonunu mümkün kılan ve izole yenidoğan murin kalbinin retrograd perfüzyonunu sağlayan bir yöntem sunulmuştur. Bu yaklaşım farmakoloji, iskemi-reperfüzyon veya tüm organ fonksiyonlarına odaklanan metabolizma çalışmaları için kullanılabilir veya kardiyomiyositlerin izolasyonu için uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin açıklanan tüm yöntemler için onayları alınmıştır. Çalışma için vahşi tip C57Bl/6 erkek doğum sonrası gün 10 fare kullanıldı.

1. Langendorff aparatının hazırlanması

  1. Karmaşıklığı en aza indirmek için, Langendorff aparatı içinde sabit akış veya sabit basınç yoluyla devridaim yapmayan oksijenli perfüzyonat kullanın (bkz.
    1. 120 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgSO 4, 1.2 mmol/L KH 2 PO 4, 1.25 mmol/L CaCl2, 25 mmol/L NaHCO3 ve pH7.4'te 11 mmol/L glikoz içeren Krebs-Henseleit tamponunu (KHB) kullanın (bkz. Malzeme Tablosu), Langendorff aparatı içindeO2'nin %95'i ve CO2'nin %5'i ile dengeleyin ve 37 °C'de tutun.
  2. Sabit akış yaklaşımı için, ~ 2,5 mL∙min-1'de sürekli bir akış hızı tutun.
    NOT: Bu akış hızı, 10 günlük (P10) bir fare kalbinin ortalama ağırlığının ~ 30 mg 17,18 olduğu göz önüne alındığında, ~ 75-80 mL / g ∙min koroner akışa yaklaşacaktır.

2. Aort kanülü imalatı

  1. Yeni doğmuş fare aort kanülünü 26 G paslanmaz çelik bir iğneden imal edin ( bkz. Keskin makas kullanarak, ucunu köreltmek için iğnenin ucunu kesin. İğne lümeninin çapını kıvırmamaya veya kısıtlamamaya dikkat edin. Kesme kenarını pürüzsüzleştirin ve laboratuvar tezgahındaki körelmiş ucu bir to-fro hareketi kullanarak nazikçe kazıyarak herhangi bir bursu çıkarın.
    NOT: Mikroskobik burs ve keskin kenarlar çıkarılmalıdır, çünkü yenidoğan fare aortunu yırtabilir ve aort kapağına zarar verebilirler. Alternatif olarak, ince kumlu zımpara kağıdı kullanın.
  2. Fabrikasyon kanülü Langendorff aparatına takın ve akışı ve direnci değerlendirin. Bilinen bir süre boyunca tampon miktarını toplayarak ve ölçerek kanül boyunca akış hızlarını ölçün. Gerçek akışın 2,5 mL min-1 olarak ayarlanan akış hızına eşit olduğundan emin olun.
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek kanül boyunca KHB akan basınç farkını ölçün.
    1. Fabrikasyon kanül takılı olsun veya olmasın sistemdeki basıncı ölçün.
    2. Ohm yasası15'e göre kanül direnci elde etmek için kanül arasındaki basınç farkını akış hızına bölün.
    3. Fabrikasyon kanül direncinin, toplam direncin ~ 16.0 ± 1.9 mmHg∙min∙mL-1'ini içerdiğinden eminolun 6. Aşırı direnç, potansiyel olarak tehlikeye atılmış bir kanül lümeni olduğunu düşündürmektedir.
      NOT: Örnek hesaplama:Kanüllü P - Kanülsüz P = ΔP. Eğer P= 48 veP olmadan = 8 ise, ΔP = 40. 2,5 mL min-1 akış hızında (Q) ve 40 kanül direncinin ΔP'sinde, R = Δ P /Q = 40 / 2,5 = 16 kullanılarak 16 mmHg∙min∙mL-1'e eşittir.
  4. 26 G kanülü çıkarın ve yüksek basınçlı boruyu ( bakınız Malzeme Tablosu) Langendorff aparatı üzerindeki kanülasyon alanına takın. Aort kanülünü borunun distal ucuna takın. Boruyu ve kanülü oksijenli tamponla havalandırarak tüm kabarcıkların çıkarılmasını sağlayın.
    NOT: Yüksek basınçlı boruların bu şekilde kullanılması, kanülün daha uzak bir konuma uzatılmasına izin verir. Bu, kuruluma bitişik bir diseksiyon mikroskobu ile aort kanülasyonuna izin vermek için gereklidir (Şekil 1).

3. Organ toplama

  1. 1 mL şırınga üzerinde 26 G'lik bir iğne kullanılarak koroner mikrotrombüs oluşumunu önlemek için intraperitoneal (IP) heparin (10 kU / kg) enjeksiyonu yoluyla antikoagülat fareler ( Malzeme Tablosuna bakınız). Herhangi bir anestezik enjeksiyonuna devam etmeden önce heparinin dolaşması için birkaç dakika bekleyin.
  2. 1 mL şırınga üzerinde 26 G'lik bir iğne kullanarak hayvanı IP enjeksiyonu ile anestezi yapın.
    NOT: Apne ve sonraki hipoksiden kaçınmak için anestezik enjeksiyondan sonra hayvanı dikkatlice izlemek önemlidir. Pentobarbital (70 mg/kg), apne 19,20'yi indüklemeden sedasyonun hızlı başlamasına izin verdiği için güvenilir bir anestezik seçeneğidir. Kullanılan dozların apne21'e neden olmaması koşuluyla diğer anestezik ajanlardan yararlanılabilir. Araştırmacılar alternatif yatıştırıcı-hipnotiklerin kardiyak fonksiyon üzerindeki etkilerini göz önünde bulundurmalıdır22,23. Ötanazide primer mod olarak servikal çıkık, kanülasyon öncesi hipoksi ve iskemiyi uzatabilir.
  3. Fareyi sırtüstü pozisyona yerleştirin ve bilinç kaybından hemen sonra uzuvları sabitleyin. Her bir uzvu sabitlemek için küçük ölçülü hipodermik iğneler kullanın. Hayvan ayak parmağı sıkışmasına cevap vermediği anda hasada başlayın; Hayvan ilk diseksiyon sırasında kendiliğinden nefes almalıdır.
  4. Düz diseksiyon makası kullanarak karın boşluğunu ortaya çıkarmak için hayvanın genişliği boyunca enine bir subksifoid kesi yapın (bkz.
    NOT: Steril teknik, prosedürün hayatta kalmayan cerrahiyi temsil ettiği göz önüne alındığında gerekli değildir.
    1. Diyaframı üstün bir şekilde tanımlayın ve ön kısmı tamamen kesin. Göğüs kafesini orta aksiller çizgi boyunca iki taraflı olarak sefalad yönünde kesin. Bir asistandan ksifoid süreci forseps ile kavramasını ve torasik organları ortaya çıkarmak için sternum ve kaburgaları kraniyal olarak yansıtmasını isteyin.
  5. Karaciğerin üzerindeki infra-diyafragmatik inferior vena kavayı (IVC) tanımlayın. IVC'yi kavisli bir iris makası ile transekte iris forseps ile proksimal segmentte hafif ön ve sefalad gerilimini korurken (bkz.
    1. IVC'yi göğüs boşluğundan yukarı ve dışarı çekerken kavisli iris makası kullanarak omurganın ön yüzeyi boyunca posterioral olarak kesin. Kalp harekete geçtikçe, makası önden açın ve kalbi ve akciğerleri tamamen çıkarmak için büyük damarları üstün bir şekilde ayırın.
      NOT: Bu yöntem, kalbin ve akciğerlerin en blok halinde hızlı bir şekilde ekplantasyonuna izin verir.
  6. Numuneyi hemen buz gibi soğuk KHB veya salin içine batırın. Kalp saniyeler içinde atmayı bırakmalıdır.

4. Kanülasyon

  1. Bir parça kağıt havlu kesin ve kanülasyon sırasında kalbi stabilize etmek için sürtünme sağlamak için sığ bir Petri kabının dibine yerleştirin. Kalbin yapışmasını önlemek için buz gibi soğuk KHB ile nemlendirin.
    1. Hazırlanan Petri kabını diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve odağı ayarlayın. Yüksek basınçlı uzatma borusuna tutturulmuş aort kanülünü, diseksiyon mikroskobunun altına, göbeğinin etrafına gevşek bir şekilde bağlanmış 5-0 ipek bir sütür ile birlikte yerleştirin (bkz.
      NOT: Petri kabındaki sıvı miktarını sınırlamak için özen gösterilmelidir, çünkü hava dolu akciğerler yüzebilir ve eksize edilen organların hareket etmesine neden olabilir.
  2. Eksize edilen torasik organları Petri kabına yerleştirin. Mikroskop altında, timusu beyaz parlaklığı ve iki lobuyla tanımlayın ve örneği, timus ön ve üstün24 olacak şekilde yönlendirin. Bu, kalbin doğru yönlendirilmesini sağlayacaktır.
  3. Forseps kullanarak, büyük damarları açığa çıkarmak için timusun loblarını açıkça ayırın. Aort arkının ayırt edici dallanma özelliklerini bularak aortu tanımlayın.
    NOT: Koyu mor bir renk tonu genellikle sağ ventrikülü ve pulmoner arteri sınırlar. Asendan aort ana pulmoner arter ile sağ atriyum arasında yer alır.
  4. Aortu ince keskin makasla transekte edin (bakınız Malzeme Tablosu) subklaviyen arter kalkışına sadece proksimal olarak.
    NOT: Aort aort kapağına çok yakın transekte edilirse, kanülün sabitlenmesini sağlamak için yeterli aort dokusu olmayacaktır. Alternatif olarak, aort çok yükseğe transekte edilirse, perfüzyon bir veya daha fazla aort dalından (subklaviyen arter gibi) sızabilir.
  5. Kuyumcu tarzı ince kavisli forseps kullanarak transekte aortu nazikçe kavrayın (bkz. Aort kapağına zarar vermemeye dikkat ederek aortu 26 G künt iğne ile dikkatlice kanüle edin. Kanülün etrafındaki ince kavisli forseps ile aortu kavrayarak yerinde tutun. Aortun kontrolü sağlandıktan sonra, iskemik zamanı sınırlamak için retrograd perfüzyonu başlatın.
    NOT: Kalp atmaya başlamalı ve miyokarddan kan boşaltıldıkça ve KHB koroner arterleri perfüze ettiğinden soluklaşacaktır. Spontan atma başarısızlığı, ventriküler engorgement varlığı veya kalbin renk değişikliği olmaması hatalı konumlanmış bir kanüle işaret eder.
  6. Asistandan gevşek bağlanmış dikişin uçlarını kavramasını isteyin ve aortu kanülün etrafına dikkatlice sokun. Aort dokusunun miktarına ve anatomik hususlara bağlı olarak, kavisli ince forsepslerin üstündeki veya altındaki dikişi (kanülü yerinde tutarak) sıkıştırın. Dikişi sıkın ve koroner akışın yeterliliğini onaylayın.
  7. Yüksek basınçlı boruyu Langendorff cihazından ayırın. Kanülün göbeğini kavrayın ve künt iğneyi yüksek basınçlı uzatma borusundan ayırın. Kanülün göbeğini cihaza hızla takın.
    NOT: Kalbi yerinden çıkarmamaya veya havayı kanüle sokmamaya özen gösterilmelidir.
  8. Kalp Langendorff aparatına normal pozisyonda asıldıktan ve yeterli perfüzyon onaylandıktan sonra, akciğer, timus ve fazla dokuyu dikkatlice kesin. Koroner sinüs atık suyunun serbestçe damlamasına izin vermek için sağ atriyumu kesin.

5. İşlevsel ölçüm

  1. 5-0 ipek dikişin sonunda küçük bir düğüm yapın (kavisli bir iğneye tutturulmuş). İğne ile küçük bir parafin filmi parçasını (2-3 mm x 2-3 mm) delin ve parafini düğümlü uca kaydırın. İğneyi ventrikülün tepesinden dikkatlice geçirin ve parafin filmi ventrikülün lateral duvarına yaslanana kadar sütürü kalpten çekin.
    NOT: Parafin filmi, düğümün kalbi yırtmasını ve ventrikülden çekilmesini önlemeye yardımcı olur.
  2. İğneyi Langendorff aparatının su dolu ısıtma ceketinin açıklığından geçirin. Kalp şimdi kaplanabilir ve ısıtılabilir.
  3. İğneyi kuvvet dönüştürücüsüne (bakınız Malzeme Tablosu) koroner sinüs damlamasını önleyecek şekilde takın. Sütürü, diyastolik gerilim veya gerginlik izlemede nadir olarak belirtildiği gibi 1-2 g bazal gerilim uygulayacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Kalbi kanülden çekmekten veya aortu bükmekten kaçının, böylece koroner perfüzyondan ödün verin.
  4. Elektrokardiyogramı kaydetmek için yüzey elektrotlarını kalbin üst ve alt kutuplarına yerleştirin.
    NOT: Bio Amp'a bağlı esnek yüzey elektrodu için iğne çıkarılmış pediatrik geçici epikardiyal pacing teli kullanın (bkz.
  5. 24 G IV kateter kullanarak analiz için koroner sinüs atık suyunu örnekleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
  6. Kirchhoff'un yasası25'e göre koroner direnç elde etmek için kanül direncini toplam sistem direncinden çıkarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

P10 fareleri, insan bebeklikdöneminde 26,27 bir zaman noktasını modellemek için kullanıldı. On beş izole C57Bl/6 yenidoğan fare kalbi başarıyla hasat edildi ve kanüle edildi. Kalpler, 2.5 mL min-1 ısıtılmış oksijenli KHB'nin sürekli akışı ile perfüze edildi. Glukoz ekstraksiyonu, oksijen tüketimi, laktat üretimi gibi metabolik parametreler ve kalp atış hızı, perfüzyon basıncı ve koroner direnç gibi fizyolojik parametreler ölçüldü. Yüzey elektrotları, içsel hız ve ritmin belirlenmesine izin veren sürekli bir elektrokardiyogramı kaydetmek için kullanıldı (Şekil 2). Uzunlamasına eksendeki kasılma kuvveti, Langendorff 28 tarafından tanımlanan yöntem kullanılarak belirlendi.

Metabolik değerlendirme, perfüzyonun yeterliliğini değerlendirmek için yapıldı. Yüzde oksijen ekstraksiyonu, koroner atık sudaki oksijen içeriğinin perfüzyondan çıkarılmasıyla hesaplandı. Miyokard oksijen tüketimi, koroner akış hızının, perfüzyonat ve koroner atık su arasındaki oksijen içeriğindeki farkın oksijenin çözünürlüğü ile çarpılmasıyla (37 ° C'de 24 μL / mLH2O ve 760 mmHg varsayılarak) 29,30 ile çarpılarak belirlendi. Bu hesaplamalar kullanılarak, ihmal edilebilir laktat üretimi ve düşük oksijen ekstraksiyonu ve glikoz tüketimi göz önüne alındığında, bu perfüzyon stratejisinin yenidoğan fare kalbinin metabolik ihtiyaçlarını karşıladığı belirlenmiştir (Tablo 1).

Tüm kalpler sinüs ritminde kendiliğinden atar (Şekil 2). Bununla birlikte, beklendiği gibi, ortalama denervated intrinsik kalp hızı, in vivo31'de bildirilen yenidoğan murin kalp atış hızlarından daha yavaştı. Ortalama gözlenen aort perfüzyon basınçları, yenidoğan farelerde tanımlanan ortalama arteriyel basınçlarla iyi korelasyon gösterdi32. Diğer fizyolojik değişken ortalamalar kaydedildi ve hesaplandı (Tablo 2).

Gözlemsel verilere dayanarak, yenidoğan hazırlığının tutarlılığını sağlamak için dışlayıcı kriterler göz önünde bulundurulmalıdır (Tablo 3). Preparatın sağlamlığı için kritik olan bir faktör, reperfüzyonu başlatmak için gereken süredir. Kanülasyon, yenidoğan fare aortunun küçük boyutu ve kırılganlığı göz önüne alındığında, prosedürün en zorlu adımıdır. Kanülasyonun kurulmasında veya reperfüzyonun başlatılmasında uzun süreli bir gecikme, sağlıklı kalbe zarar verecek veya hatta miyokard1'i ön koşullandıracaktır. Bu nedenle, iskemik sürenin 4 dakikanın altına indirilmesi önerilmektedir (yetişkin kemirgen kalbi için kılavuzlarla tutarlı)1. Başarılı kanülasyonun ardından, perfüzyonun yeterliliğinin değerlendirilmesi çok önemlidir. Yetersiz miyokard perfüzyonu belirtileri arasında uzun süreli aritmiler, kalp atış hızı aşırılıkları veya aort perfüzyon basıncı aşırı uçları bulunur.

Figure 1
Şekil 1: Aort kanülasyon kurulumu . (A) Yüksek basınçlı boruların proksimal ucu "normal" kanül pozisyon bölgesine (B'de gösterilmiştir) tutturulmuştur. Kanül, borunun distal ucuna tutturulur (C cinsinden büyütülür). (B) Aparat içinde "Normal" kanül pozisyonu. (C) Kanül, çıkarılma kolaylığı için yüksek basınçlı borunun "kayma ucu" ucuna tutturulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: Ex-vivo retrograd-perfüzyonlu yenidoğan fare kalbi. 26 G künt iğne ile başarılı bir aort kanülasyonundan sonra 10 günlük doğum sonrası fare kalbinin görüntüsü. Koroner atık su, sağ atriyumdaki bir kesiden kalpten damlarken görülebilir. Elektrokardiyogramı sürekli ölçmek için kutuplara paslanmaz çelik yüzey elektrotları yerleştirildi. Temsili EKG takibi sağda yeşil renkte görüntülenir ve sinüs ritmi ve 194 vuruş min-1 oranı gösterir. Resimde görülmeyen, kalbin tepesi ile kuvvet transdüseri arasında bağlı olan ve ventriküler kontraktil kuvvetin (sağda kırmızı ile gösterilen dalga formu) ölçülmesine izin veren sütürdür. Referans6'nın izniyle uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Metabolik parametre Zengin Atık Tüketim Çıkarma
Glikoz, mg·dL−1 194,3 ± 3,8 193,0 ± 5,5 1.4 ± 0.8 mg·dL−1
Laktat, mmol· L−1 < 0.3 ± 0.0 < 0.3 ± 0.0
P02, mmHg 641 ± 7,9 295 ± 18,4 28,2 ± 1,3 μL·min−1 55,7 ± %2,3

Tablo 1: İzole perfüze yenidoğan murin kalplerinin metabolik parametreleri. Değerler, SE ± ortalamalardır. Zengin ve koroner atık su örneklendi ve PO2 (kısmi oksijen basıncı), glikoz ve laktat ölçüldü. Glikoz alımı, oksijen ekstraksiyonu ve tüketimi hesaplandı. Zengin ve atık sudaki fark, ekstraksiyonu belirler. Tüketim, 760 mmHg'de koroner akış x (PaO 2- PvO 2) xO2 çözünürlüğü olarak hesaplanır (37 °C'de24μL/mL H2 O ve 760 mmHg olduğu varsayılarak).

Fizyolojik Parametre Demek
Aort perfüzyon basıncı, mmHg 47,9 ± 6,9
Koroner direnç, mmHg·min·mL−1 19,2 ± 2,8
Kalp atış hızı, atışlar·min−1 226 ± 8,9
Ventriküler kasılma kuvveti, g 7.2 ± 1.2

Tablo 2: İzole perfüze yenidoğan murin kalplerinin fizyolojik parametreleri. Koroner direnç±, 2.5 mL min-1 koroner akış hızına ve Ohm yasası kullanılarak aort basıncına dayanarak hesaplanmıştır. Kirchoff'un seri direnç yasasına göre, aort basıncı sistemdeki taban çizgisi direncinin üzerindeki basınç olarak hesaplanmıştır. Kalp atış hızı yüzey elektrodu ile ölçüldü ve kontraktil kuvvet, kalbin tepesini bir kuvvet dönüştürücüsüne bağlayan bir sütür ile ölçüldü. Bu tablo Referans6'nın izniyle yeniden basılmıştır.

Fizyolojik Parametre Dışlayıcı Eşik
Reperfüzyon süresi, dk >4
Aort perfüzyon basıncı, mmHg <20 veya >75
Kalp atış hızı, atışlar·min−1 <150 veya >300
Aritmi süresi, dk >3

Tablo 3: Yenidoğan murin kalp Langendorff preparatları için önerilen dışlama kriterleri. Bu tablo Referans6'nın izniyle yeniden basılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada izole yenidoğan fare kalbindeki başarılı aort kanülasyonu ve retrograd perfüzyon tanımlanmıştır. Daha da önemlisi, araştırmacıların genç murin yaşının ve küçük kalp boyutunun daha önce8 sunduğu engellerin üstesinden gelmelerini sağlar. Tasarımda karmaşık olmasa da, yaklaşım önemli derecede teknik beceri gerektirir. Teknik olarak en yetkin araştırmacılara bile kaçınılmaz olarak meydan okuyacak kilit adımlar, aortun kanülasyonu ve kanülün yerinde sabitlenmesi olacaktır. Yenidoğan kanülasyonu ile ilgili zorluk sadece aort lümeninin küçük boyutundan kaynaklanmaz. Yükselen aortun nispeten kısa uzunluğu (aort kapağı ile sağ subklaviyen kalkış arasındaki aort dokusu), araştırmacıları aort kanülünü hassas bir şekilde kontrol etmeye zorlayabilir ve ekip arkadaşları arasında dikkatli bir koordinasyon gerektirebilir. Kanülün bu bölge içinde uygun şekilde konumlandırılmaması ve sabitlenmemesi, preparatı mahvedebilir. Örneğin, kanülün çok derin ilerlemesi aort kapağına zarar verebilir veya intraventriküler kanülasyona neden olabilir. Kanülün aort kemeri içinde çok sığ bir şekilde yerleştirilmesi, subklaviyen arter gibi dallardan birinden sızıntının yayılmasına neden olabilir. Ayrıca, güçlü kanülasyon aortu yırtabilir. Sanatsal olmayan kanülasyonun bu tür sonuçları, yüksek akış hızları veya düşük perfüzyon basınçları ile ortaya çıkacaktır1. Alternatif olarak, düşük akış hızları veya yüksek perfüzyon basınçları trombüs, hava embolisi, kanül tıkanıklığı veya koroner obstrüksiyon1 varlığını gösterebilir. Aritmi, bradikardi veya taşikardi, etiyolojiden bağımsız olarak yetersiz perfüzyon belirtileridir 1,33.

Başlangıçta ortak ve basit bir perfüzyon stratejisi seçilmelidir; tamponlanmış kristaloid kullanılarak sürekli akış, kendiliğinden atan bir kalpte substrat olarak glikoz ile perfüzyon1. Bu yaklaşıma adaptasyonların gelecekteki çalışmalarda değerlendirilmesi gerekecek ve farklı perfüzyon yaklaşımlarının ve alternatif perfüzyon ve substrat stratejilerinin etkisinin bir değerlendirmesini içermelidir. Bu preparattaki miyokard perfüzyonunun P10 kalpleri için yeterli olduğu gösterilmiş olsa da, seçilen akış hızı yenidoğan kalbinin ihtiyaçlarını aşabilir. Bunun nedeni, 10 günlük farelerde kalp debisinin yaklaşık 5.3 mL min-1 31 olmasıdır. Bu nedenle, gelecekteki çalışmalar farklı akış hızlarının etkisini araştırmalı ve sabit basınç stratejilerini değerlendirmelidir. 

Sabit basınç yaklaşımları, maksimum basıncı sınırlamak için gerçek zamanlı akış ayar mekanizmalarını veya bir açılır valfiiçerebilir 5. Bu, iskemi-reperfüzyon hasarını incelerken, koroner otoregülasyonun bu bağlamda değerlendirilmesinin önemi göz önüne alındığında özellikle önemli olabilir5. Ek olarak, intrinsik kalp atış hızı perfüzyonun yeterliliği için bir biyobelirteç olarak kullanılabilirken, pacing stratejilerinin uygulanabilir olması muhtemeldir ve gelecekte araştırılmalıdır. Son olarak, gelecekteki çalışmalar oksijenli perfüzyondaki alternatif enerji substratlarını da değerlendirmelidir. Bunun nedeni, yenidoğan kalbinin yenidoğan döneminde glikoz ve laktat kullanmaktan yağ asitleri tüketmeye geçmesidir11,14. Bu nedenle, alternatif metabolik substratlar, gelişimin bu kritik döneminde fizyolojik olarak daha alakalı olabilir.

Murin kardiyak fonksiyonunun değerlendirilmesinde metodolojik gelişmeler ortaya çıkmaya devam etmektedir. Langendorff preparatını kullanan toplam araştırma çalışması sayısı 1990'lardan bu yana her yıl tutarlı kalmasına rağmen, murine özgü ex-vivo uygulamaları kullanan çalışmaların yüzdesi istikrarlı bir şekildeartmıştır 5. Böylece izole murin kalbin bilimsel bir model olarak önemi zamanla artmıştır. Burada açıklanan yöntem gibi yenilikler, artık alanın yeni doğmuş fare kalbine yaklaşımı genişletmesine izin veriyor. İskemi-reperfüzyon araştırmalarındaki faydasına ek olarak, böyle bir yöntem diğer araştırma tekniklerine ek olarak da hizmet edebilir. Örneğin, yenidoğan fare kalbinin başarılı bir şekilde kanülasyonu, kardiyomiyosit izolasyonunu kolaylaştırabilir. Bugüne kadar, yenidoğan fare kardiyomiyositlerini izole etmek için sadece daha düşük verime sahip 'yığın' sindirim yöntemleri mevcut olmuştur34. Bu nedenle, yenidoğan Langendorff preparatının enzimatik ajanların retrograd infüzyonu ile kullanılması, izole kardiyomiyositlerin verimini ve kalitesini artırabilir35.

İskemik hasara yenidoğan yanıtı erişkininkine eşit değildir ve olgunlaşmamış kalp yenidoğan döneminde birkaç geçişe uğrar15,36. Bununla birlikte, yenidoğan kalbinin gelişim biyolojisinin sağlık ve hastalıkta daha iyi anlaşılması gerekmektedir. Hipoksi, iskemi ve reperfüzyonun yenidoğan ve erişkin kalpler arasındaki ayırıcı etkileri 1970'lerden beri araştırılmaktadır. Bununla birlikte, bu önceki çalışmalar, fare37'den daha büyük hayvan türlerinin kullanımı ile sınırlıydı. İlgilenilen spesifik yolları ve proteinleri incelemek için transgenik mutantlar üretme yeteneği, yeni doğmuş bir murin ex-vivo preparatının kurulmasını gerektirir. Burada detaylandırılan yöntem, izole yenidoğan murin kalbinin retrograd perfüzyonunu sağlamak için başarılı aort kanülasyonunu sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar iskemi-reperfüzyonu yenidoğan faresi ile ilgili olarak inceleyebileceklerdir. Bu tür araştırmalar, iskemi sırasında yenidoğana özgü koruyucu mekanizmaları, hipoksiye yenidoğan yanıtını ve sağlık ve hastalık durumları sırasında olgunlaşmamış kalpteki anatomik ve metabolik gelişimsel değişiklikleri daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır36,38,39. Bu nedenle, izole perfüze yenidoğan kalp modeli, gelişimsel kardiyak biyoloji araştırmaları için güçlü bir araç olduğunu kanıtlayacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

NIH/NINDS R01NS112706 (R.L.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rodent Langendorff Apparatus Radnoti 130102EZ
24 G catheter BD 381511
26 G needle on 1 mL syringe combo BD 309597
26 G steel needle BD 305111
5-0 Silk Suture Ethicon S1173
Bio Amp ADInstruments FE135
Bio Cable ADInstruments MLA1515
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
Circulating heating water Bath Haake DC10
curved iris scissor Medline MDS10033Z
dissecting microscope Nikon SMZ-2B
find spring scissors Kent INS600127
Force Transducer ADInstruments MLT1030/D
glucose Sigma-Aldrich G8270-100G
Heparin Sagent 400-01
High pressure tubing Edwards Lifesciences 50P184
iris dressing forceps Kent INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps Miltex 17-307-MLTX
KCl Sigma-Aldrich P3911-25G
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662-25G
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506-500G
NaCl Sigma-Aldrich S9888-25G
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6014-25G
Roller Pump Gilson Minipuls 3
straight dissecting scissors Kent INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire Ethicon TPW30
Wide Range Force Transducer ADInstruments MLT1030/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, R., Mocanu, M., Yellon, D. Retrograde heart perfusion: The Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
  2. Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szeląg, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
  3. Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: Cardiovascular system studies and technological advances. Medical and Biological Engineering and Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
  4. Döring, H. The isolated perfused heart according to Langendorff technique--function--application. Physiologia Bohemoslovaca. 39 (6), 481-504 (1990).
  5. Liao, R., Podesser, B., Lim, C. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: New advances in cardiac phenotyping. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 303 (2), 156-167 (2012).
  6. Barajas, M., Yim, P., Gallos, G., Levy, R. An isolated retrograde-perfused newborn mouse heart preparation. MethodsX. 7, 101058 (2020).
  7. De Leiris, J., Harding, D., Pestre, S. The isolated perfused rat heart: A model for studying myocardial hypoxia or ischaemia. Basic Research in Cardiology. 79 (3), 313-321 (1984).
  8. Liaw, N., et al. Postnatal shifts in ischemic tolerance and cell survival signaling in murine myocardium. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 305 (10), 1171-1181 (2013).
  9. Chaudhary, K., et al. Differential effects of soluble epoxide hydrolase inhibition and CYP2J2 overexpression on postischemic cardiac function in aged mice. Prostaglandins and Other Lipid Mediators. 104, 8-17 (2013).
  10. Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
  11. Onay-Besikci, A. Regulation of cardiac energy metabolism in newborn. Molecular and Cellular Biochemistry. 287 (1), 1-11 (2006).
  12. Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. Small and large animal models in cardiac contraction research: Advantages and disadvantages. Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).
  13. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: A matter of size. Frontiers in Physiology. 3 (345), 00345 (2012).
  14. Tan, C., Lewandowski, A. The transitional heart: From early embryonic and fetal development to neonatal life. Fetal Diagnosis and Therapy. 47 (5), 373-386 (2020).
  15. Zhang, P., Lv, J., Li, Y., Zhang, L., Xiao, D. Neonatal lipopolysaccharide exposure gender-dependently increases heart susceptibility to ischemia/reperfusion injury in male rats. International Journal of Medical Sciences. 14 (11), 1163 (2017).
  16. Ziyatdinova, N., et al. Effect of If Current Blockade on Newborn Rat Heart Isolated According to Langendorff. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 167 (4), 424-427 (2019).
  17. Teng, B., Tilley, S., Ledent, C., Mustafa, S. In vivo assessment of coronary flow and cardiac function after bolus adenosine injection in adenosine receptor knockout mice. Physiological reports. 4 (11), 12818 (2016).
  18. Xu, W., et al. Lethal cardiomyopathy in mice lacking transferrin receptor in the heart. Cell Reports. 13 (3), 533-545 (2015).
  19. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research. 53 (1), 55-69 (2012).
  20. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: Anesthetic considerations in preclinical research. ILAR Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  21. Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blümel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone, ketamine-xylazine, carfentanyl-etomidate). Research in Experimental Medicine. 184 (3), 159-169 (1984).
  22. Janssen, B., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  23. Zuurbier, C., Koeman, A., Houten, S., Hollmann, M., Florijn, W. Optimizing anesthetic regimen for surgery in mice through minimization of hemodynamic, metabolic, and inflammatory perturbations. Experimental Biology and Medicine. 239 (6), 737-746 (2014).
  24. Hard, G. Thymectomy in the neonatal rat. Laboratory Animals. 9 (2), 105-110 (1975).
  25. Sun, Z., Ambrosi, E., Bricalli, A., Ielmini, D. Logic computing with stateful neural networks of resistive switches. Advanced Materials. 30 (38), 1802554 (2018).
  26. Clancy, B., Finlay, B., Darlington, R., Anand, K. Extrapolating brain development from experimental species to humans. Neurotoxicology. 28 (5), 931-937 (2007).
  27. Hornig, M., Chian, D., Lipkin, W. Neurotoxic effects of postnatal thimerosal are mouse strain dependent. Molecular Psychiatry. 9 (9), 833-845 (2004).
  28. Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen. Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 61 (6), 291-332 (1895).
  29. Edlund, A., Wennmalm, Å Oxygen consumption in rabbit Langendorff hearts perfused with a saline medium. Acta Physiologica Scandinavica. 113 (1), 117-122 (1981).
  30. Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Wengrowski, A., Kay, M. Oxygen demand of perfused heart preparations: How electromechanical function and inadequate oxygenation affect physiology and optical measurements. Experimental Physiology. 100 (6), 603-616 (2015).
  31. Wiesmann, F., et al. Developmental changes of cardiac function and mass assessed with MRI in neonatal, juvenile, and adult mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 278 (2), 652-657 (2000).
  32. Le, V., Kovacs, A., Wagenseil, J. Measuring left ventricular pressure in late embryonic and neonatal mice. Journal of visualized experiments. (60), e3756 (2012).
  33. Bednarczyk, J., et al. Incorporating dynamic assessment of fluid responsiveness into goal-directed therapy: A systematic review and meta-analysis. Critical Care Medicine. 45 (9), 1538 (2017).
  34. Louch, W., Sheehan, K., Wolska, B. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  35. Ackers-Johnson, M., Foo, R. Langendorff-free isolation and propagation of adult mouse cardiomyocytes. Methods in Molecular Biology. 1940, 193-204 (2019).
  36. Peng, Y., Buller, C., Charpie, J. Impact of N-acetylcysteine on neonatal cardiomyocyte ischemia-reperfusion injury. Pediatric Research. 70 (1), 61-66 (2011).
  37. Jarmakani, J., Nakazawa, M., Nagatomo, T., Langer, G. Effect of hypoxia on mechanical function in the neonatal mammalian heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 235 (5), 469-474 (1978).
  38. Podesser, B., Hausleithner, V., Wollenek, G., Seitelberger, R., Wolner, E. Langendorff and ischemia in immature and neonatal myocardia: Two essential key-words in Today's cardiothoracic research. Acta Chirurgica Austriaca. 25 (6), 434-437 (1993).
  39. Popescu, M., et al. Getting an early start in understanding perinatal asphyxia impact on the cardiovascular system. Frontiers in Pediatrics. 8, 68 (2020).

Tags

Tıp Sayı 181 Aort kanülasyon ex-vivo kuvvet kalp iskemi-reperfüzyon izole edilmiş Langendorff fare yenidoğan retrograd perfüzyon ventriküler
Langendorff Preparatında Yenidoğan Murin Kalplerinin Kullanımı için Modifiye Tekniği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barajas, M. B., Levy, R. J. Modified … More

Barajas, M. B., Levy, R. J. Modified Technique for the Use of Neonatal Murine Hearts in the Langendorff Preparation. J. Vis. Exp. (181), e63349, doi:10.3791/63349 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter