Summary
يوضح هذا البروتوكول كيفية استكشاف ومقارنة وتفسير البروتين البشري glycome مع الموارد عبر الإنترنت.
Abstract
تم إطلاق مبادرة Glyco@Expasy كمجموعة من قواعد البيانات والأدوات المترابطة التي تغطي عدة جوانب من المعرفة في علم الأحياء السكري. على وجه الخصوص ، يهدف إلى تسليط الضوء على التفاعلات بين البروتينات السكرية (مثل مستقبلات سطح الخلية) والبروتينات المرتبطة بالكربوهيدرات بوساطة الجلايكان. هنا ، يتم تقديم الموارد الرئيسية للمجموعة من خلال مثالين توضيحيين يتمركزان على N-glycome لمستضد البروستاتا البشري المحدد (PSA) و O-glycome لبروتينات المصل البشري. من خلال استعلامات قاعدة البيانات المختلفة وبمساعدة أدوات التصور ، توضح هذه المقالة كيفية استكشاف المحتوى ومقارنته في سلسلة متصلة لجمع وربط أجزاء المعلومات المتناثرة بخلاف ذلك. البيانات التي تم جمعها موجهة لتغذية سيناريوهات أكثر تفصيلا لوظيفة الجليكان. لذلك ، يتم اقتراح المعلوماتية الجليكونية المقدمة هنا كوسيلة إما لتعزيز أو تشكيل أو دحض الافتراضات حول خصوصية غليكوم البروتين في سياق معين.
Introduction
الجليكان والبروتينات التي ترتبط بها (البروتينات السكرية) والبروتينات التي ترتبط بها (الليكتين أو البروتينات المرتبطة بالكربوهيدرات) هي الجهات الفاعلة الجزيئية الرئيسية على سطح الخلية1. على الرغم من هذا الدور المركزي في التواصل بين الخلايا الخلوية، إلا أن الدراسات واسعة النطاق، بما في ذلك الغليكوميكس، أو الجليكوبروتيوميك، أو بيانات الجليكوبروتينات البينية لا تزال نادرة مقارنة بنظيرتها في علم الجينوم والبروتيوميات.
حتى وقت قريب ، لم يتم تطوير طرق لتوصيف الهياكل المتفرعة للكربوهيدرات المعقدة بينما لا تزال مقترنة بالبروتين الناقل. التخليق الحيوي للبروتينات السكرية هو عملية غير مدفوعة بالقوالب يلعب فيها المتبرعون بالسكريات الأحادية ، وركائز البروتين السكري المقبولة ، والجليكوزيل ترانسفيراز والجليكوزيداز دورا تفاعليا. يمكن أن تحمل البروتينات السكرية الناتجة هياكل معقدة مع نقاط تفرع متعددة حيث يمكن أن يكون كل مكون من مكونات السكاريد الأحادي أحد الأنواع العديدة الموجودة في الطبيعة1. تفرض العملية غير القائمة على القوالب التحليل الكيميائي الحيوي كخيار وحيد لتوليد البيانات الهيكلية قليلة السكاريد. غالبا ما تكون العملية التحليلية لهياكل الجليكان المرتبطة بالبروتين الأصلي صعبة لأنها تتطلب تقنيات حساسة وكمية وقوية لتحديد تكوين السكاريد الأحادي والروابط والتسلسلات المتفرعة2.
في هذا السياق ، يعد قياس الطيف الكتلي (MS) هو التقنية الأكثر استخداما على نطاق واسع في تجارب glycomics و glycoproteomics. مع مرور الوقت ، يتم تنفيذ هذه في إعدادات إنتاجية أعلى وتتراكم البيانات الآن في قواعد البيانات. هياكل غليكان بتنسيقات مختلفة3 ، تملأ GlyTouCan4 ، مستودع بيانات غليكان العالمي حيث ترتبط كل بنية بمعرف مستقر بغض النظر عن مستوى الدقة الذي يتم به تعريف الجليكان (على سبيل المثال ، ربما نوع الارتباط المفقود أو التركيب الغامض). يتم جمع هياكل متشابهة جدا ولكن يتم الإبلاغ بوضوح عن اختلافاتها الطفيفة. يتم وصف البروتينات السكرية وتنسيقها في GlyConnect5 و GlyGen6 ، وهما قاعدتا بيانات مرجعيتان لبعضهما البعض. يتم تخزين بيانات MS التي تدعم الأجزاء الهيكلية من الأدلة بشكل متزايد في GlycoPOST7. وللحصول على تغطية أوسع للموارد على الإنترنت، فإن الفصل 52 من الدليل المرجعي، أساسيات علم الأحياء السكرية، مكرس للمعلوماتية السكرية8. ومن المثير للاهتمام ، أن برامج تحديد الجليكوببتيد قد انتشرت في السنوات الأخيرة9,10 ولكن ليس لصالح التكاثر. دفع القلق الأخير قادة مبادرة HUPO GlycoProteomics (HGI) إلى وضع تحد للبرمجيات في عام 2019. تم توفير بيانات MS التي تم الحصول عليها من معالجة المخاليط المعقدة من بروتينات المصل البشري N- و O-glycosylated في أوضاع تجزئة CID و ETD و EThcD للمنافسين سواء مستخدمي البرامج أو المطورين. ولا يرد هنا سوى التقرير الكامل عن نتائج هذا التحدي(11). بادئ ذي بدء ، لوحظ انتشار عمليات تحديد الهوية. تم تفسيره بشكل رئيسي على أنه ناجم عن تنوع الأساليب المنفذة في محركات البحث ، وإعداداتها ، وكيفية تصفية المخرجات ، و "حساب" الببتيد. قد يكون التصميم التجريبي قد وضع أيضا بعض البرامج والأساليب في ميزة (غير واضحة). والأهم من ذلك، أن المشاركين الذين يستخدمون نفس البرنامج أبلغوا عن نتائج غير متناسقة، مما يسلط الضوء على قضايا خطيرة تتعلق بقابلية التكرار. واختتم بمقارنة التقديمات المختلفة بأن بعض الحلول البرمجية تؤدي أداء أفضل من غيرها وأن بعض استراتيجيات البحث تسفر عن نتائج أفضل. ومن المرجح أن توجه هذه التغذية المرتدة تحسين أساليب تحليل بيانات غليكوببتيد الآلية، وستؤثر بدورها على محتوى قاعدة البيانات.
أدى التوسع في المعلوماتية السكرية إلى إنشاء بوابات ويب توفر المعلومات والوصول إلى العديد من الموارد المماثلة أو المكملة. ويرد وصف لأحدث وأحدث هذه الأحدث في فصل من سلسلة كتب علم الجليكوساينس الشاملة(12)، ومن خلال التعاون، يتم تقديم حل لتقاسم البيانات وتبادل المعلومات في وضع الوصول المفتوح. تم تطوير إحدى هذه البوابات التي كانت تسمى في الأصل Glycomics@ExPASy 13 وأعيدت تسميتها Glyco@Expasy ، بعد الإصلاح الرئيسي لمنصة Expasy 14 التي استضافت مجموعة كبيرة من الأدوات وقواعد البيانات المستخدمة عبر العديد من -omics لعقود ، العنصر الأكثر شعبية هو UniProt15 - قاعدة معارف البروتين العالمية. تقدم Glyco@Expasy اكتشافا تعليميا للغرض من قواعد البيانات والأدوات واستخدامها ، استنادا إلى تصنيف مرئي وعرض لأوجه ترابطها. يوضح البروتوكول التالي إجراءات استكشاف بيانات الجليكوميكس و glycoproteomics مع مجموعة مختارة من الموارد من هذه البوابة التي تجعل العلاقة بين glycoproteomics و glycan-interactomics واضحة عبر glycomics. كما هو الحال ، تنتج تجارب glycomics هياكل حيث يتم تعريف السكريات الأحادية بشكل كامل وتحديد الروابط جزئيا أو كليا ، ولكن ارتباطها بموقع البروتين يكون ضعيفا ، إن وجد. في المقابل ، تولد تجارب glycoproteomics معلومات دقيقة عن مرفق الموقع ولكن مع دقة ضعيفة لهياكل الجليكان ، وغالبا ما تقتصر على تركيبات السكاريد الأحادي. يتم تجميع هذه المعلومات معا في قاعدة بيانات GlyConnect. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام أدوات البحث في GlyConnect للكشف عن روابط الجليكان المحتملة التي يتم وصفها جنبا إلى جنب مع البروتينات التي تتعرف عليها في UniLectin16 ، المرتبطة ب GlyConnect عبر glycans. ينقسم البروتوكول المعروض هنا إلى قسمين لتغطية الأسئلة الخاصة بالجليكان المرتبط ب N والمرتبط ب O والبروتينات السكرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يلزم وجود جهاز متصل بالإنترنت (يفضل شاشة أكبر) ومتصفح ويب محدث مثل Chrome أو Firefox. قد لا يكون استخدام Safari أو Edge موثوقا به.
1. من بروتين N-glycome في GlyConnect إلى ليكتين من UniLectin
- الوصول إلى الموارد من Glyco@Expasy
ملاحظة: الإجراء الموضح هنا هو الوصول إلى GlyConnect ولكن يمكن تطبيقه للوصول إلى أي مورد مسجل في النظام الأساسي.- انتقل إلى https://glycoproteome.expasy.org/glycomics-expasy وفكر في المخطط الفقاعي على اليمين الذي يعرض فئات مختلفة مثل Glycoconjugates أو Glycan Binding. في القائمة الموجودة في أقصى اليسار والتي تعكس الفئات الموجودة في الفقاعات، حدد مربع البروتينات السكرية بحيث يقوم المخطط الفقاعي الموجود على اليمين بتكبير الفقاعة المطابقة لتلك الفئة على الفور.
ملاحظة: الفقاعات الخضراء هي أدوات والفقاعات الصفراء هي قواعد بيانات. يؤدي النقر فوق أي منهما إلى التكبير مرة أخرى لتقديم تفاصيل حول المورد. قبل القيام بذلك ، قد يرغب المستخدم في فهم تبعيات هذا المورد للآخرين. - للحصول على معلومات حول التبعيات، انتقل من علامة التبويب التصنيف المواضيعي للموارد إلى علامة التبويب عجلة تبعية الموارد . ضع الماوس على GlyConnect في العجلة للتحقق من مستوى تكامله مع المصادر الأخرى (الشكل 1).
- ارجع إلى علامة التبويب التصنيف المواضيعي للموارد للوصول إلى فقاعة GlyConnect كما في الخطوة 1.1.1 وانقر فوقها (الشكل التكميلي 1) لعرض صفحة GlyConnect الرئيسية في علامة تبويب جديدة تعرض إحصائيات المحتوى في أحدث إصدار من قاعدة البيانات.
ملاحظة: يطابق نظام الألوان المفصل في الجدول 1 الأنواع المختلفة من المعلومات المخزنة في قاعدة البيانات. رمز اللون هذا صالح في جميع صفحات الكيانات في GlyConnect وهو متسق طوال الوقت. تعرض الصفحة الرئيسية أيضا أربعة أقسام مخصصة لمجموعات البيانات المركزة مثل تلك التي تصف غليكوزيل بروتين سارس-كوف-2 سبايك (COVID-19) أو تفصل على نطاق واسع السكريات قليلة السكريات في الحليب البشري (HMO). ولن يتم استكشاف هذه المسائل في هذا البروتوكول.
- انتقل إلى https://glycoproteome.expasy.org/glycomics-expasy وفكر في المخطط الفقاعي على اليمين الذي يعرض فئات مختلفة مثل Glycoconjugates أو Glycan Binding. في القائمة الموجودة في أقصى اليسار والتي تعكس الفئات الموجودة في الفقاعات، حدد مربع البروتينات السكرية بحيث يقوم المخطط الفقاعي الموجود على اليمين بتكبير الفقاعة المطابقة لتلك الفئة على الفور.
- استكشاف المعلومات السياقية لبروتين N-glycome
ملاحظة: يتم عرض جميع هياكل الجليكان في GlyConnect في ثلاثة تنسيقات بديلة وشائعة الاستخدام: (1) تسمية الرمز للجليكان (SNFG)17 (2) IUPAC المكثف18، و (3) أكسفورد19. في المقابل ، لا يوجد تدوين قياسي للتعبير عن تكوين الجليكان. في GlyConnect ، يتم استخدام التعليمة البرمجية التالية: Hex ل hexose ، HexNAc ل N-Acetylhexosamine ، dHex للفوكوز ، و NeuAc لأحماض السياليك. من أجل البساطة ، تعتمد أدوات التصور على تدوين مكثف: H للسداسي ، N ل N-Acetylhexosamine ، F للفوكوز ، و S لأحماض السياليك. بالإضافة إلى ذلك ، تشير الأحرف الصغيرة إلى تعديلات مثل "a" للأسيتيل ، و "p" للفسفرة ، و "s" للكبريتات ، لأكثر هذه البدائل المزعومة شيوعا.- لعرض واستكشاف N-glycome من مستضد البروستاتا البشري المحدد (PSA) ، من الصفحة الرئيسية GlyConnect ، تابع على النحو التالي.
ملاحظة: تمت دراسة غليكوزيل PSA البشري على مر السنين ، وخاصة في سياق سرطان البروستاتا. تخزن قاعدة بيانات GlyConnect ثلاثة مراجع20،21،22 ، والتي تجمع بين بيانات glycomics و glycoproteomics. لاحظ أنه تم الحصول على النتائج المقدمة هنا مع إصدار سبتمبر 2021 من GlyConnect. قد يؤدي الاستخدام الخفي لقاعدة البيانات إلى إحصائيات مختلفة قليلا بسبب تحديثات البيانات المتكررة. - حدد الزر PROTEIN لفتح طريقة عرض البروتين في قاعدة البيانات. في صفحة عرض البروتين، اكتب البروستاتا في نافذة البحث. ابحث عن الإدخالين المدرجين في الإخراج اللذين يميزان بين شكلين متساويين من PSA مع قيم pI متميزة. انقر فوق 790 (عمود ID) المقابل للشكل المتماثل الشائع ل PSA.
ملاحظة: ابحث عن الشريط العلوي متعدد الألوان الذي يعرض معلومات موجزة مستخرجة من العمل المنشور في المخطط المفصل أعلاه. هناك العديد من الخيارات الممكنة للتنقل كما هو موضح أدناه. - في الشريط العلوي متعدد الألوان ، انقر فوق الزر SOURCE باللون الأخضر لعرض أنواع العينات التي تمت معالجة البيانات المنشورة منها: البول والسائل المنوي. لتصفح هذه المعلومات بشكل أكبر، انقر فوق أي من أنواع العينات هذه. وينطبق الشيء نفسه على أي عنصر يظهر عند النقر فوق زر ملون.
- للتحقق من المحتوى المتعلق بالصحة في قاعدة البيانات ، انقر فوق الزر DISEASE ، الذي يحتوي على عنصرين ، أحدهما هو سرطان البروستاتا الذي يرتبط بصفحة المرض المخصصة المقابلة في GlyConnect. يظهر ملخص تلك الصفحة أن ثلاث دراسات واسعة النطاق أبلغت عن 319 تركيبة في 1087 موقعا تم العثور عليها في 308 بروتينات بشرية.
- انقر فوق الزر STRUCTURE لعرض القائمة الكاملة ل 135 بنية مرتبطة ب PSA من بيانات glycomics. انقر فوق الزر COMPOSITION للحصول على 78 تركيبة مرتبطة تحددها تجارب glycoproteomics. انقر على أي هيكل أو تكوين للحصول على مزيد من التفاصيل.
ملاحظة: يمكن الحصول على تفاصيل مثل قائمة البروتينات البديلة التي تحمل بنية معينة أو قائمة الهياكل المطابقة للتكوين. من المعروف أن PSA لديها موقع N-glycosylation واحد فقط في Asn-69 (عنصر واحد فقط يتم احتسابه لزر SITE البني). - لتقليل غموض التراكيب ، انقر فوق STRUCT المقترح أسفل تركيبة محددة (على سبيل المثال ، Hex:6 HexNAc:3 NeuAc:1). يتم تقديم اقتراح في كل مرة يتزامن فيها عدد السكريات الأحادية مع عدد البنية المذكورة أعلاه (الشكل 2).
ملاحظة: يتم مطابقة التركيبة السداسية: 6 HexNAc: 3 NeuAc: 1 الناتجة عن تجربة glycoproteomics مع أربعة هياكل عالية الدقة من بيانات glycomics. في حالة PSA ، لا يوجد غموض في الموقع لحله لأن Asn-69 فقط هو glycosylated. - لاستكشاف صفحة البروتين بالكامل، يمكنك عرض مزيد من التفاصيل على الجانب الأيمن من الصفحة (الشكل 3).
- عرض إدخال 3QUM PDB الافتراضي (بنك بيانات البروتين23) ل PSA الذي يظهر مع اثنين من الجليكان المعقدة المرفقة بكل مونومر (الشكل 3) أو إدخال 2ZCK البديل ، والذي يتوفر أيضا بسبب الكربوهيدرات المرفقة. يظهر الإدخال الثاني سلسلة واحدة.
ملاحظة: يتم تصور كلا الإدخالين باستخدام المكون الإضافي 3D LiteMol 24 الذي يعرض الجليكان في تدوين SNFG-3D المعتمد في PDB-RCSB. - انقر على الروابط المقابلة للمراجع التبادلية الأخرى لاستكشاف المعلومات الوظيفية ذات الصلة من قواعد بيانات البروتينات الرئيسية ، مثل UniProt (الشكل 3).
- عرض إدخال 3QUM PDB الافتراضي (بنك بيانات البروتين23) ل PSA الذي يظهر مع اثنين من الجليكان المعقدة المرفقة بكل مونومر (الشكل 3) أو إدخال 2ZCK البديل ، والذي يتوفر أيضا بسبب الكربوهيدرات المرفقة. يظهر الإدخال الثاني سلسلة واحدة.
- لعرض واستكشاف N-glycome من مستضد البروستاتا البشري المحدد (PSA) ، من الصفحة الرئيسية GlyConnect ، تابع على النحو التالي.
- تصور وربط المعلومات السياقية لبروتين N-glycome
ملاحظة: كما رأينا في القسم السابق ، قد يكون من الصعب فهم القوائم الطويلة من الهياكل أو التراكيب ككل ويعتمد GlyConnect على أداتين مختلفتين لتصور المعلومات الرئيسية ، وهما GlyConnect Octopus و GlyConnect Compozitor (الأول يوسع معلومات الملخص التي تم التقاطها في أزرار ملونة والثاني يبرز التبعيات الهيكلية من حيث الهيكل / التكوين الموجود في آخر). كما هو موضح أدناه ، يستكشف GlyConnect Octopus الارتباطات بين الكيانات المختلفة المخزنة في قاعدة البيانات من خلال تسليط الضوء على اتصالات متعددة أو مفردة كانعكاس لمحتوى قاعدة البيانات.- قم بإجراء بحث GlyConnect Octopus لتأكيد وجود سمات هيكلية مشتركة مثل الهياكل الأساسية الهجينة والهياكل المحتوية على حمض السياليك المتكررة للغاية في تنوع الجليكان المرتبط ب PSA ، كما هو موضح أدناه.
- انتقل إلى الصفحة الرئيسية للأخطبوط https://glyconnect.expasy.org/octopus/. احتفظ بعلامة التبويب المرتبطة ب N محددة بشكل افتراضي. انتقل إلى علامة التبويب الفرعية النوى وانقر على أيقونة الهجين . انتقل إلى علامة التبويب الفرعية خصائص وانقر على أيقونة Sialylated . انقر على زر البحث الأخضر أدناه.
ملاحظة: يتم عرض نتائج البحث بيانيا كعلاقات بين ثلاث فئات من العناصر. بشكل افتراضي ، تتطابق القائمة المركزية مع استعلام التراكيب ، وتمتد المجموعة اليسرى على البروتينات ذات الصلة ، وتمتد القائمة اليمنى على الجليكان ذي الصلة. - في الرسم البياني المعروض للعلاقات، مرر مؤشر الماوس فوق H6N4F1S1 لتسليط الضوء على الروابط إلى ستة بروتينات وثلاثة هياكل. قارن هذا عن طريق التحليق فوق H6N4F2S1 الذي يميز الشكلين المتماثلين ل PSA (يشار إليهما باسم UniProt ID: KLK3_HUMAN) وبنية واحدة (ID: 10996). مرر مؤشر الماوس فوق معرف الهيكل لإظهار تمثيل SNFG الخاص به وانقر فوقه لفتح الصفحة المقابلة (الشكل التكميلي 2).
- قم بتغيير عقد الأخطبوط إلى أي موضوع آخر يصف سياق الغليكوزيل. ويظل رمز اللون كما هو موضح سابقا (انظر الجدول 1).
- قم بتغيير العقد المركزية إلى الأنسجة لعرض 15 خيارا في منتصف الرسم البياني، وكثير منها عبارة عن سوائل الجسم. ابحث عن جميع الارتباطات بين البروتينات والجليكان التي تطابق الاستعلام اعتمادا على معلومات الأنسجة. ضع المؤشر على البول أو السائل المنوي في منتصف الرسم البياني لعرض الارتباطات المختلفة (الشكل 4A,B).
- قم بتغيير عقد المركز إلى مرض لعرض 13 خيارا، أحدها سرطان البروستاتا. البروتين الوحيد المرتبط به هو PSA (KLK3_HUMAN) (الشكل التكميلي 3).
ملاحظة: نظرة فاحصة على PSA N-glycome الموضحة في صفحة البروتين تحدد التردد العالي جدا ل NeuAc الطرفي (a?-?) جالون(ب?-?) البنية التحتية GlcNAc في كثير من الحالات على هياكل ذات هوائيين أو ثلاثة. يمكن إنشاء أخطبوط آخر على هذا الأساس كما هو موضح أدناه.
- انقر فوق الزر مسح لتحديث البحث. انتقل إلى علامة التبويب الفرعية خصائص وانقر على أيقونة الهوائي الثنائي . انتقل إلى علامة التبويب الفرعية المحددات وانقر على أيقونة 3-Sialyl-LN (النوع 2 ). انقر على زر البحث الأخضر أدناه.
- تحقق من ارتباطات الأخطبوط المستردة مع جليكان ثنائي الهوائي يحتوي على زخارف طرفية 3-Sialyl-LN (النوع 2) ، أي NeuAc (a1-3) Gal (b1-4) GlcNAc. قم بتغيير العقد المركزية إلى الأنسجة لتسهيل القراءة ومرر مؤشر الماوس فوق KLK3_HUMAN لتوصيل السائل المنوي مباشرة بالشكل المتماثل الشائع PSA وسبعة هياكل (الشكل التكميلي 4).
ملاحظة: تقوم أداة التصور الثانية ، GlyConnect Compozitor ، بإجراء مسح للعلاقات المحتملة بين كل تكوين في قائمة منه (انظر أدناه). يتم تعريف العلاقة على أنها تختلف عن واحد فقط من السكريات الأحادية بين تركيبتين. هذه العلاقات المحددة التي تم رسمها في رسم بياني تكشف عن (تعطيل) استمرارية الغليكوم. - استخدم GlyConnect Compozitor لإجراء مسح للعلاقات المحتملة بين كل تركيبة في قائمتها ، كما هو موضح أدناه لحالة PSA.
ملاحظة: يعالج GlyConnect Compozitor التراكيب بالاقتران مع سياق. يوفر علامات تبويب متميزة للاستعلام عن GlyConnect ، على سبيل المثال ، البروتينات والمصادر وخطوط الخلايا والأمراض التي لا تحتاج إلى شرح لتأهيل السياق. ويتضح ذلك هنا مع PSA على النحو التالي. - ارجع إلى صفحة البروتين في PSA: https://glyconnect.expasy.org/browser/proteins/790. على الجانب الأيمن من صفحة إدخال PSA ، انقر فوق الارتباط Compozitor. تأكد من أن حقول البحث Compozitor مملوءة مسبقا بتفاصيل إدخال Id 790 في علامة التبويب البروتين (البروتين: مستضد البروستاتا الخاص ، الأنواع: الإنسان العاقل ، ونوع الجليكان: N-linked).
- انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد لاسترداد البيانات من قاعدة البيانات وعرض الرسم البياني للتركيبات المتصلة. قم بإلغاء تحديد الخيار تضمين العقد الظاهرية . انقر فوق الزر Compute Graph لعرض رسم بياني يعرض مجموعة متصلة جيدا من 78 تركيبة تمثل PSA N-glycome ، ومخطط شريط يوضح الخصائص الرئيسية للجليكان.
- مرر مؤشر الماوس فوق الشريط الأرجواني في مخطط الشريط ، والذي يحدد موقع جميع الهياكل السياليل في الرسم البياني للكشف عن تحيز يمكن ملاحظته نحو الهياكل السياليلية.
- ابق في علامة التبويب الرئيسية البروتين وحدد مستضد البروستاتا الخاص - ارتفاع Pi isoform (psah) في حقل البروتين (الاسم).
ملاحظة: يتم ملء الحقلين نوع الجليكان وموقع غليكان تلقائيا. - انقر فوق الزر " إضافة إلى التحديد" لاسترداد البيانات من قاعدة البيانات التي تصل إلى 57 تركيبة. انقر فوق الزر " حساب الرسم البياني" لإنشاء الرسوم البيانية المتراكبة لكل من الأشكال المتساوية وتقييم الاختلافات في glycome لشكلي PSA isoforms. مرر مؤشر الماوس فوق تسميات العقدة للمطالبة بعرض عدد الهياكل المقابلة للتركيبات / التسميات (الشكل 5).
- معلومات ربط الجليكان في UniLectin
ملاحظة: تذكر المحدد الذي تم اختباره في الأخطبوط ، الموصوف باسم NeuAc (a2-3) Gal (b1-4). بحكم التعريف ، فهو جزء ملزم راسخ من بنية غليكان ، وعلى هذا النحو ، يمكن البحث عنه في قاعدة بيانات UniLectin3D25.- انتقل إلى https://www.unilectin.eu/ وانقر على زر UniLectin3D . بدلا من ذلك ، انتقل مباشرة إلى الصفحة: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/.Click على زر البحث في Glycan لفتح هذه الصفحة: https://www.unilectin.eu/unilectin3D/glycan_search (الشكل التكميلي 6).
- انقر فوق الماس الأرجواني الذي يمثل حمض السياليك ، والذي يدفع إلى عرض جميع الزخارف المرتبطة بالجليكان والتي تنتهي بحمض السياليك المخزن في قاعدة البيانات. يحتوي الجزء العلوي من هذه المجموعة من الزخارف على زخارف NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc التي تم التحقيق فيها سابقا (الشكل التكميلي 7).
- انقر فوق الشكل NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc للمطالبة بعرض جميع الليكتينات التي يعرف بها هيكل ثلاثي الأبعاد يؤكد التفاعل مع NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc . تظهر النتيجة افتراضيا الليكتين في جميع الأنواع. استخدم الخيار البحث حسب الحقل لقصر العرض على المعلومات التي تركز على الإنسان.
- انقر فوق خيار البحث حسب الحقل . في حقل الأنواع ، اكتب Homo sapiens. انقر فوق الزر استكشاف هياكل الأشعة السينية لتصفية القائمة الأصلية. لم يتبق سوى إدخال واحد ، أي الجاليكتين البشري -8. انقر فوق الزر عرض الهيكل والمعلومات ثلاثية الأبعاد في الزاوية العلوية اليمنى من العنصر المدرج لعرض معلومات مفصلة عن تفاعل الجاليكتين-8 البشري مع NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc.
- الوصول إلى المعلومات الهيكلية على galectin-8 البشري المعروضة على الصفحة مع اثنين من المشاهدين المختلفين.
- أمسك الماوس لتحويل الجزيء وجلب الليكاند إلى المقدمة باستخدام برنامج Litemol 26 المدمج لإظهار بنية اللكتين 3D. مرر الماوس فوق أحد التفاعلات المدرجة على اليسار لتحديث العرض على اليمين وتحديد مكان عمل هذا التفاعل المعين في الهيكل باستخدام برنامج PLIP27 المدمج لتفصيل التفاعلات الذرية بين الليكتين والليجند (الشكل 6).
- انقر فوق أي زر أخضر يرتبط بالإدخالات المقابلة في UniProt و PDB (المواقع الأوروبية أو الأمريكية) و GlyConnect لاستكشاف هذه الإحالات التبادلية.
2. استكشاف ومقارنة O-glycome في GlyConnect
- تصفح مجموعة بيانات تحدي HGI عالية الثقة
ملاحظة: يتم تخزين مجموعة بيانات HGI المذكورة في المقدمة في قاعدة بيانات GlyConnect. أنه يحتوي على 163 N- و 23 O-glycopeptides وجدت في 37 البروتينات السكرية تعتبر قائمة ثقة عالية. GlyConnect Compozitor28 هو المفتاح لتقييم اتساق بيانات glycome. الأهم من ذلك ، يسمح Compozitor بالعقد الافتراضية (الموضحة باللون الرمادي) عند الحاجة إلى خطوة وسيطة واحدة فقط لتوصيل العقد المعزولة. وبهذه الطريقة ، تشدد العقد الافتراضية الرسم البياني ويمكن تفسيرها على أنها هياكل يحتمل أن تكون مفقودة في النتائج التجريبية.- تصفح مجموعة بيانات HGI من الصفحة الرئيسية ل GlyConnect بالانتقال مباشرة إلى الصفحة المرجعية للمقالة: https://glyconnect.expasy.org/browser/references/2943.
ملاحظة: يعكس الملخص الموجود في الأزرار الملونة جزئيا الأرقام الواردة في المقالة. ومع ذلك ، إذا تم سرد 69 ببتيدا فريدا فقط ، فإن هذا يعكس ارتباطات متعددة بين الببتيدات والمواقع أو الهياكل. في المقالة ، يتم تعريف glycopeptide على أنه مزيج فريد من الببتيد والتكوين. في GlyConnect ، يتم النظر في الجليكوسات أولا ، ويتم وصفها بأنها مزيج من الببتيد مع الهياكل. هذا ما يفسر التناقض في الأرقام بين GlyConnect والاقتباس أعلاه. - تحقق من التردد العالي لحدوث التراكيب المرتبطة ب N ، مثل Hex:5 HexNAc:4 NeuAc:2 ، المحددة في 42 موقعا في 43 ببتيدا بدلا من التفرد المتكرر لمعظم التراكيب المرتبطة ب O المحددة في موقع واحد في 1 الببتيد.
- انقر على رابط Compozitor على الجانب الأيمن من صفحة إدخال المرجع لتقييم اتساق مجموعة البيانات. تأكد من أن أداة Compozitor تعالج DOI للمرجع مباشرة وتملأ حقل البحث بالمرجع = 10.1101/2021.03.14.435332 في علامة التبويب خيارات متقدمة من الأداة. اكتب &glycan_type=O-linked بعد رقم DOI لتضييق نطاق البحث إلى الجليكان المرتبط ب O، بحيث يصبح الاستعلام: المرجع = 10.1101/2021.03.14.435332&glycan_
type=O-linked - انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد لاسترداد البيانات من قاعدة البيانات (هناك 20 تركيبة مرتبطة ب O). احتفظ بالخيار تضمين العقد الظاهرية محددا. انقر فوق الزر " حساب الرسم البياني" لعرض الرسم البياني للتركيبات المتصلة. تسلط هذه النتيجة الضوء على العديد من الثغرات في الاستمرارية المتوقعة للتخليق الحيوي للجليكان مع تسع عقد افتراضية مطلوبة لإكمال الرسم البياني (الشكل 7).
- تصفح مجموعة بيانات HGI من الصفحة الرئيسية ل GlyConnect بالانتقال مباشرة إلى الصفحة المرجعية للمقالة: https://glyconnect.expasy.org/browser/references/2943.
- مقارنة مع O-glycome من بروتين مصل مختار في GlyConnect
ملاحظة: لتقييم ما إذا كان يمكن سد الفجوات عن طريق البيانات المخزنة في GlyConnect ، تم اختيار بروتين O-glycosylated واحد من أصل 37 مدرجا مع المرجع. في مجموعة البيانات ، تم الإبلاغ عن السلسلة الثقيلة لمثبطات Inter-alpha-trypsin H4 (Q14624) على أنها O-glycosylated على Thr-725.- انتقل إلى علامة التبويب البروتين في GlyConnect Compozitor (راجع الخطوة 2.1.3). من قائمة البروتين، حدد السلسلة الثقيلة المثبطة للتربسين بين ألفا والتريبسين H4. تأكد من أن اختيار الأنواع هو الإنسان العاقل بشكل افتراضي. قم بإلغاء تحديد N المرتبط في نوع Glycan. حدد Thr-725 فقط في قائمة المواقع بالنقر أولا على علامة الطرح الموجودة على يسار الموقع لإلغاء تحديد جميع المواقع ، ثم تحديد Thr-725 فقط من القائمة.
- انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد (لاحظ أن ستة تركيبات مرتبطة ب Thr-725). انقر فوق الزر " حساب الرسم البياني" لعرض الرسم البياني للتركيبات المتصلة (الشكل التكميلي 8).
- راقب الرسم البياني المعروض، الذي يوضح 17 تركيبة فريدة من أصل 20 تركيبة مرتبطة بحرف O لمجموعة بيانات المقالة باللون الأزرق وثلاثة تركيبات فريدة من أصل ستة في قاعدة البيانات باللون الأحمر. وبعبارة أخرى ، فإن التداخل بين المصدرين موجود في ثلاثة تركيبات ممثلة باللون الأرجواني. لاحظ أنه يتم إنشاء دوران 45 درجة للرسم البياني تلقائيا.
ملاحظة: يتم تقليل عدد العقد الظاهرية بمقدار واحد. وكما اتضح، فإن H2N2S1 المفقود في 20 تركيبة مرتبطة ب O لمجموعة بيانات المقالة والممثلة كعقدة افتراضية مملوء الآن بتركيبة إضافية مرتبطة ب Thr-725 من السلسلة الثقيلة لمثبطات Inter-alpha-trypsin H4 في قاعدة البيانات. وهذا يبسط طوبولوجيا الرسم البياني لأن عقدتين افتراضيتين أخريين أخريين تصبحان عديمي الفائدة لأنهما كانتا خيارين بديلين لسد الفجوة بين H1N2S1 وH2N2S2. ومع ذلك، فإن التركيب الثاني المستورد من قاعدة البيانات سيتم عزله لولا إنشاء عقدتين افتراضيتين بديلتين جديدتين H2N2F1S1 و H1N2F2S1. - لفهم العقد الافتراضية ، تحقق مما إذا كانت التراكيب المقابلة موجودة في GlyConnect. للقيام بذلك ، انقر فوق الزر تصدير أسفل الرسم البياني. حدد افتراضي فقط عن طريق إلغاء تحديد جميع الخيارات الأخرى. انقر على أيقونة الحافظة لنسخ مجموعة من 8 مؤلفات.
- الصق التحديد في نافذة الاستعلام في علامة التبويب مخصص في Compozitor . حدد O المرتبط في الحقل نوع Glycan . قم بتعيين تسمية التحديد في حقل التراكيب إلى، على سبيل المثال، VN لتسمية قائمة 8 تركيبات. انقر فوق الزر إضافة إلى التحديد ، ثم على زر حساب الرسم البياني . يتم الآن عرض جميع العقد الظاهرية كعقد خضراء (الشكل 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أظهر الجزء الأول من البروتوكول (القسم 1) كيفية التحقيق في خصوصية أو شيوع N-glycans المرفقة على Asn-69 من مستضد البروستاتا البشري المحدد (PSA) باستخدام منصة GlyConnect. تم التأكيد على الاختلافات المعتمدة على الأنسجة (البول والسائل المنوي) ، وكذلك الاختلافات المعتمدة على الشكل المتماثل (الطبيعي والعالي pI) في التعبير الجلايكان ، باستخدام أداتين للتصور (الشكل 4 والشكل 5).
أولا ، وفر GlyConnect Octopus ، الذي يعرض الارتباطات بين الكيانات المخزنة في قاعدة البيانات ، الفرصة لاستكشاف المعلومات السياقية من خلال (1) اختيار كيانات مختلفة ليتم عرضها في الأخطبوط و (2) النقر فوق الروابط لفحص الإدخالات ذات الصلة. وكانت النتيجة ارتباطات مميزة اعتمادا على الأنسجة.
ثانيا ، تم استخدام GlyConnect Compozitor ، المصمم أصلا لتحديد / تحسين ملف تكوين لتحديد glycopeptide ، لتقييم تعبير الجليكان في شكلين معروفين من PSA (pI العادي والعالي). أنتجت المقارنة بين كل glycome متساوي الشكل رسما بيانيا متصلا جيدا يفرد أربع عقد (تراكيب) ، اثنتان منها مميزتان ل pI isoform العالي. على الرغم من أن تداخل glycome مهم ، إلا أن مخطط شريط خصائص glycan أظهر انخفاضا في السياليل من الشائع إلى الشكل المرتفع pI (الشكل التكميلي 5).
علاوة على ذلك ، فإن استكشاف UniLectin3D يفرد الجاليكتين-8 كقارئ محتمل ل PSA glycome لأن الأخير يحتوي على العديد من الهياكل مع NeuAc (a2-3) Gal (b1-4) GlcNAc الطرفية epitope. وهذا يوفر دليلا على اتباعه ولا يمكن اعتباره دليلا نهائيا. ومع ذلك، من المعروف أن PSA و galectins يلعبان دورا أساسيا في سرطان البروستاتا29 وتم تسليط الضوء مؤخرا على الدور المحدد ل Galectin-830. يربط الجزء الأول من البروتوكول بين البيانات الهيكلية (glycoproteomics) والوظيفية (الملزمة) لإنشاء سيناريو محتمل للتفاعلات بين البروتين والبروتين بوساطة الجليكان.
في الجزء الثاني من البروتوكول (القسم 2) ، تم فحص مجموعة عالية الجودة من تركيبات O-glycan المرتبطة بنسيج معين (المصل البشري) ومقارنتها بمحتوى قاعدة بيانات GlyConnect ، مما يوفر خيار تخصيص ملف تكوين جليكان لتحديد الجليكوببتيدات المكررة (الشكل 7 والشكل 8 ). يمكن أن تعتمد على الحد الأدنى من مجموعة من 20 تركيبة متاحة من مجموعة بيانات واحدة (نتائج تحدي HGI) أو يتم تعزيزها ب 23 إلى 26 عنصرا تم جمعها بشكل عقلاني في GlyConnect لتعزيز اتساق المجموعة.
| أحمر | برتقالي فاتح | أخضر | أزرق فاتح | بنفسجي | وردي | أزرق داكن | أسمر | برتقالي داكن |
| جنس | بروتين | مصدر الأنسجة | هيكل | تكوين | مرض | مرجع | جليكوسيت | الببتيد |
الجدول 1: نظام الألوان المرتبط بكل كيان من كيانات قاعدة بيانات GlyConnect وصالح طوال الوقت.
الشكل 1: عجلة التبعية Glyco@Expasy إنشاؤها ل GlyConnect. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بنية غليكان مقترحة لتكوين جليكان مختار. بنية جليكان مقترحة من تجربة جليكوميكس لتكوين جليكان لتجربة جليكوبروتيوميك تستهدف نفس البروتين السكري، هنا مستضد البروستاتا البشري النوعي (PSA)، كما هو مقترح في صفحة GlyConnect ل PSA (ID: 790). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القائمة الجانبية اليمنى لصفحة GlyConnect ل PSA. مراجع تبادلية قابلة للنقر إلى قواعد البيانات الرئيسية الأخرى وعرضها باستخدام المكون الإضافي LiteMol glycan لهيكل 3D الحالي في PDB. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مخرج الأخطبوط GlyConnect يظهر الارتباطات المعتمدة على الأنسجة بين البروتينات والجليكانات. قام الاستعلام Hybrid AND Sialylated بإرجاع جميع التراكيب المطابقة لهذه المعايير وكل تركيبة تربط معا المعلومات المرتبطة حول البروتينات والجليكان كما هو مسجل في قاعدة البيانات. لاحظ أنه بشكل افتراضي يتم تعيين الأنواع إلى الإنسان العاقل ولكن هذا الخيار قابل للتعديل. هنا ، يعرض GlyConnect Octopus جميع البروتينات البشرية (العقد اليسرى) التي تحمل هياكل جليكان هجينة و sialylated (العقد اليمنى) مع الأنسجة التي يتم التعبير عنها (العقد المركزية). (أ) يتم تسليط الضوء على الارتباطات مع البول التي تظهر بروتينين: choriogonadotropin (GLHA_HUMAN) و PSA isoform الشائعة (KLK3_HUMAN) المتصلة بهياكل غليكان متناثرة (غير متجانسة). (ب) يتم تسليط الضوء على الارتباطات مع السائل المنوي التي تظهر شكلين متساويين من البروتين من PSA (KLK3_HUMAN) متصلين بهياكل جليكان مجمعة (مماثلة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مخرج GlyConnect Compozitor الذي يوضح N-glycome المتراكب للشكلين المتماثلين من PSA. التراكيب في التدوين المكثف تسمية كل عقدة. يتم تمثيل الجليكان المرتبطة بالشكل الأيزوفورم الشائع كعقد زرقاء وتلك الموجودة في شكل متساوي الشكل pI العالي كعقد حمراء. يظهر التداخل بين glycome كعقد أرجوانية. تمثل الأرقام الموجودة داخل العقد عدد هياكل الجليكان المطابقة للتكوين المسمى وفقا لمحتوى قاعدة بيانات GlyConnect فيما يتعلق ب PSA. تم تعديل الرسم البياني Compozitor الموضح قليلا من الإخراج الخام لفك تشابك الشبكة التي يتم إنشاؤها بواسطة مكتبة D3.js. من السهل القيام بذلك حيث يمكن سحب أي عقدة في مساحة نافذة المتصفح أينما يرغب المستخدم ، وبالتالي يمكن تقصير المسارات أو تمديدها. يمكن للمستخدم كتابة تركيبة معينة في حقل التكبير /التصغير في الزاوية العلوية اليسرى لتكبير الرسم البياني وتوسيطه على العقدة المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: إدخال موجز للجاليكتين-8 البشري مع تفاصيل ربط NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc. يؤدي النقر فوق الزر "عرض ومعلومات 3D " (المشار إليه بالقطع الناقص الأحمر) إلى فتح صفحة جديدة يتم فيها عرض صورة مقربة عن تفاعلات البقايا مع تطبيق PLIP (يشار إليها بسهم أحمر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: مخرجات GlyConnect Compozitor التي تظهر O-glycome لمجموعة بيانات المصل البشري عالية الثقة لتحدي HGI. بدون العقد الافتراضية (انظر النص) ، يكون اتصال هذا الرسم البياني منخفضا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: مخرجات GlyConnect Compozitor التي توضح إمكانية إكمال O-glycome لمجموعة بيانات المصل البشري عالية الثقة لتحدي HGI ، باستخدام محتوى قاعدة بيانات GlyConnect. يكشف الوصول إلى محتوى قاعدة بيانات GlyConnect بالكامل باستخدام علامة التبويب المخصصة في Compozitor أن التراكيب المقابلة للعقد الافتراضية يتم تعيينها باستخدام هياكل محددة موجودة كما هو موضح في تسميات العقدة. يمثل حجم العقدة عدد المراجع المخزنة في قاعدة البيانات والإبلاغ عن التكوين المقابل. تشير التسمية الرقمية للعقد إلى عدد الهياكل المقابلة المخزنة في GlyConnect. يبدو أن التراكيب المحددة لديها صفر إلى ثمانية عشر تطابقا محتملا في قاعدة البيانات. في الواقع ، هذه العقد افتراضية فقط كانعكاس لمحتوى مجموعات البيانات التجريبية. يوصى بتحسين المعلومات الموجودة في الرسم البياني لاختبار واقعية هذه العقد الإضافية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: مخطط فقاعي للصفحة الرئيسية Glyco@Expasy. تكبير الرسم البياني الفقاعي Glyco@Expasy الصفحة الرئيسية للتركيز على فئة البروتين السكري . البرامج المعروضة في الفقاعات الخضراء وقواعد البيانات في الفقاعات الصفراء. النقر على أي فقاعة يلخص الغرض من المورد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: الاقترانات المستردة من الأخطبوط التي تطابق الاستعلام اعتمادا على التكوين. عرض GlyConnect الأخطبوط الافتراضي للبروتينات البشرية (العقد اليسرى) التي تحمل هياكل جليكان هجينة وسياليل (العقد اليمنى) مع تركيبات مطابقة (العقد المركزية). يبدو التركيب H6N4F12S1 فريدا لكل من أشكال PSA (KLK3_HUMAN). يؤدي النقر فوق معرف البنية الفريد (10996) إلى فتح الصفحة المقابلة بتفاصيل توضح أن الشكلين المتماثلين هما في الواقع البروتينان الوحيدان اللذان يحملان هذا الجليكان المحدد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: الجمعيات المستردة من الأخطبوط التي تطابق الاستعلام اعتمادا على المرض. عرض GlyConnect الأخطبوط لجميع البروتينات البشرية (العقد اليسرى) التي تحمل هياكل غليكان هجينة وسياليل (العقد اليمنى) مع الأمراض التي يتم التعبير عنها (العقد المركزية). يتم تسليط الضوء على الارتباطات مع سرطان البروستاتا مما يدل على الشكل المتماثل الشائع ل PSA (KLK3_HUMAN). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: الارتباطات التي تم استردادها بواسطة الأخطبوط والتي تطابق الاستعلام اعتمادا على معلومات الأنسجة. يعرض GlyConnect Octopus جميع البروتينات البشرية (العقد اليسرى) التي تحمل هياكل جليكان ثنائية الهوائي ، بما في ذلك NeuAc (a1-3) Gal (b1-4) GlcNAc (العقد اليمنى) مع الأنسجة التي يتم التعبير عنها (العقد المركزية). يتم تمييز الارتباطات مع السائل المنوي تظهر فقط الشكل المتماثل الشائع ل PSA (KLK3_HUMAN) وسبعة هياكل. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 5: مخرجات GlyConnect Compozitor التي تبين N-glycome المتراكبة للشكلين المتماثلين من PSA. التراكيب في التدوين المكثف هي تسمية كل عقدة. يتم تمثيل الجليكان المرتبطة بالشكل الأيزوفورم الشائع كعقد زرقاء وتلك الموجودة في شكل متساوي الشكل pI العالي كعقد حمراء. يظهر التداخل بين glycome كعقد أرجوانية. تمثل الأرقام الموجودة داخل العقد عدد هياكل الجليكان المطابقة للتكوين المسمى وفقا لمحتوى قاعدة بيانات GlyConnect فيما يتعلق ب PSA. يظهر الماوس فوق المخطط الشريطي لخصائص الجليكان المراسلات بين التردد والعقد كفقاعات برتقالية. يتم تغطية جميع العقد متساوية الشكل الشائعة PSA تقريبا. ينخفض هذا التردد في الشكل المرتفع pI. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 6: واجهة البحث غليكان في UniLectin3D. يؤدي النقر فوق رمز SNFG لحمض السياليك (محاط بدائرة باللون الأحمر) إلى البحث عن جميع الروابط التي تحتوي على NeuAc ، المخزنة في UniLectin3D. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 7: مقتطف من ناتج البحث عن جميع الأربطة التي تحتوي على NeuAc. يتم وضع دائرة حول شكل NeuAc (a2-3) Gal (b1- 4) GlcNAc ذي الأهمية باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 8: مخرج GlyConnect Compozitor الذي يظهر O-glycome لمجموعة بيانات HGI المتراكبة مع تلك الموجودة في GlyConnect. مخرجات GlyConnect Compozitor تظهر O-glycome لمجموعة بيانات المصل البشري عالية الثقة لتحدي HGI باللون الأزرق المتراكبة مع O-glycome لبروتين O-glycosylated واحد من أصل 37 مدرج مع المرجع ، أي سلسلة ثقيلة من مثبطات التربسين بين ألفا التربسين H4 مع معلومات إضافية واردة في GlyConnect. هذا يعزز اتصال الرسم البياني. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GlyConnect الأخطبوط كأداة للكشف عن الارتباطات غير المتوقعة
تم تصميم GlyConnect Octopus في الأصل للاستعلام عن قاعدة البيانات مع تعريف فضفاض للجليكان. في الواقع ، غالبا ما تشير الأدبيات إلى الخصائص الرئيسية للجليكان في الغليكوم مثل كونها فوكوسيلات أو سياليل ، كونها مصنوعة من هوائين أو أكثر ، إلخ. علاوة على ذلك ، يتم تصنيف الجليكان سواء كان مرتبطا ب N أو O في النوى ، كما هو مفصل في الدليل المرجعي Essentials of Glycobiology1 ، والتي غالبا ما يتم الاستشهاد بها أيضا في المقالات المنشورة. وأخيرا ، فإن ظواهر الجليكان مثل مستضدات فصيلة الدم هي خاصية أخرى مطلوبة في الهياكل وربما تكون مخصصة لكتابة جليكان. في النهاية ، قد يكون من المناسب البحث عن الخصائص المشتركة أو المميزة للغليكوم المعبر عنها في نسيج معين أو أنواع مختارة. وبهذا المعنى، ينبغي استخدام المعلومات المجمعة كمصدر للافتراضات الجديدة بدلا من الحقائق الفريدة.
GlyConnect Compozitor كأداة لتشكيل مجموعة تكوين غليكان
إن تصفح المعلومات الهيكلية كما هو موضح في صفحة البروتين له قيود لأن القوائم تميل إلى حجب العلاقات بين الهياكل المفصلة وكذلك تلك الموجودة بين التراكيب. يحضر GlyConnect Octopus إلى الأول و GlyConnect Compozitor إلى الأخير. تكشف نظرة متأنية على الهياكل المدرجة في معظم إدخالات GlyConnect عن وجود هياكل فرعية مشتركة. ومع ذلك ، ليس من السهل فهم هذه المعلومات بصريا دون مساعدة من مشاهد مخصص.
تم إنشاء محتوى ملف تكوين الجليكان الذي يدعم تحديد مويتي الغليكان كمعلمة رئيسية لبرنامج تحديد غليكوببتيد من خلال تحليل نتائج تحدي HGI. تستوعب معظم محركات البحث الكلاسيكية للبروتينات اختيار التعديلات القائمة على الجليكو من مجموعة مستمدة من البيانات التي تم جمعها في قواعد البيانات / المستودعات أو الأدبيات. تستخدم أدوات glycoproteomics المخصصة الأخرى معرفة التخليق الحيوي للجلايكان. وبهذه الطريقة ، يتم تعريف ملف التكوين نظريا كنتيجة للنشاط الأنزيمي المتوقع. في النهاية ، هناك العديد من ملفات التكوين مثل محركات البحث والتداخل بينها متغير للغاية. ومع ذلك، فإن التعلم من التجارب السابقة في مجال البروتينات، وخاصة عندما يتم حساب التعديلات اللاحقة للترجمة، يكشف أن أداء محركات البحث مرتبط بالحد من مساحة البحث31. يتم إجراء ملاحظات مماثلة في glycoproteomics وتم تصميم GlyConnect Compozitor لدعم اختيار بيانات التكوين المتعلمة ، والتي نوقشت أهميتها سابقا32.
تم توضيح استخدام هذه الأداة بشكل غير كامل في البروتوكول خاصة فيما يتعلق بعلامة التبويب "خيارات متقدمة" التي يمكن من خلالها التعبير عن الاستعلامات التي تطلق مباشرة الوصول البرمجي إلى GlyConnect عبر واجهة برمجة التطبيقات (API) الخاصة بها. على سبيل المثال، كتابة التصنيف = الإنسان العاقل & glycanType = N-linked&الأنسجة=البول والمرض=سرطان البروستاتا في نافذة الاستعلام في علامة التبويب خيارات متقدمة يعادل ملء الحقول المقابلة في علامة التبويب المصدر (تحديد الإنسان العاقل في الأنواع، والبول في الأنسجة، و N المرتبط في نوع غليكان) وعلامة التبويب المرض (تحديد الإنسان العاقل في الأنواع، سرطان البروستاتا في المرض و N المرتبطة في نوع غليكان). وبعبارة أخرى ، فإنه يوفر في خطوة واحدة نتيجة تتطلب عدة اختيارات.
أخيرا ، في حين يتم شرح إنشاء العقد الافتراضية في البروتوكول ، فإن تكرارها المحتمل يحتاج إلى تعليق إضافي. قد لا يمكن تمييز خيارين متزامنين لأن العمل المحاكي للإنزيمات في الرسم البياني لا يفسر التسلسل الزمني لأنشطة الإنزيم. هذا هو السبب في أن Compozitor يقترح مسارين من خلال عقدتين افتراضيتين لجسر عقدتين غير متصلتين تقابلان تعداد السكاريد الأحادي مع ما يصل إلى اختلافين. وغالبا ما يوفر إدراج بيانات جديدة حلقات مفقودة. المستخدم دائما حر في النظر في العقد الافتراضية أو رفضها ، عن طريق (إلغاء) تحديد المربع تضمين العقد الافتراضية .
قواعد البيانات المعروفة وقيود البرامج
بشكل عام ، كما هو الحال مع أي تنقل على الويب ، تؤدي البروتوكولات الموضحة أعلاه أحيانا إلى صفحة غير موجودة ، وغالبا ما يرجع ذلك إلى تحديث موقع أو تعارض التحديثات بين موقعين. في هذه الحالة ، وفي الواقع ، جميع الحالات التي لا يتدفق فيها التنقل ، فإن الأسهل هو إرسال ملاحظة إلى مكتب مساعدة Expasy الذي ساهمت كفاءته بشكل كبير في نجاح البوابة في السنوات ال 28 الماضية.
محتوى GlyConnect منحاز كانعكاس للاختلالات الحالية في الأدبيات. تشير غالبية المنشورات إلى N-glycosylation في الثدييات وقاعدة البيانات أكثر ثراء في البروتينات السكرية N البشرية. ومع ذلك، فقد طلب منا في الماضي إدراج مجموعات بيانات أقل شيوعا وأن نبقى منفتحين تماما على تلقي المشورة والاقتراحات.
إلى جانب ذلك ، يقتصر Compozitor حاليا على مقارنة ثلاث مجموعات بيانات تكوين. ومن المقرر إجراء مراجعة رئيسية لعلامة التبويب الفرعية المحددة في الأخطبوط. وتحتاج موارد Glyco@Expasy إلى تحديثات منتظمة وقد لا يتم تنفيذ بعضها في الوقت المناسب؛ ومع ذلك ، يتم نشر التحذيرات و / أو الإعلانات عند حدوث ذلك.
توفر بوابات الشركاء، المعروفة باسم GlyGen (https://www.glygen.org) وGlyCosmos (https://www.glycosmos.org)، خيارات وأدوات مختلفة. في نهاية المطاف ، ينطوي تصفح المعلومات والبحث عنها على أي من الخيارين على مستوى عال من الذاتية ويعتمد إلى حد كبير على عادات المستخدمين ومخاوفهم. لا يسعنا إلا أن نأمل أن يناسب حلنا جزءا من المجتمع.
تتزايد مدخلات علم الجلايكان في مشاريع علوم الحياة ويتم إنتاج الدراسات التي تحدد دور الجلايكان في القضايا الصحية باستمرار. وقد كشف التركيز الأخير على سارس-كوف-2 مرة أخرى عن أهمية البروتينات الغليكوزيلية، وخاصة في النهج الهيكلية33. تدعم المعلوماتية السكرية علماء الجليكو في المهام اليومية لتحليل البيانات وتفسيرها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يعترف المؤلف بحرارة بالأعضاء السابقين والحاليين في مجموعة Proteome Informatics Group المشاركين في تطوير الموارد المستخدمة في هذا البرنامج التعليمي ، وعلى وجه التحديد ، جوليان ماريثوز وكاثرين هايز ل GlyConnect ، وفرانسوا بونارديل ل UniLectin ، و Davide Alocci ، و Frederic Nikitin للأخطبوط ، و Thibault Robin ل Compozitor واللمسة الأخيرة على الأخطبوط.
وتدعم الحكومة الاتحادية السويسرية تطوير مشروع glyco@Expasy من خلال أمانة الدولة للتعليم والبحث والابتكار، وتكمله حاليا المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF: 31003A_179249). يتم الحفاظ على ExPASy من قبل المعهد السويسري للمعلوماتية الحيوية واستضافته في مركز كفاءة تكنولوجيا المعلومات الحيوية. كما يعترف المؤلف بآن إمبرتي لتعاونها المتميز على منصة UniLectin المدعومة بشكل مشترك من قبل ANR PIA Glyco@Alps (ANR-15-IDEX-02) ، والصناديق المشتركة ل Alliance Campus Rhodanien (http://campusrhodanien.unige-cofunds.ch) Labex Arcane / CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| internet connection | user's choice | ||
| recent version of web browser | user's choice |
References
- Spring Harbor Laboratory Press. Essentials of Glycobiology. , Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). (2015).
- Gray, C. J., et al. Advancing solutions to the carbohydrate sequencing challenge. Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14463-14479 (2019).
- Tsuchiya, S., Yamada, I., Aoki-Kinoshita, K. F. GlycanFormatConverter: a conversion tool for translating the complexities of glycans. Bioinformatics. 35 (14), 2434-2440 (2018).
- Fujita, A., et al. The international glycan repository GlyTouCan version 3.0. Nucleic Acids Research. 49, 1529-1533 (2021).
- Alocci, D., et al. GlyConnect: glycoproteomics goes visual, interactive, and analytical. Journal of Proteome Research. 18 (2), 664-677 (2019).
- York, W. S., et al. GlyGen: computational and informatics resources for glycoscience. Glycobiology. 30 (2), 72-73 (2020).
- Watanabe, Y., Aoki-Kinoshita, K. F., Ishihama, Y., Okuda, S. GlycoPOST realizes FAIR principles for glycomics mass spectrometry data. Nucleic Acids Research. 49, 1523-1528 (2020).
- Campbell, M. P., Aoki-Kinoshita, K. F., Lisacek, F., York, W. S., Packer, N. H. Glycoinformatics. Essentials of Glycobiology. , (2015).
- Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100060 (2021).
- Mariethoz, J., Hayes, C., Lisacek, F. Glycan compositions with Compozitor to enhance glycopeptide identification. Proteomics Data Analysis. 2361, 109-127 (2021).
- Kawahara, R., et al. Communityevaluation of glycoproteomics informatics solutions reveals high-performance search strategies of serum glycopeptide analysis. Nature Methods. 18, 1304-1316 (2021).
- Lisacek, F., Aoki-Kinoshita, K. F., Vora, J. K., Mazumder, R., Tiemeyer, M. Glycoinformatics resources integrated through the GlySpace Alliance. Comprehensive Glycoscience. 1, 507-521 (2021).
- Mariethoz, J., et al. Glycomics@ExPASy: bridging the gap. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (11), 2164-2176 (2018).
- Duvaud, S., et al. Expasy, the swiss bioinformatics resource portal, as designed by its users. Nucleic Acids Research. 49, 216-227 (2021).
- The UniProt Consortium et al. UniProt: the universal protein knowledgebase in 2021. Nucleic Acids Research. 49, 480-489 (2021).
- Bonnardel, F., Perez, S., Lisacek, F., Imberty, A. Structural database for lectins and the UniLectin web platform. Lectin Purification and Analysis. 2132, 1-14 (2020).
- Neelamegham, S., et al. Updates to the symbol nomenclature for glycans guidelines. Glycobiology. 29 (9), 620-624 (2019).
- Sharon, N. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN). Nomenclature of glycoproteins, glycopeptides and peptidoglycans: JCBN recommendations 1985. Glycoconjugate Journal. 3 (2), 123-133 (1986).
- Harvey, D. J., et al. Proposal for a standard system for drawing structural diagrams of N- and O-linked carbohydrates and related compounds. Proteomics. 9 (15), 3796-3801 (2009).
- Song, E., Mayampurath, A., Yu, C. -Y., Tang, H., Mechref, Y. Glycoproteomics: identifying the glycosylation of prostate specific antigen at normal and high isoelectric points by LC-MS/MS. Journal of Proteome Research. 13 (12), 5570-5580 (2014).
- Moran, A. B., et al. Profiling the proteoforms of urinary prostate-specific antigen by capillary electrophoresis - mass spectrometry. Journal of Proteomics. 238, 104148 (2021).
- Wang, W., et al. High-throughput glycopeptide profiling of prostate-specific antigen from seminal plasma by MALDI-MS. Talanta. 222, 121495 (2021).
- wwPDB consortium metal. Protein Data Bank: the single global archive for 3D macromolecular structure data. Nucleic Acids Research. 47, 520-528 (2019).
- Sehnal, D., Grant, O. C. Rapidly display glycan symbols in 3D structures: 3D-SNFG in LiteMol. Journal of Proteome Research. 18 (2), 770-774 (2019).
- Bonnardel, F., et al. UniLectin3D, a database of carbohydrate binding proteins with curated information on 3D structures and interacting ligands. Nucleic Acids Research. 47, 1236-1244 (2019).
- Sehnal, D., et al. LiteMol suite: interactive web-based visualization of large-scale macromolecular structure data. Nature Methods. 14 (12), 1121-1122 (2017).
- Salentin, S., Schreiber, S., Haupt, V. J., Adasme, M. F., Schroeder, M. PLIP: fully automated protein-ligand interaction profiler. Nucleic Acids Research. 43, 443-447 (2015).
- Robin, T., Mariethoz, J., Lisacek, F. Examining and fine-tuning the selection of glycan compositions with GlyConnect Compozitor. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (10), 1602-1618 (2020).
- Compagno, D., et al. Glycans and galectins in prostate cancer biology, angiogenesis and metastasis. Glycobiology. 24 (10), 899-906 (2014).
- Gentilini, L. D., et al. Stable and high expression of Galectin-8 tightly controls metastatic progression of prostate cancer. Oncotarget. 8 (27), 44654-44668 (2017).
- Schwämmle, V., Verano-Braga, T., Roepstorff, P. Computational and statistical methods for high-throughput analysis of post-translational modifications of proteins. Journal of Proteomics. 129, 3-15 (2015).
- Khatri, K., Klein, J. A., Zaia, J. Use of an informed search space maximizes confidence of site-specific assignment of glycoprotein glycosylation. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (2), 607-618 (2017).
- Sztain, T., et al. A glycan gate controls opening of the SARS-CoV-2 spike protein. Nature Chemistry. 13, 963-968 (2021).
