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Biology

Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de Xenopus

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63361
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

Summary

Aquí presentamos un protocolo para expresar las proteínas de unión de brecha en ovocitos de Xenopus y registrar la corriente de unión entre dos ovocitos appuestos utilizando un amplificador comercial diseñado para grabaciones de abrazadera de voltaje de ovocitos duales en un modo de medición de corriente lateral alta.

Abstract

La expresión heteróloga de conexinas e inexinas en ovocitos de Xenopus es un enfoque poderoso para estudiar las propiedades biofísicas de las uniones de brecha (GJ). Sin embargo, este enfoque es técnicamente desafiante porque requiere una pinza de voltaje diferencial de dos ovocitos opuestos que comparten un terreno común. Aunque un pequeño número de laboratorios han logrado realizar esta técnica, esencialmente todos ellos han utilizado amplificadores caseros o amplificadores comerciales que fueron diseñados para grabaciones de un solo ovocito. A menudo es un desafío para otros laboratorios implementar esta técnica. Aunque se ha incorporado un modo de medición de alta corriente lateral en un amplificador comercial para grabaciones de abrazadera de voltaje de oocitos duales, no había habido ningún informe para su aplicación hasta nuestro estudio reciente. Hemos hecho que el enfoque de medición de alta corriente lateral sea más práctico y conveniente mediante la introducción de varias modificaciones técnicas, incluida la construcción de una plataforma de grabación basada magnéticamente que permite la colocación precisa de ovocitos y varios electrodos, el uso de la solución de baño como conductor en electrodos diferenciales de voltaje, la adopción de un electrodo KCl comercial de baja fuga como electrodo de referencia, fabricación de electrodos de corriente y voltaje a partir de capilares de vidrio de pared delgada, y posicionamiento de todos los electrodos utilizando dispositivos basados magnéticamente. El método descrito aquí permite registros convenientes y robustos de la corriente de unión (Ij) entre dos ovocitos xenopus opuestos .

Introduction

Los CG son canales intercelulares que pueden permitir el flujo de corriente y el intercambio de pequeñas moléculas citosólicas entre las células vecinas. Existen en muchos tipos de células y realizan diversas funciones fisiológicas. Los GJ en vertebrados están formados por conexinas, mientras que los de invertebrados por inexinas. Cada GJ consta de dos hemicanales yuxtapuestos con 6 u 8 subunidades por hemical, dependiendo de si son conexinas o inexinas 1,2,3. Los seres humanos tienen 21 genesde conexina 4, mientras que los modelos de invertebrados comúnmente utilizados C. elegans y Drosophila melanogaster tienen 25 y 8 genes de inexina, respectivamente 5,6. El empalme alternativo de las transcripciones de genes puede aumentar aún más la diversidad de las proteínas GJ, al menos para las inexinas 7,8.

Los CG se pueden dividir en tres categorías basadas en composiciones moleculares: homotípicas, heterotípicas y heteroméricas. Un GJ homotípico tiene todas sus subunidades siendo idénticas. Un GJ heterotípico tiene dos hemicales homoméricos, pero los dos hemicanales están formados por dos proteínas GJ diferentes. Un GJ heteromérico contiene al menos un hemicanal heteromérico. Las diversidades moleculares de los GJ pueden conferir distintas propiedades biofísicas que son importantes para sus funciones fisiológicas. Las propiedades biofísicas de GJ también son moduladas por proteínas reguladoras9. Para comprender cómo los GJ realizan sus funciones fisiológicas, es importante conocer sus composiciones moleculares, propiedades biofísicas y el papel de las proteínas reguladoras en sus funciones.

Los sistemas de expresión heterólogos se utilizan a menudo para estudiar las propiedades biofísicas de los canales iónicos, incluidos los CG, y los efectos de las proteínas reguladoras en ellos. Debido a que los sistemas de expresión heteróloga permiten la expresión de proteínas específicas, generalmente son más susceptibles de diseccionar funciones de proteínas que los tejidos nativos donde las proteínas con funciones redundantes pueden complicar el análisis, y el registro de Ij puede ser inalcanzable. Desafortunadamente, las líneas celulares más comúnmente utilizadas, excepto la célula Neuro-2A, son inapropiadas para estudiar las propiedades biofísicas de GJ debido a complicaciones por las conexinas endógenas. Incluso las células Neuro-2A no siempre son apropiadas para este tipo de análisis. Por ejemplo, no pudimos detectar ningún Ij en células Neuro-2A transfectadas con las inexinas UNC-7 y UNC-9 ni en ausencia ni en presencia de UNC-1 (no publicado), lo que es necesario para la función de unC-9 GJs en C. elegans 9,10. Por otro lado, los ovocitos Xenopus son un sistema alternativo útil para los análisis electrofisiológicos de GJs. Aunque expresan una proteína GJ endógena, la conexina 38 (Cx38)11, las posibles complicaciones se pueden evitar fácilmente inyectando un oligonucleótido antisentidoespecífico 12. Sin embargo, los análisis de GJ con ovocitos xenopus requieren una pinza de voltaje diferencial de dos células yuxtapuestas, lo cual es técnicamente un desafío. Los primeros éxitos de la abrazadera de doble voltaje de los blastómeros de rana se informaron hace unos 40 años13,14. Desde entonces, muchos estudios han utilizado esta técnica para registrar Ij en ovocitos de Xenopus pareados. Sin embargo, esencialmente todos los estudios previos se han realizado con amplificadores caseros 12,15,16 o amplificadores comerciales diseñados para grabaciones en ovocitos individuales (GeneClamp 500, AxoClamp 2A o AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Debido a que incluso los amplificadores comerciales no proporcionan instrucciones para la abrazadera de voltaje de doble ovocito, a menudo es un desafío para los laboratorios electrofisiológicos nuevos o menos sofisticados implementar esta técnica.

Solo se ha desarrollado un amplificador comercial para abrazadera de voltaje de doble ovocito, el OC-725C de Warner Instruments (Tabla de Materiales, Figura 1A). Este amplificador se puede utilizar en un modo estándar (para ovocitos individuales) o en un modo de medición de alta corriente lateral (para ovocitos simples o dobles) dependiendo de si dos tomas en su sonda de voltaje están conectadas (Figura 1B, C). Sin embargo, hasta nuestro reciente estudio7, no había habido una sola publicación que describiera el uso de este amplificador en su modo de medición de alta corriente lateral. Aunque el amplificador ha sido utilizado por otro laboratorio para grabaciones de ovocitos duales, se utilizó en el modo estándar en lugar del modo de lado alto21,22. Esta falta de informes sobre el uso del amplificador en su modo de medición de alta corriente lateral podría deberse a dificultades técnicas. No fue posible obtener grabaciones de ovocitos duales estables utilizando el modo de lado alto siguiendo las instrucciones del fabricante. A lo largo de los años, hemos probado tres enfoques diferentes para grabaciones de ovocitos duales, incluido el uso de dos amplificadores OC-725C en el modo de medición de alta corriente lateral, dos amplificadores OC-725C en el modo estándar y dos amplificadores de otro fabricante. Finalmente logramos obtener grabaciones estables solo con el primer enfoque después de un extenso ensayo y error. Esta publicación describe y demuestra los procedimientos que utilizamos para expresar las proteínas GJ en los ovocitos xenopus, registrar Ij utilizando el modo de medición de alta corriente lateral y analizar los datos electrofisiológicos utilizando un software comercial popular. Puede encontrarse información adicional sobre la técnica de doble pinza de voltaje en otras publicaciones19,23.

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Protocol

Las cirugías se realizan siguiendo un protocolo aprobado por el comité institucional de cuidado de animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Connecticut.

1. Cirugía de rana y preparación de ovocitos desfolicados

  1. Anestesiar una rana africana adulta con garras (Xenopus laevis) (Tabla de Materiales) sumergiéndola en una solución de tricaína fría (con hielo) (~ 300 mg / L).
  2. Espere (~ 15 minutos) hasta que la rana muestre poca o ninguna respuesta al apretar sus patas palmeadas. Coloque la rana en una mesa de operaciones con el vientre hacia arriba.
  3. Después de una incisión longitudinal (8-10 mm de largo) en la región abdominal inferior izquierda o derecha, extraiga suavemente un pequeño trozo de tejido ovárico con un par de fórceps y corte el tejido ovárico con un par de tijeras pequeñas.
  4. Sumergir inmediatamente el tejido ovárico libre en una solución ND96 libre de Ca2+ (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) dentro de una placa de Petri de 60 mm.
  5. Después de cerrar la incisión con suturas simples interrumpidas con una sutura de seda 5-0 (Tabla de materiales), vuelva a colocar la rana en un tanque de agua poco profundo para su recuperación.
    NOTA: La incisión se cierra en dos pasos: primero las capas peritoneal y muscular, y luego la capa de la piel. Cada rana se somete a 5 cirugías con al menos un intervalo de 4 semanas entre dos cirugías consecutivas.
  6. Transfiera el tejido ovárico aislado a un tubo centrífugo de 50 ml que contenga 10 ml de solución ND96 libre de Ca2+ con 20 mg de colagenasa (Tabla de Materiales) y 20 mg de hialuronidasa (Tabla de Materiales).
  7. Agite el tubo en un agitador orbitario a temperatura ambiente (RT) hasta que todos los ovocitos se hayan aislado (solitario).
  8. A partir de entonces, transfiera 30-50 ovocitos a una placa de Petri utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y examine los ovocitos con frecuencia bajo un estereomicroscopio (≥ poder de aumento más alto 25x) para determinar si están defolculados.
    NOTA: La pipeta Pasteur debe ser "cortada" a una abertura de punta más ancha usando un escribano de diamante (Tabla de Materiales) y flameada para alisar el borde de corte.
  9. Tan pronto como el 70% -80% de los ovocitos se dedfolulen, decante la solución enzimática inclinando suavemente el tubo. Lave los ovocitos 5 veces llenando el tubo con solución ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) y decantando la solución.
  10. Después del lavado final, transfiera los ovocitos a una placa de Petri de 60 mm que contenga solución ND96. Recoger y transferir ovocitos grandes y de aspecto saludable a una placa de Petri de 60 mm que contiene solución de ND96 suplementada con piruvato de sodio (2 mM) y penicilina-estreptomicina (100 U/mL) utilizando una pipeta Pasteur de vidrio limpio.
    NOTA: Los "ovocitos grandes y de aspecto saludable" son aquellos de las etapas V y VI que no muestran signos de sobredigestión por parte de las enzimas.
  11. Coloque la placa de Petri que contiene los ovocitos recogidos dentro de una cámara ambiental (15-18 °C).

2. Expresión de la proteína GJ

  1. Sintetizar ARN complementario (ARNc) de una conexina o inexina específica in vitro utilizando un kit de transcripción de ARN (Tabla de Materiales) siguiendo el protocolo del fabricante.
  2. Precipitar el ARNc utilizando un método de cloruro de litio descrito en el manual de usuario del kit de transcripción de ARN.
  3. Lave el pellet con etanol al 70%, disuelva en 20 μL de H2O libre de nucleasa y agregue 1 μL de inhibidor de la ribonucleasa (40 U, Tabla de materiales).
  4. Medir la concentración del ARNc utilizando un espectrofotómetro (Tabla de Materiales).
  5. Mezclar el ARNc con un oligo sinsentido Cx38 para que las concentraciones finales sean de 200-1.000 ng/μL de cRNA y 100 ng/μL oligo.
    NOTA: La secuencia oligo es 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, que corresponde a los nucleótidos de -5 a +25 en Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI Adhesión: NM_001088018)11. El oligo se mantiene como una solución madre (2,0 mg/ml) antes de ser mezclado con el ARNc.
  6. Elimine las partículas en el ARNc girando en una microcentrífuga (~ 16,000 x g) durante 2 minutos, y transfiera rápidamente todo el sobrenadante a un nuevo tubo mediante pipeteo (evite perturbar el fondo del tubo de la microcentrífuga).
  7. Divida el ARNc en alícuotas (2,5 μL/vial) y guarde las alícuotas en un congelador de -80 °C.
  8. Prepare una placa de inyección de ovocitos pegando una pequeña pieza (~ 1 cm x 1 cm) de malla de nylon (Tabla de materiales) en la parte inferior de una placa de Petri de 35 mm con un adhesivo epoxi de curado rápido.
    NOTA: La placa de inyección de ovocitos es reutilizable. Lávelo con etanol al 70% después de cada uso.
  9. Llene la placa de inyección de ovocitos aproximadamente hasta la mitad con la solución de ND96 (suplementada con piruvato y penicilina-estreptomicina).
  10. Coloque 25-30 ovocitos en filas dentro de la placa de Petri.
  11. Prepare micropipetas de vidrio para inyecciones de ovocitos siguiendo las instrucciones del manual de usuario del inyector de nanolitros automatizado (Tabla de materiales).
    NOTA: El uso de un biselador de microelectrodos (Tabla de materiales) puede ayudar a producir micropipetas de inyección afiladas que causan un daño mínimo a los ovocitos.
  12. Rellene una micropipeta de inyección con aceite mineral ligero e insértela en el soporte de micropipeta del inyector.
  13. Transfiera el ARNc de una de las alícuotas almacenadas a la superficie interior de una cubierta o fondo de placa de Petri mediante pipeteo.
  14. Aspire la gota de ARNc en la punta de la micropipeta presionando el botón FILL en el controlador del inyector.
  15. Inyecte el ARNc (~50 nL/ovocito) pulsando el botón INYECTAR .
    NOTA: El volumen de inyección puede ser ajustado por los interruptores dip en el controlador del inyector.
  16. Transfiera los ovocitos inyectados a una nueva placa de Petri que contenga solución de ND96 (suplementada con piruvato y penicilina-estreptomicina), y manténgalos dentro de la cámara ambiental (15-18 ° C) durante 1-3 días (dependiendo de la velocidad y el nivel de expresión de la proteína GJ). Reemplace la solución diariamente transfiriendo los ovocitos a una nueva placa de Petri.

3. Emparejamiento de ovocitos

  1. Transfiera algunos de los ovocitos inyectados a una placa de Petri de 35 mm que contenga solución ND96.
  2. Use dos pinzas finas (Tabla de Materiales) para despegar suavemente la membrana vitelina transparente que envuelve el ovocito.
    NOTA: Puede ser necesario afilar las puntas de las pinzas antes del primer uso y, de vez en cuando, utilizando un trozo de papel de lija fino (600 Grit).
  3. Coloque 2 ovocitos por pocillo en una cámara de emparejamiento de ovocitos (Figura 1D) que contenga solución ND96 (suplementada con piruvato y penicilina-estreptomicina).
    NOTA: La cámara de emparejamiento de ovocitos se construye pegando una pequeña pieza de una Minitray Microwell (Tabla de Materiales) en la parte inferior de una placa de Petri de 35 mm (Tabla de Materiales) utilizando un adhesivo epoxi de curado rápido. La Minitray se corta en trozos pequeños utilizando un cortador de alambre caliente (Tabla de Materiales). El uso de la Minitray para el emparejamiento de ovocitos fue descrito originalmente por otros24. Aunque una proteína GJ podría distribuirse de manera no uniforme en la membrana celular de los ovocitos dependiendo de las propiedades de carga de los residuos de aminoácidos en sus dominios citosólicos25, el emparejamiento aleatorio (sin discriminar entre los polos animal y vegetal del ovocito) parece ser suficiente en general.
  4. Mantenga la placa de Petri que contiene ovocitos pareados en RT en la mesa de aislamiento para ser utilizada para registros electrofisiológicos.
    NOTA: La duración del emparejamiento puede variar de unas pocas horas a un día. Una práctica conveniente es emparejar ovocitos al final de la tarde y registrarlos al día siguiente.

4. Preparación del sistema de adquisición

  1. Configure dos amplificadores de abrazadera de ovocitos OC-725C (Tabla de materiales) en el modo de medición de corriente lateral alta ajustando un interruptor de inmersión interno (Figura 1B).
  2. Conecte a tierra los amplificadores interconectando primero las tomas de circuito de tierra en los paneles traseros y luego conectándose a la jaula de Faraday y la luz de fibra utilizada para iluminar la cámara de grabación.
  3. Conecte los amplificadores a un convertidor de señal analógico a digital (Tabla de materiales) y configúrelos en el módulo Clampex del software pClamp (Tabla de materiales) siguiendo las instrucciones del fabricante del amplificador.
  4. Pruebe el sistema de adquisición con la celda modelo suministrada con el amplificador.
    1. Conecte la sonda VDIFF y los cables de corriente (I) a la celda modelo, conecte los zócalos rojo y negro de la sonda VDIFF con el puente incluido, conecte cualquiera de las patas del puente a cualquiera de los pines de la celda modelo y conecte el cable de tierra de la celda modelo al cable desde la toma GROUNDS CIRCUIT del amplificador (Figura 1E).
    2. Ponga a cero los medidores de electrodo de voltaje (Vm) y electrodo de baño (Im) del amplificador girando las perillas Vm OFFSET y Ve OFFSET , respectivamente, cambie la abrazadera de OFF a Fast o SLOW y gire el dial GAIN en el sentido de las agujas del reloj a un nivel que permita una abrazadera de voltaje adecuada (Figura 1A). El interruptor D.C. GAIN puede estar en la posición OUT o IN .
    3. Ejecute un protocolo de adquisición simple que contenga algunos pasos de voltaje para confirmar que el voltaje que se muestra en el medidor de Vm cambia de acuerdo con el protocolo de adquisición y que los rastros de voltaje y corriente se muestran correctamente en Clampex.
      NOTA: Solo se puede probar un amplificador cada vez que se utiliza este enfoque.

5. Registro Ij entre ovocitos pareados

  1. Crear protocolos de adquisición para la grabación Ij en el software pClamp.
    NOTA: Cree dos protocolos de adquisición. En uno de ellos, el amplificador # 1 se utiliza para producir una serie de pasos de voltaje de membrana (Vm) (por ejemplo, -150 a +90 mV a intervalos de 10 mV), mientras que el amplificador # 2 se utiliza para mantener un Vm constante (por ejemplo, -30 mV). En el otro protocolo, el amplificador # 2 se usa para producir los pasos Vm , mientras que el amplificador # 1 se usa para mantener la constante Vm. Los pasos Vm positivos y negativos deben aplicarse alternativamente (por ejemplo, -150, +90, -140, +80 ......), que se pueden programar en Clampex utilizando la función Lista de usuarios en el protocolo de adquisición.
  2. Configurar la etapa de grabación
    1. Deje caer una placa de Petri que contenga ovocitos emparejados en el receptáculo de la placa de Petri en la plataforma de grabación (Figura 2A)
    2. Seleccione un par de ovocitos y gire la placa de Petri si es necesario para que los dos ovocitos estén en la dirección izquierda y derecha, y bloquee la etapa en posición por su base magnética.
    3. Fije los soportes magnéticos que sostienen las sondas de corriente y voltaje en lugares apropiados en la mesa de aislamiento.
      NOTA: Asegúrese de que las sondas de corriente y voltaje de un amplificador estén ubicadas en el lado izquierdo, mientras que las del otro amplificador estén en el lado derecho, y que la sonda de voltaje esté frente a la sonda de corriente en cada lado (Figura 2B, C).
  3. Configurar el electrodo de referencia
    1. Coloque un electrodo de referencia (Tabla de Materiales) cerca del borde de la placa de Petri hacia el lado del usuario (Figura 2B, C).
    2. Conecte el electrodo de referencia a la toma negra (Circuit Ground) en solo una de las dos sondas VDIFF .
  4. Configurar los electrodos VDIFF
    1. Tire de un par de micropipetas de vidrio, rompa un poco de la punta con el escribano de diamante (Tabla de materiales) y alise el borde de la punta puliendo al fuego.
      NOTA: La resistencia de la punta debe ser inferior a 150 kΩ (medida con ND96 en la pipeta). Por lo general, se utilizan micropipetas con una resistencia de punta de 20-150 kΩ.
    2. Sostenga la micropipeta sobre la llama de un quemador de alcohol para doblarla a un ángulo suave (~ 130 °) en una posición de ~ 1 cm de distancia de la punta.
      NOTA: Las micropipetas fabricadas son reutilizables. Enjuáguelos con agua después de cada uso.
    3. Rellene la pipeta de vidrio completamente con una solución ND96, insértela en un soporte de microelectrodo precargado (con ND96) (Tabla de materiales, Figura 2D) y asegúrese de que no haya burbujas de aire presentes en el sistema.
    4. Inserte el pin de 2 mm del soporte de microelectrodo en el zócalo de 2 mm de un cable de conexión de electrodo VDIFF (Figura 2D).
    5. Sujete el zócalo de 2 mm en una pinza de base magnética (Figura 2D) y apunte la punta del electrodo VDIFF hacia uno de los dos ovocitos (Figura 2E).
      NOTA: Ajuste la posición y el ángulo de la pinza para que la punta del electrodo esté muy cerca del ovocito
    6. Inserte el pin de 1 mm del cable de conexión del electrodo VDIFF en el zócalo rojo (entrada VDIFF ) en la sonda VDIFF del mismo lado.
    7. Prepare y conecte un electrodo VDIFF para el otro ovocito y amplificador siguiendo procedimientos similares.
      NOTA: Una vista en primer plano de un par de ovocitos y todos los electrodos se muestran en la Figura 2E.
  5. Configurar los electrodos de corriente y voltaje
    1. Prepare los electrodos de voltaje y corriente de los capilares de vidrio, rellene (aproximadamente a mitad de camino) con una solución KCl (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 con KOH) e insértelos en los soportes de electrodos provistos con los amplificadores.
      NOTA: Los electrodos deben tener una resistencia de ~1 MΩ. Se pueden obtener electrodos adecuados a partir de un tipo de capilares de vidrio de pared delgada (Tabla de Materiales) utilizando un conjunto específico de parámetros de tracción (Tabla 1). Tales puntas pueden penetrar fácilmente en la membrana celular de los ovocitos sin la necesidad de presionar el botón Vm o Ve BUZZ en el amplificador.
    2. Baje los electrodos en la solución de baño, ponga a cero los medidores Vm e Im girando los diales Vm OFFSET y Ve OFFSET y verifique la resistencia del electrodo presionando Vm Electrode Test y Ve Electrode Test.
    3. Inserte los electrodos de corriente y voltaje en los ovocitos y observe potenciales de membrana negativos (típicamente -20 a -50 mV).
      NOTA: Los medidores Vm e Im del mismo amplificador deben mostrar dos valores idénticos o muy similares.
  6. Adquisición de datos
    1. En la sección Abrazadera del amplificador, confirme que D.C. GAIN está en la posición IN, gire la perilla GAIN en el sentido de las agujas del reloj a un nivel que permita la abrazadera de voltaje adecuada (generalmente de un tercio a la mitad del rango completo) y gire el interruptor de la abrazadera de OFF a FAST.
      NOTA: Al encender la abrazadera, los medidores Vm e Im mostrarán el voltaje de retención y la corriente de retención, respectivamente. Aunque la corriente de retención puede variar un poco dependiendo de las condiciones de los ovocitos, generalmente es pequeña y estable en la explotación Vm (por ejemplo, -30 mV).
    2. Ejecute un protocolo de adquisición.
      NOTA: Se mostrarán cuatro rastros en la pantalla. Las trazas de voltaje y corriente de un amplificador indican los pasos de Vm aplicados al ovocito #1 y la corriente necesaria para producir los pasos de Vm , mientras que los del otro amplificador indican la constante Vm (-30 mV) del ovocito #2, y la corriente inyectada para mantener esta constante Vm. La corriente inyectada en el ovocito #2 representa la Ij.

6. Análisis de datos

  1. Análisis con Clampfit.
    1. Abra un archivo abf grabado en el módulo Clampfit de pClamp.
    2. Utilice los cursores 1 y 2 para encerrar un segmento de la línea de base antes de que las trazas Ij .
    3. Haga clic en el icono Ajustar línea base para abrir una ventana línea base. Seleccione Restar media de cursores 1..2 para Método y confirme que Todas las señales visibles y Todas las trazas visibles están seleccionadas para Selección de trazas.
    4. Al hacer clic en Aceptar, la ventana Línea base se cierra, las líneas base de todas las trazas de corriente y voltaje convergen en el nivel cero. Tenga en cuenta que los pasos de voltaje cambian a nuevos niveles que son iguales al voltaje original menos el voltaje de retención (por ejemplo, -30 mV).
    5. Para trazar la relación Ij y Vj usando el estado estacionario Ij, encierre un segmento deseado de las trazas Ij que representan el estado estacionario Ij con los cursores 1 y 2, coloque el cursor 3 en cualquier lugar dentro de la ventana de tiempo de los pasos de voltaje.
    6. Vaya a Analizar / Gráfico rápido / I-V para abrir una ventana I-V .
    7. En Eje X (Voltaje), seleccione Cursor 3 en Señal, especifique la señal de paso de voltaje (por ejemplo, Voltaje 1) en el menú desplegable y marque la casilla Invertir.
      NOTA: La casilla Invertir está marcada para convertir la Vm a valores equivalentes a Vj, que se define como Vm del ovocito #2-V m del ovocito #1.
    8. En Eje Y (Actual), seleccione la fuente de la señal Ij (por ejemplo, Actual 0) en el menú desplegable junto a Señal, defina Región como Cursores 1..2 en el menú desplegable y seleccione Media.
      NOTA: Para trazar las relaciones pico Ij y Vj , los cursores 1 y 2 deben incluir el segmento de las trazas Ij que contienen el pico Ij en el paso 6.1.5 y seleccionar Pico (en lugar de Media) en el paso 6.1.8.
    9. En la opción Destino , seleccione Reemplazar o Anexar.
    10. Al hacer clic en Aceptar en la ventana I-V , se muestra una relación Ij - Vj en la pantalla, y se pueden encontrar los valores Ij y Vj correspondientes haciendo clic en Ventana/Resultado.
  2. Trazar y ajustar la relación Gj-V j en OriginPro (Tabla de Materiales)
    1. Copie las dos columnas que contienen los valores Vj e Ij de la ventana Resultados de Clampfit (paso 6.1.10) en un nuevo libro en Origin. Asegúrese de que los valores Vj e Ij estén bajo las columnas X e Y, respectivamente.
    2. Agregue cuatro columnas nuevas en el libro haciendo clic en Columna/ Agregar nuevas columnas.
    3. Asigne a la primera columna nueva el nombre Gj, llénela introduciendo la ecuación "columna Ij/columna Vj * 1.000" en la ventana Establecer valores de columna y cree un gráfico de dispersión de la relación Gj-V j.
      NOTA: La multiplicación por 1.000 (opcional) es para evitar el inconveniente de tratar con números muy pequeños en pasos posteriores.
    4. Ajuste los puntos de datos Gj sobre los rangos Vj negativo y positivo de forma independiente a la función de Boltzmann. Calcule Gj en Vj = 0 mV ingresando los valores Gjmax, Gjmin, A y V0 a partir del ajuste en la ecuación de Boltzmann, lo que se puede hacer en una hoja de cálculo. El Gj así obtenido se utilizará como Gjmax en el siguiente paso.
      NOTA: La ecuación para ajustarse a la función de Boltzmann es: G j = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, en la que V0 es la Vj en la que la conductancia es medio máxima, Gjmax es la conductancia máxima, Gjmin es la Vj-insensible conductancia residual23. Para realizar la conexión, primero agregue la ecuación de Boltzmann como una nueva función de conexión en OriginPro y, a continuación, seleccione esta función para la conexión. Introduzca los valores aproximados de semilla para Gjmax, Gjmin, V0 y A antes de ejecutar la función de ajuste. Asegúrese de que el parámetro Gjmax no esté fijo para esta conexión.
    5. Nombra la segunda y tercera columnas nuevas como nGj-L y nGj-R ("n" para "normalizado"), y llénalas dividiendo la columna Gj por los valores Gjmax derivados de las curvas izquierda y derecha Gj - Vj , respectivamente (paso 6.2.4).
    6. Asigne a la cuarta columna nueva el nombre nGj-LR y llénela copiando los valores de los rangos Vj negativo y positivo de las columnas nGj-L y nGj-R, respectivamente.
    7. Cree un diagrama de dispersión para nGj-LR sobre Vj y ajuste los puntos de datos sobre los rangos Vj negativo y positivo a la función de Boltzmann de forma independiente. Asegúrese de que el parámetro Gjmax esté fijado en 1.0 para la conexión.
    8. Mantenga registros de los resultados de ajuste (por ejemplo, el gráfico ajustado y los valores Gjmin, V0 y A ).

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Representative Results

UNC-7 y UNC-9 son inexinas de C. elegans. Mientras que UNC-9 tiene una sola isoforma, UNC-7 tiene múltiples isoformas que difieren principalmente en la longitud y secuencia de aminoácidos de sus amino terminales 7,8. Estas inexinas pueden formar GJ homotípicas y heterotípicas (de UNC-7 y UNC-9) cuando se expresan en ovocitos xenopus 7,8. Las trazas representativas Ij y las relaciones Gj-V j normalizadas resultantes de los GJ homotípicos UNC-7b y UNC-9 se muestran en la Figura 3. En estos experimentos con ovocitos pareados, Vm del Ovocito 1 se sujetaron a diferentes niveles de la tensión de retención (-30 mV), mientras que la del Ovocito 2 se mantuvo constante a -30 mV para monitorear la Ij. Los resultados muestran que estos dos tipos de GJ difieren en la tasa de inactivación Vj-dependiente de Ij, la dependencia V j (indicada por la pendiente de la curva G j-V j) y la cantidad del residuo Gj. Muchos otros ejemplos de CG UNC-7 y UNC-9, incluidos los CG rectificadores, se pueden encontrar en nuestra reciente publicación7.

Figure 1
Figura 1: Configuración de la cámara de emparejamiento de ovocitos y el amplificador. (A) Panel frontal del amplificador de abrazadera de ovocitos OC-725C. (B) Un interruptor DIP dentro del amplificador configurado para la medición de corriente lateral alta. Todos los interruptores de palanca excepto 2, 5 y 7 están en la posición OFF para usar el amplificador en el modo de medición de corriente lateral alta. (C) Una sonda VDIFF con el zócalo rojo (para la entrada VDIFF ) y el zócalo negro (para circuit ground) desconectados o conectados. La sonda se puede utilizar para el modo estándar de abrazadera de voltaje cuando los dos enchufes están conectados. (D) Una cámara de emparejamiento de ovocitos. (E) Una celda modelo con conexiones para probar el sistema de adquisición con el amplificador en el modo de medición de corriente lateral alta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuración de ovocitos y electrodos. (A) La etapa de grabación. El orificio circular tiene un diámetro de 36 mm. (B) Diagrama que muestra las posiciones de los diversos electrodos. (C) Disposición real de los diversos electrodos. (D) Dos electrodos VDIFF con sus soportes y cables de conexión sujetos en la etapa de grabación por dos abrazaderas magnéticas diferentes, incluido un soporte magnético de puente de agar modificado (Tabla de materiales) (arriba) y una abrazadera de tubo (Tabla de materiales) (abajo). El primero es más estable en el mantenimiento de la posición del electrodo debido a su base magnética más grande, pero requiere modificación. Las micropipetas de vidrio se giran 90° desde sus posiciones de operación para mostrar los ángulos de flexión. (E) Una vista en primer plano de un par de ovocitos y los electrodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Trazas de registro representativas. (A) Diagrama que muestra el experimento de ovocitos. Los pasos de voltaje de membrana (Vm) negativos y positivos se aplican al Ovocito 1 desde una retención Vm de -30 mV, mientras que el Ovocito 2 se mantiene a una constante Vm de -30 mV. La tensión transyuncional (Vj) se define como Vm del Ovocito 2 -Vm del Ovocito 1. (B). Muestra Ij trazas y la resultante conductancia de unión normalizada (Gj) -Vj relación de uniones homotípicas UNC-9. (C) Muestra Ij trazas y la resultante relación normalizada Gj-V j de las uniones homotípicas de brecha UNC-7b. Las relaciones Gj-V j están ajustadas por una función de Boltzmann (líneas rojas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Paso No. Calor Tirar Velocidad Hora
1 260 ... 40 200
2 240 ... 40 200
3 240 60 40 200
4 245 100 60 200
Consulte el manual del usuario en el sitio web del fabricante para obtener definiciones de los parámetros de extracción (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Tabla 1: Parámetros de extracción de electrodos. Estos parámetros se basan en capilares de vidrio de pared delgada (Tabla de Materiales) y una temperatura de rampa de 258 en un extractor de micropipetaS P-97 (Tabla de Materiales). Deben ajustarse de acuerdo con la temperatura de la rampa para este vidrio en su tirador. Por ejemplo, si la temperatura de la rampa en el extractor es 20 ° más alta, agregue 20 ° a cada paso y realice los ajustes necesarios. En general, el tamaño de la punta se puede optimizar ajustando la velocidad del último paso. Consulte el manual del usuario en el sitio web del fabricante para conocer los significados de los parámetros de extracción (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

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Discussion

La optimización del sistema parece ser necesaria para los experimentos de pinza de voltaje de ovocitos duales. Sin él, las grabaciones pueden ser altamente inestables, y los amplificadores pueden tener que inyectar una cantidad excesiva de corriente para llegar al Vm objetivo, lo que resulta en daños en los ovocitos y fallas de grabación. Varios factores son críticos para obtener registros de ovocitos duales estables con el método de medición de corriente lateral alta. Primero, los electrodos de corriente y voltaje deben tener la resistencia adecuada (~ 1 MΩ), y sus soportes deben estar limpios. En segundo lugar, los electrodos VDIFF deben tener baja resistencia (<150 kΩ) y estar cerca de los ovocitos. En tercer lugar, todos los electrodos para el mismo ovocito (voltaje, corriente y VDIFF) deben colocarse en el mismo lado (izquierda o derecha), y el orden de los electrodos (de atrás hacia adelante) debe ser corriente, voltaje y VDIFF. Por último, el electrodo de referencia debe estar ubicado cerca del borde de la placa de Petri de 35 mm hacia el usuario.

Hemos modificado algunos procedimientos recomendados por el fabricante e hicimos algunas otras mejoras. Entre ellos se encuentran: 1) micropipetas llenas de ND96 en lugar de puentes de agar cargados con KCl para servir como electrodos VDIFF . Los electrodos de vidrio son fáciles de construir, reutilizables y no dañinos para los ovocitos; 2) un electrodo KCl de baja fuga como electrodo de referencia. Este electrodo tiene baja resistencia (~2.7 kΩ) y potencial estable, y tiene fugas de pequeños electrolitos (~5.7 x 10-8 mL/h); 3) una plataforma de grabación diseñada y construida a medida que permite un posicionamiento estable, conveniente y preciso de los ovocitos y los diversos electrodos. Esta etapa también proporciona un amplio acceso a un estereomicroscopio, una luz de fibra con cuellos de cisne duales y los cuatro soportes magnéticos utilizados para montar y posicionar los electrodos de corriente y voltaje; y 4) fabricación de electrodos de corriente y voltaje a partir de un tipo de capilares de vidrio de pared delgada. Estos electrodos tienen la resistencia de punta deseada (0.5-1.4 MΩ), pueden penetrar la membrana de la célula de los ovocitos muy fácilmente y causar un daño mínimo a los ovocitos.

Ocasionalmente, el sistema de grabación no funciona correctamente, como lo indica una corriente de retención inusualmente grande o en continuo aumento, el desarrollo de una mancha blanca en la membrana celular alrededor del electrodo de corriente y trazas inestables de Vm en respuesta a comandos de voltaje. Las posibles causas son 1) un sistema de electrodos VDIFF tiene una pequeña burbuja de aire o la punta del electrodo VDIFF no está dirigida correctamente hacia el ovocito; 2) un electrodo de voltaje o corriente tiene alta resistencia (por ejemplo, >2 MΩ) o su soporte está sucio por el depósito de sal; 3) el cable de conexión para un electrodo VDIFF está roto; 4) la ganancia D.C. no está configurada en IN durante la pinza de voltaje.

Aquí hemos descrito un método para registrar Ij de ovocitos de Xenopus . Permite una pinza de voltaje estable de dos ovocitos opuestos. Este método es fácil de implementar y parece no tener limitaciones obvias para analizar las propiedades biofísicas de los CG. Sin embargo, no estamos en condiciones de decir cómo se compara con otros métodos publicados. Esperamos que los laboratorios que están recientemente interesados en configurar la técnica de abrazadera de voltaje de doble ovocito encuentren que vale la pena considerar este método.

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Disclosures

Los autores no tienen conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a Haiying Zhan, Qian Ge por su participación en la etapa inicial del desarrollo técnico, Kiranmayi Vedantham por ayudar con las figuras y al Dr. Camillo Peracchia por el asesoramiento sobre la cámara de emparejamiento de ovocitos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bridge Magnetic Holder ALA Scientific Instruments MPSALT-H More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket.
Auto Nanoliter Injector Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA Nanoject II Automated nanoliter injector
Collagenase, Type II Gibco-USA, Langley, OK, USA 17101-015
Diamond Scriber Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 62108-ST
Differential Voltage Probe Warner Instruments, Hamden, CT, USA 7255DI
Analog-to-Digital Signal Converter Molecular Devices, San Jose,CA, USA Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500341
Glass Capillaries Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA 3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter Amazon.com Proxxon 37080 An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal.
Hyaluronidase, Type I-S MilliporeSigma, Burlington, MA, USA H3506
Magnetic Holder Base Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA MB-L-45
Microelectrode Beveler Sutter Instrument, Novato, CA, USA BV-10
Microelectrode Holder World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA MEH1S15
Micropipette Puller Sutter Instrument, , Novato, CA, USA P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3 Invitrogen-FisherScientific AM1348
Nunc MicroWell MiniTray Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA 438733 Microwell Minitray
Nylon mesh Component Supply Company, Sparta, TN, USA U-CMN-1000
Oocyte Clamp Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA OC-725C
OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA 2020b
pClamp Molecular Devices, , San Jose,CA, USA Version 10
Reference Electrode World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA DRIREF-2SH Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) Invitrogen-FisherScientific 10777-019
Silk Suture 5-0 Covidien, North Haven, CT, USA VS890
Spectrophotometer NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA TW150F-4
Tube Clamper Narishige International USA, Amityville, NY, USA CAT-1 Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base.
Xenopus laevis Xenopus Express, Brooksville, FL, USA IMP-XL-FM

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References

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Biología Número 179 unión de brecha inexina Caenorhabditis elegans C. elegans ovocitos de Xenopus corriente de unión pinza de voltaje
Registro de la corriente de unión gap de los ovocitos de <em>Xenopus</em>
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Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap… More

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (179), e63361, doi:10.3791/63361 (2022).

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