Summary
Aqui apresentamos um protocolo para expressar proteínas de junção de lacunas em oócitos xenopus e gravar corrente juncional entre dois oócitos apposed usando um amplificador comercial projetado para gravações de tensão de oócito duplo em um modo de medição de corrente lateral alta.
Abstract
A expressão heterologous de connexinas e innexins em Xenopus oócitos é uma abordagem poderosa para estudar as propriedades biofísicas das junções de lacunas (GJs). No entanto, essa abordagem é tecnicamente desafiadora porque requer um grampo de tensão diferencial de dois oócitos opostos compartilhando um terreno comum. Embora um pequeno número de laboratórios tenham conseguido executar essa técnica, essencialmente todos eles usaram amplificadores caseiros ou amplificadores comerciais que foram projetados para gravações de oócito único. É frequentemente desafiador para outros laboratórios implementar essa técnica. Embora um modo de medição de corrente lateral alta tenha sido incorporado em um amplificador comercial para gravações duplas de grampo de tensão oócito, não havia nenhum relatório para sua aplicação até nosso estudo recente. Tomamos a abordagem de medição de corrente lateral mais prática e conveniente introduzindo várias modificações técnicas, incluindo a construção de uma plataforma de gravação baseada magneticamente que permite a colocação precisa de oócitos e vários eletrodos, uso da solução de banho como condutor em eletrodos diferenciais de tensão, adoção de um eletrodo KCl comercial de baixa vazagem como eletrodo de referência, fabricação de eletrodos de corrente e tensão de capilares de vidro de parede fina, e posicionamento de todos os eletrodos usando dispositivos baseados magneticamente. O método descrito aqui permite gravações convenientes e robustas de corrente juncional (Ij) entre dois oócitos xenopus opostos .
Introduction
GJs são canais intercelulares que podem permitir o fluxo atual e a troca de pequenas moléculas citosóicas entre as células vizinhas. Eles existem em muitos tipos de células e desempenham diversas funções fisiológicas. GJs em vertebrados são formados por connexins, enquanto aqueles em invertebrados por innexinas. Cada GJ consiste em dois hemichannels justtaposed com 6 ou 8 subunidades por hemichannel, dependendo se são connexinas ou innexins 1,2,3. Os humanos têm 21 genes connexin4, enquanto os modelos invertebrados comumente usados C. elegans e Drosophila melanogaster têm 25 e 8 genes innexin, respectivamente 5,6. O splicing alternativo de transcrições genéticas pode aumentar ainda mais a diversidade de proteínas GJ, pelo menos para innexins 7,8.
Os GJs podem ser divididos em três categorias baseadas em composições moleculares: homotípica, heterotípica e heteromérica. Um GJ homotípico tem todas as suas subunidades idênticas. Um GJ heterotípico tem dois hemichannels homomédicos, mas os dois hemicanais são formados por duas proteínas GJ diferentes. Um GJ heteromérico contém pelo menos um hemichannel heteromérico. As diversidades moleculares dos GJs podem conferir propriedades biofísicas distintas que são importantes para suas funções fisiológicas. As propriedades biofísicas da GJ também são moduladas pelas proteínas regulatórias9. Para entender como os GJs desempenham suas funções fisiológicas, é importante conhecer suas composições moleculares, propriedades biofísicas e os papéis das proteínas regulatórias em suas funções.
Sistemas de expressão heterologos são frequentemente usados para estudar propriedades biofísicas de canais de íons, incluindo GJs, e os efeitos das proteínas regulatórias sobre eles. Como sistemas de expressão heterologos permitem a expressão de proteínas específicas, eles geralmente são mais favoráveis à dissecação de funções proteicas do que os tecidos nativos onde proteínas com funções redundantes podem complicar a análise, e o registro de Ij pode ser inatingível. Infelizmente, as linhas celulares mais usadas, exceto a célula Neuro-2A, são inadequadas para estudar propriedades biofísicas GJ devido a complicações por connexinas endógenas. Mesmo as células Neuro-2A nem sempre são apropriadas para este tipo de análise. Por exemplo, não pudemos detectar nenhuma célula Ij em células Neuro-2A transfeinadas com as innexins UNC-7 e UNC-9 na ausência ou na presença de UNC-1 (inédito), o que é necessário para a função de GJs UNC-9 em C. elegans 9,10. Por outro lado, os oócitos xenopus são um sistema alternativo útil para análises eletrofisiológicas de GJs. Embora expressem uma proteína Endogensa GJ, connexin 38 (Cx38)11, complicações potenciais podem ser facilmente evitadas injetando um oligonucleotídeo antissamo-americano específico12. No entanto, análises de GJs com oócitos xenopus requerem um grampo de tensão diferencial de duas células justapostas, o que é tecnicamente desafiador. Os primeiros sucessos do grampo de dupla tensão de blastomeres de sapo foram relatados cerca de 40 anos atrás13,14. Desde então, muitos estudos têm usado essa técnica para gravar Ij em xenopus oócitos emparelhados. No entanto, essencialmente todos os estudos anteriores foram realizados com amplificadores caseiros 12,15,16 ou amplificadores comerciais projetados para gravações em oócitos únicos (GeneClamp 500, AxoClamp 2A ou AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Como mesmo os amplificadores comerciais não fornecem instruções para o grampo de tensão de oócito duplo, muitas vezes é desafiador para novos ou menos sofisticados laboratórios eletrofisiológicos implementarem essa técnica.
Apenas um amplificador comercial foi desenvolvido para grampo de tensão oólito duplo, o OC-725C da Warner Instruments (Tabela de Materiais, Figura 1A). Este amplificador pode ser usado em um modo padrão (para oócitos únicos) ou em um modo de medição de corrente lateral alta (para oócitos únicos ou duplos) dependendo se dois soquetes em sua sonda de tensão estão conectados (Figura 1B, C). No entanto, até nosso estudo recente7, não havia uma única publicação descrevendo o uso deste amplificador em seu modo de medição de corrente lateral alta. Embora o amplificador tenha sido usado por outro laboratório para gravações duplas de oócito, ele foi usado no padrão e não no modo lateral alto21,22. Essa falta de relatórios usando o amplificador em seu modo de medição de corrente lateral alta pode ser devido a dificuldades técnicas. Não conseguimos obter gravações estáveis de oócito duplo usando o modo lateral alto seguindo instruções do fabricante. Ao longo dos anos, tentamos três abordagens diferentes para gravações de oócitos duplos, incluindo o uso de dois amplificadores OC-725C no modo de medição de corrente lateral alta, dois amplificadores OC-725C no modo padrão e dois amplificadores de outro fabricante. Eventualmente conseguimos obter gravações estáveis apenas com a primeira abordagem após extensa tentativa e erro. Esta publicação descreve e demonstra os procedimentos que usamos para expressar proteínas GJ em oócitos xenopus, gravar Ij usando o modo de medição de corrente lateral alta e analisar os dados eletrofisiológicos usando software comercial popular. Podem ser encontradas informações adicionais sobre a técnica de grampo de dupla tensão em outras publicações19,23.
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Protocol
As cirurgias são realizadas seguindo um protocolo aprovado pelo comitê institucional de cuidados com animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Connecticut.
1. Cirurgia de sapo e preparação de oócitos desfollicuados
- Anestesiar uma fêmea adulta de sapo africano (Xenopus laevis) (Tabela de Materiais) imergindo em uma solução tricaina fria (com gelo) (~300 mg/L).
- Espere (~15 min) até que o sapo mostre pouca ou nenhuma resposta para apertar seus pés de teia. Coloque o sapo em uma mesa de operação com sua barriga virada para cima.
- Depois de uma incisão longitudinal (8-10 mm de comprimento) na região abdominal inferior esquerda ou direita, retire suavemente um pequeno pedaço de tecido do ovário com um par de fórceps, e corte o tecido do ovário com uma tesoura pequena.
- Imerque imediatamente o tecido do ovário livre em uma solução ND96 ca2+free (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) dentro de uma placa de Petri de 60 mm.
- Depois de fechar a incisão por suturas simples interrompidas usando uma sutura de seda 5-0 (Tabela de Materiais), coloque o sapo de volta em um tanque de águas rasas para recuperação.
NOTA: A incisão é fechada em duas etapas: primeiro as camadas peritoneal e muscular, e depois a camada da pele. Cada sapo é submetido a 5 cirurgias com pelo menos um intervalo de 4 semanas entre duas cirurgias consecutivas. - Transfira o tecido do ovário isolado para um tubo centrífuga de 50 mL contendo 10 mL de solução ND96 livre de Ca2 com 20 mg de colagenase (Tabela de Materiais) e 20 mg de hialuronidase (Tabela de Materiais).
- Agite o tubo em um agitador orbital à temperatura ambiente (RT) até que todos os oócitos tenham se isolado (solitário).
- Depois disso, transfira 30-50 oócitos para uma placa de Petri usando uma pipeta Pasteur de vidro e examine os oócitos frequentemente sob um estereoscópio (≥25x maior poder de ampliação) para determinar se eles são desfolliculados.
NOTA: A pipeta Pasteur deve ser "cortada" para uma abertura de ponta mais ampla usando um escriba de diamante (Tabela de Materiais) e inflamada para suavizar a borda de corte. - Assim que 70%-80% dos oócitos são desfolliculados, decante a solução enzimácica inclinando suavemente o tubo. Lave os oócitos 5 vezes preenchendo o tubo com solução ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) e decantando a solução.
- Após a lavagem final, transfira os oócitos para uma placa de Petri de 60 mm contendo solução ND96. Escolha e transfira oócitos grandes e saudáveis para uma placa de Petri de 60 mm contendo solução ND96 suplementada com piruvato de sódio (2 mM) e penicilina-estreptomicina (100 U/mL) usando uma pipeta Pasteur de vidro limpo.
NOTA: "oócitos grandes e saudáveis" são os dos estágios V e VI que não mostram nenhum sinal de super digestão pelas enzimas. - Coloque a placa de Petri contendo os oócitos colhidos dentro de uma câmara ambiental (15-18 °C).
2. Expressão da proteína GJ
- Sintetizar RNA complementar (cRNA) de uma connexina específica ou innexina in vitro usando um kit de transcrição de RNA (Tabela de Materiais) seguindo o protocolo do fabricante.
- Precipitar o cRNA usando um método de cloreto de lítio descrito no manual do usuário do kit de transcrição do RNA.
- Lave a pelota com 70% de etanol, dissolva-a em 20 μL de H2O sem nuclease e adicione 1 μL de inibidor de ribonuclease (40 U, Tabela de Materiais).
- Meça a concentração do cRNA utilizando um espectotômetro (Tabela de Materiais).
- Misture o cRNA com um oligo antissamença Cx38 para que as concentrações finais sejam 200-1.000 ng/μL cRNA e 100 ng/μL oligo.
NOTA: A sequência de oligo é de 5′-GCTTTAGTAATTCCCCCCTGCCATGTTTC-3′, que corresponde aos nucleotídeos de -5 a +25 em Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI Accession: NM_001088018)11. O oligo é mantido como uma solução de estoque (2,0 mg/mL) antes de ser misturado com o cRNA. - Elimine partículas no cRNA girando em um microcentrifuuge (~16.000 x g) por 2 min, e transfira rapidamente todo o supernatante para um novo tubo por pipetação (evite perturbar o fundo do tubo de microcentrifuuagem).
- Divida o cRNA em alíquotas (2,5 μL/frasco) e armazene as alíquotas em um congelador de -80 °C.
- Prepare uma placa de injeção de oócito colando uma pequena peça (~1 cm x 1 cm) de malha de nylon (Tabela de Materiais) na parte inferior de uma placa de Petri de 35 mm usando um adesivo epóxi de cura rápida.
NOTA: O prato de injeção de oócito é reutilizável. Lave-o com 70% de etanol após cada uso. - Encha o prato de injeção de oócito aproximadamente na metade com a solução ND96 (suplementada com piruvato e penicilina-estreptomicina).
- Coloque 25-30 oócitos em fileiras dentro da placa de Petri.
- Prepare micropipettos de vidro para injeções de oócito seguindo instruções no manual do usuário do injetor nanoliter automatizado (Tabela de Materiais).
NOTA: O uso de um bipe microelerode (Tabela de Materiais) pode ajudar a produzir micropipettos de injeção afiada que causam danos mínimos aos oócitos. - Enchir uma micropipette de injeção com óleo mineral leve e inseri-lo no suporte de micropipette do injetor.
- Transfira o cRNA de uma das alíquotas armazenadas para a superfície interna de uma tampa de placa de Petri ou fundo por pipetação.
- Aspire a gota de cRNA na ponta da micropipette pressionando o botão FILL no controlador do injetor.
- Injete o cRNA (~50 nL/oócito) pressionando o botão INJECT .
NOTA: O volume de injeção pode ser definido pelos interruptores de mergulho no controlador injetor. - Transfira os oócitos injetados para uma nova placa de Petri contendo solução ND96 (suplementada com piruvato e penicilina-estreptomicina), e mantenha-os dentro da câmara ambiental (15-18 °C) por 1-3 dias (dependendo da velocidade e nível de expressão da proteína GJ). Substitua a solução diariamente transferindo os oócitos para uma nova placa de Petri.
3. Emparelhamento de oócito
- Transfira alguns dos oócitos injetados em uma placa de Petri de 35 mm contendo solução ND96.
- Use duas pinças finas (Tabela de Materiais) para descascar suavemente a membrana vitelline transparente que envolve o oócito.
NOTA: Pode ser necessário afiar as pontas da pinça antes do primeiro uso e de tempos em tempos, usando um pedaço de lixa fina (600 Grit). - Coloque 2 oócitos por poço em uma câmara de pareamento oócito (Figura 1D) contendo solução ND96 (suplementada com piruvato e penicilina-estreptomicina).
NOTA: A câmara de emparelhamento de oócito é construída colando um pequeno pedaço de uma Minitray Microwell (Tabela de Materiais) na parte inferior de uma placa de petri de 35 mm (Tabela de Materiais) usando um adesivo epóxi de cura rápida. O Minitray é cortado em pequenos pedaços usando um cortador de arame quente (Tabela de Materiais). O uso do Minitray para emparelhamento de oócitos foi originalmente descrito por outros24. Embora uma proteína GJ possa distribuir não uniformemente na membrana celular oócica, dependendo das propriedades de carga de resíduos de aminoácidos em seus domínios citosóis25, o pareamento aleatório (sem discriminar entre os polos animal e vegetal do oócito) parece ser suficiente em geral. - Mantenha a placa de Petri contendo oócitos emparelhados na RT na mesa de isolamento para ser usada para gravações eletrofisiológicas.
NOTA: A duração do emparelhamento pode variar de algumas horas a um dia. Uma prática conveniente é emparelhar oócitos no final da tarde e gravar deles no dia seguinte.
4. Preparação do sistema de aquisição
- Configure dois amplificadores de grampo oócito OC-725C (Tabela de Materiais) ao modo de medição de corrente lateral alta ajustando um interruptor de mergulho interno (Figura 1B).
- Aterrar os amplificadores interligando primeiro as tomadas do Circuito de Solo nos painéis traseiros e, em seguida, conectando-se à gaiola faraday e à luz de fibra usada para iluminar a câmara de gravação.
- Conecte os amplificadores a um conversor de sinal analógico-digital (Tabela de Materiais) e configure-os no módulo Clampex do software pClamp (Tabela de Materiais) seguindo instruções do fabricante do amplificador.
- Teste o sistema de aquisição com a célula modelo fornecida com o amplificador.
- Conecte a sonda VDIFF e os cabos atuais (I) à célula modelo, conecte os soquetes Vermelho e Preto na sonda VDIFF com o jumper incluído, conecte qualquer perna do jumper a qualquer pino da célula modelo e conecte o fio moído na célula modelo ao cabo da tomada DE CIRCUITO DE GROUNDS do amplificador (Figura 1E).
- Zero os medidores de Eletrodo de Tensão (Vm) e Eletrodo de Banho (Im) do amplificador girando os botões Vm OFFSET e Ve OFFSET , respectivamente, alternar o grampo de OFF para rápido ou lento e gire o mostrador GAIN no sentido horário para um nível que permita o grampo de tensão adequado (Figura 1A). O interruptor D.C. GAIN pode estar na posição OUT ou IN .
- Execute um protocolo de aquisição simples contendo algumas etapas de tensão para confirmar que a tensão exibida no medidor Vm muda de acordo com o protocolo de aquisição e que os traços de tensão e corrente são exibidos corretamente no Clampex.
NOTA: Apenas um amplificador pode ser testado cada vez usando esta abordagem.
5. Gravação Ij entre oócitos emparelhados
- Crie protocolos de aquisição para gravar Ij no software pClamp.
NOTA: Crie dois protocolos de aquisição. Em um deles, o amplificador nº 1 é usado para produzir uma série de passos de tensão de membrana (Vm) (por exemplo, -150 a +90 mV em intervalos de 10 mV), enquanto o amplificador #2 é usado para manter um V m constante (por exemplo, -30 mV). No outro protocolo, o amplificador #2 é usado para produzir os passos Vm, enquanto o amplificador nº 1 é usado para manter o V m constante. As etapas V m positivas e negativas devem ser aplicadas alternativamente (por exemplo, -150, +90, -140, +80 ......), que podem ser programadas na Clampex usando o recurso Lista de Usuário no protocolo de aquisição. - Configure o estágio de gravação
- Solte uma placa de Petri contendo oócitos emparelhados no recipiente da placa de Petri na plataforma de gravação (Figura 2A)
- Selecione um par de oócitos e gire a placa de Petri se necessário para que os dois oócitos estejam na direção esquerda e direita, e bloqueie o estágio em posição por sua base magnética.
- Fixar as manchas magnéticas segurando as sondas de corrente e tensão em locais apropriados na mesa de isolamento.
NOTA: Certifique-se de que as sondas de corrente e tensão de um amplificador estão localizadas no lado esquerdo, enquanto as do outro amplificador estão no lado direito, e que a sonda de tensão está na frente da sonda atual em cada lado (Figura 2B, C).
- Configurar o eletrodo de referência
- Coloque um eletrodo de referência (Tabela de Materiais) próximo à borda da placa de Petri em direção ao lado do usuário (Figura 2B, C).
- Conecte o eletrodo de referência ao soquete preto (Circuit Ground) em apenas uma das duas sondas VDIFF .
- Configure os eletrodos VDIFF
- Puxe um par de micropipettos de vidro, quebre um pouco da ponta com o escriba de diamante (Tabela de Materiais), e alise a borda da ponta pelo polimento de fogo.
NOTA: A resistência à ponta deve ser inferior a 150 kΩ (medida com ND96 na pipeta). Normalmente são utilizados micropipettos com resistência à ponta de 20-150 kΩ. - Segure a micropipette acima da chama de um queimador de álcool para dobrá-lo a um ângulo liso (~130°) em uma posição ~1 cm de distância da ponta.
NOTA: Os micropipettos fabricados são reutilizáveis. Enxágüe-os com água após cada uso. - Encha a pipeta de vidro completamente com a solução ND96, insira-a em um suporte de microeletrínda pré-preenchido (com ND96) (Tabela de Materiais, Figura 2D) e garanta que não haja bolhas de ar no sistema.
- Insira o pino de 2 mm do suporte de microeletrodo no soquete de 2 mm de um fio de conexão eletrodo VDIFF (Figura 2D).
- Fixar o soquete de 2 mm em um grampo baseado magneticamente (Figura 2D), e apontar a ponta do eletrodo VDIFF em direção a um dos dois oócitos (Figura 2E).
NOTA: Ajuste a posição e o ângulo do grampo para que a ponta do eletrodo fique muito próxima do oócito - Insira o pino de 1 mm do fio de conexão do eletrodo VDIFF na tomada vermelha (Entrada VDIFF ) na sonda VDIFF no mesmo lado.
- Prepare e conecte um eletrodo VDIFF para o outro oócito e amplificador seguindo procedimentos semelhantes.
NOTA: Uma visão de close-up de um par de oócitos e todos os eletrodos são mostrados na Figura 2E.
- Puxe um par de micropipettos de vidro, quebre um pouco da ponta com o escriba de diamante (Tabela de Materiais), e alise a borda da ponta pelo polimento de fogo.
- Configure os eletrodos de corrente e tensão
- Prepare a tensão e os eletrodos de corrente dos capilares de vidro, encha-os (cerca de meio caminho) com uma solução KCl (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 com KOH), e insira-os nos porta-eletrodos fornecidos com os amplificadores.
NOTA: Os eletrodos devem ter uma resistência de ~1 MΩ. Os eletrodos adequados podem ser obtidos a partir de um tipo de capilares de vidro de parede fina (Tabela de Materiais) utilizando um conjunto específico de parâmetros de puxar (Tabela 1). Essas pontas podem facilmente penetrar na membrana celular oócito sem a necessidade de pressionar o vm ou o botão Ve BUZZ no amplificador. - Abaixe os eletrodos na solução de banho, zero os medidores Vm e Im girando os mostradores Vm OFFSET e Ve OFFSET e verifique a resistência ao eletrodo pressionando o Teste de Eletrodo VM e o Teste de Eletrodo Ve.
- Insira os eletrodos de corrente e tensão nos oócitos e observe potenciais negativos da membrana (tipicamente -20 a -50 mV).
NOTA: Os medidores Vm e Im do mesmo amplificador devem exibir dois valores idênticos ou muito semelhantes.
- Prepare a tensão e os eletrodos de corrente dos capilares de vidro, encha-os (cerca de meio caminho) com uma solução KCl (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 com KOH), e insira-os nos porta-eletrodos fornecidos com os amplificadores.
- Aquisição de dados
- Na seção Clamp do amplificador, confirme que O D.C. GAIN está na posição IN , gire o botão GAIN no sentido horário para um nível que permita um grampo de tensão adequado (tipicamente de um terço a metade da faixa completa) e gire o interruptor clamp de DESLIGADO para FAST.
NOTA: Ao acender o grampo, os medidores Vm e Im exibirão a tensão de retenção e a corrente de retenção, respectivamente. Embora a corrente de retenção possa variar um pouco dependendo das condições do oócito, geralmente é pequena e estável na tenção Vm (por exemplo, -30 mV). - Execute um protocolo de aquisição.
NOTA: Quatro traços serão exibidos na tela. Os traços de tensão e corrente de um amplificador indicam as etapas Vm aplicadas ao oócito #1 e a corrente necessária para produzir os passos Vm , enquanto as do outro amplificador indicam o Vm constante (-30 mV) do oócito #2, e a corrente injetada para manter esta Vm constante. A corrente injetada no oócito nº 2 representa o Ij.
- Na seção Clamp do amplificador, confirme que O D.C. GAIN está na posição IN , gire o botão GAIN no sentido horário para um nível que permita um grampo de tensão adequado (tipicamente de um terço a metade da faixa completa) e gire o interruptor clamp de DESLIGADO para FAST.
6. Análise de dados
- Análise com Clampfit.
- Abra um arquivo abf gravado no módulo Clampfit do pClamp.
- Use os cursores 1 e 2 para incluir um segmento da linha de base antes que o Ij trace.
- Clique no ícone Ajuste a linha de base para trazer uma janela de linha de base. Selecione Subtrair a média dos cursores 1..2 para o método e confirme que todos os sinais visíveis e todos os traços visíveis estão selecionados para seleção de rastreamento.
- Ao clicar em OK, a janela da linha de base fecha, as linhas de base de todos os traços de corrente e tensão convergem no nível zero. Observe que as etapas de tensão mudam para novos níveis iguais à tensão original menos a tensão de retenção (por exemplo, -30 mV).
- Para traçar a relação Ij e Vj utilizando estado estável Ij, inclua um segmento desejado dos traços Ij representando o estado estável Ij com cursores 1 e 2, coloque cursor 3 em qualquer lugar dentro da janela de tempo das etapas de tensão.
- Vá para Analisar/ Gráfico Rápido/ I-V para abrir uma janela I-V .
- Em X-Axis (Tensão), selecione Cursor 3 do Signal, especifique o sinal de passo de tensão (por exemplo, Tensão 1) no menu suspenso e marque a caixa Inverter.
NOTA: A caixa Inverte é verificada para converter o Vm em valores equivalentes a Vj, que é definido como Vm de oócito #2-Vm de oócito #1. - Em Y-Axis (Current), selecione a fonte do sinal Ij (por exemplo, Corrente 0) no menu suspenso ao lado do Signal, defina Região como Cursors 1..2 do menu suspenso e selecione Média.
NOTA: Para traçar as relações Ij e Vj , os cursores 1 e 2 devem incluir o segmento de traços Ij contendo o pico Ij na etapa 6.1.5 e selecionar Peak (em vez de Médio) na etapa 6.1.8. - Na opção Destino , selecione Substituir ou Anexar.
- Ao clicar em OK na janela I-V , uma relação Ij - Vj é exibida na tela, e os valores correspondentes Ij e Vj podem ser encontrados clicando em Janela/Resultado.
- Plote se encaixe na relação Gj-V j na OriginPro (Tabela de Materiais)
- Copie as duas colunas contendo valores Vj e Ij da janela Resultados do Clampfit (passo 6.1.10) para uma nova pasta de trabalho em Origem. Certifique-se de que os valores Vj e Ij estão nas colunas X e Y, respectivamente.
- Adicione quatro novas colunas na pasta de trabalho clicando em Coluna/ Adicionar novas colunas.
- Nomeie a primeira coluna nova como Gj, preencha-a digitando a equação "coluna Ij/coluna Vj * 1.000" na janela Valores da Coluna definida, e crie um gráfico de dispersão da relação Gj-V j.
NOTA: A multiplicação por 1.000 (opcional) é evitar o inconveniente de lidar com números muito pequenos nas etapas seguintes. - Ajuste os pontos de dados Gj sobre as faixas Vj negativas e positivas independentemente da função Boltzmann. Calcule Gj em Vj = 0 mV digitando os valores Gjmax, Gjmin, A e V0 do encaixe na equação de Boltzmann, o que pode ser feito em uma planilha. O Gj assim obtido será usado como Gjmax na próxima etapa.
NOTA: A equação para se encaixar na função Boltzmann é: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, em que V0 é o Vj em que a condutância é meio máxima, Gjmax é a condução máxima, Gjmin é o Vj-insensível condução residual23. Para executar o encaixe, primeiro adicione a equação de Boltzmann como uma nova função de montagem no OriginPro e, em seguida, selecione esta função para montagem. Digite valores de sementes aproximados para o Gjmax, Gjmin, V0 e A antes de executar a função de montagem. Certifique-se de que o parâmetro Gjmax não está fixado para este encaixe. - Nomeie a segunda e terceira novas colunas como nGj-L e nGj-R ("n" para "normalizada"), e preencha-as dividindo a coluna Gj pelos valores Gjmax derivados das curvas Gj - Vj esquerdo e v j, respectivamente (etapa 6.2.4).
- Nomeie a quarta nova coluna como nGj-LR, e preencha-a copiando valores das faixas Vj negativas e positivas das colunas nGj-L e nGj-R, respectivamente.
- Crie um gráfico de dispersão para nGj-LR sobre Vj, e encaixe os pontos de dados sobre as faixas Vj negativas e positivas para a função Boltzmann de forma independente. Certifique-se de que o parâmetro Gjmax esteja fixado em 1.0 para a montagem.
- Mantenha registros dos resultados de montagem (por exemplo, o gráfico montado e os valores Gjmin, V0 e A ).
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Representative Results
UNC-7 e UNC-9 são innexins de C. elegans. Enquanto o UNC-9 tem apenas uma isoforma, o UNC-7 tem isóformes múltiplos que diferem principalmente no comprimento e na sequência de aminoácidos de seus terminais de amino 7,8. Estas innexinas podem formar GJs homotípicos, bem como heteríticos (de UNC-7 e UNC-9) quando expressos em oócitos xenopus 7,8. Os traços representativos Ij e as relações Gj-V j normalizadas resultantes dos GJs homotípicos UNC-7b e UNC-9 são mostrados na Figura 3. Nestes experimentos com oócitos emparelhados, Vm de Oócito 1 foram fixados a diferentes níveis da tensão de retenção (-30 mV), enquanto o de Oócito 2 foi mantido constante em -30 mV para monitorar o Ij. Os resultados mostram que esses dois tipos de GJs diferem na taxa de inativação Ij-dependente de V j, dependência Vj (indicada pela inclinação da curva Gj-V j), e a quantidade do Gj residual. Muitos outros exemplos de GJs UNC-7 e UNC-9, incluindo GJs retificadores, podem ser encontrados em nossa recente publicação7.
Figura 1: Câmara de emparelhamento oócito e configuração do amplificador. (A) Painel frontal do amplificador de grampo oócito OC-725C. (B) Um interruptor DIP dentro do amplificador configurado para a medição da corrente lateral alta. Todos os interruptores, exceto 2, 5 e 7, estão na posição OFF para usar o amplificador no modo de medição de corrente lateral alta. (C) Uma sonda VDIFF com a tomada vermelha (para entrada VDIFF ) e soquete preto (para Circuit Ground) desconectados ou conectados. A sonda pode ser usada para o modo de tensão padrão quando as duas tomadas estiverem conectadas. (D) Uma câmara de emparelhamento de oócito. (E) Uma célula modelo com conexões para testar o sistema de aquisição com o amplificador no modo de medição de corrente lateral alta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração de oólito e eletrodo. (A) O estágio de gravação. O orifício circular tem um diâmetro de diagrama de 36 mm. (B) mostrando as posições dos vários eletrodos. (C) Layout real dos vários eletrodos. (D) Dois eletrodos VDIFF com seus suportes e cabos de conexão fixados no estágio de gravação por dois grampos magnéticos diferentes, incluindo um suporte magnético de ponte de agar modificado (tabela de materiais) (superior) e um grampo de tubo (Tabela de Materiais) (inferior). O primeiro é mais estável na manutenção da posição do eletrodo por causa de sua base magnética maior, mas requer modificação. Os micropipettos de vidro são girados 90° de suas posições operacionais, a fim de mostrar os ângulos de dobra. (E) Uma visão de perto de um par de oócitos e eletrodos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Traços de gravação representativos. (A) Diagrama mostrando o experimento oócito. As etapas de tensão de membrana negativa e positiva (Vm) são aplicadas ao Oócito 1 a partir de um Vm de -30 mV, enquanto o Oócito 2 é mantido em um Vm constante de -30 mV. A tensão transjuncional (Vj) é definida como Vm de Oócito 2 -Vm de Oócito 1. (B). Amostra Ij traços e a condução juncional normalizada resultante (Gj) -Vj relação de junções de lacunas homotípicas UNC-9. (C) Amostra Ij traços e a relação Gj-V j normalizada resultante de junções de lacuna homotípica unc-7b. As relações Gj-V j são equipadas por uma função Boltzmann (linhas vermelhas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo Nº. | Calor | Puxar | Velocidade | Hora |
| 1 | 260 | ... | 40 | 200 |
| 2 | 240 | ... | 40 | 200 |
| 3 | 240 | 60 | 40 | 200 |
| 4 | 245 | 100 | 60 | 200 |
| Consulte o manual do usuário no site do fabricante para obter definições dos parâmetros de puxar (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html). | ||||
Tabela 1: Parâmetros de puxar eletrodo. Esses parâmetros são baseados em capilares de vidro de parede fina (Tabela de Materiais) e uma temperatura de rampa de 258 em um puxador de micropipette P-97 (Tabela de Materiais). Eles precisam ser ajustados de acordo com a temperatura da rampa para este vidro em seu puller. Por exemplo, se a temperatura da rampa no puxador for 20° maior, adicione 20° a cada etapa e faça os ajustes necessários. Geralmente, o tamanho da ponta pode ser otimizado ajustando a velocidade da última etapa. Consulte o manual do usuário no site do fabricante para obter significados dos parâmetros de puxar (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).
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Discussion
A otimização do sistema parece ser necessária para experimentos de grampo de tensão de oócito duplo. Sem ele, as gravações podem ser altamente instáveis, e os amplificadores podem ter que injetar uma quantidade excessiva de corrente para atingir o alvo Vm, resultando em danos oócitos e falhas de gravação. Vários fatores são fundamentais para a obtenção de gravações de oócito dupla estável com o método de medição de corrente lateral alta. Primeiro, os eletrodos de corrente e tensão devem ter resistência adequada (~1 MΩ), e seus suportes devem estar limpos. Em segundo lugar, os eletrodos VDIFF devem ter baixa resistência (<150 kΩ) e estar perto dos oócitos. Em terceiro lugar, todos os eletrodos para o mesmo oócito (tensão, corrente e VDIFF) devem ser posicionados no mesmo lado (esquerda ou direita), e a ordem dos eletrodos (de trás para frente) deve ser corrente, tensão e DIFF V. Por fim, o eletrodo de referência deve estar localizado perto da borda da placa petri de 35 mm em direção ao usuário.
Modificamos alguns procedimentos recomendados do fabricante e fizemos algumas outras melhorias. Entre eles estão: 1) micropipettos cheios de ND96 em vez de pontes de ágar carregadas de KCL para servir como eletrodos VDIFF . Os eletrodos de vidro são fáceis de construir, reutilizáveis e não prejudiciais aos oócitos; 2) um baixo vazamento de eletrodo KCl como eletrodo de referência. Este eletrodo tem baixa resistência (~2,7 kΩ) e potencial estável, e vaza pequenos eletrólitos (~5,7 x 10-8 mL/h); 3) uma plataforma de gravação personalizada e construída que permite um posicionamento estável, conveniente e preciso de oócitos e dos vários eletrodos. Esta etapa também fornece amplo acesso a um estereómico, uma luz de fibra com pescoços duplos, e os quatro suportes magnéticos usados para montar e posicionar os eletrodos de corrente e tensão; e 4) fabricação de eletrodos de corrente e tensão a partir de um tipo de capilares de vidro de parede fina. Estes eletrodos têm a resistência à ponta desejada (0,5-1,4 MΩ), podem penetrar a membrana celular oócito muito facilmente, e causar danos mínimos aos oócitos.
Ocasionalmente, o sistema de gravação não funciona corretamente, como indicado por uma corrente de retenção extraordinariamente grande ou continuamente crescente, desenvolvimento de uma mancha branca na membrana celular ao redor do eletrodo atual, e traços Vm instáveis em resposta aos comandos de tensão. As possíveis causas são 1) um sistema de eletrodo VDIFF tem uma pequena bolha de ar ou a ponta do eletrodo VDIFF não é direcionada adequadamente para o oócito; 2) um eletrodo de tensão ou corrente tem alta resistência (por exemplo , >2 MΩ) ou seu suporte está sujo do depósito de sal; 3) o fio de conexão para um eletrodo VDIFF está quebrado; 4) o ganho de .C D não é definido como IN durante o grampo de tensão.
Aqui nós descrevemos um método para gravar Ij de Xenopus oócitos. Permite um grampo de tensão estável de dois oócitos opostos. Este método é fácil de implementar e parece não ter limitações óbvias para analisar as propriedades biofísicas dos GJs. No entanto, não estamos em posição de dizer como ele se compara com outros métodos publicados. Esperamos que os laboratórios que estão recentemente interessados em criar a técnica de duplo oócito voltage-clamp encontrem esse método que valha a pena considerar.
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Disclosures
Os autores não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Agradecemos a Haiying Zhan, Qian Ge por seu envolvimento na fase inicial de desenvolvimento técnico, Kiranmayi Vedantham por ajudar com os números, e dr. Camillo Peracchia por conselhos sobre a câmara de pareamento oócito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
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