Hier wordt een methode gepresenteerd voor de analyse van eiwitaggregatiekinetiek in de nematode Caenorhabditis elegans. Dieren uit een leeftijdsgesynchroniseerde populatie worden op verschillende tijdstippen afgebeeld, gevolgd door semi-geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler en passend bij een wiskundig model in AmyloFit.
Eiwitaggregatie in onoplosbare insluitsels is een kenmerk van een verscheidenheid aan menselijke ziekten, waarvan er vele leeftijdsgebonden zijn. De nematode Caenorhabditis elegans is een gerenommeerd modelorganisme dat op grote schaal in het veld is gebruikt om eiwitaggregatie en toxiciteit te bestuderen. De optische transparantie maakt de directe visualisatie van eiwitaggregatie door fluorescentiemicroscopie mogelijk. Bovendien maken de snelle voortplantingscyclus en korte levensduur de nematode een geschikt model om te screenen op genen en moleculen die dit proces moduleren.
De kwantificering van de totale belasting bij levende dieren is echter slecht gestandaardiseerd, meestal uitgevoerd door handmatige inclusietelling onder een fluorescentiedissectiemicroscoop op één tijdstip. Deze aanpak kan resulteren in een hoge variabiliteit tussen waarnemers en beperkt het begrip van het aggregatieproces. Daarentegen wordt amyloïde-achtige eiwitaggregatie in vitro routinematig gecontroleerd door thioflavine T-fluorescentie op een zeer kwantitatieve en tijdsgebonden manier.
Hier wordt een analoge methode gepresenteerd voor de onbevooroordeelde analyse van aggregatiekinetiek in levende C. elegans, met behulp van een confocale microscoop met hoge doorvoer in combinatie met op maat gemaakte beeldanalyse en data-fitting. De toepasbaarheid van deze methode wordt aangetoond door het monitoren van inclusievorming van een fluorescerend gelabeld polyglutamine (polyQ) eiwit in de lichaamswand spiercellen. De beeldanalyseworkflow maakt het mogelijk om het aantal insluitsels op verschillende tijdstippen te bepalen, die zijn aangepast aan een wiskundig model op basis van onafhankelijke nucleatiegebeurtenissen in individuele spiercellen. De hier beschreven methode kan nuttig zijn om de effecten van proteostasefactoren en potentiële therapieën voor eiwitaggregatieziekten bij een levend dier op een robuuste en kwantitatieve manier te beoordelen.
De accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten in onoplosbare afzettingen komt voor bij een breed scala aan ziekten. Bekende voorbeelden zijn de aggregatie van amyloïde-β en tau bij de ziekte van Alzheimer, α-synucleïne bij de ziekte van Parkinson en huntingtine met geëxpandeerd polyQ bij de ziekte van Huntington 1,2. Het verkeerd vouwen van deze polypeptiden tot amyloïde fibrillen wordt geassocieerd met toxiciteit en celdood door mechanismen die nog grotendeels onduidelijk zijn. Het ophelderen van de mechanismen van amyloïde vorming zal cruciaal zijn voor het ontwikkelen van effectieve therapieën, die momenteel niet beschikbaar zijn.
Gedetailleerde onderzoeken naar amyloïdevorming zijn in vitro uitgevoerd op basis van thioflavine T-fluorescentiemetingen, wat heeft geleid tot een mechanistisch begrip van het aggregatieproces en het effect van remmende moleculen 3,4,5. Het is echter niet duidelijk of dezelfde aggregatiemechanismen gelden in de complexe omgeving van levende cellen en organismen. De nematodenworm Caenorhabditis elegans is een geschikt modelorganisme om eiwitaggregatie in vivo te bestuderen. Het heeft een relatief eenvoudige anatomie, maar bestaat uit meerdere weefsels, waaronder spieren, darmen en een zenuwstelsel. Het is genetisch goed gekarakteriseerd en hulpmiddelen voor genetische modificatie zijn direct beschikbaar. Bovendien heeft het een korte generatietijd van ~ 3 dagen en een totale levensduur van 2-3 weken. Als zodanig kan eiwitaggregatie worden onderzocht gedurende de levensduur van het dier op een experimenteel geschikte tijdschaal. Ten slotte is de nematode optisch transparant, waardoor de aggregatie van fluorescerend gelabelde eiwitten in levende dieren kan worden gevolgd.
Deze kenmerken van C. elegans zijn eerder gebruikt om de aggregatie van polyQ-eiwitten te onderzoeken als een model voor Huntington en andere polyQ-expansieziekten. Boven de pathogene drempel van 35-40 glutamineresiduen kunnen de polyQ-eiwitten gelabeld met geel fluorescerend eiwit (YFP) worden waargenomen om onoplosbare insluitsels te vormen in het spierweefsel 6,7, neuronen8 en de darm 9,10. Deze kenmerken zijn op grote schaal gebruikt om te screenen op genen 11,12,13 en klein-molecuul modifiers 14 van eiwitaggregatie en toxiciteit.
C. elegans heeft het potentieel om een belangrijke rol te spelen bij het overbruggen van de kloof tussen in vitro studies van eiwitaggregatie en complexere ziektemodellen zoals muizen15. C. elegans is vatbaar voor geneesmiddelenscreening16 , maar kan ook worden gebruikt om een fundamenteel begrip te verkrijgen van de moleculaire mechanismen van eiwitaggregatie in vivo, zoals onlangs is aangetoond17. Voor beide toepassingen is het echter van het grootste belang om een kwantitatieve en reproduceerbare maat voor eiwitaggregatie te extraheren. Hier wordt dit bereikt met behulp van een confocale microscoop met hoge doorvoer in combinatie met een speciale beeldanalysepijplijn (figuur 1).
De hierin gepresenteerde methode vergemakkelijkt een onbevooroordeelde en kwantitatieve analyse van eiwitaggregatiekinetiek in het modelorganisme C. elegans. Het hangt af van vier belangrijke elementen (figuur 1): 1) het handhaven van een leeftijdsgesynchroniseerde populatie van nematoden; 2) fluorescentiemicroscopie in multiwellplaten; 3) geautomatiseerde inclusietelling in CellProfiler; 4) data passend in AmyloFit. Vergeleken met het handmatig tellen van insluitsels in vrij bewegende dieren of van opgeslagen afbeeldingen26, is kwantificering in CellProfiler zowel sneller als onbevooroordeeld. De andere belangrijke vooruitgang van het protocol is de verwerving van kinetische gegevens, in plaats van afzonderlijke tijdspunten, die kwantitatieve inzichten bieden in het aggregatiemechanisme bij het aanpassen van de gegevens aan een wiskundig model.
De vier elementen van het protocol kunnen worden gebruikt als onafhankelijke modules die afhankelijk van de toepassing kunnen worden gewijzigd. Leeftijdsgesynchroniseerde populaties kunnen ook worden gehandhaafd met behulp van 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) om de dieren te steriliseren. Deze verbinding beïnvloedt de levensduur en proteostase24,25 en is zeer kankerverwekkend voor de experimentator; het sluit echter handmatige overdracht van de wormen uit, wat arbeidsintensief kan zijn wanneer grote aantallen worden behandeld. Andere alternatieven zijn het gebruik van steriele mutanten29 of filtratie-apparaten om nakomelingen30 te scheiden.
De fluorescentiemicroscopiestap kan ook worden aangepast, bijvoorbeeld met behulp van hogere vergrotingen om de eiwitaggregatie in neuronen te controleren. Widefield-microscopie kan voldoende zijn om polyQ-aggregatie in spiercellen te controleren wanneer het relatieve verschil tussen de omstandigheden belangrijker is dan het absolute aantal insluitsels. De CellProfiler-pijplijn kan in deze gevallen nog steeds worden gebruikt, hoewel de instellingen om wormen en insluitsels te herkennen door de gebruiker moeten worden aangepast. De doorvoer van de techniek wordt momenteel beperkt door de noodzaak om de dieren handmatig in de 384-putplaat te plukken. Dit kan mogelijk worden verholpen door het gebruik van microfluïdische apparaten16. Natriumazide is een relatief hard verdovingsmiddel, dat kan worden vervangen door fysieke immobilisatie met hydrogels of kralen28,29.
De hier gepresenteerde analyse in AmyloFit is gebaseerd op een aggregatiemechanisme dat bestaat uit onafhankelijke nucleatiegebeurtenissen in individuele cellen. In gevallen waarin dit model niet past, moet de gebruiker een alternatief overwegen, zoals het eerder ontwikkelde coöperatieve aggregatiemodel17. Een beperking van deze benadering is dat stammen die het eiwit van belang in verschillende concentraties tot expressie brengen, beschikbaar moeten zijn, hoewel deze kunnen worden gegenereerd met behulp van routinematige C. elegans-methoden 24.
Al met al biedt dit protocol de middelen om hoogwaardige gegevens te verkrijgen voor eiwitaggregatiekinetiek in een in vivo modelsysteem, waardoor gedetailleerde analyse van aggregatiemechanismenmogelijk is 17. Hoewel de methode werd gedemonstreerd voor polyQ-aggregatie in het C. elegans spierweefsel, kunnen toekomstige toepassingen van het protocol andere eiwitten en weefsels en de effecten van proteostasefactoren en kleine moleculen omvatten.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken het Morimoto-lab voor C. elegans-stammen en Esmeralda Bosman voor hulp bij de confocale microscoop met hoge doorvoer. Dit werk werd gefinancierd met een start-up beurs van de Universiteit Utrecht aan T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |