Ici, une méthode est présentée pour l’analyse de la cinétique d’agrégation des protéines chez le nématode Caenorhabditis elegans. Les animaux d’une population synchronisée selon l’âge sont photographiés à différents moments, suivis d’un comptage semi-automatisé des inclusions dans CellProfiler et d’un ajustement à un modèle mathématique dans AmyloFit.
L’agrégation des protéines en inclusions insolubles est une caractéristique d’une variété de maladies humaines, dont beaucoup sont liées à l’âge. Le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle bien établi qui a été largement utilisé sur le terrain pour étudier l’agrégation et la toxicité des protéines. Sa transparence optique permet la visualisation directe de l’agrégation des protéines par microscopie à fluorescence. De plus, le cycle de reproduction rapide et la courte durée de vie font du nématode un modèle approprié pour dépister les gènes et les molécules qui modulent ce processus.
Cependant, la quantification de la charge globale chez les animaux vivants est mal standardisée, généralement effectuée par comptage manuel de l’inclusion sous un microscope à dissection de fluorescence à un seul moment. Cette approche peut entraîner une grande variabilité entre les observateurs et limiter la compréhension du processus d’agrégation. En revanche, l’agrégation de protéines de type amyloïde in vitro est systématiquement surveillée par fluorescence T de thioflavine de manière très quantitative et résolue dans le temps.
Ici, une méthode analogue est présentée pour l’analyse impartiale de la cinétique d’agrégation chez C. elegans vivant, en utilisant un microscope confocal à haut débit combiné à une analyse d’image et à un ajustement de données sur mesure. L’applicabilité de cette méthode est démontrée par la surveillance de la formation d’inclusion d’une protéine de polyglutamine (polyQ) marquée par fluorescence dans les cellules musculaires de la paroi corporelle. Le flux de travail d’analyse d’images permet de déterminer le nombre d’inclusions à différents moments, qui sont adaptés à un modèle mathématique basé sur des événements de nucléation indépendants dans des cellules musculaires individuelles. La méthode décrite ici peut s’avérer utile pour évaluer les effets des facteurs de protéostasie et des thérapies potentielles pour les maladies d’agrégation des protéines chez un animal vivant de manière robuste et quantitative.
L’accumulation de protéines mal repliées dans des dépôts insolubles se produit dans un large éventail de maladies. Des exemples bien connus sont l’agrégation de β amyloïde et de tau dans la maladie d’Alzheimer, la α-synucléine dans la maladie de Parkinson et la huntingtine avec polyQ expansé dans la maladie de Huntington 1,2. Le mauvais repliement de ces polypeptides en fibrilles amyloïdes est associé à la toxicité et à la mort cellulaire par des mécanismes encore largement flous. L’élucidation des mécanismes de formation de l’amyloïde sera cruciale pour développer des thérapies efficaces, qui ne sont actuellement pas disponibles.
Des études détaillées de la formation d’amyloïde ont été réalisées in vitro sur la base de mesures de fluorescence de la thioflavine T, conduisant à une compréhension mécaniste du processus d’agrégation et de l’effet des molécules inhibitrices 3,4,5. Cependant, il n’est pas clair si les mêmes mécanismes d’agrégation sont vrais dans l’environnement complexe des cellules et des organismes vivants. Le ver nématode Caenorhabditis elegans est un organisme modèle approprié pour étudier l’agrégation des protéines in vivo. Il a une anatomie relativement simple mais se compose de plusieurs tissus, y compris le muscle, l’intestin et un système nerveux. Il est génétiquement bien caractérisé et des outils de modification génétique sont facilement disponibles. En outre, il a un temps de génération court d’environ 3 jours et une durée de vie totale de 2-3 semaines. En tant que tel, l’agrégation des protéines peut être examinée tout au long de la durée de vie de l’animal sur une échelle de temps expérimentalement pratique. Enfin, le nématode est optiquement transparent, ce qui permet de suivre l’agrégation de protéines marquées par fluorescence chez les animaux vivants.
Ces caractéristiques de C. elegans ont déjà été exploitées pour étudier l’agrégation des protéines polyQ en tant que modèle pour la maladie de Huntington et d’autres maladies d’expansion polyQ. Au-dessus du seuil pathogène de 35 à 40 résidus de glutamine, on peut observer les protéines polyQ marquées avec une protéine fluorescente jaune (YFP) pour former des inclusions insolubles dans le tissu musculaire 6,7, les neurones8 et l’intestin 9,10. Ces caractéristiques ont été largement utilisées pour dépister les gènes 11,12,13 et les modificateurs de petites molécules 14 de l’agrégation et de la toxicité des protéines.
C. elegans a le potentiel de jouer un rôle important pour combler le fossé entre les études in vitro de l’agrégation des protéines et des modèles de maladies plus complexes tels que les souris15. C. elegans se prête au dépistagede médicaments 16 mais peut également être exploité pour obtenir une compréhension fondamentale des mécanismes moléculaires de l’agrégation des protéines in vivo, comme démontré récemment17. Cependant, pour les deux applications, il est d’une importance primordiale d’extraire une mesure quantitative et reproductible de l’agrégation des protéines. Ici, ceci est réalisé avec l’utilisation d’un microscope confocal à haut débit combiné à un pipeline d’analyse d’image dédié (Figure 1).
La méthode présentée ici facilite une analyse quantitative et impartiale de la cinétique d’agrégation des protéines dans l’organisme modèle C. elegans. Elle dépend de quatre éléments clés (figure 1) : 1) le maintien d’une population de nématodes synchronisée selon l’âge; 2) microscopie à fluorescence dans des plaques multipuits; 3) comptage automatisé des inclusions dans CellProfiler; 4) l’ajustement des données dans AmyloFit. Par rapport au comptage manuel des inclusions chez les animaux en mouvement libre ou à partir d’images enregistrées26, la quantification dans CellProfiler est à la fois plus rapide et plus impartiale. L’autre avancée clé du protocole est l’acquisition de données cinétiques, plutôt que de points temporels uniques, qui fournit des informations quantitatives sur le mécanisme d’agrégation lors de l’ajustement des données à un modèle mathématique.
Les quatre éléments du protocole peuvent être utilisés comme des modules indépendants qui peuvent être modifiés en fonction de l’application. Les populations synchronisées selon l’âge peuvent également être maintenues en utilisant la 5-fluoro-2′-désoxyuridine (FUDR) pour stériliser les animaux. Ce composé affecte la durée de vie et la protéostasie24,25 et est hautement cancérogène pour l’expérimentateur; cependant, il empêche le transfert manuel des vers, ce qui peut être laborieux lorsque de grands nombres sont manipulés. D’autres alternatives sont l’utilisation de mutants stériles29 ou de dispositifs de filtration pour séparer la progéniture30.
L’étape de microscopie à fluorescence peut également être ajustée, par exemple, en utilisant des grossissements plus élevés pour surveiller l’agrégation des protéines dans les neurones. La microscopie à grand champ peut être suffisante pour surveiller l’agrégation de polyQ dans les cellules musculaires lorsque la différence relative entre les conditions est plus importante que le nombre absolu d’inclusions. Le pipeline CellProfiler peut toujours être utilisé dans ces cas, bien que les paramètres de reconnaissance des vers et des inclusions devront être ajustés par l’utilisateur. Le débit de la technique est actuellement limité par la nécessité de cueillir manuellement les animaux dans la plaque de 384 puits. Cela peut potentiellement être résolu par l’utilisation de dispositifs microfluidiques16. L’azoture de sodium est un anesthésique relativement dur, qui pourrait être remplacé par une immobilisation physique avec des hydrogels ou des perles28,29.
L’analyse d’AmyloFit présentée ici est basée sur un mécanisme d’agrégation constitué d’événements de nucléation indépendants dans des cellules individuelles. Dans les cas où ce modèle ne convient pas, l’utilisateur devrait envisager une alternative telle que le modèle d’agrégation coopérative développé précédemment17. Une limite de cette approche est que des souches exprimant la protéine d’intérêt à différentes concentrations doivent être disponibles, bien que celles-ci puissent être générées à l’aide des méthodes de routine de C. elegans 24.
Dans l’ensemble, ce protocole fournit les moyens d’obtenir des données de haute qualité pour la cinétique d’agrégation des protéines dans un système de modèle in vivo , permettant une analyse détaillée des mécanismes d’agrégation17. Bien que la méthode ait été démontrée pour l’agrégation de polyQ dans le tissu musculaire de C. elegans , les applications futures du protocole pourraient inclure d’autres protéines et tissus et les effets des facteurs de protéostasie et des petites molécules.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions le laboratoire Morimoto pour les souches de C. elegans et Esmeralda Bosman pour son aide sur le microscope confocal à haut débit. Ce travail a été financé par une subvention de démarrage de l’Université d’Utrecht à T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |