Her presenteres en metode for analyse av proteinaggregeringskinetikk i nematoden Caenorhabditis elegans. Dyr fra en alderssynkronisert populasjon er avbildet på forskjellige tidspunkter, etterfulgt av halvautomatisert inkluderingstelling i CellProfiler og tilpasning til en matematisk modell i AmyloFit.
Proteinaggregering i uoppløselige inneslutninger er et kjennetegn på en rekke menneskelige sykdommer, hvorav mange er aldersrelaterte. Nematoden Caenorhabditis elegans er en veletablert modellorganisme som har blitt mye brukt i feltet for å studere proteinaggregering og toksisitet. Den optiske gjennomsiktigheten muliggjør direkte visualisering av proteinaggregering ved fluorescensmikroskopi. Videre gjør den raske reproduktive syklusen og kort levetid nematoden til en passende modell for å screene for gener og molekyler som modulerer denne prosessen.
Kvantifiseringen av aggregert belastning hos levende dyr er imidlertid dårlig standardisert, vanligvis utført ved manuell inkluderingstelling under et fluorescens disseksjonsmikroskop på et enkelt tidspunkt. Denne tilnærmingen kan føre til høy variasjon mellom observatører og begrenser forståelsen av aggregasjonsprosessen. I motsetning overvåkes amyloidlignende proteinaggregering in vitro rutinemessig av thioflavin T fluorescens på en svært kvantitativ og tidsbestemt måte.
Her presenteres en analog metode for den objektive analysen av aggregasjonskinetikk i levende C. elegans, ved hjelp av et konfokalt mikroskop med høy gjennomstrømning kombinert med skreddersydd bildeanalyse og datatilpasning. Anvendelsen av denne metoden er demonstrert ved å overvåke inkluderingsdannelse av et fluorescerende merket polyglutamin (polyQ) protein i kroppsveggens muskelceller. Bildeanalysearbeidsflyten gjør det mulig å bestemme antall inneslutninger på forskjellige tidspunkter, som er tilpasset en matematisk modell basert på uavhengige kjernehendelser i individuelle muskelceller. Metoden beskrevet her kan være nyttig for å vurdere effekten av proteostasefaktorer og potensielle terapeutiske for proteinaggregeringssykdommer hos et levende dyr på en robust og kvantitativ måte.
Akkumuleringen av feilfoldede proteiner i uoppløselige avsetninger forekommer i et bredt spekter av sykdommer. Kjente eksempler er aggregering av amyloid-β og tau i Alzheimers sykdom, α-synuklein ved Parkinsons sykdom, og huntingtin med utvidet polyQ ved Huntingtons sykdom 1,2. Feilfoldingen av disse polypeptider i amyloidfibriler er forbundet med toksisitet og celledød av mekanismer som fortsatt i stor grad er uklare. Belyse mekanismene for amyloiddannelse vil være avgjørende for å utvikle effektive terapier, som for tiden ikke er tilgjengelige.
Detaljerte undersøkelser av amyloiddannelse har blitt utført in vitro basert på thioflavin T fluorescensmålinger, noe som fører til en mekanistisk forståelse av aggregasjonsprosessen og effekten av hemmende molekyler 3,4,5. Det er imidlertid ikke klart om de samme aggregeringsmekanismene gjelder i det komplekse miljøet av levende celler og organismer. Nematode ormen Caenorhabditis elegans er en egnet modellorganisme for å studere proteinaggregering in vivo. Den har en relativt enkel anatomi, men består av flere vev, inkludert muskler, tarm og et nervesystem. Det er genetisk godt karakterisert, og verktøy for genetisk modifikasjon er lett tilgjengelige. Videre har den en kort generasjonstid på ~ 3 dager og en total levetid på 2-3 uker. Som sådan kan proteinaggregering undersøkes gjennom dyrets levetid på en eksperimentelt praktisk tidsskala. Til slutt er nematoden optisk gjennomsiktig, noe som muliggjør sporing av aggregering av fluorescerende merkede proteiner hos levende dyr.
Disse egenskapene til C. elegans har tidligere blitt utnyttet til å undersøke aggregering av polyQ-proteiner som modell for Huntingtons og andre polyQ-ekspansjonssykdommer. Over den patogene terskelen på 35-40 glutaminrester, kan polyQ-proteinene merket med gult fluorescerende protein (YFP) observeres for å danne uoppløselige inneslutninger i muskelvevet 6,7, nevroner8 og tarmen 9,10. Disse funksjonene har blitt mye brukt til å screene for gener 11,12,13 og småmolekyl modifikatorer14 av proteinaggregasjon og toksisitet.
C. elegans har potensial til å spille en viktig rolle i å bygge bro mellom in vitro-studier av proteinaggregering og mer komplekse sykdomsmodeller som mus15. C. elegans er egnet til legemiddelscreening16 , men kan også utnyttes for å oppnå en grunnleggende forståelse av molekylære mekanismer for proteinaggregering in vivo, som vist nylig17. For begge bruksområdene er det imidlertid av største betydning å trekke ut et kvantitativt og reproduserbart mål på proteinaggregering. Her oppnås dette ved bruk av et konfokalt mikroskop med høy gjennomstrømning kombinert med en dedikert bildeanalyserørledning (figur 1).
Metoden som presenteres her, letter en objektiv og kvantitativ analyse av proteinaggregeringskinetikk i modellorganismen C. elegans. Det avhenger av fire nøkkelelementer (figur 1): 1) opprettholde en alderssynkronisert populasjon av nematoder; 2) fluorescensmikroskopi i multiwell plater; 3) automatisert inkluderingstelling i CellProfiler; 4) datatilpasning i AmyloFit. Sammenlignet med manuell telling av inneslutninger hos fritt bevegelige dyr eller fra lagrede bilder26, er kvantifisering i CellProfiler både raskere og mer objektivt. Den andre viktige utviklingen av protokollen er innsamling av kinetiske data, i stedet for enkelttidspunkter, som gir kvantitativ innsikt i aggregeringsmekanismen når dataene tilpasses en matematisk modell.
De fire elementene i protokollen kan brukes som uavhengige moduler som kan endres avhengig av programmet. Alderssynkroniserte populasjoner kan også opprettholdes ved hjelp av 5-fluoro-2′-deoksyuridin (FUDR) for å sterilisere dyrene. Denne forbindelsen påvirker levetiden og proteostase24,25 og er svært kreftfremkallende for eksperimentet; Det utelukker imidlertid manuell overføring av ormene, noe som kan være arbeidskrevende når store tall håndteres. Andre alternativer er bruk av sterile mutanter29 eller filtreringsenheter for å skille avkom30.
Fluorescensmikroskopitrinnet kan også justeres, for eksempel ved hjelp av høyere forstørrelser for å overvåke proteinaggregering hos nevroner. Widefield mikroskopi kan være tilstrekkelig til å overvåke polyQ aggregering i muskelceller når den relative forskjellen mellom forholdene er viktigere enn absolutt antall inneslutninger. CellProfiler-rørledningen kan fortsatt brukes i disse tilfellene, selv om innstillingene for å gjenkjenne ormer og inkluderinger må justeres av brukeren. Gjennomstrømningen av teknikken er for tiden begrenset av behovet for manuell plukking av dyrene i 384-brønnsplaten. Dette kan potensielt løses ved bruk av mikrofluidiske enheter16. Natriumazid er et relativt hardt bedøvelsesmiddel, som kan erstattes av fysisk immobilisering med hydrogeler eller perler28,29.
Analysen i AmyloFit presentert her er basert på en aggregasjonsmekanisme som består av uavhengige kjernehendelser i individuelle celler. I tilfeller der denne modellen ikke passer, bør brukeren vurdere et alternativ som samarbeids aggregeringsmodellen utviklet tidligere17. En begrensning av denne tilnærmingen er at stammer som uttrykker proteinet av interesse ved forskjellige konsentrasjoner, må være tilgjengelige, selv om disse kan genereres ved hjelp av rutinemessige C. elegans-metoder 24.
Til sammen gir denne protokollen midler til å skaffe data av høy kvalitet for proteinaggregeringskinetikk i et in vivo-modellsystem , noe som muliggjør detaljert analyse av aggregasjonsmekanismer17. Selv om metoden ble demonstrert for polyQ aggregering i C. elegans muskelvev, fremtidige anvendelser av protokollen kan omfatte andre proteiner og vev og effekten av proteostase faktorer og små molekyler.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Morimoto lab for C. elegans stammer og Esmeralda Bosman for hjelp på high-throughput confocal mikroskop. Dette arbeidet ble finansiert av et oppstartsstipend fra Utrecht University til T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |