هنا ، يتم تقديم طريقة لتحليل حركية تجميع البروتين في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. يتم تصوير الحيوانات من مجموعة سكانية متزامنة مع العمر في نقاط زمنية مختلفة ، تليها عد التضمين شبه الآلي في CellProfiler وتناسبها مع نموذج رياضي في AmyloFit.
يعد تجميع البروتين في شوائب غير قابلة للذوبان سمة مميزة لمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية ، وكثير منها مرتبط بالعمر. الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هي كائن حي نموذجي راسخ تم استخدامه على نطاق واسع في هذا المجال لدراسة تجميع البروتين والسمية. تتيح شفافيتها البصرية التصور المباشر لتجميع البروتين بواسطة المجهر الفلوري. علاوة على ذلك ، فإن الدورة التناسلية السريعة والعمر القصير يجعلان من الديدان الخيطية نموذجا مناسبا لفحص الجينات والجزيئات التي تعدل هذه العملية.
ومع ذلك ، فإن القياس الكمي للحمل الكلي في الحيوانات الحية غير موحد بشكل جيد ، وعادة ما يتم إجراؤه عن طريق العد اليدوي للإدراج تحت مجهر تشريح التألق في نقطة زمنية واحدة. ويمكن أن يؤدي هذا النهج إلى تباين كبير بين المراقبين ويحد من فهم عملية التجميع. في المقابل ، يتم مراقبة تراكم البروتين الشبيه بالأميلويد في المختبر بشكل روتيني بواسطة فلورة ثيوفلافين T بطريقة كمية للغاية ويتم حلها بمرور الوقت.
هنا ، يتم تقديم طريقة مماثلة للتحليل غير المتحيز لحركية التجميع في C. elegans الحية ، باستخدام مجهر بؤري عالي الإنتاجية جنبا إلى جنب مع تحليل الصور حسب الطلب وتركيب البيانات. يتم إثبات قابلية تطبيق هذه الطريقة من خلال مراقبة تكوين تضمين بروتين البولي جلوتامين (polyQ) المسمى بالفلورسنت في خلايا عضلات جدار الجسم. يسمح سير عمل تحليل الصور بتحديد أعداد الشوائب في نقاط زمنية مختلفة ، والتي يتم تركيبها على نموذج رياضي يعتمد على أحداث النوى المستقلة في خلايا العضلات الفردية. قد تكون الطريقة الموصوفة هنا مفيدة لتقييم آثار عوامل البروتينات والعلاجات المحتملة لأمراض تجميع البروتين في حي بطريقة قوية وكميتة.
يحدث تراكم البروتينات غير المطوية في رواسب غير قابلة للذوبان في مجموعة واسعة من الأمراض. ومن الأمثلة المعروفة على ذلك تجميع β أميلويد وتاو في مرض الزهايمر ، α-سينوكلين في مرض باركنسون ، وهنتنغتين مع polyQ الموسع في مرض هنتنغتون 1,2. يرتبط سوء طي هذه الببتيدات المتعددة إلى ألياف أميلويد بالسمية وموت الخلايا بواسطة آليات لا تزال غير واضحة إلى حد كبير. سيكون توضيح آليات تكوين الأميلويد أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة ، غير متوفرة حاليا.
تم إجراء تحقيقات مفصلة لتشكيل الأميلويد في المختبر بناء على قياسات التألق ثيوفلافين T ، مما أدى إلى فهم ميكانيكي لعملية التجميع وتأثير الجزيئات المثبطة3،4،5. ومع ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت آليات التجميع نفسها صحيحة في البيئة المعقدة للخلايا الحية والكائنات الحية. الدودة الخيطية Caenorhabditis elegans هي كائن حي نموذجي مناسب لدراسة تراكم البروتين في الجسم الحي. لديها تشريح بسيط نسبيا ولكنها تتكون من أنسجة متعددة ، بما في ذلك العضلات والأمعاء والجهاز العصبي. وهي تتميز بشكل جيد وراثيا ، وأدوات التعديل الوراثي متاحة بسهولة. علاوة على ذلك ، لديها وقت جيل قصير من ~ 3 أيام وعمر إجمالي من 2-3 أسابيع. على هذا النحو ، يمكن فحص تجميع البروتين عبر عمر الحيوان على نطاق زمني مناسب تجريبيا. وأخيرا، فإن الديدان الخيطية شفافة بصريا، مما يتيح تتبع تجميع البروتينات ذات العلامات الفلورية في الحيوانات الحية.
تم استغلال هذه الميزات من C. elegans سابقا للتحقيق في تجميع بروتينات polyQ كنموذج لأمراض توسع Huntington وغيرها من أمراض توسع polyQ. فوق العتبة المسببة للأمراض من 35-40 بقايا الجلوتامين ، يمكن ملاحظة بروتينات polyQ الموسومة بالبروتين الفلوري الأصفر (YFP) لتشكيل شوائب غير قابلة للذوبان في الأنسجة العضلية6,7 ، الخلايا العصبية8 ، والأمعاء 9,10. وقد استخدمت هذه الميزات على نطاق واسع لفحص الجينات 11،12،13 ومعدلات الجزيئات الصغيرة 14 من تجميع البروتين والسمية.
C. elegans لديه القدرة على لعب دور مهم في سد الفجوة بين الدراسات المختبرية لتجميع البروتين ونماذج الأمراض الأكثر تعقيدا مثل الفئران15. C. elegans قابل لفحص المخدرات16 ولكن يمكن أيضا استغلاله للحصول على فهم أساسي للآليات الجزيئية لتراكم البروتين في الجسم الحي ، كما هو موضح مؤخرا17. ومع ذلك ، بالنسبة لكلا التطبيقين ، من الأهمية بمكان استخراج مقياس كمي وقابل للتكرار لتجميع البروتين. هنا ، يتم تحقيق ذلك باستخدام مجهر بؤري بؤري عالي الإنتاجية جنبا إلى جنب مع خط أنابيب مخصص لتحليل الصور (الشكل 1).
تسهل الطريقة المعروضة هنا تحليلا كميا وغير متحيز لحركية تجميع البروتين في الكائن الحي النموذجي C. elegans. ويعتمد ذلك على أربعة عناصر رئيسية (الشكل 1): 1) الحفاظ على مجموعة متزامنة حسب العمر من الديدان الخيطية؛ و 1) الحفاظ على عدد من الديدان الخيطية المتزامنة مع تقدم العمر؛ و 1) الحفاظ على عدد من الديدان الخيطية المتزامنة مع العمر؛ و 1) الحفاظ على عدد من الديدان الخيطية المتزامنة 2) المجهر الفلوري في لوحات متعددة الآبار ؛ 3) العد الآلي للتضمين في CellProfiler ؛ 4) تركيب البيانات في AmyloFit. بالمقارنة مع العد اليدوي للشوائب في الحيوانات المتحركة بحرية أو من الصور المحفوظة26 ، فإن القياس الكمي في CellProfiler أسرع وأكثر حيازة. التقدم الرئيسي الآخر للبروتوكول هو الحصول على البيانات الحركية ، بدلا من النقاط الزمنية الفردية ، والتي توفر رؤى كمية في آلية التجميع عند ملاءمة البيانات مع نموذج رياضي.
يمكن استخدام العناصر الأربعة للبروتوكول كوحدات مستقلة يمكن تعديلها اعتمادا على التطبيق. يمكن أيضا الحفاظ على السكان المتزامنين مع العمر باستخدام 5-fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) لتعقيم الحيوانات. يؤثر هذا المركب على العمر الافتراضي والبروتيوستاسيس24,25 وهو مسرطن للغاية للمجرب ؛ ومع ذلك ، فإنه يمنع النقل اليدوي للديدان ، والتي يمكن أن تكون كثيفة العمالة عند التعامل مع أعداد كبيرة. البدائل الأخرى هي استخدام الطفرات المعقمة29 أو أجهزة الترشيح لفصل النسل30.
يمكن أيضا تعديل خطوة الفحص المجهري الفلوري ، على سبيل المثال ، باستخدام تكبيرات أعلى لمراقبة تراكم البروتين في الخلايا العصبية. قد يكون الفحص المجهري واسع المجال كافيا لمراقبة تراكم polyQ في خلايا العضلات عندما يكون الفرق النسبي بين الظروف أكثر أهمية من الأعداد المطلقة للشوائب. لا يزال من الممكن استخدام خط أنابيب CellProfiler في هذه الحالات ، على الرغم من أن الإعدادات للتعرف على الديدان والتضمينات ستحتاج إلى تعديلها من قبل المستخدم. إنتاجية هذه التقنية محدودة حاليا بسبب الحاجة إلى الانتقاء اليدوي للحيوانات في لوحة 384 بئرا. يمكن علاج هذا عن طريق استخدام أجهزة الموائع الدقيقة16. أزيد الصوديوم هو مخدر قاس نسبيا ، والذي يمكن استبداله بالتجميد البدني مع الهلاميات المائية أو الخرز28,29.
يعتمد التحليل في AmyloFit المعروض هنا على آلية تجميع تتكون من أحداث نووية مستقلة في الخلايا الفردية. في الحالات التي لا يتناسب فيها هذا النموذج ، يجب على المستخدم النظر في بديل مثل نموذج التجميع التعاوني الذي تم تطويره سابقا17. أحد القيود المفروضة على هذا النهج هو أن السلالات التي تعبر عن البروتين ذي الأهمية بتركيزات مختلفة يجب أن تكون متاحة ، على الرغم من أنه يمكن توليدها باستخدام طرق C. elegans الروتينية 24.
وإجمالا، يوفر هذا البروتوكول وسيلة للحصول على بيانات عالية الجودة لحركية تجميع البروتين في نظام نموذجي في الجسم الحي ، مما يسمح بإجراء تحليل مفصل لآليات التجميع17. على الرغم من أن الطريقة قد أثبتت لتجميع polyQ في الأنسجة العضلية C. elegans ، إلا أن التطبيقات المستقبلية للبروتوكول قد تشمل بروتينات وأنسجة أخرى وتأثيرات عوامل البروتيوستاسيس والجزيئات الصغيرة.
The authors have nothing to disclose.
نشكر مختبر موريموتو لسلالات C. elegans و Esmeralda Bosman على المساعدة في المجهر البؤري عالي الإنتاجية. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء التشغيل من جامعة أوتريخت إلى T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |