Hier wird eine Methode zur Analyse der Proteinaggregationskinetik im Fadenwurm Caenorhabditis elegans vorgestellt. Tiere aus einer alterssynchronisierten Population werden zu verschiedenen Zeitpunkten abgebildet, gefolgt von einer halbautomatischen Inklusionszählung in CellProfiler und Anpassung an ein mathematisches Modell in AmyloFit.
Die Proteinaggregation in unlösliche Einschlüsse ist ein Kennzeichen einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, von denen viele altersbedingt sind. Der Fadenfaden Caenorhabditis elegans ist ein etablierter Modellorganismus, der in diesem Bereich häufig zur Untersuchung der Proteinaggregation und -toxizität eingesetzt wurde. Seine optische Transparenz ermöglicht die direkte Visualisierung der Proteinaggregation durch Fluoreszenzmikroskopie. Darüber hinaus machen der schnelle Fortpflanzungszyklus und die kurze Lebensdauer den Fadenwurm zu einem geeigneten Modell, um nach Genen und Molekülen zu suchen, die diesen Prozess modulieren.
Die Quantifizierung der Gesamtbelastung bei lebenden Tieren ist jedoch schlecht standardisiert, typischerweise durch manuelle Einschlusszählung unter einem Fluoreszenzdissektionsmikroskop zu einem einzigen Zeitpunkt. Dieser Ansatz kann zu einer hohen Variabilität zwischen den Beobachtern führen und das Verständnis des Aggregationsprozesses einschränken. Im Gegensatz dazu wird die Amyloid-ähnliche Proteinaggregation in vitro routinemäßig durch Thioflavin-T-Fluoreszenz in einer hochquantitativen und zeitaufgelösten Weise überwacht.
Hier wird eine analoge Methode zur unvoreingenommenen Analyse der Aggregationskinetik in lebenden C. elegans vorgestellt, wobei ein konfokales Hochdurchsatzmikroskop in Kombination mit maßgeschneiderter Bildanalyse und Datenanpassung verwendet wird. Die Anwendbarkeit dieser Methode wird durch die Überwachung der Einschlussbildung eines fluoreszierend markierten Polyglutamins (PolyQ) -Proteins in den Körperwandmuskelzellen nachgewiesen. Der Bildanalyse-Workflow ermöglicht die Bestimmung der Anzahl der Einschlüsse zu verschiedenen Zeitpunkten, die an ein mathematisches Modell angepasst werden, das auf unabhängigen Keimbildungsereignissen in einzelnen Muskelzellen basiert. Die hier beschriebene Methode kann sich als nützlich erweisen, um die Auswirkungen von Proteostasefaktoren und potenziellen Therapeutika für Proteinaggregationskrankheiten bei einem lebenden Tier auf robuste und quantitative Weise zu bewerten.
Die Anreicherung von fehlgefalteten Proteinen in unlösliche Ablagerungen tritt bei einer Vielzahl von Krankheiten auf. Bekannte Beispiele sind die Aggregation von Amyloid-β und Tau bei der Alzheimer-Krankheit, α-Synuclein bei der Parkinson-Krankheit und Huntingtin mit expandiertem PolyQ bei der Huntington-Krankheit 1,2. Die Fehlfaltung dieser Polypeptide in Amyloidfibrillen ist mit Toxizität und Zelltod durch Mechanismen verbunden, die noch weitgehend unklar sind. Die Aufklärung der Mechanismen der Amyloidbildung wird entscheidend für die Entwicklung wirksamer Therapien sein, die derzeit nicht verfügbar sind.
Detaillierte Untersuchungen der Amyloidbildung wurden in vitro auf der Grundlage von Thioflavin-T-Fluoreszenzmessungen durchgeführt, was zu einem mechanistischen Verständnis des Aggregationsprozesses und der Wirkung hemmender Moleküleführte 3,4,5. Es ist jedoch nicht klar, ob die gleichen Aggregationsmechanismen in der komplexen Umgebung lebender Zellen und Organismen gelten. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist ein geeigneter Modellorganismus, um die Proteinaggregation in vivo zu untersuchen. Es hat eine relativ einfache Anatomie, besteht aber aus mehreren Geweben, einschließlich Muskeln, Darm und einem Nervensystem. Es ist genetisch gut charakterisiert, und Werkzeuge zur genetischen Veränderung sind leicht verfügbar. Darüber hinaus hat es eine kurze Generationszeit von ~ 3 Tagen und eine Gesamtlebensdauer von 2-3 Wochen. So kann die Proteinaggregation über die gesamte Lebensdauer des Tieres auf einer experimentell günstigen Zeitskala untersucht werden. Schließlich ist der Fadenwurm optisch transparent, was die Verfolgung der Aggregation fluoreszierend markierter Proteine in lebenden Tieren ermöglicht.
Diese Eigenschaften von C. elegans wurden zuvor ausgenutzt, um die Aggregation von PolyQ-Proteinen als Modell für Huntington- und andere PolyQ-Expansionskrankheiten zu untersuchen. Oberhalb der pathogenen Schwelle von 35-40 Glutaminresten kann beobachtet werden, dass die mit gelb fluoreszierendem Protein (YFP) markierten PolyQ-Proteine unlösliche Einschlüsse im Muskelgewebe6,7, Neuronen8 und im Darm 9,10 bilden. Diese Merkmale wurden häufig verwendet, um nach Genen 11,12,13 und niedermolekularen Modifikatoren 14 der Proteinaggregation und -toxizität zu suchen.
C. elegans hat das Potenzial, eine wichtige Rolle bei der Überbrückung der Lücke zwischen In-vitro-Studien zur Proteinaggregation und komplexeren Krankheitsmodellen wie Mäusenzu spielen 15. C. elegans ist für das Wirkstoff-Screening16 zugänglich, kann aber auch genutzt werden, um ein grundlegendes Verständnis der molekularen Mechanismen der Proteinaggregation in vivo zu erlangen, wie kürzlichgezeigt wurde 17. Für beide Anwendungen ist es jedoch von größter Bedeutung, ein quantitatives und reproduzierbares Maß für die Proteinaggregation zu extrahieren. Dies wird hier durch den Einsatz eines konfokalen Hochdurchsatzmikroskops in Kombination mit einer dedizierten Bildanalyse-Pipeline erreicht (Abbildung 1).
Die hierin vorgestellte Methode ermöglicht eine unvoreingenommene und quantitative Analyse der Proteinaggregationskinetik im Modellorganismus C. elegans. Es hängt von vier Schlüsselelementen ab (Abbildung 1): 1) Aufrechterhaltung einer alterssynchronisierten Population von Nematoden; 2) Fluoreszenzmikroskopie in Multiwell-Platten; 3) automatisierte Einschlusszählung in CellProfiler; 4) Datenanpassung in AmyloFit. Im Vergleich zur manuellen Zählung von Einschlüssen in frei beweglichen Tieren oder aus gespeicherten Bildern26 ist die Quantifizierung in CellProfiler sowohl schneller als auch unvoreingenommener. Die andere wichtige Weiterentwicklung des Protokolls ist die Erfassung kinetischer Daten anstelle von einzelnen Zeitpunkten, die quantitative Einblicke in den Aggregationsmechanismus bei der Anpassung der Daten an ein mathematisches Modell liefert.
Die vier Elemente des Protokolls können als unabhängige Module verwendet werden, die je nach Anwendung modifiziert werden können. Alterssynchronisierte Populationen können auch mit 5-Fluor-2′-Desoxyuridin (FUDR) aufrechterhalten werden, um die Tiere zu sterilisieren. Diese Verbindung beeinflusst die Lebensdauer und Proteostase24,25 und ist für den Experimentator stark krebserregend; Es schließt jedoch eine manuelle Übertragung der Würmer aus, die arbeitsintensiv sein kann, wenn große Mengen gehandhabt werden. Weitere Alternativen sind der Einsatz von sterilen Mutanten29 oder Filtergeräten zur Trennung von Nachkommen30.
Der Fluoreszenzmikroskopie-Schritt kann auch eingestellt werden, indem beispielsweise höhere Vergrößerungen verwendet werden, um die Proteinaggregation in Neuronen zu überwachen. Die Weitfeldmikroskopie kann ausreichen, um die PolyQ-Aggregation in Muskelzellen zu überwachen, wenn der relative Unterschied zwischen den Bedingungen wichtiger ist als die absolute Anzahl der Einschlüsse. Die CellProfiler-Pipeline kann in diesen Fällen weiterhin verwendet werden, obwohl die Einstellungen zur Erkennung von Würmern und Einschlüssen vom Benutzer angepasst werden müssen. Der Durchsatz der Technik ist derzeit durch die Notwendigkeit der manuellen Kommissionierung der Tiere in die 384-Well-Platte begrenzt. Dies kann möglicherweise durch den Einsatz von mikrofluidischen Gerätenbehoben werden 16. Natriumazid ist ein relativ hartes Anästhetikum, das durch physikalische Immobilisierung mit Hydrogelen oder Perlen ersetzt werden könnte28,29.
Die hier vorgestellte Analyse in AmyloFit basiert auf einem Aggregationsmechanismus, der aus unabhängigen Keimbildungsereignissen in einzelnen Zellen besteht. In Fällen, in denen dieses Modell nicht passt, sollte der Benutzer eine Alternative in Betracht ziehen, z. B. das zuvor entwickelte kooperativeAggregationsmodell 17. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass Stämme, die das interessierende Protein in verschiedenen Konzentrationen ausdrücken, verfügbar sein müssen, obwohl diese mit routinemäßigen C. elegans-Methoden erzeugt werden können24.
Insgesamt bietet dieses Protokoll die Möglichkeit, qualitativ hochwertige Daten für die Proteinaggregationskinetik in einem In-vivo-Modellsystem zu erhalten, das eine detaillierte Analyse der Aggregationsmechanismen ermöglicht17. Obwohl die Methode für die PolyQ-Aggregation im Muskelgewebe von C. elegans demonstriert wurde, können zukünftige Anwendungen des Protokolls andere Proteine und Gewebe sowie die Auswirkungen von Proteostasefaktoren und kleinen Molekülen umfassen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken dem Morimoto-Labor für C. elegans-Stämme und Esmeralda Bosman für die Unterstützung beim konfokalen Hochdurchsatzmikroskop. Diese Arbeit wurde durch ein Start-up-Stipendium der Universität Utrecht an T.S.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |