यहां, नेमाटोड केनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। एक उम्र सिंक्रनाइज़ आबादी से जानवरों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर चित्रित किया जाता है, इसके बाद सेलप्रोफाइलर में अर्ध-स्वचालित समावेशन गिनती और एमिलोफिट में एक गणितीय मॉडल के लिए फिटिंग होती है।
अघुलनशील समावेशन में प्रोटीन एकत्रीकरण विभिन्न प्रकार के मानव रोगों की पहचान है, जिनमें से कई उम्र से संबंधित हैं। सूत्रकृमि Caenorhabditis elegans एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है कि व्यापक रूप से प्रोटीन एकत्रीकरण और विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है। इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, तेजी से प्रजनन चक्र और कम जीवनकाल नेमाटोड को जीन और अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाते हैं जो इस प्रक्रिया को संशोधित करते हैं।
हालांकि, जीवित जानवरों में कुल भार का परिमाणीकरण खराब मानकीकृत होता है, आमतौर पर एक ही समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल समावेशन गिनती द्वारा किया जाता है। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप पर्यवेक्षकों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है और एकत्रीकरण प्रक्रिया की समझ को सीमित कर सकती है। इसके विपरीत, विट्रो में अमाइलॉइड-जैसे प्रोटीन एकत्रीकरण को नियमित रूप से थायोफ्लेविन टी प्रतिदीप्ति द्वारा अत्यधिक मात्रात्मक और समय-हल किए गए फैशन में निगरानी की जाती है।
यहां, एक अनुरूप विधि जीवित सी एलिगन्स में एकत्रीकरण कैनेटीक्स के निष्पक्ष विश्लेषण के लिए प्रस्तुत की गई है, जो कस्टम-निर्मित छवि विश्लेषण और डेटा फिटिंग के साथ संयुक्त एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करती है। इस विधि की प्रयोज्यता को शरीर की दीवार की मांसपेशियों की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) प्रोटीन के समावेश गठन की निगरानी करके प्रदर्शित किया जाता है। छवि विश्लेषण वर्कफ़्लो विभिन्न टाइमपॉइंट्स पर समावेशन की संख्या के निर्धारण की अनुमति देता है, जो व्यक्तिगत मांसपेशी कोशिकाओं में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन घटनाओं के आधार पर गणितीय मॉडल में फिट होते हैं। यहां वर्णित विधि एक मजबूत और मात्रात्मक तरीके से एक जीवित जानवर में प्रोटीन एकत्रीकरण रोगों के लिए प्रोटियोस्टैसिस कारकों और संभावित चिकित्सीय के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोगी साबित हो सकती है।
अघुलनशील जमा में misfolded प्रोटीन का संचय रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में होता है। प्रसिद्ध उदाहरण अल्जाइमर रोग में एमिलॉइड-β और ताऊ का एकत्रीकरण, पार्किंसंस रोग में α-सिन्यूक्लिन, और हंटिंगटन रोग 1,2 में विस्तारित पॉलीक्यू के साथ हंटिंगटिन हैं। अमाइलॉइड फाइब्रिल में इन पॉलीपेप्टाइड्स की मिसफोल्डिंग विषाक्तता और कोशिका मृत्यु से तंत्र से जुड़ी हुई है जो अभी भी काफी हद तक अस्पष्ट हैं। एमाइलॉइड गठन के तंत्र को स्पष्ट करना प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा, जो वर्तमान में अनुपलब्ध हैं।
एमाइलॉइड गठन की विस्तृत जांच इन विट्रो में थायोफ्लेविन टी प्रतिदीप्ति माप के आधार पर की गई है, जिससे एकत्रीकरण प्रक्रिया की यांत्रिक समझ और निरोधात्मक अणुओंके प्रभाव 3,4,5 हो गए हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या एक ही एकत्रीकरण तंत्र जीवित कोशिकाओं और जीवों के जटिल वातावरण में सच है। सूत्रकृमि कृमि Caenorhabditis elegans विवो में प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल जीव है। इसमें एक अपेक्षाकृत सरल शरीर रचना विज्ञान है, लेकिन इसमें मांसपेशियों, आंत और तंत्रिका तंत्र सहित कई ऊतक होते हैं। यह आनुवंशिक रूप से अच्छी तरह से विशेषता है, और आनुवंशिक संशोधन के लिए उपकरण आसानी से उपलब्ध हैं। इसके अलावा, इसमें ~ 3 दिनों की एक छोटी पीढ़ी का समय और 2-3 सप्ताह का कुल जीवनकाल है। इस प्रकार, प्रोटीन एकत्रीकरण की जांच प्रयोगात्मक रूप से सुविधाजनक टाइमस्केल पर जानवर के जीवनकाल में की जा सकती है। अंत में, सूत्रकृमि ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी है, जो जीवित जानवरों में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन के एकत्रीकरण की ट्रैकिंग को सक्षम करता है।
C. elegans की इन विशेषताओं को पहले हंटिंगटन और अन्य पॉलीक्यू विस्तार रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में पॉलीक्यू प्रोटीन के एकत्रीकरण की जांच करने के लिए शोषण किया गया है। 35-40 ग्लूटामाइन अवशेषों की रोगजनक सीमा के ऊपर, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) के साथ लेबल किए गए पॉलीक्यू प्रोटीन को मांसपेशियों केऊतकों में अघुलनशील समावेशन बनाने के लिए देखा जा सकता है 6,7, न्यूरॉन्स8, और आंत 9,10। इन विशेषताओं का व्यापक रूप से जीन11,12,13 और प्रोटीन एकत्रीकरण और विषाक्तता के छोटे-अणु संशोधक14 के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया गया है।
C. elegans में प्रोटीन एकत्रीकरण के इन विट्रो अध्ययनों और चूहों जैसे चूहोंके 15 जैसे अधिक जटिल रोग मॉडल के बीच के अंतर को पाटने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की क्षमता है। C. elegans दवा स्क्रीनिंग16 के लिए उपयुक्त है, लेकिन विवो में प्रोटीन एकत्रीकरण के आणविक तंत्र की मौलिक समझ प्राप्त करने के लिए भी शोषण किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही मेंप्रदर्शित किया गया है 17। हालांकि, दोनों अनुप्रयोगों के लिए, प्रोटीन एकत्रीकरण के मात्रात्मक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य उपाय निकालने के लिए यह प्रमुख महत्व का है। यहां, यह एक समर्पित छवि विश्लेषण पाइपलाइन (चित्रा 1) के साथ संयुक्त एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाता है।
यहां प्रस्तुत विधि मॉडल जीव सी एलिगन्स में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के एक निष्पक्ष और मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करती है। यह चार प्रमुख तत्वों (चित्रा 1) पर निर्भर करता है: 1) नेमाटोड की एक आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी को बनाए रखना; 2) मल्टीवेल प्लेटों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी; 3) CellProfiler में स्वचालित समावेशन गिनती; 4) AmyloFit में डेटा फिटिंग. स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में या सहेजी गई छवियों से समावेशन की मैनुअल गिनती की तुलना में26, CellProfiler में परिमाणीकरण तेज और अधिक निष्पक्ष दोनों है। प्रोटोकॉल की अन्य महत्वपूर्ण प्रगति एकल टाइमपॉइंट्स के बजाय गतिज डेटा का अधिग्रहण है, जो डेटा को गणितीय मॉडल में फिट करने पर एकत्रीकरण तंत्र में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
प्रोटोकॉल के चार तत्वों को स्वतंत्र मॉड्यूल के रूप में उपयोग किया जा सकता है जिसे एप्लिकेशन के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी को जानवरों को निष्फल करने के लिए 5-फ्लोरो-2′-डीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) का उपयोग करके भी बनाए रखा जा सकता है। यह यौगिक जीवनकाल और प्रोटियोस्टैसिस24,25 को प्रभावित करता है और प्रयोगकर्ता के लिए अत्यधिक कार्सिनोजेनिक है; हालांकि, यह कीड़े के मैनुअल हस्तांतरण को रोकता है, जो बड़ी संख्या में नियंत्रित होने पर श्रम-गहन हो सकता है। अन्य विकल्प संतानों को अलग करने के लिए बाँझ उत्परिवर्ती29 या निस्पंदन उपकरणों का उपयोग कर रहे हैं30.
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी चरण को भी समायोजित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स में प्रोटीन एकत्रीकरण की निगरानी के लिए उच्च आवर्धन का उपयोग करना। वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी मांसपेशियों की कोशिकाओं में पॉलीक्यू एकत्रीकरण की निगरानी करने के लिए पर्याप्त हो सकती है जब स्थितियों के बीच सापेक्ष अंतर समावेशन की पूर्ण संख्या की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण होता है। CellProfiler पाइपलाइन का उपयोग अभी भी इन मामलों में किया जा सकता है, हालांकि कीड़े और समावेशन को पहचानने के लिए सेटिंग्स को उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित करने की आवश्यकता होगी। तकनीक का थ्रूपुट वर्तमान में 384-अच्छी तरह से प्लेट में जानवरों के मैन्युअल पिकिंग की आवश्यकता से सीमित है। यह संभावित रूप से माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपयोग से ठीक किया जा सकताहै 16। सोडियम एज़ाइड एक अपेक्षाकृत कठोर संवेदनाहारी है, जिसे हाइड्रोजेल या मोतियों28,29 के साथ भौतिक स्थिरीकरण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत एमाइलोफिट में विश्लेषण एक एकत्रीकरण तंत्र पर आधारित है जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाओं में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन की घटनाएं शामिल हैं। उन मामलों में जहां यह मॉडल फिट नहीं होता है, उपयोगकर्ता को एक विकल्प पर विचार करना चाहिए जैसे कि सहकारी एकत्रीकरण मॉडल पहलेसे विकसित 17। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि विभिन्न सांद्रता में ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करने वाले उपभेदों को उपलब्ध होने की आवश्यकता होती है, हालांकि इन्हें नियमित सी एलिगेंस विधियों का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकताहै।
कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक इन विवो मॉडल सिस्टम में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने का साधन प्रदान करता है, जिससे एकत्रीकरण तंत्र 17 के विस्तृत विश्लेषण की अनुमतिमिलती है। यद्यपि विधि को C. elegans मांसपेशी ऊतक में polyQ एकत्रीकरण के लिए प्रदर्शित किया गया था, प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में अन्य प्रोटीन और ऊतक और प्रोटियोस्टैसिस कारकों और छोटे अणुओं के प्रभाव शामिल हो सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर सहायता के लिए सी एलिगन्स उपभेदों और एस्मेराल्डा बोसमैन के लिए मोरिमोतो प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूट्रेक्ट विश्वविद्यालय से टीएस को स्टार्ट-अप अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |