Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

निगरानी प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स विवो में स्वचालित शामिल Caenorhabditis elegans में गिनती का उपयोग कर

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/63365
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Bijvoet Centre for Biomolecular Research, Utrecht University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, नेमाटोड केनोरहाब्डिटिस एलिगेंस में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। एक उम्र सिंक्रनाइज़ आबादी से जानवरों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर चित्रित किया जाता है, इसके बाद सेलप्रोफाइलर में अर्ध-स्वचालित समावेशन गिनती और एमिलोफिट में एक गणितीय मॉडल के लिए फिटिंग होती है।

Abstract

अघुलनशील समावेशन में प्रोटीन एकत्रीकरण विभिन्न प्रकार के मानव रोगों की पहचान है, जिनमें से कई उम्र से संबंधित हैं। सूत्रकृमि Caenorhabditis elegans एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है कि व्यापक रूप से प्रोटीन एकत्रीकरण और विषाक्तता का अध्ययन करने के लिए क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है। इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन एकत्रीकरण के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, तेजी से प्रजनन चक्र और कम जीवनकाल नेमाटोड को जीन और अणुओं के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल बनाते हैं जो इस प्रक्रिया को संशोधित करते हैं।

हालांकि, जीवित जानवरों में कुल भार का परिमाणीकरण खराब मानकीकृत होता है, आमतौर पर एक ही समय बिंदु पर प्रतिदीप्ति विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत मैन्युअल समावेशन गिनती द्वारा किया जाता है। इस दृष्टिकोण के परिणामस्वरूप पर्यवेक्षकों के बीच उच्च परिवर्तनशीलता हो सकती है और एकत्रीकरण प्रक्रिया की समझ को सीमित कर सकती है। इसके विपरीत, विट्रो में अमाइलॉइड-जैसे प्रोटीन एकत्रीकरण को नियमित रूप से थायोफ्लेविन टी प्रतिदीप्ति द्वारा अत्यधिक मात्रात्मक और समय-हल किए गए फैशन में निगरानी की जाती है।

यहां, एक अनुरूप विधि जीवित सी एलिगन्स में एकत्रीकरण कैनेटीक्स के निष्पक्ष विश्लेषण के लिए प्रस्तुत की गई है, जो कस्टम-निर्मित छवि विश्लेषण और डेटा फिटिंग के साथ संयुक्त एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करती है। इस विधि की प्रयोज्यता को शरीर की दीवार की मांसपेशियों की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पॉलीग्लूटामाइन (पॉलीक्यू) प्रोटीन के समावेश गठन की निगरानी करके प्रदर्शित किया जाता है। छवि विश्लेषण वर्कफ़्लो विभिन्न टाइमपॉइंट्स पर समावेशन की संख्या के निर्धारण की अनुमति देता है, जो व्यक्तिगत मांसपेशी कोशिकाओं में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन घटनाओं के आधार पर गणितीय मॉडल में फिट होते हैं। यहां वर्णित विधि एक मजबूत और मात्रात्मक तरीके से एक जीवित जानवर में प्रोटीन एकत्रीकरण रोगों के लिए प्रोटियोस्टैसिस कारकों और संभावित चिकित्सीय के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोगी साबित हो सकती है।

Introduction

अघुलनशील जमा में misfolded प्रोटीन का संचय रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में होता है। प्रसिद्ध उदाहरण अल्जाइमर रोग में एमिलॉइड-β और ताऊ का एकत्रीकरण, पार्किंसंस रोग में α-सिन्यूक्लिन, और हंटिंगटन रोग 1,2 में विस्तारित पॉलीक्यू के साथ हंटिंगटिन हैं। अमाइलॉइड फाइब्रिल में इन पॉलीपेप्टाइड्स की मिसफोल्डिंग विषाक्तता और कोशिका मृत्यु से तंत्र से जुड़ी हुई है जो अभी भी काफी हद तक अस्पष्ट हैं। एमाइलॉइड गठन के तंत्र को स्पष्ट करना प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण होगा, जो वर्तमान में अनुपलब्ध हैं।

एमाइलॉइड गठन की विस्तृत जांच इन विट्रो में थायोफ्लेविन टी प्रतिदीप्ति माप के आधार पर की गई है, जिससे एकत्रीकरण प्रक्रिया की यांत्रिक समझ और निरोधात्मक अणुओंके प्रभाव 3,4,5 हो गए हैं। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या एक ही एकत्रीकरण तंत्र जीवित कोशिकाओं और जीवों के जटिल वातावरण में सच है। सूत्रकृमि कृमि Caenorhabditis elegans विवो में प्रोटीन एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल जीव है। इसमें एक अपेक्षाकृत सरल शरीर रचना विज्ञान है, लेकिन इसमें मांसपेशियों, आंत और तंत्रिका तंत्र सहित कई ऊतक होते हैं। यह आनुवंशिक रूप से अच्छी तरह से विशेषता है, और आनुवंशिक संशोधन के लिए उपकरण आसानी से उपलब्ध हैं। इसके अलावा, इसमें ~ 3 दिनों की एक छोटी पीढ़ी का समय और 2-3 सप्ताह का कुल जीवनकाल है। इस प्रकार, प्रोटीन एकत्रीकरण की जांच प्रयोगात्मक रूप से सुविधाजनक टाइमस्केल पर जानवर के जीवनकाल में की जा सकती है। अंत में, सूत्रकृमि ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी है, जो जीवित जानवरों में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोटीन के एकत्रीकरण की ट्रैकिंग को सक्षम करता है।

C. elegans की इन विशेषताओं को पहले हंटिंगटन और अन्य पॉलीक्यू विस्तार रोगों के लिए एक मॉडल के रूप में पॉलीक्यू प्रोटीन के एकत्रीकरण की जांच करने के लिए शोषण किया गया है। 35-40 ग्लूटामाइन अवशेषों की रोगजनक सीमा के ऊपर, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) के साथ लेबल किए गए पॉलीक्यू प्रोटीन को मांसपेशियों केऊतकों में अघुलनशील समावेशन बनाने के लिए देखा जा सकता है 6,7, न्यूरॉन्स8, और आंत 9,10। इन विशेषताओं का व्यापक रूप से जीन11,12,13 और प्रोटीन एकत्रीकरण और विषाक्तता के छोटे-अणु संशोधक14 के लिए स्क्रीन करने के लिए उपयोग किया गया है।

C. elegans में प्रोटीन एकत्रीकरण के इन विट्रो अध्ययनों और चूहों जैसे चूहोंके 15 जैसे अधिक जटिल रोग मॉडल के बीच के अंतर को पाटने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की क्षमता है। C. elegans दवा स्क्रीनिंग16 के लिए उपयुक्त है, लेकिन विवो में प्रोटीन एकत्रीकरण के आणविक तंत्र की मौलिक समझ प्राप्त करने के लिए भी शोषण किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही मेंप्रदर्शित किया गया है 17। हालांकि, दोनों अनुप्रयोगों के लिए, प्रोटीन एकत्रीकरण के मात्रात्मक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य उपाय निकालने के लिए यह प्रमुख महत्व का है। यहां, यह एक समर्पित छवि विश्लेषण पाइपलाइन (चित्रा 1) के साथ संयुक्त एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग के साथ प्राप्त किया जाता है।

Protocol

1. C. elegans की एक आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी का विकास

  1. नेमाटोड विकास माध्यम (NGM) प्लेटों पर C. elegans उपभेदों को बनाए रखने के लिएमानक प्रक्रियाओं के अनुसार 20 °C पर Escherichia coli OP50 के साथ seeded.
  2. एक प्लैटिनम कीड़े लेने के साथ एक 6 सेमी बीज वाले एनजीएम प्लेट पर 10 वयस्क नेमाटोड रखकर एक सिंक्रनाइज़ अंडे-ले प्रदर्शन करें। वयस्कों को उन्हें हटाने से पहले 20 डिग्री सेल्सियस पर ~ 2 घंटे के लिए अंडे देने के लिए छोड़ दें। तनाव की उर्वरता और लिए जाने वाले समय बिंदुओं की संख्या के आधार पर, प्रति तनाव 1-4 प्लेटें तैयार करें।
  3. अंडे के साथ प्लेटों को इनक्यूबेटर में 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। जानवरों के विकास की निगरानी करें जब तक कि वे वयस्कता तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: जिस दिन जानवर वयस्कता तक पहुंच गए हैं, उसे यहां दिन 1 के रूप में परिभाषित किया गया है। आमतौर पर, यह अंडे देने के तीन दिन बाद होता है।
  4. दिन 1 से शुरू करते हुए, जानवरों को उनकी संतानों से अलग करने के लिए दैनिक रूप से नए बीज वाले एनजीएम प्लेटों में स्थानांतरित करें। उन जानवरों के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए जो स्थानांतरण के दौरान मर जाते हैं या खो जाते हैं, स्थानांतरण ~ 40 जानवरों को प्रति तनाव बार छवियों की संख्या (चरण 2 देखें) की संख्या के अनुसार। तब तक आगे बढ़ें जब तक कि जानवरों ने निषेचित अंडे देना बंद नहीं कर दिया है (~ वयस्कता का दिन 6)।
    नोट: बैगिंग या अन्य विकासात्मक फेनोटाइप के साथ जानवरों को बाहर निकालें। बैगिंग आमतौर पर एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन को व्यक्त करने वाले उपभेदों में मनाया जाता है।

2. एक multiwell प्लेट में सी elegans के नमूने की तैयारी

नोट: जैसा कि इमेजिंग प्रक्रिया को एनेस्थेटिक्स की आवश्यकता होती है जो अंततः जानवरों को मार देगा, उसी जानवरों को बाद के समय बिंदुओं के लिए पुन: उपयोग नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, एक ही आयु-सिंक्रनाइज़ बैच के विभिन्न जानवरों को अलग-अलग दिनों में चित्रित किया जाता है। भले ही अधिकांश उपभेदों में दिन 1 पर कुछ समावेशन होंगे, लेकिन इस समय बिंदु को बेसलाइन के रूप में शामिल करने की सिफारिश की जाती है।

  1. एक संवेदनाहारी के रूप में 25 mM NaN 3 के साथ पूरक M9 बफर के 100 μL के साथ कुओं की आवश्यक संख्या को भरकर 384-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें। छविबनाने के लिए प्रति तनाव एक अच्छी तरह से भरें।
    नोट: सोडियम एज़ाइड (NaN3) विषाक्त है और इसे देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए।
  2. प्रत्येक तनाव के लिए, प्लैटिनम कृमि पिक का उपयोग करके 20 जानवरों को एक अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
    नोट: कीड़े को कुएं में रखने से पहले बैक्टीरियल लॉन के बाहर रखा जाना चाहिए। बैक्टीरिया जानवरों को कृमि पिक का पालन करते हैं, जो उनकी रिहाई को रोक सकता है और अच्छी तरह से सामग्री को बादल देगा। आम तौर पर, 20 खाली अच्छी तरह से जगह की अनावश्यक इमेजिंग को सीमित करते हुए कीड़े के बीच ओवरलैप को रोकने के लिए प्रति अच्छी तरह से जानवरों की इष्टतम संख्या है।
  3. वाष्पीकरण को रोकने के लिए ढक्कन के साथ प्लेट को कवर करें, और तैयारी के बाद 1 घंटे के भीतर प्लेट की छवि बनाएं।
  4. चरण 2.1-2.3 को दैनिक रूप से दोहराएं जब तक कि शामिल करने की संख्या में एक स्थिर पठार तक नहीं पहुंच जाता है या जब तक कि अधिकांश जानवरों की मृत्यु नहीं हो जाती है। 24 घंटे के अंतराल को सुनिश्चित करने के लिए हर दिन एक ही समय में नमूना तैयारी और इमेजिंग करें।

3. उच्च थ्रूपुट confocal माइक्रोस्कोप पर छवि अधिग्रहण

नोट: यह प्रयोग भी एक multiwell प्लेट धारक के साथ एक नियमित कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोप पर स्थापित किया जा सकता है। एक बड़े फ़ील्ड-ऑफ-व्यू के साथ एक कैमरा पूरे अच्छी तरह से विस्तारित करने के लिए आवश्यक टाइल्स की संख्या को सीमित करने के लिए फायदेमंद है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोस्कोप और सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री तालिका देखें।

  1. साधन पर स्विच करें और सॉफ़्टवेयर खोलें।
  2. मापन सेटिंग्स | पर जाकर एक नया प्रोटोकॉल प्रारंभ करें नया। सही मल्टीवेल प्लेट प्रकार का चयन करें और कोई नई माप सेटिंग बनाएँ क्लिक करें.
  3. Ch 1 पर जाकर प्रतिदीप्ति के लिए चैनल सेट करें। उद्देश्य को 10x पर सेट करें। प्रकाश स्रोत के रूप में 488 एनएम का चयन करें और छवि YFP के लिए उत्सर्जन फ़िल्टर के रूप में BP525/25। फ़ाइल आकार को कम करने के लिए 2x2 पर बिनिंग सेट करें.
  4. चैनल जोड़ें क्लिक करें और विधि के रूप में Brightfield का चयन करें.
  5. माप करने के लिए एक z-स्टैक confocal प्रतिदीप्ति छवि जोड़ने के लिए, कार्रवाई सूची के तहत 3 डी प्रतिदीप्ति अधिग्रहण चुनें। Select पर जाएं और Ch 1 चुनें। फ़ाइल आकार को कम करने के लिए, छवि संसाधन को अधिकतम पर सेट करें ताकि अधिकतम प्रोजेक्शन छवि पूर्ण z-स्टैक के बजाय सहेजी जा सके.
  6. BF/Ph अधिग्रहण | पर क्लिक करें | का चयन करें Brightfield चैनल के लिए Ch 2.
  7. प्ले बटन पर क्लिक करें (सही-इंगित त्रिकोण प्रतीक की तलाश करें) अनलोड वेल प्लेट्स के बगल में और माइक्रोस्कोप में 384-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
  8. 3D प्रतिदीप्ति अधिग्रहण के अंतर्गत, परीक्षण क्लिक करें और इष्टतम स्थानांतरण दूरी निर्धारित करने के लिए एक अच्छी तरह से युक्त कीड़े का चयन करें जिस पर कीड़े सही ढंग से केंद्रित हैं। आरोही दूरी को 50 μm पर सेट करें, -50 μm तक अवरोही दूरी, और z-स्टैक में जानवरों की पूरी मोटाई पर कब्जा करने के लिए स्लाइसिंग अंतराल को 2 μm पर स्लाइसिंग करें।
  9. संतृप्ति से बचने के दौरान सभी चार उपभेदों के लिए एक अच्छा संकेत तीव्रता प्राप्त करने के लिए एक्सपोज़र समय का अनुकूलन करें। सभी उपभेदों और समय बिंदुओं के लिए एक ही जोखिम समय का उपयोग करें।
  10. वेल प्लेट स्कैन सेटिंग के तहत इमेज किए जाने वाले कुओं का चयन करें। टाइल का चयन करें और पूरे अच्छी तरह से प्राप्त करें।
  11. मापन सेटिंग सहेजें और मापन प्रारंभ करें क्लिक करके प्रयोग प्रारंभ करें. बाद के समय बिंदुओं के लिए, एक ही माप सेटिंग खोलें और स्थानांतरण दूरी और कुओं को समायोजित करने के लिए छवि बनाई जा करने के लिए।

4. ImageJ में टाइल छवियों सिलाई

नोट:: यह चरण केवल 4x से बड़ा उद्देश्य का उपयोग करते समय आवश्यक है, जिसके लिए प्रत्येक कुएं की छवि एकाधिक टाइल्स के रूप में अधिग्रहित की जाती है। इस विश्लेषण वर्कफ़्लो में, टाइल्स की सिलाई मुफ्त सॉफ़्टवेयर FIJI/ImageJ19 (चित्रा 2) का उपयोग करके की जाती है। चरण 3 में उपयोग किए जाने वाले उपकरण के आधार पर, साथ के सॉफ़्टवेयर में सीधे सिलाई करना भी संभव हो सकता है।

  1. फिजी20 डाउनलोड करें और इसे खोलें।
  2. Plugins | पर जाएँ सिलाई | ग्रिड / संग्रह सिलाई21.
  3. पॉपअप विंडो में, ग्रिड/संग्रह सिलाई, उस प्रकार और क्रम का चयन करें जिसके द्वारा टाइल्स एकत्र की गई थीं। ग्रिड चुनें: पंक्ति-दर-पंक्ति और दाएँ और नीचे.
  4. अगली विंडो में, ग्रिड सिलाई: ग्रिड: पंक्ति-दर-पंक्ति, दाएँ और नीचे, x और y दिशाओं में टाइल्स की संख्या डालें। यहां उपयोग किए जाने वाले 10x उद्देश्य के लिए, ग्रिड आकार x के रूप में 2, ग्रिड आकार y के रूप में 3, और टाइल ओवरलैप के रूप में 0 चुनें।
  5. ब्राउज़ करें क्लिक करें और सिलाई करने के लिए TIFF छवियों वाले फ़ोल्डर का चयन करें.
  6. प्रत्येक फ़ाइल नाम में टाइल संख्या की स्थिति में {i} का उपयोग करते हुए, टाइल्स के लिए फ़ाइल नामों के अंतर्गत सामान्य फ़ाइल नाम सम्मिलित करें.
  7. नीचे दिए गए सभी बक्से को अनटिक करें।
  8. प्लगइन चलाएँ.
  9. अगले चरण में विश्लेषण के लिए परिणामस्वरूप छवियों को TIFF फ़ाइलों के रूप में सहेजें।

5. CellProfiler22 का उपयोग कर स्वचालित समावेशन गिनती

  1. डाउनलोड करें और ओपन-सोर्स छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर, CellProfiler23 स्थापित करें। github.com/sinnigelab/aggregate-quantification से InclusionCounting.cpproj पाइपलाइन डाउनलोड करें।
  2. CellProfiler खोलें और पाइपलाइन को यहाँ कोई पाइपलाइन फ़ाइल ड्रॉप विंडो में खींचें। प्रोजेक्ट लोड करने के लिए हाँ क्लिक करें.
  3. छवियाँ इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें और खिड़की ड्रॉप फ़ाइलें और फ़ोल्डर में सिले हुए छवियों को खींचें यहाँ.
  4. मेटाडेटा इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें। सिले हुए चित्रों के नामों के अनुसार फ़ाइल नाम से निकालने के लिए नियमित अभिव्यक्ति समायोजित करें.
  5. NamesandTypes इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें और समायोजित करें फ़ाइल नामों में चैनलों से मेल खाने के लिए नियम मानदंड का चयन करें।
    नोट:: पाइपलाइन की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स में, BF वाले फ़ाइल नामों को ब्राइटफ़ील्ड छवियों के रूप में पहचाना जाता है और इन्हें वर्म्स नाम दिया जाता है. YFP युक्त फ़ाइल नामों को प्रतिदीप्ति छवियों के रूप में पहचाना जाता है और उन्हें प्रतिदीप्ति नाम दिया जाता है।
  6. CellProfiler से आउटपुट को सहेजने के लिए डिफ़ॉल्ट फ़ोल्डर का चयन करने के लिए आउटपुट सेटिंग्स देखें पर क्लिक करें।
  7. पहले इमेजिंग डेटासेट का उपयोग करके पाइपलाइन की सेटिंग्स की जांच करने के लिए स्टार्ट टेस्ट मोड पर क्लिक करें। पाइपलाइन में सभी मॉड्यूल के माध्यम से चलाने के लिए भागो पर क्लिक करें या एक समय में पाइपलाइन एक मॉड्यूल के माध्यम से चलाने के लिए कदम उठाएं। EditObjectsManually मॉड्यूल में वर्म बाह्यरेखाओं को समायोजित करने के लिए, निर्देशों को देखने के लिए मदद पर क्लिक करें और पाइपलाइन चलाना जारी रखने के लिए पूर्ण पर क्लिक करें।
    नोट:: निकाले गए माप परीक्षण मोड में रहते हुए निर्यात नहीं किया जाएगा। कीड़े और समावेशन का पता लगाने के लिए थ्रेशोल्डिंग पैरामीटर को उपयोग किए जाने वाले उपभेदों और आवर्धन के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  8. Exit Test Mode और Analyze Images पर क्लिक करें।
  9. आउटपुट फ़ाइलों को देखने के लिए आउटपुट फ़ोल्डर खोलें। मूल फ़ाइल नाम के साथ छवियों को खोलें, इसके बाद रूपरेखा के बाद यह जांचने के लिए कि कीड़े और समावेशन सही ढंग से ओवरलेड थे या नहीं।
    नोट:: प्रति वर्म inclusions की संख्या विस्तारितWormObjects नाम की फ़ाइल में पाया जा सकता है। इनपुट छवियों के बारे में अधिक जानकारी छवि नाम की फ़ाइल में पाई जा सकती है। अतिरिक्त आउटपुट को पाइपलाइन में ExportToSpreadsheet मॉड्यूल में चुना जा सकता है।

6. AmyloFit5 का उपयोग कर शामिल गिनती डेटा की वैश्विक फिटिंग

नोट:: यह चरण केवल तभी किया जा सकता है जब एकाधिक प्रोटीन सांद्रता के लिए डेटा उपलब्ध हो. Q40-YFP के लिए, शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में overexpression के विभिन्न स्तरों के साथ चार उपभेदों का एक सेट पहले17 बनाया गया है। अन्य मामलों में, उपन्यास उपभेदों को प्लास्मिड माइक्रोइंजेक्शन और जीनोमिक एकीकरण24 का उपयोग करके उत्पन्न किया जाना चाहिए।

  1. एकत्रीकरण कैनेटीक्स AmyloFit25 के लिए मुफ्त ऑनलाइन फिटिंग मंच पर जाएं। या तो किसी मौजूदा खाते के साथ पंजीकृत करें या लॉग इन करें.
    नोट:: AmyloFit का उपयोग कैसे करें पर एक व्यापक मैनुअल अतिरिक्त मदद के लिए पहुँचा जा सकता है। अधिक जानकारी के लिए वेबपेज के ऊपरी-बाईं ओर (लॉगिन के बाद) लिंक देखें।
  2. AmyloFit का उपयोग शुरू करने के लिए, प्रोजेक्ट का नाम दें और प्रोजेक्ट बनाएँ पर क्लिक करें। प्रोजेक्ट को ओपन पर क्लिक करके खोलें और इसे एक नाम देकर और Create & Load Session पर क्लिक करके एक सत्र बनाएं।
  3. डेटा जोड़ें क्लिक करें और बाएँ पैनल में दिखाई गई डेटा स्वरूप आवश्यकताओं का पालन करते हुए, प्रति जानवर समावेशन की औसत संख्या वाली फ़ाइल अपलोड करें. नया डेटा लोड करें क्लिक करें.
  4. प्रीप्रोसेसिंग चरणों को छोड़ दें, जो शामिल करने के लिए आवश्यक नहीं हैं गिनती डेटा, शून्य-बिंदु ऑफसेट के लिए औसत से अधिक अंकों की संख्या और पठार से 0 के लिए औसत करने के लिए बिंदुओं की संख्या सेट करके। सबमिट करें क्लिक करें. प्रत्येक प्रोटीन एकाग्रता के लिए इस चरण को दोहराएँ (यानी, अपलोड की गई फ़ाइल में प्रत्येक स्तंभ)।
  5. मॉडल पैनल में कस्टम का चयन करें, समीकरण बॉक्स में Ncells * (1-exp(-Kcell * m **(n)*(t-1))) दर्ज करें और मॉडल लोड करें क्लिक करें।
    नोट: जैसा कि AmyloFit मूल रूप से इन विट्रो assays से गतिज डेटा के विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया था, एक कस्टम-निर्मित मॉडल को C. elegans के समावेशन गणना डेटा का विश्लेषण करने के लिए लोड किया जाना चाहिए। यहां उपयोग किए गए समीकरण में, एनकोशिकाएं उन कोशिकाओं की संख्या है जिनमें समावेशन गठन होता है, केसेल न्यूक्लिएशन दर स्थिर है, एम इंट्रासेल्युलर प्रोटीन एकाग्रता है, और एन न्यूक्लिएशन का प्रतिक्रिया क्रम है।
  6. पैरामीटर प्रकारों को Nकक्षों के लिए Global Const, Kकक्ष और n के लिए वैश्विक फ़िट, और m के लिए कॉन्स्ट पर सेट करें. शरीर की दीवार मांसपेशीकोशिकाओं के लिए 95 के लिए एन कोशिकाओं का मूल्य सेट करें और केसेल के लिए प्रारंभिक अनुमान और एन को 1। बाएं पैनल में विभिन्न उपभेदों के लिए m के मान दर्ज करें.
    नोट: प्रारंभिक अनुमान यहां उपयोग किए जाने वाले अपेक्षाकृत सरल मॉडल के लिए प्रासंगिक नहीं हैं। अधिक जटिल मॉडल के लिए, गणना समय को छोटा करने के लिए अपेक्षित मूल्यों का अनुमान दर्ज करना फायदेमंद है।
  7. बेसिन हॉप्स की संख्या अपरिवर्तित छोड़ दें और फिटिंग पैनल में फिट पर क्लिक करें।
  8. डाउनलोड डेटा और फ़िट पर क्लिक करके फ़िट निकालें.
    नोट:: मॉडल के वैश्विक फ़िट द्वारा निकाले गए पैरामीटर नीचे-दाएँ कोने में सूचीबद्ध किया जाएगा। डेटा और फिट का एक प्लॉट स्वचालित रूप से शीर्ष-दाएं पैनल में उत्पन्न हो जाएगा। इस प्लॉट को डाउनलोड पीडीएफ पर क्लिक करके निकाला जा सकता है और डिस्प्ले प्लॉट विकल्प पर जाकर अनुकूलित किया जा सकता है। Kसेल में अणुओं की इकाइयाँ होती हैं सांद्रता-n समय-1 सेल-1। विभिन्न n के साथ मूल्यों की तुलना करने के लिए, Kसेल को किसी दिए गए प्रोटीन एकाग्रता पर न्यूक्लिएशन दर में परिवर्तित किया जा सकता है, इसे mn के साथ गुणा करके।

Representative Results

यहां वर्णित विधि (चित्रा 1) का उपयोग एक निर्माण के एकत्रीकरण कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए किया गया था जिसमें वाईएफपी (Q40-YFP) से जुड़े 40 ग्लूटामाइन शामिल थे। प्रोटीन को UNC-54 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है, जो शरीर की दीवार की मांसपेशियों की कोशिकाओं में अभिव्यक्ति को चलाता है। चूंकि ये अपेक्षाकृत बड़े और कल्पना करने में आसान हैं, इसलिए इस ऊतक में Q40-YFP द्वारा गठित समावेशन को हल करने के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग पर्याप्त है। चार उपभेदों (लाइनों ए-डी) को पहले विवो17 में पॉलीक्यू एकत्रीकरण की एकाग्रता-निर्भरता का आकलन करने के लिए प्रोटीन को अलग-अलग हद तक व्यक्त करने के लिए विकसित किया गया था।

ए-डी लाइनों की आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी 2 एच अंडे-ले द्वारा उत्पन्न की गई थी, जिसके बाद संतान वयस्कता तक पहुंचने के बाद दैनिक हस्तांतरण हुआ। वयस्कता के दिन 1 से 10 तक, चार उपभेदों में से प्रत्येक से 20 जानवरों को एक उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 384-अच्छी तरह से प्लेट में चित्रित किया गया था। कुओं की छवियों को 6 टाइलों के रूप में अधिग्रहित किया गया था, जिन्हें इमेजजे21 (चित्रा 2) में एक प्लगइन का उपयोग करके एक साथ सिला गया था। सिले हुए चित्रों को बाद में प्रत्येक तनाव और समय बिंदु के लिए प्रति जानवर औसत समावेशन संख्या को मापने के लिए एक कस्टम-निर्मित CellProfiler22 पाइपलाइन (चित्रा 3) का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था।

डेटा को तब एमिलोफिट5 (चित्रा 4) में एक गणितीय मॉडल में फिट किया गया था। मॉडल इस धारणा पर आधारित है कि 95 शरीर की दीवार मांसपेशी कोशिकाओं में से प्रत्येक स्वतंत्र रूप से एक दर-सीमित न्यूक्लिएशन घटना द्वारा एक समावेश प्राप्त करता है, जिसके बाद तेजी से कुल वृद्धि17 होती है। फिट ने 9.9 × 105 अणुओं एम -2.1 डी -1 सेल -1 और 2.1 का प्रतिक्रिया क्रम का एक न्यूक्लिएशन दर स्थिरांक प्राप्त किया, जो 1 एमएम की इंट्रासेल्युलर प्रोटीन एकाग्रता पर 0.38 अणुओं डी -1 सेल -1 की न्यूक्लिएशन दर के अनुरूप है। दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों ने न्यूक्लिएशन दर और प्रतिक्रिया क्रम के लिए निकटता से संबंधित मूल्यों का नेतृत्व किया, जो एक समान प्रोटोकॉल17 (तालिका 1) का उपयोग करके पिछले अध्ययन के साथ समझौते में हैं।

Figure 1
चित्र 1: विधि का योजनाबद्ध अवलोकन। (A) आयु-सिंक्रनाइज़ C. elegans आबादी एक समयबद्ध अंडे-ले द्वारा उत्पन्न होती है। (बी) एक ही आबादी के जानवरों को अलग-अलग समय बिंदुओं पर 384-अच्छी तरह से प्लेट में चित्रित किया जाता है। (सी) टाइलों को पूरे कुओं की छवियों को बनाने के लिए एक साथ सिला जाता है, जिसका विश्लेषण सेलप्रोफाइलर में प्रति जानवर शामिल करने की संख्या को मापने के लिए किया जाता है। (डी) डेटा को एमिलोफिट का उपयोग करके गणितीय मॉडल में फिट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: प्लगइन ग्रिड/ संग्रह सिलाई21 का उपयोग कर ImageJ में सिलाई प्रक्रिया के स्क्रीनशॉट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: समावेशन संख्याओं को मापने के लिए CellProfiler पाइपलाइन की योजनाबद्ध। (A-C) ब्राइटफील्ड छवि (A) का उपयोग कीड़े (B, C में क्लोज़-अप) की पहचान करने के लिए किया जाता है। (D-G) प्रतिदीप्ति छवि (डी, ई में क्लोज-अप) का उपयोग समावेशन (एफ) की पहचान करने के लिए किया जाता है। कीड़े और समावेशन कुएं (जी) में प्रत्येक कीड़े के लिए समावेशन की संख्या प्रदान करने से संबंधित हैं। दिखाई गई छवियां Q40 लाइन की हैं वयस्कता के दिन 3 पर एक जानवर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एमाइलोफिट में एक गणितीय मॉडल के लिए डेटा को फिट करना। (ए) डेटा एमाइलोफिट पर अपलोड किए गए हैं। (बी) एक कस्टम समीकरण को मॉडल समावेशन गठन के लिए दर्ज किया जाता है, प्रत्येक सेल में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन घटनाओं को मानते हुए। (C) C. elegans लाइनों A-D के लिए एकत्रीकरण कैनेटीक्स की फिटिंग Q40-YFP के विभिन्न स्तरों को व्यक्त करती है। डेटा दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

डेटासेट 1 डेटासेट 2 Sinnige et al.17
n 2.1 1.9 1.6
Kसेल (अणु M-n d-1 सेल-1) 9.9 x 105 1.4 x 105 3.1 x 104
1 mM पर न्यूक्लिएशन दर (अणु d-1 सेल-1) 0.38 0.21 0.35

तालिका 1: न्यूक्लिएशन दर और Q40-YFP एकत्रीकरण के प्रतिक्रिया क्रम के मान। प्रोटोकॉल के दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृतियों के लिए डेटा और पहले प्रकाशित डेटा17 के साथ तुलना।

Discussion

यहां प्रस्तुत विधि मॉडल जीव सी एलिगन्स में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के एक निष्पक्ष और मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा प्रदान करती है। यह चार प्रमुख तत्वों (चित्रा 1) पर निर्भर करता है: 1) नेमाटोड की एक आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी को बनाए रखना; 2) मल्टीवेल प्लेटों में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी; 3) CellProfiler में स्वचालित समावेशन गिनती; 4) AmyloFit में डेटा फिटिंग. स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में या सहेजी गई छवियों से समावेशन की मैनुअल गिनती की तुलना में26, CellProfiler में परिमाणीकरण तेज और अधिक निष्पक्ष दोनों है। प्रोटोकॉल की अन्य महत्वपूर्ण प्रगति एकल टाइमपॉइंट्स के बजाय गतिज डेटा का अधिग्रहण है, जो डेटा को गणितीय मॉडल में फिट करने पर एकत्रीकरण तंत्र में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

प्रोटोकॉल के चार तत्वों को स्वतंत्र मॉड्यूल के रूप में उपयोग किया जा सकता है जिसे एप्लिकेशन के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। आयु-सिंक्रनाइज़ आबादी को जानवरों को निष्फल करने के लिए 5-फ्लोरो-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (एफयूडीआर) का उपयोग करके भी बनाए रखा जा सकता है। यह यौगिक जीवनकाल और प्रोटियोस्टैसिस24,25 को प्रभावित करता है और प्रयोगकर्ता के लिए अत्यधिक कार्सिनोजेनिक है; हालांकि, यह कीड़े के मैनुअल हस्तांतरण को रोकता है, जो बड़ी संख्या में नियंत्रित होने पर श्रम-गहन हो सकता है। अन्य विकल्प संतानों को अलग करने के लिए बाँझ उत्परिवर्ती29 या निस्पंदन उपकरणों का उपयोग कर रहे हैं30.

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी चरण को भी समायोजित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, न्यूरॉन्स में प्रोटीन एकत्रीकरण की निगरानी के लिए उच्च आवर्धन का उपयोग करना। वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी मांसपेशियों की कोशिकाओं में पॉलीक्यू एकत्रीकरण की निगरानी करने के लिए पर्याप्त हो सकती है जब स्थितियों के बीच सापेक्ष अंतर समावेशन की पूर्ण संख्या की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण होता है। CellProfiler पाइपलाइन का उपयोग अभी भी इन मामलों में किया जा सकता है, हालांकि कीड़े और समावेशन को पहचानने के लिए सेटिंग्स को उपयोगकर्ता द्वारा समायोजित करने की आवश्यकता होगी। तकनीक का थ्रूपुट वर्तमान में 384-अच्छी तरह से प्लेट में जानवरों के मैन्युअल पिकिंग की आवश्यकता से सीमित है। यह संभावित रूप से माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के उपयोग से ठीक किया जा सकताहै 16। सोडियम एज़ाइड एक अपेक्षाकृत कठोर संवेदनाहारी है, जिसे हाइड्रोजेल या मोतियों28,29 के साथ भौतिक स्थिरीकरण द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत एमाइलोफिट में विश्लेषण एक एकत्रीकरण तंत्र पर आधारित है जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाओं में स्वतंत्र न्यूक्लिएशन की घटनाएं शामिल हैं। उन मामलों में जहां यह मॉडल फिट नहीं होता है, उपयोगकर्ता को एक विकल्प पर विचार करना चाहिए जैसे कि सहकारी एकत्रीकरण मॉडल पहलेसे विकसित 17। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि विभिन्न सांद्रता में ब्याज के प्रोटीन को व्यक्त करने वाले उपभेदों को उपलब्ध होने की आवश्यकता होती है, हालांकि इन्हें नियमित सी एलिगेंस विधियों का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकताहै।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल एक इन विवो मॉडल सिस्टम में प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने का साधन प्रदान करता है, जिससे एकत्रीकरण तंत्र 17 के विस्तृत विश्लेषण की अनुमतिमिलती है। यद्यपि विधि को C. elegans मांसपेशी ऊतक में polyQ एकत्रीकरण के लिए प्रदर्शित किया गया था, प्रोटोकॉल के भविष्य के अनुप्रयोगों में अन्य प्रोटीन और ऊतक और प्रोटियोस्टैसिस कारकों और छोटे अणुओं के प्रभाव शामिल हो सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर सहायता के लिए सी एलिगन्स उपभेदों और एस्मेराल्डा बोसमैन के लिए मोरिमोतो प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं। इस काम को यूट्रेक्ट विश्वविद्यालय से टीएस को स्टार्ट-अप अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plate Greiner 781091 Black with flat clear bottom
AmyloFit Knowles lab v2.0 Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk
C. elegans Q40 line A Morimoto lab AM1228 Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]
C. elegans Q40 line B Morimoto lab AM1229 Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]
C. elegans Q40 line C Morimoto lab AM1230 Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]
C. elegans Q40 line D Morimoto lab AM1231 Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP]
CellProfiler Broad Institute 4.1.3 Downloaded from https://cellprofiler.org
E. coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50
FIJI Open-source (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/
High-throughput confocal microscope Yokogawa CellVoyager CV7000S
M9 buffer Home-made 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4
NGM plates Home-made  17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol
Pasteur pipette WU Mainz 250 To make worm pick, 150 mm length
Platinum iridium wire Alfa Aesar 39383 To make worm pick, 0.25 mm diameter
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Stereomicroscope Leica S9

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  2. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, amyloid formation, and human disease: a summary of progress over the last decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  3. Knowles, T. P. J., et al. An analytical solution to the kinetics of breakable filament assembly. Science. 326 (5959), 1533-1537 (2009).
  4. Cohen, S. I. A., et al. Proliferation of amyloid-β42 aggregates occurs through a secondary nucleation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9758-9763 (2013).
  5. Meisl, G., et al. Molecular mechanisms of protein aggregation from global fitting of kinetic models. Nature Protocols. 11 (2), 252-272 (2016).
  6. Satyal, S. H., et al. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5750-5755 (2000).
  7. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  8. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  9. Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).
  10. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14204-14209 (2011).
  11. Nollen, E. A. A. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  12. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  13. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9, 1-16 (2014).
  14. Calamini, B., et al. Small-molecule proteostasis regulators for protein conformational diseases. Nature Chemical Biology. 8 (2), 185-196 (2012).
  15. Sinnige, T., Stroobants, K., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Biophysical studies of protein misfolding and aggregation in in vivo models of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Quarterly Reviews of Biophysics. 49, 22 (2020).
  16. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  17. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 202188118 (2021).
  18. Brenner, S. Caenorhabditis elegans. Methods. 77 (1), 71-94 (1974).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. FIJI/ImageJ. , Available from: https://imagej.net/downloads (2012).
  21. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  22. Lamprecht, M. R., Sabatini, D. M., Carpenter, A. E. CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis. BioTechniques. 42 (1), 71-75 (2007).
  23. CellProfiler. Broad Institute. , Available from: https://cellprofiler.org/releases (2021).
  24. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  25. Knowles group, University of Cambridge. , Available from: https://amylofit.com/amylofitmain/login/ (2021).
  26. Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), (2021).
  27. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  28. Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing and Development. 141-142, 1-4 (2014).
  29. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biology. 8 (8), 47-48 (2010).
  30. Hunter, S., Maulik, M., Scerbak, C., Vayndorf, E., Taylor, B. E. Caenorhabditis sieve: A low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  31. Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
  32. Dong, L., et al. Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms. PLoS One. 13 (3), 0193989 (2018).

Tags

जैव रसायन अंक 178
निगरानी प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स <em>विवो में</em> स्वचालित शामिल <em>Caenorhabditis elegans</em> में गिनती का उपयोग कर
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Molenkamp, J., den Outer, A., van… More

Molenkamp, J., den Outer, A., van Schijndel, V., Sinnige, T. Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (178), e63365, doi:10.3791/63365 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter