여기에서, 선충류 예쁜꼬마선충에서의 단백질 응집 동역학의 분석을 위한 방법이 제시 된다. 연령 동기화 된 집단의 동물은 서로 다른 시점에서 이미지화되고 CellProfiler에서 반자동 포함 계수가 수행되고 AmyloFit의 수학적 모델에 적합합니다.
불용성 내포물로의 단백질 응집은 다양한 인간 질병의 특징이며, 그 중 많은 부분이 연령과 관련이 있습니다. 선충류 Caenorhabditis elegans 는 단백질 응집 및 독성을 연구하기 위해 현장에서 널리 사용 된 잘 정립 된 모델 유기체입니다. 그것의 광학적 투명도는 형광 현미경에 의한 단백질 응집의 직접적인 시각화를 가능하게 한다. 또한, 빠른 생식주기와 짧은 수명으로 인해 선충류는이 과정을 조절하는 유전자와 분자를 스크리닝하기에 적합한 모델입니다.
그러나, 살아있는 동물에서 응집체 부하의 정량화는 저조한 표준화되고, 전형적으로 단일 시점에서 형광 해부 현미경 하에서 수동 포접 계수에 의해 수행된다. 이 접근법은 관찰자 간의 높은 변동성을 초래할 수 있으며 집계 프로세스에 대한 이해를 제한합니다. 대조적으로, 시험관 내에서 아밀로이드-유사 단백질 응집은 고도로 정량적이고 시간-해결된 방식으로 티오플라빈 T 형광에 의해 일상적으로 모니터링된다.
여기에서, 살아있는 C. elegans에서 응집 동역학의 편향되지 않은 분석을 위해 맞춤형 이미지 분석 및 데이터 피팅과 결합 된 고처리량 공초점 현미경을 사용하여 유사한 방법이 제시됩니다. 이 방법의 적용 가능성은 체벽 근육 세포에서 형광 표지 폴리글루타민 (polyQ) 단백질의 포접 형성을 모니터링함으로써 입증됩니다. 이미지 분석 워크플로우를 통해 서로 다른 시점에서의 내포물 수를 결정할 수 있으며, 이는 개별 근육 세포의 독립적인 핵 형성 사건을 기반으로 한 수학적 모델에 적합합니다. 여기에 기재된 방법은 살아있는 동물에서 단백질 응집 질환에 대한 프로테오스타시스 인자 및 잠재적인 치료제의 효과를 강력하고 정량적인 방식으로 평가하는데 유용한 것으로 입증될 수 있다.
미스폴딩 된 단백질이 불용성 침전물로 축적되는 것은 광범위한 질병에서 발생합니다. 잘 알려진 예는 알츠하이머 병에서 아밀로이드 β과 타우의 응집, 파킨슨 병의 α 시누클레인, 헌팅턴병 1,2에서 확장 된 polyQ를 가진 헌팅틴입니다. 이들 폴리펩티드를 아밀로이드 피브릴로 잘못 폴딩하는 것은 여전히 크게 불분명한 메카니즘에 의한 독성 및 세포 사멸과 관련된다. 아밀로이드 형성의 메커니즘을 밝히는 것은 현재 사용할 수없는 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요합니다.
아밀로이드 형성에 대한 상세한 조사는 티오플라빈 T 형광 측정에 기초하여 시험관 내에서 수행되었으며, 응집 과정 및 억제 분자 3,4,5의 효과에 대한 기계론적 이해로 이어졌다. 그러나 살아있는 세포와 유기체의 복잡한 환경에서 동일한 응집 메커니즘이 사실인지 여부는 분명하지 않습니다. 선충류 Caenorhabditis elegans는 생체 내에서 단백질 응집을 연구하기에 적합한 모델 유기체입니다. 그것은 비교적 간단한 해부학을 가지고 있지만 근육, 장 및 신경계를 포함한 여러 조직으로 구성됩니다. 그것은 유전적으로 잘 특성화되어 있으며, 유전자 변형을위한 도구를 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한 ~ 3 일의 짧은 생성 시간과 2-3 주간의 총 수명을 가지고 있습니다. 따라서, 단백질 응집은 실험적으로 편리한 시간 척도로 동물의 수명에 걸쳐 검사될 수 있다. 마지막으로, 선충류는 광학적으로 투명하여 살아있는 동물에서 형광 표지 단백질의 응집을 추적 할 수 있습니다.
C. elegans의 이러한 특징은 헌팅턴 및 다른 polyQ 확장 질환에 대한 모델로서 polyQ 단백질의 응집을 조사하기 위해 이전에 악용되었습니다. 35-40개의 글루타민 잔기의 병원성 역치 이상에서, 황색 형광 단백질(YFP)로 표지된 폴리Q 단백질은 근육 조직6,7, 뉴런8, 및 장 9,10에 불용성 내포물을 형성하는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 특징들은 단백질 응집 및 독성의 유전자(11,12,13) 및 소분자 개질제(14)를 스크리닝하는데 널리 사용되어 왔다.
C. elegans는 단백질 응집에 대한 시험관내 연구와 마우스15와 같은보다 복잡한 질병 모델 사이의 격차를 해소하는 데 중요한 역할을 할 잠재력을 가지고 있습니다. C. 엘레간은 약물 스크리닝16에 순응할 수 있지만, 최근17에서 입증된 바와 같이 생체내에서 단백질 응집의 분자 메카니즘에 대한 근본적인 이해를 얻기 위해 또한 이용될 수 있다. 그러나, 두 가지 용도 모두에서, 단백질 응집의 정량적 및 재현 가능한 측정을 추출하는 것이 가장 중요하다. 여기서 이는 전용 이미지 분석 파이프라인과 결합된 고처리량 공초점 현미경을 사용하여 달성됩니다(그림 1).
본원에 제시된 방법은 모델 유기체 C. elegans에서 단백질 응집 동역학의 편향되지 않은 정량적 분석을 용이하게 한다. 그것은 네 가지 핵심 요소에 달려 있습니다 (그림 1) : 1) 선충류의 연령 동기화 된 개체군을 유지; 2) 멀티웰 플레이트에서의 형광 현미경 검사; 3) CellProfiler에서 자동 포함 계수; 4) AmyloFit의 데이터 피팅. 자유롭게 움직이는 동물 또는 저장된 이미지26에서 내포물의 수동 계산과 비교할 때, CellProfiler의 정량화는 더 빠르고 편향되지 않습니다. 프로토콜의 또 다른 주요 발전은 단일 시간점이 아닌 운동 데이터를 획득하는 것이며, 이는 데이터를 수학적 모델에 피팅 할 때 집계 메커니즘에 대한 양적 통찰력을 제공합니다.
프로토콜의 네 가지 요소는 응용 프로그램에 따라 수정할 수있는 독립적 인 모듈로 사용할 수 있습니다. 연령-동기화된 개체군은 또한 동물을 살균하기 위해 5-플루오로-2′-데옥시우리딘(FUDR)을 사용하여 유지될 수 있다. 이 화합물은 수명 및 프로테오스타시스24,25에 영향을 미치며 실험자에게 발암성이 매우 높습니다. 그러나 많은 수의 웜을 처리 할 때 노동 집약적 일 수있는 웜의 수동 전송을 배제합니다. 다른 대안은 자손(30)을 분리하기 위해 멸균 돌연변이체(29) 또는 여과 장치를 사용하는 것이다.
형광 현미경 검사 단계는 또한 예를 들어, 뉴런에서 단백질 응집을 모니터링하기 위해 더 높은 배율을 사용하여 조정될 수 있다. 와이드필드 현미경 검사는 조건 간의 상대적 차이가 절대 내포물의 수보다 더 중요할 때 근육 세포에서 polyQ 응집을 모니터링하기에 충분할 수 있다. 이러한 경우에도 CellProfiler 파이프라인을 계속 사용할 수 있지만 사용자가 웜 및 포함을 인식하는 설정을 조정해야 합니다. 이 기술의 처리량은 현재 384-웰 플레이트 내로 동물을 수동으로 채취해야 할 필요성에 의해 제한됩니다. 이것은 잠재적으로 미세유체 장치(16)의 사용에 의해 해결될 수 있다. 나트륨 아지드는 상대적으로 가혹한 마취제이며, 이는 하이드로겔 또는 비드28,29로 물리적 고정화로 대체될 수 있다.
여기에 제시된 AmyloFit의 분석은 개별 세포에서 독립적 인 핵 형성 사건으로 구성된 응집 메커니즘을 기반으로합니다. 이 모델이 적합하지 않은 경우, 사용자는 이전에 개발된17개의 협동 집계 모델과 같은 대안을 고려해야 한다. 이 접근법의 한계는 상이한 농도에서 관심있는 단백질을 발현하는 균주가 이용가능할 필요가 있지만, 이들은 일상적인 C. elegans 방법(24)을 사용하여 생성될 수 있다는 것이다.
전체적으로, 이 프로토콜은 생체내 모델 시스템에서 단백질 응집 동역학에 대한 고품질 데이터를 획득하는 수단을 제공하며, 응집 메커니즘(17)의 상세한 분석을 가능하게 한다. 이 방법이 C. elegans 근육 조직에서의 polyQ 응집에 대해 입증되었지만, 프로토콜의 향후 적용은 다른 단백질 및 조직 및 프로테오스타시스 인자 및 소분자의 효과를 포함할 수 있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 C. elegans 균주에 대한 Morimoto 실험실과 높은 처리량의 공초점 현미경에 대한 도움을 주신 Esmeralda Bosman에게 감사드립니다. 이 작품은 위트레흐트 대학에서 T.S.에 대한 창업 보조금으로 자금을 지원받았습니다.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |