Burada, nematod Caenorhabditis elegans’ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler’da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit’teki matematiksel bir modele uyar.
Çözünmeyen inklüzyonlara protein agregasyonu, çoğu yaşa bağlı olan çeşitli insan hastalıklarının bir işaretidir. Nematod, Caenorhabditis elegans , protein agregasyonu ve toksisitesini incelemek için alanda yaygın olarak kullanılan köklü bir model organizmadır. Optik şeffaflığı, floresan mikroskobu ile protein agregasyonunun doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Dahası, hızlı üreme döngüsü ve kısa ömür, nematodu bu süreci modüle eden genleri ve molekülleri taramak için uygun bir model haline getirir.
Bununla birlikte, canlı hayvanlarda agrega yükünün miktarı, tipik olarak tek bir zaman noktasında bir floresan diseksiyon mikroskobu altında manuel dahil etme sayımı ile gerçekleştirilen zayıf bir şekilde standartlaştırılmıştır. Bu yaklaşım, gözlemciler arasında yüksek değişkenliğe neden olabilir ve toplama işleminin anlaşılmasını sınırlar. Buna karşılık, in vitro amiloid benzeri protein agregasyonu, tioflavin T floresansı tarafından oldukça kantitatif ve zamanla çözülmüş bir şekilde rutin olarak izlenir.
Burada, ısmarlama görüntü analizi ve veri uydurma ile birleştirilmiş yüksek verimli bir konfokal mikroskop kullanarak, canlı C. elegans’ta toplama kinetiğinin tarafsız analizi için benzer bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntemin uygulanabilirliği, vücut duvarı kas hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş bir poliglutamin (poliQ) proteininin dahil edilme oluşumunun izlenmesiyle gösterilmiştir. Görüntü analizi iş akışı, bireysel kas hücrelerindeki bağımsız çekirdeklenme olaylarına dayanan matematiksel bir modele takılan farklı zaman noktalarındaki kapanım sayılarının belirlenmesini sağlar. Burada açıklanan yöntem, canlı bir hayvanda proteostaz faktörlerinin ve protein agregasyon hastalıkları için potansiyel terapötiklerin etkilerini sağlam ve nicel bir şekilde değerlendirmek için yararlı olabilir.
Yanlış katlanmış proteinlerin çözünmeyen birikintilere birikmesi, çok çeşitli hastalıklarda ortaya çıkar. İyi bilinen örnekler, Alzheimer hastalığında amiloid-β ve tau’nun, Parkinson hastalığında α-sinükleinin ve Huntington hastalığında genişlemiş poliQ ile huntingtin’in agregasyonudur 1,2. Bu polipeptitlerin amiloid fibrillere yanlış katlanması, hala büyük ölçüde belirsiz olan mekanizmalar tarafından toksisite ve hücre ölümü ile ilişkilidir. Amiloid oluşum mekanizmalarının aydınlatılması, şu anda kullanılamayan etkili tedavilerin geliştirilmesi için çok önemli olacaktır.
Amiloid oluşumunun ayrıntılı araştırmaları, tiyoflavin T floresan ölçümlerine dayanarak in vitro olarak gerçekleştirilmiş ve agregasyon işleminin mekanik bir şekilde anlaşılmasına ve inhibitör moleküllerin etkisine yol açmıştır 3,4,5. Bununla birlikte, aynı toplama mekanizmalarının canlı hücrelerin ve organizmaların karmaşık ortamında geçerli olup olmadığı açık değildir. Nematod solucanı Caenorhabditis elegans, protein agregasyonunu in vivo olarak incelemek için uygun bir model organizmadır. Nispeten basit bir anatomiye sahiptir, ancak kas, bağırsak ve sinir sistemi dahil olmak üzere birden fazla dokudan oluşur. Genetik olarak iyi karakterize edilmiştir ve genetik modifikasyon için araçlar kolayca mevcuttur. Ayrıca, ~ 3 günlük kısa bir üretim süresine ve toplam 2-3 haftalık bir ömre sahiptir. Bu nedenle, protein agregasyonu, hayvanın ömrü boyunca deneysel olarak uygun bir zaman ölçeğinde incelenebilir. Son olarak, nematod optik olarak şeffaftır ve canlı hayvanlarda floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin toplanmasının izlenmesini sağlar.
C. elegans’ın bu özellikleri daha önce Huntington ve diğer poliQ genişleme hastalıkları için bir model olarak poliQ proteinlerinin toplanmasını araştırmak için kullanılmıştır. 35-40 glutamin kalıntısının patojenik eşiğinin üstünde, sarı floresan protein (YFP) ile etiketlenmiş poliQ proteinlerinin, kas dokusunda6,7, nöronlar 8 ve bağırsak 9,10’da çözünmez inklüzyonlar oluşturduğu gözlenebilir. Bu özellikler, protein agregasyonu ve toksisitesinin 11,12,13 genlerini ve küçük moleküllü değiştiricileri 14’ü taramak için yaygın olarak kullanılmıştır.
C. elegans , protein agregasyonunun in vitro çalışmaları ile fareler15 gibi daha karmaşık hastalık modelleri arasındaki boşluğu kapatmada önemli bir rol oynama potansiyeline sahiptir. C. elegans , ilaç taraması16’ya uygundur, ancak yakın zamanda gösterildiği gibi, in vivo protein agregasyonunun moleküler mekanizmalarının temel bir anlayışını elde etmek için de kullanılabilir.17. Bununla birlikte, her iki uygulama için, protein agregasyonunun nicel ve tekrarlanabilir bir ölçüsünü çıkarmak çok önemlidir. Burada bu, özel bir görüntü analizi boru hattı ile birleştirilmiş yüksek verimli bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir (Şekil 1).
Burada sunulan yöntem, model organizma C. elegans’taki protein agregasyon kinetiğinin tarafsız ve nicel bir analizini kolaylaştırır. Dört temel unsura bağlıdır (Şekil 1): 1) yaş senkronize bir nematod popülasyonunu korumak; 2) çok kuyulu plakalarda floresan mikroskopi; 3) CellProfiler’da otomatik dahil etme sayımı; 4) AmyloFit’te veri sığdırma. Serbestçe hareket eden hayvanlarda veya kaydedilmiş görüntülerden26 inklüzyonların manuel olarak sayılmasıyla karşılaştırıldığında, CellProfiler’daki niceleme hem daha hızlı hem de daha tarafsızdır. Protokolün diğer önemli ilerlemesi, verileri matematiksel bir modele uydurduktan sonra toplama mekanizmasına nicel içgörüler sağlayan tek zaman noktaları yerine kinetik verilerin elde edilmesidir.
Protokolün dört elemanı, uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilen bağımsız modüller olarak kullanılabilir. Yaş senkronize popülasyonlar, hayvanları sterilize etmek için 5-floro-2′-deoksiüridin (FUDR) kullanılarak da korunabilir. Bu bileşik ömrü ve proteostazı24,25 etkiler ve deneyci için oldukça kanserojendir; Bununla birlikte, solucanların manuel transferini engeller, bu da çok sayıda işlendiğinde emek yoğun olabilir. Diğer alternatifler, yavruları ayırmak için steril mutantların29 veya filtrasyon cihazlarınınkullanılmasıdır 30.
Floresan mikroskobu adımı, örneğin nöronlardaki protein agregasyonunu izlemek için daha yüksek büyütmeler kullanılarak da ayarlanabilir. Geniş alan mikroskopisi, koşullar arasındaki nispi farkın mutlak inklüzyon sayılarından daha önemli olduğu durumlarda kas hücrelerinde poliQ agregasyonunu izlemek için yeterli olabilir. CellProfiler ardışık düzeni bu durumlarda hala kullanılabilir, ancak solucanları ve eklemeleri tanıma ayarlarının kullanıcı tarafından ayarlanması gerekir. Tekniğin verimi şu anda hayvanların 384 kuyucuklu plakaya manuel olarak toplanması ihtiyacı ile sınırlıdır. Bu, mikroakışkan cihazların kullanımıyla potansiyel olarak düzeltilebilir16. Sodyum azid, hidrojeller veya boncuklarla fiziksel immobilizasyon ile değiştirilebilen nispeten sert bir anesteziktir28,29.
Burada sunulan AmyloFit’teki analiz, bireysel hücrelerdeki bağımsız çekirdeklenme olaylarından oluşan bir toplama mekanizmasına dayanmaktadır. Bu modelin uymadığı durumlarda, kullanıcı daha önce geliştirilen kooperatif toplama modeli gibi bir alternatif düşünmelidir17. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, ilgilenilen proteini farklı konsantrasyonlarda ifade eden suşların mevcut olması gerektiğidir, ancak bunlar rutin C. elegans yöntemleri24 kullanılarak üretilebilir.
Toplamda, bu protokol, in vivo model bir sistemde protein toplama kinetiği için yüksek kaliteli veriler elde etmek için araçlar sağlar ve toplama mekanizmalarının ayrıntılı analizine izin verir17. Yöntem, C. elegans kas dokusunda poliQ agregasyonu için gösterilmiş olmasına rağmen, protokolün gelecekteki uygulamaları diğer proteinleri ve dokuları ve proteostaz faktörlerinin ve küçük moleküllerin etkilerini içerebilir.
The authors have nothing to disclose.
C. elegans suşları için Morimoto laboratuvarına ve yüksek verimli konfokal mikroskop konusundaki yardımları için Esmeralda Bosman’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Utrecht Üniversitesi’nden T.S.’ye bir start-up hibesi ile finanse edildi.
384-well plate | Greiner | 781091 | Black with flat clear bottom |
AmyloFit | Knowles lab | v2.0 | Access at www.amylofit.ch.cam.ac.uk |
C. elegans Q40 line A | Morimoto lab | AM1228 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line B | Morimoto lab | AM1229 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line C | Morimoto lab | AM1230 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
C. elegans Q40 line D | Morimoto lab | AM1231 | Genotype rmIs404[unc-54p::Q40::YFP] |
CellProfiler | Broad Institute | 4.1.3 | Downloaded from https://cellprofiler.org |
E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
FIJI | Open-source | (Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j | Downloaded from https://imagej.net/software/fiji/ |
High-throughput confocal microscope | Yokogawa | CellVoyager CV8000 | |
M9 buffer | Home-made | 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgSO4 | |
NGM plates | Home-made | 17 g/L agar, 2.5 g/L bacto-peptone, 3 g/L NaCl, 25 mM KPO4 buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 5 mg/L cholesterol | |
Pasteur pipette | WU Mainz | 250 | To make worm pick, 150 mm length |
Platinum iridium wire | Alfa Aesar | 39383 | To make worm pick, 0.25 mm diameter |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Stereomicroscope | Leica | S9 |