一种重力喂养的经心灌注方法，用于小鼠中枢神经系统的组织学分析

Summary

提出了一种用于小鼠中枢神经系统组织学分析的方便的重力喂养灌注方法。磷酸化α突触核蛋白的免疫荧光检测在帕金森病的小鼠模型中得到证明。这项工作还全面描述了经心肌灌注，解剖，组织冷冻/包埋和冷冻切片步骤。

Abstract

从小鼠中分离的脑和脊髓标本的组织学分析是该模型系统中病理学评估的常见做法。为了维持这些脆弱组织的形态，常规通过麻醉动物的心脏插管（输血）给予化学固定剂，如多聚甲醛。传统上，小鼠心脏的经心灌注依赖于使用蠕动泵或气压来提供该过程所需的盐水和固定剂溶液。作为这些方法的易于获得的替代方案，这项工作演示了使用重力进给灌注剂输送方法的使用，该方法使用大多数五金店中可用的材料。

为了验证这种新的灌注方法，这项工作演示了在大脑和脊髓中灵敏检测磷酸化α突触核蛋白所需的所有后续步骤。这些步骤包括解剖固定的脑和脊髓组织，快速冷冻/包埋和冷冻切片以及免疫荧光染色。由于该方法导致固定剂的全身递送，因此它也可用于制备用于组织学分析的其他非神经元组织。

Introduction

小鼠中枢神经系统（CNS）病理学的组织学表征是神经变性研究中使用的常规技术。由于神经元组织在死亡后迅速降解，通常的做法是将化学固定剂（如多聚甲醛）递送到中枢神经系统组织以保持其形态^1，2。化学固定可以通过用固定溶液进行全身灌注或通过分离组织并将其浸入固定溶液（称为“滴固定”）来进行。灌注是固定给药的首选方法，因为滴注可能不允许固定溶液快速渗透到深部CNS结构^3，4，5中。此外，由于难以从脊柱中移除未固定的脊髓，因此通过灌注输送固定溶液允许 原位 保存脊髓微观和大体解剖结构，并使组织变硬以尽量减少移除过程中的损伤。

固定所需的缓冲液和固定剂溶液的输送通常使用市售泵或气压进行。由于以下原因，灌注液的重力输送可以作为泵输送的替代方案：（1）泵或气压输送在某些情况下可能需要用户在整个灌注过程中手动维持系统中的压力。灌注液的重力输送可以在没有用户干预的情况下保持。（2）通过从标准科学供应商处获得材料，可以以低成本为用户建造重力输送的灌注物装置。这项工作描述了如何使用清洗瓶和乙烯基管构建简单的重力灌注装置。使用帕金森病的小鼠模型，这项工作证明了该系统在分离大脑和脊髓组织进行冷冻切片之前灌注大脑和脊髓组织的功效。这项工作全面描述了从动物中解剖固定组织所需的所有步骤，技术和材料，快速冷冻/包埋和冷冻组织，并通过间接免疫荧光显微镜检测大脑和脊髓中磷酸化α突触核蛋白的存在。

Protocol

该方案中呈现的数据和实验步骤是使用C57BL / 6J小鼠生成的。所有涉及动物的方法均已获得纽约州立大学上州医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1.灌注装置及解剖平台的搭建

1. 如图 1 所示，用锋利的剃须刀刀片将两个 500 mL 清洗瓶冲洗到旋入式瓶盖的内侧，从而修剪两个 500 mL 清洗瓶中的内吸管。在每个缓冲瓶的底部切一个4厘米x 4厘米的正方形孔。在每个瓶子的底部切一个小孔，以允许弯曲的不锈钢微孔通过。
2. 在微瓣上创建一个“S”形弯曲，以便它们可以用作悬挂缓冲瓶的钩子。将弯曲的微瓣插入缓冲瓶中的适当开口。
3. 切割两根 25 厘米长的管子，并将其与外瓶吸管出口紧密连接。将这些管的末端与 Y 形连接器连接在一起。切割 2 m 的管子，并将其连接到 Y 形连接器的自由端。
4. 从1 mL注射器上取下柱塞，并将注射器切开距离注射器尖端约6厘米处。首先用剃须刀片划伤塑料，然后急剧折断注射器塑料，从而切割注射器。
5. 将注射器的切割面插入塑料管的自由端。插入到足够深度以确保密封牢固。
   注意：灌注装置内的所有连接必须足够紧密以避免泄漏，这一点很重要。在连接松动的情况下，可以根据需要在连接处放置和拧紧小的不锈钢软管夹，以确保必要时紧密密封。
6. 将一个缓冲瓶标记为 PFA ，将一个瓶子标记为 PBS （缓冲液）。测量距离瓶子开口长度的大约1/^3rd ，并在此时在瓶子周长周围画一条线，以表示灌注液溶液的适当填充水平。
7. 拉直，然后在大回形针中创建一个环，该回形针可以绕在管子的圆周周围。将此环围绕管子放置在注射器的近端。
8. 将适当大小的聚苯乙烯泡沫块放入玻璃托盘中。将回形针的末端放入聚苯乙烯泡沫块中以固定管子。
9. 使用纸巾，将玻璃托盘的前端抬高约2厘米。
   注意：这会将鼠标置于特伦德伦堡位置的大约20°（向后倾斜），以便在解剖过程中更容易地观察隔膜，并鼓励灌注期间液体的引流。

图1：描绘组装的灌注装置的示意图。 缩写：PBS =磷酸盐缓冲盐水;PFA = 多聚甲醛。 请点击此处查看此图的大图。

2. 多聚甲醛（PFA）溶液的制备

注意：PFA溶液必须在灌注当天新鲜制备，并在灌注结束时丢弃在指定的废物容器中，然后由训练有素的人员进行处置。该方案产生1L的4%PFA溶液，足以灌注约4只小鼠。PFA具有高毒性，必须注意避免吸入或直接接触粉末状或液体形式的皮肤。因此，大多数准备步骤都是在戴手套，防护镜和通风橱下的实验室外套的情况下进行的。

1. 使用蒸馏水冲洗1升烧杯，并注入约800毫升18 mΩ分子生物学级H₂O。
2. 在微波炉中加热H₂O的烧杯3分钟或直到水温达到65°C。 放在保持在通风橱中的加热/搅拌板上。
3. 用蒸馏水冲洗搅拌棒，并将其放入热水中。启动搅拌器，将热板调至中火。确保水温不超过70°C。
4. 戴上外科口罩，手套，护目镜和实验室外套，并测量40克PFA粉末。将这种粉末倒入热水中。
5. 使用转移移液器，向溶液中加入几滴5M NaOH。让PFA粉末完全溶解。如果粉末在几分钟后尚未完全溶解，请根据需要加入5 M NaOH的滴剂。
6. 一旦几乎所有的PFA都溶解了（看起来有点浑浊），停止搅拌/加热，并立即加入100毫升10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。最后，使用18 mΩ分子生物学级H₂O将水加满烧杯上的1 L标记，用保鲜膜盖住烧杯并将其置于-20°C冰箱中，直到溶液达到室温（约45分钟）。
7. 使用适当的标准品校准pH计。当烧杯在搅拌板上时，测量溶液的pH值并加入HCl，直到pH值达到7.4。如有必要，如果pH值太低，则加入5M NaOH以增加pH值。
8. 将真空瓶连接到真空瓶，并在烧瓶中放置一个带有滤纸的干净的陶瓷布希纳漏斗。打开真空，使用装有4%PFA溶液的转印移液管润湿滤纸。
9. 将4%PFA溶液缓慢倒入滤纸上，直到所有溶液都被过滤。
10. 将过滤后的溶液转移到清洁，避光的容器中，并将其储存在4°C直至使用（储存不超过24小时）。

3. 经心“无泵”灌注

1. 在通风橱中，将聚苯乙烯泡沫塑料解剖块放入玻璃托盘中。确保解剖块有5-6根短针用于在手术过程中抑制小鼠，2根长针用于支撑灌注管。
2. 使用蒸馏水冲洗灌注装置。在悬挂灌注装置之前，让所有水排出。将灌注瓶悬挂在灌注动物上方1米处（对于20-30克小鼠）。
3. 使用10x PBS用18 mΩ分子生物学级H₂O稀释的1x PBS制备1x PBS的非无菌溶液。
4. 如图 2所示，使用止血器夹紧灌注装置的主线。用另一种止血剂钳夹住PFA线。
   注意：每条生产线可能需要使用多个止血器进行闭塞，以完全防止血流。
5. 在室温下用1x PBS填充 缓冲 容器。
6. 将灌注装置的注射器端放在烧杯中以收集废物缓冲液并除去阻塞主线的止血器（图2，左）。
7. 允许PBS流过管路，同时通过用力敲击管壁来去除滞留的空气。
8. 一旦所有空气都从缓冲液和主管线上除去，通过在主管线上放置止血器来阻塞流动。
9. 从PFA管路中取出止血剂，让PBS以逆行方式流向PFA瓶，同时敲除PFA管线中的任何气泡（图2，中间）。继续允许PBS进入PFA管路，直到在瓶子开口的正上方可以看到PBS。用止血剂封闭PFA管路，以阻止流入PFA瓶。
10. 将蝴蝶输液针头连接到灌注注射器，并通过管路冲洗PBS（通过打开主线止血器）以清除灌注注射器中的气泡。关闭主线止血剂。
11. 确保PBS瓶现在大约是PBS的1/3^。 如有必要，通过主管线冲洗PBS或将更多PBS灌装到缓冲瓶中，直到其全部^容量的1 /3。
12. 从PBS，PFA和主管道中除去所有气泡后，在室温下用4%的PFA溶液填充PFA瓶，直到瓶子上的黑色标记（大约1/3^次 满）（图2，右）。

图2：用于灌注手术的灌注装置的制备。 首先，关闭PFA线止血器，打开PBS线和主线上的止血剂。填充 PBS 并从 PBS 线路和主线路中移除气泡。接下来，通过打开PFA线上的止血剂并关闭主线上的止血剂来填充PBS线。去除 PFA 管路中的气泡。最后，当PBS到达PFA瓶的开口时，关闭PFA线上的止血剂。将PFA瓶1/3^装满 PFA。确保PBS瓶中的PBS水平为1/3^， 并在必要时通过打开主线止血器填充PBS或排出PBS。缩写：PBS =磷酸盐缓冲盐水;PFA = 多聚甲醛。 请点击此处查看此图的大图。

13. 通过用水和70%乙醇清洁以下器械来准备非生存手术：大剪刀，细解剖剪刀，皮钳，细开窗弯曲镊子。
14. 通过将无尘湿巾放入50 mL锥形管中来准备麻醉。在通风橱中，用异氟醚彻底浸泡无尘湿巾，并将打开的管倒置在500 mL烧杯中。确保烧杯底部没有液体异氟醚，并在将小鼠放入烧杯之前丢弃任何液体异氟醚。
15. 将鼠标放入烧杯中，并将保鲜膜放在开口处以开始麻醉。
16. 进行麻醉，直到小鼠停止呼吸（约1分钟和30秒）。
17. 呼吸停止后，立即从烧杯中取出鼠标，并更换50 mL锥形管上的盖子。
18. 检查鼠标是否通过使用脚趾捏合反射充分麻醉。如果动物未充分麻醉，则施用更多异氟醚，如步骤3.15所述。
19. 快速工作，将鼠标放在聚苯乙烯泡沫块上，并使用四根短针头（例如，22 G注射器针头）将爪子向外固定。
20. 用皮钳抬起腹部皮肤，用大剪刀切穿腹壁。确保没有腹部器官被切开！
21. 继续腹部切口上部朝向肝脏。将肝脏从前腹壁上分离，并继续将初始切口上部朝向膈肌。将此切口停在距离横膈膜约1厘米处。注意确保肝脏不被割伤！
22. 继续将初始切口横向向上朝向隔膜的右侧和左侧，以形成“Y”形切口（图3A）。
23. 当切口到达横膈膜时，用细解剖剪刀在隔膜上开一个洞，切穿动物右侧的肋骨。将肋骨切开到右腋窝的大约一半。
24. 通过隔膜的左侧几乎一直到左腋窝做一个类似但更长的切口。
25. 反射胸壁并将其固定在聚苯乙烯泡沫块上。
26. 如有必要，从心脏周围切除脂肪以暴露左心室。与右心室相比，根据相对较浅的颜色来识别左心室。
27. 识别左心室后，用细弯曲的镊子用轻压保持心脏稳定。打开主线止血器，让PBS流过针头。立即刺穿左心室，并确保针头插入心室不超过0.5厘米。如有必要，请稍微拔出针头。
    注意：针头在左心室的准确放置通过血液逆行流入针管来指示。重要的是要确保针头不会太深地插入心室。这可能导致逆行流经肺静脉或刺穿室间隔。
28. 将蝴蝶管放在用聚苯乙烯泡沫塑料制成的 X 上，使用两个大的18 G针。
    注意：这是至关重要的，因为它可以避免在灌注过程中蝴蝶针在心脏内移动。
29. 识别下腔静脉离开肝脏时使用细切开剪刀进行横切（图3B）。或者，用剪刀打开右心房。
30. 立即打开主线以允许PBS灌注开始（图3C）。
31. 确保PBS正在从聚苯乙烯泡沫块中排出并进入下面的玻璃托盘。如果没有发生这种情况，请重新调整托盘或聚苯乙烯泡沫块的角度，以允许将液体排入玻璃托盘。
32. 继续PBS灌注，直到流出下腔静脉的液体无血（约3分钟）。
    注意：在心脏中正确放置针头将导致肝脏血液的视觉清除，血液将从红色变为稻草色。如果没有发生这种情况，可以通过在左心室内重新定位输液针来补救。可以在腹侧尾部基部做一个小切口，以评估灌注的质量。适当的灌注将导致从尾基切口流出清晰的PBS。
33. 快速工作，用止血剂阻塞PBS管线并打开PFA管。
34. 让PFA灌注几分钟，直到尾巴开始卷曲。一旦尾巴开始卷曲，开始50分钟的计时器。如果PFA灌注5分钟后尾巴没有卷曲，开始50分钟的PFA灌注计时器。
35. 在整个灌注过程中持续监测瓶中的PFA水平，以确保水平不会下降得太低。如果液位低于瓶盖上方 2 厘米，则在瓶中填充更多 PFA。

图3：描绘经心灌注的图表。（A）首先切开腹壁，然后向腋窝切开两个横向指向的切口，形成“Y”。（B）进入胸腔并暴露心脏后，针头进入左心室。接下来，将IVC或右心房横切，以允许灌注物在体内循环后引流。IVC的切割优于隔膜。（三）灌注液的施用程序。缩写 = IVC = 下腔静脉。请点击此处查看此图的大图。

35. 50分钟后，用止血剂阻塞主线，并将针头从左心室取出。
    注意：此时整个小鼠是僵硬的，现在可以在4°C下放置在4%PFA的标记容器中过夜。 在这个阶段，可以解剖出CNS组织并将其单独置于固定剂中过夜。在这项工作中，将整个小鼠置于固定剂中，因为这缩短了在4°C下固定和放置之间的间隔。 这也避免了在过夜固定完成之前预先解剖动物时可能发生的任何可能的神经组织机械变形。

4. 中枢神经系统解剖

1. 通过用水冲洗然后用70%乙醇清洗来准备以下用于解剖的仪器：剪刀，皮钳，弯曲的开窗镊子，弯曲的细镊子，直的细镊子，细剪刀。
2. 按如下方式标记每只小鼠四个管子，并填充无菌的20%蔗糖：小鼠ID， 大脑1，小鼠ID， 大脑2，小鼠ID， 腰椎，小鼠ID， 宫颈。
3. 从PFA溶液中取出鼠标，并用纸巾将其吸干以除去多余的PFA。
4. 使用大剪刀，通过切脖子来取下鼠标头。
5. 将身体放入PFA溶液中。保留头部以从颅骨中解剖大脑。
6. 为了剖解大脑，首先将颅骨皮肤向前反射以暴露整个颅骨（图4A）。
7. 使用细解剖剪刀在耳道上进行浅切口，以进入颅骨
8. 沿着横窦继续这个切口，直到颅骨在两个听道之间一直切开。
9. 沿着纵裂垂直于前一个切口，一直到颅骨最隆起的部分（大约在眼睛之间）。
10. 使用开窗弯曲的镊子，横向反射颅骨以暴露前脑。继续切除颅骨，直到整个前脑（包括嗅球）暴露出来。
11. 通过切开枕骨并开始切开颅骨的尾部区域，然后慢慢地继续向大孔切开。
12. 横向反射两块颅骨，以尾部暴露小脑和脑干（图4B）。
13. 使用超细弯曲的镊子将嗅球与前颅骨分开，并从嗅球开始将大脑从颅底剥离。
14. 当大脑从颅底剥离时，使用超细镊子切开颅神经并允许切除大脑。
15. 继续从颅底剥离大脑，直到整个完整的大脑被移除（图4C，D）。
16. 沿着纵裂将大脑切成两半，将左右半球彼此分开（图4E，F）。
17. 将一个半球放在 大脑1 管中，第二个半球放在 大脑2 管中。将这些管储存在4°C，直到大脑半球下沉（约过夜）。

图4：去除固定的大脑。 （A）头骨顶部。（B）颅骨内暴露的大脑。（C）孤立的大脑（背侧）。（D）孤立的大脑（腹侧）。（E） 左半球（侧向）。（F） 左半球（内侧）。比例尺 = 1 厘米（E 和 F）。 请点击此处查看此图的大图。

18. 要解剖脊髓，请将小鼠体从PFA中取出并将其吸干。
19. 将鼠标放在俯卧位置的聚苯乙烯泡沫塑料解剖块上，并使用四根针将爪子固定在块中。
20. 通过将皮肤从颈部到尾巴从小鼠的中线切开以暴露整个背部来开始解剖。
21. 反射背部的肌肉和筋膜，露出脊柱的后部。
22. 从最颅椎开始，使用细剪刀切开椎板，同时避开脊髓（图5A）。
23. 将超细弯曲的镊子放在板下，向上拉以骨折椎骨以暴露脊髓（图5B）。
24. 使用弯曲的镊子反射骨折的椎骨并暴露脊髓的最外侧区域。
25. 通过将超细弯曲的镊子放在椎板下方并压裂椎骨，继续下一个椎骨的此过程。继续骨折椎骨，直到整个颈椎和胸椎暴露出来（图5C）。
26. 继续暴露脊髓，直到腰椎脊髓的末端（图5D）。
27. 使用锋利的剃须刀片，一直切开胸中脊髓。
28. 使用超细弯曲镊子，从脊柱和脊髓前方的筋膜横向横切脊神经，以将颈椎脊髓与脊柱缓慢分离。
29. 继续切除颈椎脊髓，直到它脱离椎骨（图5E）。将颈-胸中脊髓放入标有 宫颈的管中。将此管储存在4°C，直到颈椎脊髓下沉（约过夜）。
30. 继续骨折胸椎，一直到马尾，如步骤4.22至4.25中所述。当马尾暴露时，使用锋利的剃须刀片切割腰椎脊髓下方1厘米处的脊髓（图5F）。
31. 按照步骤4.26-4.27中概述的，从椎骨上切除腰椎脊髓。将腰椎中期马尾脊髓放入标有 腰椎的管中。将此管储存在4°C，直到腰椎脊髓下沉（约过夜）。
32. 当所有组织都沉入20%蔗糖中时，将它们转移到30%蔗糖的标记管中，直到它们沉没或3天。
    注意：脊柱组织通常不会在30%蔗糖下沉。

图5：去除固定的脊髓节段。 （A）初始切入颈椎的椎板。（B）放置弯曲的镊子来骨折单个椎骨。（三）暴露的颈椎。（D）暴露在颈椎、胸椎和腰椎外露。（五）切除脊神经后切除颈椎。（F）切割骶骨脊柱。（G） 孤立的颈椎。（H） 孤立的腰椎。比例尺 = 1 厘米（G 和 H）。 请点击此处查看此图的大图。

5. OCT包埋和组织储存

1. 对于每只小鼠，标记四个矩形冷冻胚胎：小鼠ID， 右半球，嵌入日期;鼠标 ID， 左半球，嵌入日期;鼠标ID， 宫颈，嵌入日期;鼠标 ID、 腰部、嵌入日期。
2. 设置一个聚苯乙烯泡沫塑料容器，并在容器上方悬挂一个金属杯。
3. 在聚苯乙烯泡沫塑料容器中装满液氮大约一半。在金属杯中装满新鲜的2-甲基丁烷，大约一半。
   注意：2-甲基丁烷有毒、高挥发性和易燃性。必须注意通过在通风橱中执行后续步骤并远离燃烧源来避免吸入。
4. 慢慢将金属杯放入液氮中，避免液氮溅入金属杯中。
5. 让2-甲基丁烷开始冷冻。当2-甲基丁烷冻结时，从30%蔗糖溶液中取出所需的组织，并用无尘擦拭将其吸干。
6. 将组织放在冷冻室中，喙部区域指向模具的顶部（未标记）部分。
7. 将最佳切割温度的包埋介质 （OCT） 少量浇注在冷冻室中的组织上，仅使用足以完全覆盖组织。避免使用过多的OCT，因为这会导致开裂。从 OCT 中去除任何气泡。
8. 当冷冻的2-甲基丁烷完全覆盖金属杯的内表面时，将冷冻食品完全浸入上覆液相2-甲基丁烷中12秒。12秒后，将冷冻食品放入标有标签的铝箔正方形中沥干，并包裹整个低温食品。立即将包裹好的冷冻食品放在干冰上，避免解冻。确保冷冻的OCT/冷冻食品始终覆盖有干冰。
9. 对所有组织重复步骤 5.6 到 5.8。将一只小鼠的组织放入密封的小塑料袋中，然后放入冷冻安全的密封容器中。将此容器储存在-80°C深的冰箱中，直到切片。

6. 冷冻切片

1. 在冷冻切片之前，请确保低温恒温器室温度和样品头设置为适当的设置。
   注意：用于切割脑切片的腔室温度为-20°C，试样头温度为-20°C，截面厚度为30μm。对于切割脊髓切片，使用-23°C的腔室温度，-30°C的标本头温度和30μm的切片厚度。重要的是要注意，在切片过程中需要调整低温恒温器设置（特别是标本头温度），以解决组织质量问题。通常，降低标本头温度以纠正组织涂片。相反，增加标本头部温度以纠正过度的组织卷曲。
2. 从-80°C冰箱中取出所需的OCT块，并将未包装的冷冻/ OCT块放入低温恒温器室中。
3. 让OCT块适应腔室温度30分钟。
4. 用70%乙醇清洁卡盘，并用无尘擦拭干净。将清洁的卡盘放入低温恒温器室中，并在卡盘上形成硬币大小的OCT圆圈。让OCT冻结（约1-2分钟）。
5. 当OCT冻结后，在卡盘上放置一个豌豆大小的新鲜OCT点，并立即将组织OCT块放在卡盘上。在OCT完全冻结之前，确保组织完全垂直于卡盘。
   注意：通常，大脑最臀部的区域朝向卡盘放置，以便从尾端开始切片。对于脊髓，通常，将最尾部区域放置在卡盘上，以便从喙端开始切片。
6. 当 OCT 硬化后，在 OCT 块的底部周围放置更多的 OCT，以便在切片过程中充当结构支撑。当该支撑物稍微硬化时，将卡盘放在试样头上，让OCT块达到试样头的温度30分钟。
7. 将切片机刀片放入刀片架中，然后清洁防卷板。调整防卷板距离，以确保组织在切片过程中通过板的正下方。有关防滚动板正确定位的更多信息，请参阅低温恒温器手册。
8. 在OCT阻滞剂适应标本头温度后，开始修剪OCT阻滞剂，直到达到组织。当组织可见时，从 修剪 切换到 切片 ，并开始切割30μm切片。将防卷板移到一边，并使用显微镜载玻片拾取该部分。
9. 继续切割和收集切片，直到对切片的解剖位置满意或所有组织均已切割。将载玻片在室温下干燥1-3天。干燥后，将载玻片放入载玻片盒中，并将此盒放入密封的塑料袋中。在将载玻片放入-80°C深的冰箱之前，用小鼠ID和组织信息标记袋子。

7. 免疫荧光染色

1. 在室温下解冻载玻片1小时。
2. 将载玻片放入水平载玻片罐中，并在PBS中洗涤切片3次，每次在室温下在摇摇杯上洗涤10分钟。
3. 制备封闭缓冲液（2%BSA + 0.3%Triton-X-100在1x PBS中）。每张载玻片使用约 1 mL。
4. 通过在底部加水来创建加湿室。将载玻片正面朝上水平放置，不要让它们变干。向每张载玻片中加入1mL封闭缓冲液，并在室温下孵育至少1小时。
5. 通过将一抗稀释在抗体缓冲液中（0.7%BSA + 0.3%Triton-X-100在1x PBS中）来制备一抗溶液。
   注意：对于磷酸化的α-突触核蛋白抗体，使用1：500的稀释因子。
6. 每张载玻片加入200-300μL一抗溶液。用盖玻片盖住以分散抗体并在4°C下孵育过夜。
7. 第二天，从加湿室中取出载玻片，并将其放入装有1x PBS的垂直Coplin罐中，以使盖玻片脱落。对每张载玻片单独执行此操作，并在取下盖玻片时注意不要干扰组织部分。
8. 将载玻片放入水平载玻片罐中，并在PBS中洗涤切片3次，每次在室温下在摇摇杯上洗涤10分钟。
   注意：所有后续步骤必须在熄灯的情况下执行，以避免光漂白荧光基团！
9. 通过在抗体缓冲液中稀释二抗来制备二抗溶液。
   注意：为了检测磷酸化的α突触核蛋白，在抗体缓冲液中使用稀释因子为1：500的抗兔二次偶联Alexa 488（0.7%BSA + 0.3%Triton-X-100在1x PBS中）。
10. 将载玻片水平放置于加湿室中，每张载玻片加入200-300μL二抗溶液。用盖玻片覆盖以分散抗体。在室温下孵育至少2小时。
11. 从加湿室中取出载玻片，并将其放入装有1x PBS的垂直Coplin罐中，以使盖玻片脱落。对每张载玻片单独执行此操作，并在取下盖玻片时注意不要干扰组织部分。
12. 将载玻片放入水平载玻片罐中，并在PBS中洗涤切片3次，每次在室温下在摇摇杯上洗涤10分钟。
13. 用毛巾擦干载玻片的侧面，并甩掉多余的PBS。
14. 向每张载玻片添加 3 滴安装介质。添加盖玻片，用一对镊子轻轻推出气泡，然后按压盖玻片，然后通过共聚焦显微镜成像。

Representative Results

高质量灌注表现为肝脏、脊髓和中枢神经系统深部结构中没有血液（图 4C 和 图 5G，H）。硬脑膜下方（例如，静脉窦内）或硬脑膜与颅骨之间的滞留血液没有问题，因为这种血液不在脑实质内。 图4A 中看到的血液位于颅骨和硬脑膜物质之间，因此没有问题或提示灌注质量差。新鲜的大脑和脊髓非常柔软，在处理过程中容易受损。相比之下，充分固定的组织是坚硬的。为了通过这种灌注方法评估组织的质量和组织形态的保存，这项工作证明了在15个月大的小鼠和7个月大的表达人A53T α突触核蛋白的中脑和腰脊髓中检测磷酸化的α突触核蛋白（图6）。

A53T 突变在常染色体显性遗传性帕金森病 （PD） 患者中的比例过高。此外，具有A53T突变的人类α突触核蛋白在小鼠^6，7中表达时可以概括人类PD的许多特征。丝氨酸129残基处的α-突触核蛋白的磷酸化已被证明 在体内 和 体外 诱导α-突触核蛋白聚集⁸。Lewey 体是 PD 或 Lewey 体痴呆^{患者 9} 的典型组织学发现。Lewey体内存在的大多数α-突触核蛋白在丝氨酸129^10，11处被磷酸化。结果，磷酸化α突触核蛋白的积累被用作PD病理学组织学严重程度的标志物。本研究发现，与表达人A53T α-突触核蛋白的7个月大无症状小鼠相比，磷酸化的α-突触核蛋白在15.5个月大的有症状小鼠中积累的水平显着更高。这与描述这些小鼠脊髓前角和中脑细胞病理学富集的报告一致。⁶ 由此可以得出结论，这里描述的简化灌注方法为下游组织学表征提供了高质量的CNS组织固定。

图6：来自帕金森病小鼠模型的中脑和腰椎脊髓组织中磷酸化α-突触核蛋白的标记。 将年龄（15.5个月大）终末期瘫痪小鼠与7个月大的健康小鼠进行比较。两只小鼠都表达人α突触核蛋白的错误折叠易感突变体变体（A53T），其诱导帕金森样病理学。比例尺 = 100 μm（上面板）和 50 μm（下面板）。缩写：α syn-A53T = α-突触核蛋白的A53T突变体;DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚;PS129 = 磷酸化的丝氨酸129 α-突触核蛋白。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

这项工作描述了进行经心灌注的关键步骤。在构建灌注装置（方案第 1 节）时，重要的是使用足够灵活的导管，以便被止血剂完全闭塞。一些硬导管可能未被止血剂充分闭塞，并且可能仍允许 PFA 在初始 PBS 灌注期间泄漏到主管路中。在制备4%PFA溶液时，重要的是要确保pH值是生理性的（7.4）。由于PFA溶液的制备涉及将其加热至65°C，因此在测量pH值之前必须将溶液冷却回25°C，因为这是在仪表上校准pH值的温度。

在腹部进行初始切口时，必须注意避免腹部器官撕裂（方案第2节）。当向隔膜上部解剖时，重要的是要避免肝脏撕裂伤，因为肝脏通常与前腹壁粘附。为了克服这一点，肝脏被小心而钝地从前壁上解剖，然后继续向隔膜切口。当通过膈肌进入胸腔时，重要的是要避免心脏，大血管和肺部撕裂伤。为了避免这种情况，剪刀尖端在表面上保持并与肋骨成锐角。

暴露心脏的初始解剖从初始切口开始大约需要2分钟。预计在此期间，一些空气已经进入了蝴蝶针的尖端。将这种空气引入小鼠的循环中将产生质量差的灌注。因此，在心脏插管之前，打开主管线并通过针头冲洗PBS以去除气泡至关重要。理想情况下，当一个小的PBS涓流流过针尖时，心脏是插管的，以确保在刺穿左心室时完全没有空气。

当针头进入左心室时，它不能太深，以至于将针尖引入右心室（RV）。将针头放置在RV或二尖瓣之外，当开始灌注时，会导致肺部立即“充气”。这是不希望的，必须稍微拔出针头以确保左心室放置。如果针头放置正确，肺部将在整个灌注过程中保持平坦。当开始灌注时，有时观察到一种透明的液体从动物张开的嘴里冒出来。这通常是由于灌注压力过高或由于针头在心脏内错位。作者推测，灌注压力升高导致灌注液从小动脉毛细血管床外渗，PBS通过支气管树逆行流入食道和口腔。

灌注压力必须通过降低PBS瓶中PBS的水平或通过降低PBS瓶的高度来降低。或者，如果针头太深地插入左心室，它可能会穿过二尖瓣并将灌注物输送到左心房。如上所述，这可能导致通过肺静脉的逆行流动和灌注物外渗到小动脉。使用 PBS 彻底清除循环系统中的血液对于避免固定性诱导的血液成分交联导致随后固定灌注时血管阻塞尤为重要。通过肝脏的颜色变化和来自腹侧尾基切口的PBS流来有效评估清除率。血液清除通常通过PBS灌注3分钟完成;然而，如果在较短的时间内出现视觉清除迹象，则在3分钟内引入固定剂。不建议延长清除时间，因为延迟固定灌注会导致中枢神经系统精细结构¹中的伪影。

当PFA被施用时，监测PFA瓶中PFA溶液的水平非常重要。如果PFA水平下降到PFA瓶口上方小于4厘米，请加满PFA瓶。灌注完成后，灌注装置必须用蒸馏水彻底冲洗。这一点很重要，因为主管线中残留的PFA会用PFA污染初始PBS灌注，并导致低质量的灌注。最后，25 G蝴蝶针通常推荐给20-30g范围内的平均大小成年小鼠。然而，除了调整固定剂瓶以提供最佳流速外，较大或较小的小鼠可能需要稍大或更小的针头。

对于中枢神经系统解剖和OCT包埋（方案第3节），脊髓组织通常不会完全沉入30%的蔗糖中。因此，这些组织在蔗糖中放置2天，然后嵌入OCT中，无论它们是否下沉。当冷冻OCT中的组织时，某些组织在置于冷却的2-甲基丁烷中时可能会破裂。这在大脑中更常见，通常发生在组织上放置过多的OCT时。为避免这种情况，在立即冷冻之前，仅放置足够的OCT以覆盖组织表面。在某些协议中，尽管完全浸没在OCT中，但开裂并不常见。这通常是由于较慢的冷冻方法，例如使用干冰冷却的2-甲基丁烷或将冷冻冷冻直接放在干冰块上时。在这项工作中，液氮冷却的2-甲基丁烷是优选的，因为冷冻速率比较慢的冷冻方法更快，并且可能更好地保持组织形态。

在冷冻切片组织时（方案第4节），重要的是要避免多次冻融循环。因此，最好从单个OCT块中切割所有部分，以获得用于分析的特定大脑区域，而不是解冻和重新冻结选定的区域。如果这不可行，在获得几个部分后，用户可以重新冷冻并将OCT块储存在-80°C深的冰箱中1-2次以上，以备将来使用。

与更传统的泵或空气压力输送灌注液相比，该方法的主要优点如下：（1）灌注装置的成本低廉且可及性好。（2）用户在整个灌注过程中不需要人工保持灌注装置内的压力。（3）灌注压力低于其他低成本灌注替代方案，例如通过注射器输送。使用伯努利方程计算出，当灌注液瓶相对于针头放置在1 m的高度时，这里构建的重力灌注装置将保持约73 mm Hg的灌注压力。鉴于这明显低于这些动物的收缩压，该灌注压可能足够低以避免血管破裂¹²。

到目前为止，作者已经成功地使用这种灌注系统来检测帕金森病小鼠模型中磷酸化的α突触核蛋白的存在。在此期间，这种灌注方法没有遇到泵灌注递送方法不存在的重大限制。这种技术的主要局限性是灌注与滴注相比，其耗时性。这种技术优于滴注，因为灌注导致固定剂更深入地渗透到CNS结构中。这种技术的第二个限制是它需要一些手术技能来执行，因为在进入胸腔后必须快速插管心脏。然而，根据经验，训练有素的用户可以在最初切口进入腹部的1分钟内常规地对心脏进行治疗。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical	Fisher Scientific	03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound	Fisher Scientific	NC1029572
Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors	Amazon	B0752XHK2X	"fine scissors"
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G	Fisher Scientific	14-826-5D
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G	Fisher Scientific	14-826B
Corning PES Syringe Filters	Fisher Scientific	09-754-29
Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x	Fisher Scientific	SH30258
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9703100
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	"curved fenestrated forceps"
Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps	Fisher Scientific	16-100-123	"curved fine forceps"
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122	"straight fine forceps"
Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends	Fisher Scientific	21-401-5
Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates	Fisher Scientific	FB966J
Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50	Fisher Scientific	12-548-5M
Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel	Fisher Scientific	13-820-074	"skin forceps"
Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks	Fisher Scientific	FB3002000
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors	Fisher Scientific	08-951-20	"dissecting scissors"
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use	Fisher Scientific	14-955-464
Fisherbrand Straight Locking Hemostats	Fisher Scientific	16-100-115
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in.	Fisher Scientific	14-174-1C
Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles	Fisher Scientific	09-790-12F
Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID - Polypropylene - QC	Fisher Scientific	01-000-686
Garvey Economy Single Edge Cutter Blade	Amazon	B001GXFAEQ
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488	ThermoFisher Scientific	35552
Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps	Fisher Scientific	14-198-5A	"hose clamps"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable	Fisher Scientific	NC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set	Fisher Scientific	22-010-137	"butterfly needle"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply	Fisher Scientific	06-666
Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Fisher Scientific	P36962
Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles	ThermoFisher Scientific	2425-0506	"buffer bottles"
PAP pen	abcam	ab2601
Paraformaldehyde Granular	Electron Microscopy Systems	19210
Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm	Fisher Scientific	15-242D
Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y]	abcam	ab51253
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465-2.5kg
Stainless Steel Drinking Cup 18-oz	amazon	B0039PPO9U
Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1	Us Biological	S8010
Triton X-100	Us Biological	T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP	MWI Animal Health	502017