Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En gravitationsmatad transkardiell perfusionsmetod för histologisk analys av musens centrala nervsystem

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63386
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University, 2Department of Neurology, State University of New York Upstate Medical University, 3Department of Neuroscience and Physiology, State University of New York Upstate Medical University

Summary

En bekväm gravitationsmatad perfusionsmetod för histologisk analys av musens centrala nervsystem presenteras. Immunofluorescerande detektion av fosforylerat α-synuklein demonstreras i en musmodell av Parkinsons sjukdom. Detta arbete beskriver också omfattande transkardiell perfusion, dissektion, vävnadsfrysning / inbäddning och frysta sektioneringssteg.

Abstract

Den histologiska analysen av hjärn- och ryggmärgsprover isolerade från möss är vanlig praxis för bedömning av patologi i detta modellsystem. För att upprätthålla morfologin hos dessa känsliga vävnader är det rutinmässigt att administrera ett kemiskt fixeringsmedel såsom paraformaldehyd via kannulering av hjärtat i bedövade djur (transkardiell perfusion). Transkardiell perfusion av mushjärtat har traditionellt förlitat sig på användningen av peristaltiska pumpar eller lufttryck för att leverera både saltlösning och fixativa lösningar som är nödvändiga för denna process. Som ett lättillgängligt alternativ till dessa metoder visar detta arbete användningen av en tyngdkraftsmatad metod för perfusatleverans som använder material som finns i de flesta hårdvaruaffärer.

För att validera denna nya perfusionsmetod visar detta arbete alla efterföljande steg som är nödvändiga för känslig detektion av fosforylerat α-synuklein i både hjärnan och ryggmärgen. Inkluderat i dessa steg är dissektion av de fasta hjärn- och ryggmärgsvävnaderna, snabb frysning / inbäddning och kryosektion av vävnaderna och immunofluorescerande färgning. Eftersom denna metod resulterar i helkroppsleverans av fixeringsmedlet kan den också användas för att förbereda andra icke-neuronala vävnader för histologisk analys.

Introduction

Histologisk karakterisering av patologi i musens centrala nervsystem (CNS) är en rutinteknik som används vid studier av neurodegeneration. Eftersom neuronala vävnader snabbt bryts ned efter döden är det vanligt att leverera ett kemiskt fixeringsmedel såsom paraformaldehyd till CNS-vävnaderna för att bevara deras morfologi 1,2. Kemisk fixering kan utföras antingen genom helkroppsperfusion med en fixeringslösning eller genom isolering av vävnader och deras nedsänkning i en fixativ lösning (kallad "droppfixering"). Perfusion är den föredragna metoden för fixering, eftersom droppfixering kanske inte tillåter snabb penetrering av fixeringslösningen i djupa CNS-strukturer 3,4,5. Dessutom, eftersom det är svårt att ta bort den ofixerade ryggmärgen från ryggraden, möjliggör leverans av fixeringslösningen via perfusion in situ bevarande av ryggmärgsmikroskopisk och grov anatomi och förstärker vävnaden för att minimera skador under borttagning.

Leverans av de buffert- och fixeringslösningar som krävs för fixering utförs vanligtvis med kommersiellt tillgängliga pumpar eller lufttryck. Gravitationsleverans av perfusat kan fungera som ett alternativ till pumpleverans av följande skäl: (1) Pump- eller lufttryckstillförsel kan i vissa fall kräva att en användare manuellt upprätthåller trycket i systemet under hela perfusionen. Gravitationsleverans av perfusat kan upprätthållas utan användarintervention. (2) En tyngdkraftslevererad perfusatapparat kan konstrueras till låg kostnad för användaren genom att erhålla material som finns tillgängligt från vetenskapliga standardleverantörer. Detta arbete beskriver hur man konstruerar en enkel gravitationsperfusionsanordning med hjälp av tvättflaskor och vinylslangar. Med hjälp av en musmodell av Parkinsons sjukdom visar detta arbete effekten av detta system för att perfusera hjärnan och ryggmärgsvävnaderna före deras isolering för frusen sektionering. Detta arbete beskriver omfattande alla steg, tekniker och material som behövs för att dissekera den fasta vävnaden ur djuret, snabbt frysa / bädda in och kryosektion vävnaden och upptäcka närvaron av fosforylerat α-synuklein i både hjärnan och ryggmärgen via indirekt immunofluorescensmikroskopi.

Protocol

Data och experimentella steg som presenteras i detta protokoll genererades med hjälp av C57BL / 6J-möss. Alla metoder som involverar djur godkändes av State University of New York Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Konstruktion av perfusionsapparat och dissektionsplattform

  1. Som visas i figur 1, trimma de inre sugrören från två 500 ml tvättflaskor genom att skära dessa jämnt till insidan av skruvlocket med ett vasst rakblad. Skär ett 4 cm x 4 cm fyrkantigt hål i botten på varje buffertflaska. Skär ett litet hål i botten av varje flaska för att tillåta passage av en böjd mikrospatula i rostfritt stål.
  2. Skapa en "S" -formad böjning i mikrospatulasna så att de kan användas som krokar för att hänga buffertflaskorna. Sätt in de böjda mikrosappulasna i lämpliga öppningar i buffertflaskorna.
  3. Skär två 25 cm långa slangar och anslut dessa ordentligt med de yttre flaskstråuttagen. Sammanfoga ändarna på dessa rör tillsammans med Y-kontakten. Klipp 2 m slang och anslut denna till den fria änden av Y-kontakten.
  4. Ta bort kolven från 1 ml spruta och skär sprutan cirka 6 cm från sprutspetsen. Skär sprutan genom att först punktera plasten med ett rakblad och sedan knäppa sprutan kraftigt.
  5. Sätt in sprutans skurna yta i den fria änden av plaströret. Sätt i tillräckligt djup för att säkerställa en tät tätning.
    OBS: Det är viktigt att alla anslutningar i perfusionsapparaten är tillräckligt täta för att undvika läckage. Vid lösa anslutningar kan små slangklämmor i rostfritt stål placeras och dras åt vid korsningar efter önskemål för att säkerställa en tät tätning vid behov.
  6. Märk en buffertflaska som PFA och en flaska som PBS (buffert). Mät ungefär 1/3rd av längden bort från flasköppningen och dra en linje runt flaskans omkrets vid denna punkt för att beteckna lämplig fyllningsnivå för perfusatlösningarna.
  7. Räta ut och skapa sedan en ögla i ett stort gem som får plats runt slangens omkrets. Placera denna ögla runt slangen precis proximal mot sprutan.
  8. Placera ett frigolitblock av lämplig storlek i glasbrickan. Placera ändarna på gemet i frigolitblocket för att fästa slangen.
  9. Använd pappershanddukar och höj glasbrickans främre ände med cirka 2 cm.
    OBS: Detta kommer att placera musen i ungefär 20 ° av Trendelenburg-positionen (bakåtlutning) för att möjliggöra enklare visualisering av membranet under dissektion och uppmuntra dränering av vätskor under perfusion.

Figure 1
Figur 1: Diagram som visar den monterade perfusionsapparaten. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; PFA = paraformaldehyd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Beredning av paraformaldehydlösning (PFA)

OBS: PFA-lösningen måste beredas färsk på perfusionsdagen och kasseras i slutet av perfusionen i en utsedd avfallsbehållare innan den bortskaffas av utbildad personal. Detta protokoll gör 1 L av 4% PFA-lösning, vilket är tillräckligt för att perfusera cirka 4 möss. PFA är mycket giftigt och försiktighet måste vidtas för att undvika inandning eller direkt hudkontakt i antingen pulverform eller flytande form. De flesta förberedelsesteg utförs därför när du bär handskar, skyddsglasögon och en labbrock under en dragskåpa.

  1. Skölj en 1 L-bägare med destillerat vatten och fyll med cirka 800 ml 18 mΩ molekylärbiologiskH2O.
  2. Värm bägaren påH2Oi en mikrovågsugn i 3 minuter eller tills vattentemperaturen når 65 °C. Placera på en värme-/omrörningsplatta som förvaras i en dragskåp.
  3. Skölj en omrörningsstav med destillerat vatten och lägg den i varmt vatten. Starta omröraren och vrid upp värmeplattan till medelvärme. Se till att vattentemperaturen inte överstiger 70 °C.
  4. Använd en kirurgisk mask, handskar, skyddsglasögon och labbrock och mät 40 g PFA-pulver. Häll detta pulver i det uppvärmda vattnet.
  5. Använd en överföringspipett och tillsätt några droppar 5 M NaOH till lösningen. Låt PFA-pulvret lösas upp helt. Om pulvret inte har lösts helt efter några minuter, tillsätt droppar på 5 M NaOH efter behov.
  6. När nästan allt PFA har lösts upp (verkar något grumligt), stoppa omrörningen / uppvärmningen och tillsätt omedelbart 100 ml 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Fyll slutligen på vattnet till 1 L-märket på bägaren med 18 mΩ molekylärbiologisk H2O. Täck bägaren med plastfolie och placera den i en frys på -20 °C tills lösningen når rumstemperatur (cirka 45 min).
  7. Kalibrera en pH-mätare med lämpliga standarder. Medan bägaren är på en omrörningsplatta, mät lösningens pH och tillsätt HCl tills pH når 7,4. Tillsätt vid behov 5 M NaOH för att öka pH-värdet om det är för lågt.
  8. Anslut en vakuumkolv till vakuum och placera en ren keramisk Büchner-tratt med filterpapper i kolven. Slå på vakuumet och blöt filterpapperet med en överföringspipett fylld med 4% PFA-lösningen.
  9. Häll långsamt 4% PFA-lösningen på filterpapperet tills all lösning har filtrerats.
  10. Överför den filtrerade lösningen till en ren, ljusskyddad behållare och förvara den vid 4 °C tills den används (förvaras inte längre än 24 timmar).

3. Transkardiell "pumpfri" perfusion

  1. Placera ett frigolitdissekeringsblock i dragskåpet i en glasbricka. Se till att dissekeringsblocket har 5-6 korta nålar för att hålla fast musen under operationen och 2 långa nålar för att stödja perfusionsslangen.
  2. Skölj perfusionsapparaten med destillerat vatten. Låt allt vatten rinna av innan du hänger upp perfusionsapparaten. Häng perfusionsflaskorna 1 m över det perfuserade djuret (för en 20-30 g mus).
  3. Bered en icke-steril lösning av 1x PBS med 10x PBS utspädd med 18 mΩ molekylärbiologiskH2O.
  4. Som visas i figur 2, kläm fast huvudlinjen för perfusionsapparaten med användning av en hemostat. Kläm fast PFA-linjen med en annan hemostat.
    OBS: Ocklusion med flera hemostater kan vara nödvändigt per linje för att helt förhindra flöde.
  5. Fyll buffertbehållaren med 1x PBS vid rumstemperatur.
  6. Placera perfusionsapparatens sprutände i en bägare för att samla upp avfallsbufferten och avlägsna hemostaten som täcker huvudlinjen (figur 2, vänster).
  7. Låt PBS strömma genom linjen medan du tar bort instängd luft genom att kraftigt knacka på rörets väggar.
  8. När all luft har avlägsnats från bufferten och huvudledningarna, ockludera flödet genom att placera en hemostat på huvudledningen.
  9. Ta bort hemostaten från PFA-linjen och låt PBS flöda på ett retrograd sätt upp till PFA-flaskan medan du knackar ut eventuella bubblor i PFA-linjen (figur 2, mitten). Fortsätt att tillåta PBS i PFA-linjen tills PBS kan ses strax ovanför flaskans öppning. Ockludera PFA-linjen med en hemostat för att stoppa flödet i PFA-flaskan.
  10. Anslut fjärilsinfusionsnålen till perfusionssprutan och spola PBS genom linjen (genom att öppna huvudlinjens hemostat) för att ta bort bubblor från perfusionssprutan. Stäng huvudlinjens hemostat.
  11. Se till att PBS-flaskan nu är ungefär 1/3rd full av PBS. Spola vid behov PBS genom huvudledningen eller fyll mer PBS i buffertflaskan tills 1/3rd av dess fulla kapacitet.
  12. När alla bubblor har tagits bort från PBS-, PFA- och huvudledningarna fyller du PFA-flaskan med 4% PFA-lösning vid rumstemperatur upp till det svarta märket på flaskan (ungefär 1/3rd full) (figur 2, höger).

Figure 2
Figur 2: Beredning av perfusionsapparaten för perfusionskirurgi. Stäng först PFA-linjen hemostat och öppna hemostaten på PBS-linjen och huvudlinjen. Fyll PBS och ta bort bubblor från PBS-linjen och huvudlinjen. Fyll sedan PFA-linjen med PBS genom att öppna hemostaten på PFA-linjen och stänga hemostaten på huvudlinjen. Ta bort bubblor i PFA-linjen. Slutligen stäng hemostaten på PFA-linjen när PBS når öppningen av PFA-flaskan. Fyll PFA-flaskan 1/3rd full av PFA. Se till att PBS-nivån i PBS-flaskan är 1/3rd full och fyll antingen med PBS eller töm PBS genom att öppna huvudlinjens hemostat om det behövs. Förkortningar: PBS = fosfatbuffrad saltlösning; PFA = paraformaldehyd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Förbered dig på icke-överlevnadskirurgi genom att rengöra följande instrument med vatten följt av 70% etanol: stor sax, fin dissekerande sax, hudtång, fina fenestrerade böjda pincett.
  2. Förbered anestesin genom att placera dammfria våtservetter i ett 50 ml koniskt rör. Blötlägg de dammfria våtservetterna noggrant med isofluran i en dragskåp och placera det öppnade röret upp och ner i en 500 ml bägare. Se till att det inte finns något flytande isofluran i botten av bägaren och kassera eventuellt flytande isofluran innan du placerar en mus i bägaren.
  3. Placera musen i bägaren och placera plastfolie över öppningen för att påbörja anestesi.
  4. Administrera anestesi tills musen slutar andas (cirka 1 min och 30 s).
  5. När andningen har slutat, ta omedelbart bort musen från bägaren och sätt tillbaka locket på det 50 ml koniska röret.
  6. Kontrollera att musen är tillräckligt sövd med hjälp av tånypreflexen. Om djuret inte är tillräckligt sövt, administrera mer isofluran enligt beskrivningen i steg 3.15.
  7. Arbeta snabbt, placera musen på frigolitblocket och fäst tassarna utåt med fyra korta nålar (t.ex. 22 G sprutnålar).
  8. Lyft bukhuden med hudtång, använd den stora saxen för att skära genom bukväggen. Se till att inga bukorgan skärs!
  9. Fortsätt bukskärningen överlägset mot levern. Lossa levern från den främre bukväggen och fortsätt det initiala snittet överlägset mot membranet. Stoppa detta snitt ca 1 cm sämre än membranet. Var noga med att se till att levern inte skärs!
  10. Fortsätt det första snittet i sidled upp mot höger och vänster sida av membranet för att göra ett "Y" -format snitt (figur 3A).
  11. När snittet når membranet, gör ett hål i membranet med den fina dissekerande saxen och skär genom revbenen på djurets högra sida. Skär revbenen ungefär halvvägs till höger axilla.
  12. Gör ett liknande men längre snitt genom membranets vänstra sida nästan hela vägen till vänster axilla.
  13. Reflektera bröstväggen och fäst den på frigolitblocket.
  14. Dissekera vid behov bort fettet från runt hjärtat för att exponera vänster kammare. Identifiera vänster ventrikel baserat på den relativt ljusare färgen jämfört med höger ventrikel.
  15. Efter att ha identifierat vänster ventrikel, håll hjärtat stadigt med lätt tryck med de fina krökta tångarna. Öppna huvudlinjens hemostat så att PBS kan strömma genom nålen. Genomborra omedelbart vänster ventrikel och se till att nålen sätts in högst 0,5 cm i ventrikeln. Dra ut nålen något om det behövs.
    OBS: Noggrann placering av nålen i vänster kammare indikeras av retrograd blodflöde i nålslangen. Det är viktigt att se till att nålen inte är för djupt införd i ventrikeln. Detta kan resultera i retrograd flöde genom lungvenerna eller piercing av interventrikulär septum.
  16. Vila fjärilsslangen på ett X tillverkat i frigolit med två stora 18 G nålar.
    OBS: Detta är kritiskt eftersom det kommer att undvika rörelse av fjärilsnålen i hjärtat under perfusion.
  17. Identifiera den underlägsna vena cava när den lämnar levern och transektera den med den fina dissekerande saxen (figur 3B). Alternativt kan du öppna rätt atrium med sax.
  18. Öppna omedelbart huvudlinjen så att PBS-perfusion kan starta (figur 3C).
  19. Se till att PBS dränerar bort frigolitblocket och in i glasbrickan nedan. Om detta inte inträffar, justera vinkeln på brickan eller styrofoakblocket för att tillåta tömning av vätskor i glasbrickan.
  20. Fortsätt PBS-perfusion tills vätskan som strömmar ut ur den underlägsna vena cava är blodfri (cirka 3 min).
    OBS: Korrekt placering av nålen i hjärtat kommer att resultera i visuell rensning av blod från levern, som kommer att förvandlas från rött till halmfärgat. Om detta inte inträffar kan det åtgärdas genom att infusionsnålen placeras om i vänster kammare. Ett litet snitt kan göras i den ventrala svansbasen för att bedöma kvaliteten på perfusion. Korrekt perfusion kommer att resultera i att klar PBS flyter från svansbasens snitt.
  21. Arbeta snabbt, ockludera PBS-linjen med en hemostat och öppna PFA-linjen.
  22. Låt PFA genomskåda i några minuter tills svansen börjar krulla. När svansen börjar krulla, börja en 50 min timer. Om svansen inte krullar efter 5 min PFA-perfusion, börja en 50 min timer för PFA-perfusionen.
  23. Övervaka PFA-nivån i flaskan kontinuerligt under hela perfusionen för att säkerställa att nivån inte sjunker för lågt. Fyll mer PFA i flaskan om nivån sjunker under 2 cm över flasklocket.

Figure 3
Figur 3: Diagram som visar transkardiell perfusion. (B) Efter att ha kommit in i brösthålan och utsatt hjärtat förs nålen in i vänster kammare. Därefter transekteras IVC eller höger förmak för att möjliggöra dränering av perfusater efter att de har cirkulerat genom kroppen. IVC skärs överlägset membranet. C) Förfarande för administrering av perfusater. Förkortning = IVC = sämre vena cava. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Efter 50 minuter har gått, ockludera huvudlinjen med en hemostat och dra ut nålen från vänster kammare.
    OBS: Hela musen är styv vid denna tidpunkt och kan nu placeras i en märkt behållare med 4% PFA över natten vid 4 °C. I detta skede är det möjligt att dissekera cns-vävnaderna och placera dem individuellt i fixativ över natten. I detta arbete placeras hela musen i fixativ eftersom detta förkortar intervallet mellan fixering och placering vid 4 °C. Detta undviker också eventuell mekanisk förvrängning av nervvävnad som kan uppstå om djur fördissekeras innan fixeringen över natten är klar.

4. CNS-dissektion

  1. Förbered följande instrument för dissektion genom att tvätta med vatten följt av 70% etanol: sax, hudtång, böjda fenestrerade pincett, böjda fina pincett, raka fina pincett, fina saxar.
  2. Märk fyra rör per mus enligt följande och fyll med steril 20% sackaros: Mus-ID, Hjärna 1, Mus-ID, Hjärna 2, Mus-ID, Ländrygg, Mus-ID, Cervikal.
  3. Ta bort musen från PFA-lösningen och torka den med en pappershandduk för att ta bort överflödigt PFA.
  4. Använd den stora saxen och ta bort musens huvud genom att klippa i nacken.
  5. Placera kroppen i PFA-lösningen. Behåll huvudet för att dissekera hjärnan från skallen.
  6. För att dissekera hjärnan, börja med att reflektera kranialhuden framåt för att exponera hela skallen (figur 4A).
  7. Gör ett grunt snitt i hörselgången med den fina dissekerande saxen för att komma in i skallen
  8. Fortsätt detta snitt längs den tvärgående sinusen tills skallen skärs hela vägen mellan båda hörselkanalerna.
  9. Gör ett snitt vinkelrätt mot föregående snitt längs den längsgående sprickan hela vägen till den mest rostrala delen av skallen (ungefär mellan ögonen).
  10. Använd de fenestrerade böjda tångarna och reflektera skallen i sidled för att exponera framhjärnan. Fortsätt att ta bort skallen tills hela framhjärnan, inklusive luktlökarna, är exponerade.
  11. Börja dissekera den kaudala regionen av skallen genom att göra ett snitt genom det occipitala benet och långsamt fortsätta detta snitt ner mot foramen magnum.
  12. Reflektera de två bitarna av skallen i sidled för att exponera lillhjärnan och hjärnstammen kaudalt (figur 4B).
  13. Använd de ultrafina böjda tångarna för att separera luktlökarna från den främre skallen och börja skala hjärnan bort från skallbasen med början vid luktlökarna.
  14. När hjärnan skalas bort från skallbasen, använd ultrafina tångar för att skära kranialnerverna och tillåta borttagning av hjärnan.
  15. Fortsätt att skala bort hjärnan från skallbasen tills hela den intakta hjärnan har tagits bort (figur 4C,D).
  16. Skär hjärnan på mitten längs den längsgående sprickan för att separera höger och vänster halvklot från varandra (figur 4E,F).
  17. Placera en halvklot i hjärnan 1 rör och den andra halvklotet i hjärnan 2 rör. Förvara dessa rör vid 4 °C tills hjärnhalvorna sjunker (ungefär över natten).

Figure 4
Figur 4: Borttagning av fast hjärna. (B) Exponerad hjärna i skallen. (C) Isolerad hjärna (dorsal aspekt). (D) Isolerad hjärna (ventral aspekt). (E) Vänster halvklot (lateral aspekt). (F) Vänster halvklot (medial aspekt). Skalstänger = 1 cm (E och F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. För att dissekera ryggmärgen, ta bort muskroppen från PFA och torka den torr.
  2. Placera musen på ett styrofoam dissekeringsblock i det benägna läget och fäst tassarna i blocket med fyra nålar.
  3. Börja dissektionen genom att skära huden ner i musens mittlinje från nacke till svans för att exponera hela baksidan.
  4. Reflektera muskeln och fascian på baksidan för att exponera den bakre delen av ryggraden.
  5. Börja vid de mest kraniala ryggkotorna, använd den fina dissekerande saxen för att skära igenom lamina samtidigt som du undviker ryggmärgen (figur 5A).
  6. Placera de ultrafina böjda tångarna under lamina och dra uppåt för att bryta ryggkotorna för att exponera ryggmärgen (figur 5B).
  7. Använd de böjda tångarna för att reflektera de brutna ryggkotorna och exponera de mest laterala regionerna i ryggmärgen.
  8. Fortsätt denna process för nästa ryggkotor genom att placera de ultrafina krökta tångarna under lamina och spricka ryggkotorna. Fortsätt att bryta ryggkotorna tills hela halsryggen och bröstryggen exponeras (figur 5C).
  9. Fortsätt att exponera ryggmärgen till slutet av ländryggen (figur 5D).
  10. Skär hela vägen genom midtorakisk ryggmärg med ett vasst rakblad.
  11. Med hjälp av de ultrafina böjda tångarna transekterar du ryggmärgsnerven i sidled från ryggraden och fascian främre till ryggmärgen för att separera livmoderhalsen långsamt från ryggraden.
  12. Fortsätt att dissekera ut livmoderhalsens ryggmärg tills den är fri från ryggkotorna (figur 5E). Placera den cervikala-midtorakiska ryggmärgen i röret märkt livmoderhalscancer. Förvara detta rör vid 4 °C tills livmoderhalsens ryggmärg sjunker (ungefär över natten).
  13. Fortsätt att bryta bröstkotorna hela vägen till cauda equina enligt beskrivningen i steg 4.22 till 4.25. När cauda equina exponeras, använd ett vasst rakblad för att skära ryggmärgen 1 cm under ländryggen (figur 5F).
  14. Dissekera ryggmärgen i ländryggen bort från ryggkotorna enligt beskrivningen i steg 4.26-4.27. Placera ryggmärgen i ländryggen i mitten av cauda equina-ryggmärgen i röret märkt ländrygg. Förvara detta rör vid 4 °C tills ländryggen sjunker (ungefär över natten).
  15. När alla vävnader har sjunkit i 20% sackaros, överför dem till märkta rör med 30% sackaros tills de har sjunkit eller i 3 dagar.
    OBS: Ryggradsvävnader sjunker ofta inte vid 30% sackaros.

Figure 5
Figur 5: Avlägsnande av fasta ryggmärgssegment. (B) Placering av böjda pincett för att bryta enskilda ryggkotor. (C) Den exponerade cervikala ryggraden. (D) Exponerad livmoderhals-, bröst- och ländrygg. (E) Avlägsnande av livmoderhalsen efter skärning av ryggradsnerver. (F) Skärning av den sakrala ryggraden. (G) Isolerad cervikal ryggrad. (H) Isolerad ländrygg. Skalstänger = 1 cm (G och H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Inbäddning och förvaring av vävnader i ULT

  1. För varje mus, märk fyra rektangulära kryomolder: Mus-ID, Höger halvklot, Datum för inbäddning; Mus-ID, vänster halvklot, datum för inbäddning; Mus-ID, livmoderhalscancer, datum för inbäddning; Mus-ID, ländrygg, datum för inbäddning.
  2. Ställ in en frigolitbehållare och häng en metallkopp ovanför behållaren.
  3. Fyll frigolitbehållaren med flytande kväve ungefär halvvägs. Fyll metallkoppen med färsk 2-metylbutan ungefär halvvägs.
    OBS: 2-metylbutan är giftigt, mycket flyktigt och brandfarligt. Försiktighet måste vidtas för att undvika inandning genom att utföra efterföljande steg i en dragskåp och bort från förbränningskällor.
  4. Sänk långsamt ner metallkoppen i det flytande kvävet och undvik stänk av det flytande kvävet i metallkoppen.
  5. Låt 2-metylbutanen börja frysa. Medan 2-metylbutan fryser, ta ut önskad vävnad ur 30% sackaroslösningen och torka den torr på en dammfri torkduk.
  6. Placera vävnaden i en kryomol med rostralområdet pekat mot den övre (omärkta) delen av formen.
  7. Häll sparsamt optimalt inbäddningsmedium (OCT) över vävnaden i kryomolden, med endast tillräckligt för att täcka vävnaden helt. Undvik att använda överdriven OCT eftersom det kan orsaka sprickbildning. Ta bort eventuella bubblor från OCT.
  8. När fryst 2-metylbutan helt har täckt metallkoppens inre yta, sänk ner kryomolen helt i den överliggande vätskefas 2-metylbutanen i 12 s. Efter 12 s, placera cryomolden för att rinna av i en märkt aluminiumfolieruta och linda in hela cryomolden. Placera omedelbart den inslagna kryomolden på torris och undvik upptining. Se till att den frysta OCT/cryomold alltid är täckt med torris.
  9. Upprepa steg 5.6 till 5.8 för alla vävnader. Placera vävnaden för en mus i en förseglad liten plastpåse och sedan i en kryosäker, förseglad behållare. Förvara behållaren i djupfrysen -80 °C tills sektionerna är skurna.

6. Kryosektion

  1. Innan kryosektion, se till att kryostatkammarens temperatur och provhuvud är inställda på lämpliga inställningar.
    OBS: En kammartemperatur på -20 °C, en provhuvudtemperatur på -20 °C och en sektionstjocklek på 30 μm används för att skära hjärnsektioner. För skärning av ryggmärgssektioner används en kammartemperatur på -23 °C, en provhuvudtemperatur på -30 °C och en sektionstjocklek på 30 μm. Det är viktigt att notera att kryostatinställningarna (särskilt provhuvudets temperatur) måste justeras under sektionering för att ta itu med problem med vävnadskvaliteten. I allmänhet sänks provhuvudets temperatur för att korrigera för vävnadsutstrykning. Omvänt ökas provhuvudets temperatur för att korrigera för överdriven vävnadskrullning.
  2. Ta bort önskat OCT-block från frysen -80 °C och placera det oförpackade kryomold/OCT-blocket i kryostatkammaren.
  3. Låt OCT-blocket acklimatisera sig till kammartemperaturen i 30 minuter.
  4. Rengör en chuck med 70% etanol och torka den torr med en dammfri torkduk. Placera den rengjorda chucken i kryostatkammaren och gör en myntstor cirkel av OCT på chucken. Låt OCT frysa (ca 1-2 min).
  5. När OCT har frusit, placera en ärtstor prick med färsk OCT på chucken och placera omedelbart vävnadens OCT-block på chucken. Se till att vävnaden är helt vinkelrät mot chucken innan OCT fryser helt.
    OBS: I allmänhet placeras den mest rostrala regionen i hjärnan mot chucken så att sektionering börjar från den kaudala änden. För ryggmärgen placeras i allmänhet den mest kaudala regionen på chucken så att sektionering börjar från rostraländen.
  6. När OCT har härdat, placera mer OCT runt basen av OCT-blocket för att fungera som strukturellt stöd under sektionering. När detta stöd har härdat något, placera chucken på provhuvudet och låt OCT-blocket nå provhuvudets temperatur i 30 minuter.
  7. Placera ett mikrotomblad i bladhållaren och rengör krängningsplattan. Justera avståndet för rullplattan för att säkerställa att vävnaden passerar precis under plattan under sektionering. För mer information om korrekt placering av antirulleplattan, se kryostathandboken.
  8. När OCT-blocket har acklimatiserat sig till provhuvudets temperatur, börja trimma OCT-blocket tills vävnaden har uppnåtts. När vävnaden är synlig, byt från trimning till sektionering och börja klippa 30 μm sektioner. Flytta antirulleplattan åt sidan och plocka upp sektionen med ett mikroskopglas.
  9. Fortsätt att klippa och samla sektioner tills de är nöjda med sektionernas anatomiska placering eller all vävnad har skurits. Placera bilderna för att torka vid rumstemperatur i 1-3 dagar. Efter torkning, placera bilderna i en glidlåda och placera den här lådan i en förseglad plastpåse. Märk påsen med mus-ID och vävnadsinformation innan du placerar objektsglasen i djupfrysen -80 °C.

7. Immunofluorescerande färgning

  1. Tina bilderna i 1 h vid rumstemperatur.
  2. Placera objektglasen i en horisontell glidburk och tvätta sektionerna 3 gånger i PBS i 10 minuter varje tvätt vid rumstemperatur på en shaker.
  3. Förbered blockeringsbuffert (2% BSA + 0,3% Triton-X-100 i 1x PBS). Använd cirka 1 ml per bild.
  4. Skapa en fuktad kammare genom att tillsätta vatten till botten. Lägg bilderna uppåt horisontellt och låt dem inte torka ut. Tillsätt 1 ml blockerande buffert till varje objektsglas och inkubera i minst 1 timme vid rumstemperatur.
  5. Förbered primär antikroppslösning genom att späda ut den primära antikroppen i antikroppsbuffert (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 i 1x PBS).
    OBS: För den fosforylerade α-synukleinantikroppen användes en utspädningsfaktor på 1:500.
  6. Tillsätt 200-300 μl primär antikroppslösning per bild. Täck med ett täckglas för att sprida antikroppen och inkubera vid 4 °C över natten.
  7. Nästa dag, ta bort bilderna från den fuktade kammaren och placera dem i en vertikal Coplin-burk fylld med 1x PBS så att täckglaset kan falla av. Gör detta för varje bild individuellt och var försiktig så att du inte stör vävnadssektionen när du tar bort täckglaset.
  8. Placera objektglasen i en horisontell glidburk och tvätta sektionerna 3 gånger i PBS i 10 minuter varje tvätt vid rumstemperatur på en shaker.
    OBS: Alla efterföljande steg måste utföras med lamporna släckta för att undvika fotoblekning av fluoroforen!
  9. Förbered den sekundära antikroppslösningen genom att späda ut den sekundära antikroppen i antikroppsbufferten.
    OBS: För detektion av fosforylerat α-synuklein användes anti-kanin sekundär konjugerad till Alexa 488 med en utspädningsfaktor på 1:500 i antikroppsbuffert (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 i 1x PBS).
  10. Lägg objektglasen horisontellt i den fuktade kammaren och tillsätt 200-300 μl sekundär antikroppslösning per bild. Täck med en täckglas för att sprida antikroppen. Inkubera vid rumstemperatur i minst 2 timmar.
  11. Ta bort bilderna från den fuktade kammaren och placera dem i en vertikal Coplin-burk fylld med 1x PBS så att täckglaset faller av. Gör detta för varje bild individuellt och var försiktig så att du inte stör vävnadssektionen när du tar bort täckglaset.
  12. Placera objektglasen i en horisontell glidburk och tvätta sektionerna 3 gånger i PBS i 10 minuter varje tvätt vid rumstemperatur på en shaker.
  13. Torka sidan av bilderna på en handduk och skaka av överflödig PBS.
  14. Tillsätt 3 droppar monteringsmedium till varje bild. Tillsätt täckglaset och tryck försiktigt ut bubblor med ett par pincett genom att trycka på täckglaset innan du avbildar med konfokalmikroskopi.

Representative Results

Högkvalitativ perfusion indikeras av frånvaron av blod i levern, ryggmärgen och djupa CNS-strukturer (Figur 4C och Figur 5G,H). Kvarhållet blod under dura mater (till exempel inom venösa bihålor) eller mellan dura mater och skalle har inte varit problematiskt eftersom detta blod inte finns i hjärnans parenkym. Blodet som ses i figur 4A ligger mellan skallen och dura-materian och är därför inte problematiskt eller tyder på perfusion av dålig kvalitet. Den färska hjärnan och ryggmärgen är ganska mjuka och skadas lätt under hantering. Tillräckligt fasta vävnader är i jämförelse fasta. För att bedöma vävnadens kvalitet och bevarandet av vävnadens morfologi med denna perfusionsmetod visar detta arbete detekteringen av fosforylerat α-synuklein i mellanhjärnan och ländryggen hos en 15 månader gammal mus och en 7 månader gammal mus som uttrycker human A53T α-synuklein (Figur 6).

A53T-mutationen är överrepresenterad hos patienter med autosomal dominant Parkinsons sjukdom (PD). Dessutom kan humant α-synuklein med A53T-mutationen rekapitulera många av egenskaperna hos human PD när de uttrycks i möss 6,7. Fosforylering av α-synuklein vid Serine 129-återstoden har visats in vivo och in vitro för att inducera α-synukleinaggregering8. Lewey-kroppar är det klassiska histologiska fyndet som finns hos patienter med PD- eller Lewey body demens9. En majoritet av α-synuklein som finns i Lewey-kroppar fosforyleras vid Serine 12910,11. Som ett resultat används ackumuleringen av fosforylerat α-synuklein som en markör för den histologiska svårighetsgraden av PD-patologi. Den aktuella studien visar att fosforylerat α-synuklein ackumuleras på en signifikant högre nivå hos 15,5 månader gamla symtomatiska möss i förhållande till 7 månader gamla asymptomatiska möss som uttrycker humanT A53T α-synuklein. Detta överensstämmer med rapporter som beskriver en anrikning av cytopatologi i ryggmärgs främre horn och mellanhjärnan hos dessa möss. 6 Av detta dras slutsatsen att den förenklade perfusionsmetoden som beskrivs här ger högkvalitativ fixering av CNS-vävnader för nedströms histologisk karakterisering.

Figure 6
Figur 6: Etikett för fosforylerat α-synuklein i midhjärnan och ryggmärgsvävnader i ländryggen från en musmodell av Parkinsons sjukdom. Den åldrade (15,5 månader gamla) förlamade musen i slutstadiet jämförs med den 7 månader gamla friska musen. Båda mössen uttrycker en felveckningsbenägen mutantvariant (A53T) av humant α-synuklein som inducerar Parkinsons-liknande patologi. Skalstänger = 100 μm (övre paneler) och 50 μm (nedre paneler). Förkortning: α syn-A53T = A53T mutant av α-synuklein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; PS129 = fosforylerat serin 129 av α-synuklein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta arbete beskriver de kritiska stegen för att utföra transkardiell perfusion. Vid konstruktion av perfusionsapparaten (protokollavsnitt 1) är det viktigt att använda slangar som är tillräckligt flexibla för att helt täppas till av en hemostat. Vissa styva slangar kanske inte är tillräckligt ockluderade av en hemostat och kan fortfarande tillåta PFA att läcka in i huvudledningen under den första PBS-perfusionen. Vid beredning av 4% PFA-lösningen är det viktigt att säkerställa att pH-värdet är fysiologiskt (7.4). Eftersom beredningen av PFA-lösningen innebär att den upphettas till 65 °C måste lösningen kylas ned till 25 °C innan pH-värdet mäts, eftersom detta är den temperatur vid vilken pH kalibreras på mätaren.

När du gör det första snittet i buken måste man se till att undvika laceration av bukorganen (protokollavsnitt 2). När man dissekerar överlägset mot membranet är det viktigt att undvika laceration av levern eftersom det är vanligt att levern är vidhäftande med den främre bukväggen. För att övervinna detta dissekeras levern försiktigt och trubbigt bort från den främre väggen innan man fortsätter ett snitt mot membranet. När man kommer in i brösthålan genom membranet är det viktigt att undvika laceration av hjärtat, stora kärl och lungan. För att undvika detta hålls saxspetsen ytligt och i en spetsig vinkel med bröstkorgen.

Den första dissektionen för att exponera hjärtat tar cirka 2 minuter från det första snittet. Det förväntas att under denna tid har lite luft kommit in i spetsen på fjärilnålen. Införandet av denna luft i musens cirkulation kommer att ge perfusion av dålig kvalitet. Därför är det viktigt att huvudledningen öppnas och PBS spolas genom nålen omedelbart före kannulering av hjärtat för att ta bort luftbubblor. Helst kannuleras hjärtat medan en liten PBS-rännil flyter genom nålspetsen för att säkerställa fullständig frånvaro av luft vid punktering av LV.

När nålen kommer in i LV får den inte gå så djupt att nålspetsen förs in i höger kammare (RV). Placering av nålen i antingen husbilen eller bortom mitralventilen kommer att resultera i omedelbar "inflation" i lungorna när perfusion startas. Detta är oönskat, och nålen måste dras tillbaka något för att säkerställa LV-placering. Om nålen placeras ordentligt kommer lungorna att förbli plana under hela perfusionen. När perfusion initieras observeras det ibland att en klar vätska kommer ut ur djurets öppna mun. Detta beror vanligtvis på ett perfusionstryck som är för högt eller på grund av felplacering av nålen i hjärtat. Författarna spekulerar i att förhöjda perfusionstryck resulterar i extravasering av perfusatet från den arteriolära kapillärbädden och retrograd flöde av PBS via bronkialträdet i matstrupen och munhålan.

Perfusionstrycket måste sänkas genom att antingen minska PBS-nivån i PBS-flaskan eller genom att sänka PBS-flaskans höjd. Alternativt, om nålen placeras för djupt i vänster kammare, kan den färdas genom mitralventilen och leverera perfusat till vänster förmak. Detta kan resultera i retrograd flöde genom lungvenerna och extravasering av perfusat i arteriolerna, som beskrivits ovan. Grundlig clearance av blod från cirkulationssystemet med PBS är särskilt viktigt för att undvika fixativinducerad tvärbindning av blodkomponenter som resulterar i kärlocklusion vid efterföljande fixativ perfusion. Clearance bedöms effektivt genom en färgförändring i levern och PBS-flödet från ett snitt i den ventrala svansbasen. Blodclearance är i allmänhet komplett med 3 min perfusion med PBS; Men om visuella tecken på clearance uppträder vid kortare tidpunkter, introduceras fixativ tidigare än 3 min. Längre clearancetider rekommenderas inte eftersom fördröjd fixativ perfusion leder till artefakter i CNS finstruktur1.

När PFA administreras är det viktigt att övervaka nivån av PFA-lösning i PFA-flaskan. Fyll PFA-flaskan om nivån av PFA sjunker till mindre än 4 cm över PFA-flaskans mynning. Efter att perfusionen har slutförts måste perfusionsapparaten sköljas ordentligt med destillerat vatten. Detta är viktigt eftersom kvarvarande PFA i huvudledningen kommer att förorena den initiala PBS-perfusionen med PFA och resultera i perfusion av dålig kvalitet. Slutligen rekommenderas 25 G fjärilsnålar i allmänhet för medelstora vuxna möss i intervallet 20-30 g. Större eller mindre möss kan dock kräva något större eller mindre mätnålar utöver justeringen av fixeringsflaskorna för att ge optimala flödeshastigheter.

För CNS-dissektion och OCT-inbäddning (protokollavsnitt 3) är det vanligt att ryggmärgsvävnader inte helt sjunker i 30% sackaros. Dessa vävnader lämnas därför i sackaros i 2 dagar och sedan inbäddade i OCT, oavsett om de sjunker eller inte. Vid frysning av vävnader i OCT är det möjligt att vissa vävnader kan spricka när de placeras i kyld 2-metylbutan. Detta är vanligare med hjärnan och inträffar vanligtvis när för mycket OCT placeras på vävnaden. För att undvika detta, placera endast tillräckligt med OCT för att täcka vävnadsytorna före omedelbar frysning. I vissa protokoll är sprickbildning mindre vanligt trots fullständig nedsänkning i OCT. Detta beror vanligtvis på en långsammare frysningsmetod som när man använder torriskyld 2-metylbutan eller placerar kryomolen direkt på ett block av torris. Flytande kvävekyld 2-metylbutan är att föredra i detta arbete eftersom frysningshastigheten är betydligt snabbare och bättre kan bevara vävnadsmorfologin än långsammare frysningsmetoder.

Vid kryosektion av vävnaden (protokollavsnitt 4) är det viktigt att undvika flera frys-tina cykler. Därför är det optimalt att klippa alla sektioner från ett enda OCT-block för att få en specifik hjärnregion för analys istället för att tina och frysa om utvalda områden. Om detta inte är genomförbart, efter att ha fått några sektioner, kan användare frysa in igen och lagra OCT-blocken i djupfrysen -80 ° C 1-2 gånger till för framtida bruk.

De stora fördelarna med denna metod jämfört med mer traditionell pump- eller lufttrycksleverans av perfusat är följande: (1) låg kostnad och tillgänglighet för perfusionsapparaten. (2) Användare behöver inte manuellt upprätthålla trycket i perfusionsapparaten under hela perfusionen. (3) Lägre och mer konsekvent perfusionstryck än andra billiga alternativ för perfusion, t.ex. via spruttillförsel. Med hjälp av Bernoullis ekvation beräknas att den tyngdkraftsmatade perfusionsapparaten som konstrueras här kommer att upprätthålla ett perfusionstryck på cirka 73 mm Hg när perfusatflaskorna placeras på 1 m höjd i förhållande till nålen. Med tanke på att detta ligger betydligt under det systoliska blodtrycket hos dessa djur, är detta perfusionstryck sannolikt tillräckligt lågt för att undvika vaskulär bristning12.

Författarna har hittills framgångsrikt använt detta perfusionssystem för att detektera närvaron av fosforylerat α-synuklein i en musmodell av Parkinsons sjukdom. Under denna tid har signifikanta begränsningar med denna perfusionsmetod inte uppstått som inte finns med en pumpperfusionsleveransmetod. Den största begränsningen av denna teknik är den tidskrävande karaktären av perfusion kontra droppfixering. Denna teknik är att föredra framför droppfixering eftersom perfusion resulterar i djupare penetration av fixativ till CNS-strukturerna. En andra begränsning av denna teknik är att den kräver viss kirurgisk skicklighet att utföra, eftersom hjärtat måste kannuleras snabbt efter inträde i brösthålan. Men med erfarenhet kan utbildade användare rutinmässigt kanulera hjärtat inom 1 min efter det första snittet i buken.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar Xiaowen Wang, Liam Coyne och Jason Grullon för deras hjälp med att utveckla detta protokoll. Detta arbete stöddes av NIH-bidragen AG061204 och AG063499.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific 03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound Fisher Scientific NC1029572
Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors Amazon B0752XHK2X "fine scissors"
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G Fisher Scientific 14-826-5D
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G Fisher Scientific 14-826B
Corning PES Syringe Filters Fisher Scientific 09-754-29
Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Scientific SH30258
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder Fisher Scientific BP9703100
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps Fisher Scientific 16-100-110 "curved fenestrated forceps"
Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps Fisher Scientific 16-100-123 "curved fine forceps"
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122 "straight fine forceps"
Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends Fisher Scientific 21-401-5
Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates Fisher Scientific FB966J
Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50 Fisher Scientific 12-548-5M
Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel Fisher Scientific 13-820-074 "skin forceps"
Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks Fisher Scientific FB3002000
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-951-20 "dissecting scissors"
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-464
Fisherbrand Straight Locking Hemostats Fisher Scientific 16-100-115
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in. Fisher Scientific 14-174-1C
Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles Fisher Scientific 09-790-12F
Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID - Polypropylene - QC Fisher Scientific 01-000-686
Garvey Economy Single Edge Cutter Blade Amazon B001GXFAEQ
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488 ThermoFisher Scientific 35552
Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps Fisher Scientific 14-198-5A "hose clamps"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable Fisher Scientific NC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set Fisher Scientific 22-010-137 "butterfly needle"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06-666
Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36962
Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles ThermoFisher Scientific 2425-0506 "buffer bottles"
PAP pen abcam ab2601
Paraformaldehyde Granular Electron Microscopy Systems 19210
Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm Fisher Scientific 15-242D
Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y] abcam ab51253
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465-2.5kg
Stainless Steel Drinking Cup 18-oz amazon B0039PPO9U
Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1 Us Biological S8010
Triton X-100 Us Biological T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP MWI Animal Health 502017

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).
  2. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
  3. McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146 (2019).
  4. Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).
  5. Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
  7. Martin, L. J., et al. Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
  8. Fujiwara, H., et al. alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).
  9. Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
  10. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
  11. Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).
  12. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).

Tags

Neurovetenskap utgåva 179
En gravitationsmatad transkardiell perfusionsmetod för histologisk analys av musens centrala nervsystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J.… More

Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J. A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System. J. Vis. Exp. (179), e63386, doi:10.3791/63386 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter