Summary
En protokol, der skitserer dannelsen af humane blastoider, der effektivt, rettidigt og sekventielt genererer blastocystlignende celler.
Abstract
En model af den humane blastocyst dannet af stamceller (blastoid) ville understøtte videnskabelige og medicinske fremskridt. Imidlertid vil dens prædiktive kraft afhænge af dens evne til effektivt, rettidigt og trofast at rekapitulere sekvenserne af blastocystudvikling (morfogenese, specifikation, mønster) og til at danne celler, der afspejler blastocyststadiet. Her viser vi, at naive humane pluripotente stamceller dyrket under PXGL-forhold og derefter tredobbelt hæmmet for flodhesten, transformerende vækstfaktor- β og ekstracellulære signalregulerede kinaseveje effektivt gennemgår morfogenese for at danne blastoider (>70%). I overensstemmelse med udviklingstid (~ 4 dage) ruller blastoider blastocystsekvensen af specifikation ved at producere analoger af trofoblast og epiblast efterfulgt af dannelsen af analoger af den primitive endoderm og de polære trofoblaster. Dette resulterer i dannelsen af celler transkriptionelt svarende til blastocystet (>96%) og et mindretal af postimplantationsanaloger. Blastoider mønstrer effektivt ved at danne den embryonale-abembryoniske akse præget af modningen af polarområdet (NR2F2+), som erhverver det specifikke potentiale til retningsbestemt at binde sig til hormonelt stimulerede endometrieceller, som i utero. En sådan human blastoid er en skalerbar, alsidig og etisk model til at studere menneskelig udvikling og implantation in vitro.
Introduction
Manglen på eksperimentelle modeller har begrænset forståelsen af tidlig human embryogenese. Den nuværende viden om menneskespecifikke aspekter af embryonal udvikling stammer fra overskydende embryoner til in vitro-befrugtning (IVF), der doneres til forskning. Den begrænsede tilgængelighed, vanskelighederne ved eksperimentelle manipulationer og embryonernes varierende kvalitet hindrer imidlertid videnskabelige undersøgelser. Tværtimod vil en trofast in vitro-model af menneskelige embryoner give mulighed for komplekse eksperimentelle manipulationer og dermed give en etisk mulighed for at supplere forskningen i menneskelige embryoner 1,2,3,4. En tidligere udviklet model af museeksplosyster kombinerede museembryonale stamceller og trofoblaststamceller5. I denne detaljerede protokol beskrives en metode til at generere en model af den humane blastocyst fra naive pluripotente stamceller, der er tro mod elementære blastocystkriterier, 6.
Fire kriterier for humane blastoider. Her, i et forsøg på at etablere en standardiseret definition af humane blastoider, foreslår vi fire minimale kriterier. Selv om disse kriterier ikke er udtømmende, kan de tjene som grundlag for at evaluere de parametre, der tillader dannelse af humane blastoider (figur 1A). (1) Blastoider bør dannes effektivt med hensyn til morfologi og generering af analogerne i de tre slægter, nemlig epiblast (Epi), trofektoderm (TE) og primitiv endoderm (PrE). Ineffektivitet vil sandsynligvis pege på en utilstrækkelig indledende celletilstand eller / og dyrkningstilstand (f.eks. Blastoidmedium). (2) Blastoider bør generere analoger af de tre slægter i henhold til udviklingssekvensen (Epi/TE først, PrE/polarTE sidst)7,8 og timing (induktion ~ 3 dage; embryonale dage 5-7)7,9. (3) Blastoider bør danne analoger af blastocyststadiet, men ikke af postimplantationsstadier (f.eks. epiblast, trofoblast eller amnionceller efter implantation). (4) Endelig bør blastoider være i stand til at rekapitulere funktionelle træk ved blastocystimplantation og -udvikling. Ved hjælp af denne protokol dannes humane blastoider effektivt ved hjælp af flere cellelinjer (>70%), er i stand til at generere blastocystcellulære analoger sekventielt og inden for 4 dage, og analogerne ligner transkriptionelt blastocyststadiet (>96% baseret på flere analyser)6,10,11. Endelig genererer blastoider robust den embryonale-abembryoniske akse, som gør det muligt for dem at interagere med hormonelt stimulerede endometrieceller gennem polarområdet og robust udvide slægterne ved udvidet kultur (tidsækvivalent: embryonal dag 13).
Betydningen af den oprindelige celletilstand. Humane pluripotente stamceller (hPSC'er) kan stabiliseres i forskellige tilstande, der forsøger at fange præcise udviklingsstadier. Disse tilstande opretholdes af dyrkningsbetingelser, der, selvom de stadig er suboptimale, begrænser celler i en præimplantations- (~ embryonale dage 5-7) eller postimplantationslignende (~ embryonale dage 8-14) epiblaststadium12. Transkriptomisk analyse viste, at hPSC'er dyrket i PD0325901, XAV939, Gö6983 og leukæmihæmmende faktor (LIF; betegnet PXGL naive hPSC'er)13,14 ligner mere blastocystepyblasten sammenlignet med hPSC'er dyrket i fibroblastvækstfaktor (FGF) 2 og activin15 (betegnet primede hPSC'er12) og til humane udvidede pluripotente stamceller (hEPSC'er)16 (se analyse i reference17, 18,19). Følgelig matcher transkriptomet af grundede hPSC'er bedst med en cynomolgus-abeepiblast efter implantation/præ-gastrulation20. Yderligere molekylære kriterier, som transposonekspression, DNA-methylering og X-kromosomtilstand, bekræftede, at variationer af den naive tilstand mere ligner blastocystepyblasten sammenlignet med den grundede tilstand17,21. Endelig er linjer af naive hPSC'er med succes blevet afledt direkte fra blastocysts ved hjælp af PXGL-kulturbetingelser22.
Humane tidlige blastocystceller er endnu ikke begået. Murine afstamningsspecifikation forekommer fra morula-stadiet, der går forud for blastocyststadiet23. Tværtimod har dissociations- og reaggregeringsforsøg vist, at de humane troftektodermceller fra tidlige blastocysts endnu ikke er begået24. Følgelig har analyse af cellerne i humane blastocysts ved enkeltcellet RNA-sekventering (scRNAseq) vist, at den første afstamningsspecifikation (trofoblast/epiblast) forekommer efter dannelsen af blastocysthulrummet7. Denne udskudte menneskelige specifikation korrelerer med observationer om, at hPSC'er er potente til at danne trofoblaster 25,26,27, når muse-PSC'er stort set er forpligtet til epiblast-slægten. Disse kombinerede observationer førte til muligheden for, at naive hPSC'er afspejler et blastocyststadium og bevarer potentialet til at danne de tre blastocyst-slægter. På det seneste er hPSC'ernes styrke til at specificere ekstraembryonale analoger blevet foreslået at skifte fra trophektoderm til amnion under progression fra naiv til primet tilstand27. Således ligner naive hPSC'er mere præimplantationstrinnet17,18,21 og har en forbedret kapacitet til at danne trofoblaster sammenlignet med primede hPSC'er27, hEPSC'er16 eller mellemliggende omprogrammerede tilstande28, som er tilbøjelige til at danne postimplantationsanaloger10 (figur 1B ). Den oprindelige celletilstand er således afgørende for dannelsen af de relevante ekstraembryonale analoger. Selvom der stadig mangler at blive foretaget en grundig side-om-side-analyse af konverterede trofektodermanaloger, synes en PXGL-naiv tilstand, der afspejler den tidlige blastocyst, vigtig for at danne blastoider med høj troskab.
Tilskyndelse til specifikation og morfogenese ved at signalere veje hæmning. Hæmningen af hippo-signalvejen er en bevaret mekanisme, der driver trofoblastspecifikation hos mus, køer og mennesker 9,29,30. Siden 2013 er det også kendt, at hæmningen af NODAL (A83-01) og den ekstracellulære signalregulerede kinase (ERK; PD0325901 eller tilsvarende) og aktiveringen af knoglemorfogenetisk protein (BMP) signalveje udløser primede hPSC'er for at aktivere transkriptionsnetværket forbundet med trofoblastafstrækken 25,31,32,33,34. Desuden bekræftede flere rapporter for nylig også, at hæmningen af både NODAL- og ERK-vejen og aktiveringen af BMP letter trofoblastdifferentieringen fra naive hPSC'er 25,31,32,33,34. Endelig, hvis trofoblastspecifikation udløses fra en naiv tilstand, rekapitulerer celler aspekter af trophektodermensudviklingsprogression 26. Imidlertid er selvfornyende linjer, der afspejler blastocysttropektodermen, ikke blevet stabiliseret in vitro. Efter trofoblastspecifikationen kan induktion af den epidermale vækstfaktor (EGF) og Wnt-signalveje sammen med HDAC-hæmning lette trofoblastudviklingsprogression34,35 og stabilisere celler i linjer af humane trofoblaststamceller (hTSC'er), der afspejler cytotrofoblaster efter implantation18,35. Sådanne linjer kan udledes både af blastocysts og placentavæv35.
Den anden ekstraembryonale slægt, betegnet PrE, er specificeret efter trofoblaster og stammer fra epiblasten 7,9. I modsætning til murine PrE36 menes den menneskelige modstykke at være uafhængig af FGF, der signalerer 37,38. Linjer, der afspejler den ekstraembryonale endoderm (nævnt nEnd), blev etableret fra naive hPSC'er ved induktion af signalveje ved hjælp af activin A, Wnt og LIF39. Uforenelig med embryohæmningsforsøg har ERK-hæmning vist sig at forhindre dannelsen af sådanne nEND-celler in vitro39. Indtil nu er sådanne linjer ikke afledt direkte fra blastocysts.
På det seneste er modeller af det tidlige embryo blevet dannet ved at kombinere variationer af de medier, der tidligere er udviklet til hTSCs35- og nEND-celler39, således ved hjælp af aktivatorer af den transformerende vækstfaktor - β (TGF-β), EGF og Wnt-signalveje28,40. Disse embryomodeller dannes ved lav effektivitet (10%-20%) og danner celler, der ligner post- snarere end præimplantationstrin10, herunder analoger af epiblasten efter implantation, trofoblast, amnion, gastrula, mesodermalt væv (~ embryonal dag 14) og cytotrophoblaster10. Tværtimod styrer en tredobbelt hæmning af Hippo-, ERK- og TGF-β-vejene effektivt dannelsen af blastoider, der omfatter blastocystlignende celler41. Sammen med den oprindelige celletilstand foreslår vi, at tredobbelt vejhæmning (Hippo, ERK, TGF-β) er den anden væsentlige parameter til dannelse af high-fidelity blastoider (figur 1B).
Evaluering af celletilstanden og det reflekterede stadium ved hjælp af scRNAseq. Tilstandene af celler, der komponerer blastoider, kan evalueres gennem scRNAseq-analyse. Deres transkriptionelle lighed med specifikke embryonale stadier kan måles ved hjælp af blastoidceller alene og ved sammenligning med primede hPSC'er eller hTSC'er, der afspejler postimplantationstrin20,35. Udførelse af klyngeanalyser ved hjælp af forskellige definitionsniveauer afslører, hvordan delpopulationer gradvist smelter sammen, når definitionen falder, hvilket afslører klyngernes ligheder. Selv om optimaliteten i antallet af klynger kan måles42, informerer højopløsningsklyngedannelse også om den eventuelle forekomst af små unormale delpopulationer, f.eks. afspejler postimplantationsfaserne10. De gener, der udtrykkes forskelligt mellem klynger, kan give information om deres analoger i udviklingsprocessen ved at vurdere ekspressionsniveauerne af referencegensæt, der definerer stadiespecifikke slægter. Dette gør det muligt at måle berigelsen af blastoidsubpopulationer enten ved hjælp af uovervågede afstandskort (f.eks. ved hjælp af topberigede gener) eller ved hjælp af gensætberigelsesanalyse (GSEA)43. Ved hjælp af denne blastoidprotokol dannes kun tre hovedklynger, der transkriptionelt afspejler de tre blastocyst-slægter. En klynge omfatter både de oprindelige naive hPSC'er og epiblastanalogen af blastoiderne. Analyse af celler på forskellige tidspunkter viste den sekventielle karakter af slægtsspecifikation (trofoblaster begynder at specificere inden for 24 timer og primitive endodermceller inden for 60 timer). En højopløsningsklynge fangede en underpopulation af celler (3,2%), der udtrykte gener, der er specifikke for embryoner i gastrulationsstadiet (muligvis mesoderm eller amnion). Det bemærkes, at de oprindelige naive hPSC'er også omfattede 5% af postimplantationslignende celler, som tidligere beskrevet44. I en anden analyse kan blastoidceller fusioneres i silico med referenceceller isoleret fra concepti på forskellige stadier 45,46,47 for at udlede stadieækvivalens. Her blev celler isoleret fra præimplantationskoncepti45,46, in vitro-dyrkede blastocyster45 og embryoner i gastrulationsstadi47 anvendt som referencepunkter. Ved hjælp af denne protokol blev det kvantificeret, at de uoverensstemmende blastoidceller afsløret ved højopløsningsklynger faktisk klynger med postimplantationsmesoderm og amnion. I fremtidige trin bør transkriptombenchmarking suppleres med analyse af transposonekspression, DNA-methylering og af X-kromosomstatus, der også giver milepæle for udviklingsstadier21.
Evaluering af aksedannelse og andre funktioner af humane blastoider. En moden blastocyst er kendetegnet ved dannelsen af de embryonale-abembryoniske aksemønstrende trofoblaster til implantation. Ved hjælp af denne blastoidprotokol dannes en akse robust eksemplificeret ved en modning af de proksimale trofoblaster (f.eks. NR2F2 +/CDX2-), der kun opnår evnen til at binde sig til endometrieorganoidceller, når de er hormonelt stimulerede48,49. Sammenligning med trofosfærer, der ikke danner epiblasten, viser, at disse indre celler inducerer tilstødende trofoblaster til at modnes for at formidle den oprindelige vedhæftning til endometrium. Når de dyrkes i et udvidet kulturmedium designet til cynomolgus abeblastocysts50, udvides alle tre slægter fra blastoiden konsekvent i yderligere seks dage (tidsækvivalent til dag 13), selvom deres organisation ikke afspejler dette udviklingsstadium.
Implikationen af højeffektive og high-fidelity humane blastoider. Bevarelsen af udviklingsprincipper, der blev opdaget i modelorganismer, er i sagens natur vanskelig at teste i det menneskelige koncept på grund af den begrænsede adgang og de tekniske vanskeligheder ved genetisk og fysisk at manipulere det. En højeffektiv blastoidmodel med høj nøjagtighed vil give mulighed for genetiske og lægemiddelscreeninger med høj kapacitet, som er grundlaget for videnskabelige og biomedicinske opdagelser. Desuden vil inkorporeringen af komplekse genetiske modifikationer for at ændre og registrere biologiske processer supplere sådanne undersøgelser. Samlet set foreslår vi, at den tredobbelte hæmning (Hippo, TGF-β, ERK) af naive PXGL hPSC'er er ledende for effektiv dannelse af humane blastoider med høj troskab, der overholder de fire minimale kriterier. Den skalerbare og alsidige karakter af denne protokol gør den velegnet til at generere målrettede hypoteser, der derefter kan valideres ved hjælp af humane blastocysts. Som sådan vil humane blastoider ikke erstatte brugen af human conceptus til in vitro-forskning , men kan fungere som en stærk måde at kanalisere forskning gennem tidligere utilgængelige eksperimentelle tilgange i hjertet af den videnskabelige og biomedicinske opdagelsesproces. Protokollen viser, hvordan man danner humane blastoider, og også hvordan man analyserer de celler, der er indeholdt i blastoiden.
Protocol
Retningslinjerne for stamcelleforskning og klinisk oversættelse fra International Society for Stem Cell Research (ISSCR) anbefaler, at forskning i humane blastoider kun er tilladt efter gennemgang og godkendelse gennem en specialiseret videnskabelig og etisk gennemgangsproces 3,4. Alle de eksperimentelle procedurer blev udført ved at følge retningslinjerne fra den humane forskningsetiske komité ved Institut for Molekylær Bioteknologi ved det østrigske videnskabsakademi (IMBA) under godkendelse Rivron_Stellungnahme_2020-04-22. Overholdelse af disse retningslinjer er nødvendig for at offentliggøre forskningsresultater i videnskabelige tidsskrifter.
1. Kultur af human naiv embryonal stamcelle i PXGL-tilstand
BEMÆRK: Naive hPSC'er kan fås fra relevante laboratorier. Linjer, der anvendes her, blev hentet fra laboratorierne Yasuhiro Takashima (i øjeblikket på CiRA, Kyoto, Japan) og Austin Smith (i øjeblikket ved Living Systems Institute, Exeter, UK). Alternativt kan naive hPSC'er genbosættes internt fra linjer af grundede hPSC'er som beskrevet tidligere13,14. Naive hPSC'er synes stabile for flere passager (> 15), men kulturens kvalitet kan variere over tid. Hvis kvaliteten af naiv hPSC falder, skal du optø et nyt hætteglas med celler eller generere de novo naive hPSC'er fra grundede PSC'er. For alle mediesammensætninger se supplerende tabel 1.
- Fremstilling af bestrålet museembryonale feederlag (MEF'er)
- Dagen før passaging af naive hPSC'er skal du forberede en 6-brønds cellekulturplade med bestrålede MEF-lag ved at følge nedenstående trin.
- Belæg en 6-brønds cellekulturplade med 1 ml 0,1% gelatine i PBS pr. Brønd. Inkuber pladen ved 37 °C i 30 min. Fjern gelatineopløsningen.
- Mef-medium fremstilles ved 37 °C.
- Tø MEF'er op i et vandbad ved 37 °C, indtil der kun er en lille isklump tilbage. Hætteglassets volumen opløses med 1 ml fremstillet MEF-medium ved hjælp af en P1000-pipette.
- Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør. Affjedringen drejes ned ved 200 x g i 4 min. Aspirer supernatanten og resuspend MEF-pelleten ved at tilsætte frisk MEF-medium (tilstrækkelig til 1,5 ml pr. Brønd).
- Tæl cellerne ved hjælp af celletællingsdias, og tilsæt 300.000 celler pr. brønd, og overfør pladen til en normoxy-inkubator ved 37 °C.
BEMÆRK: Hvis MEF'er løsnes over tid, kan friske MEF'er tilføjes til PXGL-mediet under rutinemæssig medieændring.
- Passaging af humane naive pluripotente stamceller
- Før du passerer hPSC'er, skal du kontrollere deres morfologi under mikroskopet. Kolonier har typisk en kuppelformet morfologi med lyse, definerede grænser. Hvis de enkelte kolonier viser en fladere morfologi, eller hvis differentierede kolonier begynder at dukke op, skal du følge instruktionerne i trin 1.2.8.
- Aspirer mediet og vask cellerne med PBS en gang. Tilsæt 500 μL celleløsningsopløsning pr. Brønd af en 6-brønds plade.
- Inkuber cellerne i 5 minutter ved 37 °C. Brug en P1000-pipette og pipette cellerne flere gange for at adskille kolonierne i enkeltceller.
- Saml cellerne og overfør dem til et 15 ml rør indeholdende vaskebuffer (1 ml pr. Brønd af en 6-brønds plade ). Spin ned cellerne ved 200 x g i 4 min.
- Aspirer supernatanten og resuspend pellet i frisk PXGL medium (tilstrækkelig til 1,5 ml pr. Brønd). Overvej et opdelingsforhold på 1: 3-1: 6 for rutinemæssig passaging.
BEMÆRK: Efter hver 3-4 passager, eller hvis kvaliteten af cellekulturen falder baseret på cellemorfologien (f.eks. Fremkomsten af flade kolonier i befolkningen), tilsættes 10 μM Y-27632 og vækstfaktor kældermembranekstrakt (5 μL / brønd) til mediet i løbet af de første 24 timer efter passaging. - Før du replaterer hPSC'erne, skal du forberede pladerne med friske MEF'er ved at aspirere MEF-mediet og vaske cellerne en gang med PBS. Brug derefter en P1000-pipette til at overføre 1,5 ml hPSC-cellesuspension pr. brønd på en 6-brøndsplade, der indeholder MEF'erne.
BEMÆRK: Sørg for, at pipettering fører til en homogen såning af cellerne på tværs af brøndområdet. Dette vil sikre væksten af kolonier med homogene størrelser og relativ synkronisering af cellerne. - Dyrkning af hPSC'er under hypoxiske forhold ved 37 °C i et befugtet miljø. Efter 24 timer skal hPSC'er fastgøres. Et stort antal ikke-klæbende (eller flydende) celler afspejler et problem med levedygtighed eller tilknytning ved passage.
- Skift medium med 1,5 ml PXGL-medium pr. Brønd dagligt. Passage hPSC'er hver 3-4 dage eller brug dem til blastoiddannelsesforsøg.
BEMÆRK: Efter optøning af hPSC'er skal du passere dem i mindst tre passager, før du starter et blastoideksperiment.
2. Dannelse af blastoider
- Dannelse af naive PSC-aggregater
- Forbered og forvarm PXGL-mediet, N2B27 basalmediet, vaskebufferen, PBS og aggregeringsmedierne, inden eksperimentet påbegyndes. Ekskluder MEF'er fra hPSC-suspensionen til dannelse af blastoider ved at følge nedenstående trin.
- Til UDELUKKELSE af MEF fremstilles en gelatinebelagt plade ved at tilsætte 1 ml 0,1 % gelatine i brønden på en 6-brønds plade og inkuberes ved 37 °C i 30-90 minutter.
- For at høste cellerne skal du aspirere mediet og vaske cellerne med 1 ml PBS.
- Der tilsættes 500 μL celleløsningsopløsning (pr. brønd på en 6-brøndsplade) og inkuberes ved 37 °C i 5 minutter.
- Kontroller cellerne under mikroskopet for at følge dissociationen af kolonier i enkeltceller (et par multicellulære klumper kan dissocieres senere ved blid pipettering).
- Fortynd celleløsningsopløsningen med 1 ml vaskebuffer. Saml cellerne fra pladen ved forsigtigt pipettering 5 til 10 gange. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml rør. Spin ned cellerne ved 200 x g i 4 min.
- Aspirer supernatanten, resuspender cellerne i 1,5 ml PXGL-medium (pr. brønd på en 6-brønds plade) og frø cellerne på de gelatinebelagte plader til MEF-udelukkelse og inkuber ved 37 ° C i 60-90 minutter.
- Når de naive celler er podet til MEF-udelukkelse, skal PBS fjernes fra mikrobrønde og ligestille brøndene med 200 μL basalT N2B27-medium (pr. 1 mikrobrøndchip) og inkuberes i 60 minutter ved 37 ° C.
- Saml supernatanten, der indeholder de ikke-fastgjorte naive celler, overfør den til et 15 ml rør, og drej cellerne ned ved 200 x g i 4 minutter.
- Aspirer medierne og resuspend cellerne i 1 ml N2B27 basalmedie. Tæl cellerne ved hjælp af celletællingsdias. Spin ned cellerne ved 200 x g i 4 min.
- Aspirere mediet og tilsæt en passende mængde på 10 μM Y-27632 indeholdt i N2B27-medier for at opnå en celletæthed på 30.000 celler pr. 50 μL.
BEMÆRK: Optimalt indledende såcellenummer kan variere mellem de forskellige cellelinjer. For eksempel til frø 50-60 celler / mikrobrønd, 30.000 celler (inklusive overskud i betragtning af at nogle celler falder uden for mikrobrønden) podet i 1 brønd af 96 brøndplade, der indeholder 430 mikrobrønde. Et uhensigtsmæssigt startcelletal kan resultere i, at den lille aggregatdannelse uden hulrum eller dannelse af kaviteret struktur når mere end 250 μm. - Aspirer mediet fra ligevægtige mikrobrøndarrays, og tilsæt 25 μL N2B27-medier med 10 μM Y-27632. Tilsæt 50 μL cellesuspension og inkuber ved 37 °C i 15 minutter (indtil cellerne falder ned i bunden af mikrobrønden). Derefter tilsættes 125 μL N2B27-medium suppleret med 10 μM Y-27632.
- Blastoid udvikling
- Inden for 24 timer kan aggregater af naive hPSC'er observeres (dag 0) på mikrobrøndchippen. For at starte blastoiddannelse skal du forberede PALLY-medium og følge nedenstående trin.
- Forvarm PALLY medium ved 37 °C i 30 min.
BEMÆRK: 1-Oleoyl lysophosphatidsyre (LPA) og 10 μM Y-27632 skal tilsættes lige før brug. Den optimale koncentration af LPA varierer mellem 0,5-5 μM. Dette skal titreres for individuelle hPSC-linjer, der anvendes til blastoider. - Aspirer aggregeringsmediet. Tilsæt 200 μL forvarmet PALLY-medium til mikrobrøndene. Cellekulturpladen anbrings tilbage i en hypoxisk inkubator ved 37 °C. Gentag medieændringen på dag 1.
- På dag 2 skal du fjerne PALLY medium og tilføje 200 μL N2B27 medium suppleret med LPA og 10 μM Y-27632.
BEMÆRK: På dag 2 fortsætter størstedelen af aggregaterne med at vokse. Imidlertid danner nogle aggregater små hulrum. Kontinuerlig dyrkning af blastoider i PALLY indtil dag 4 eller in vitro-dyrkningsmedium (IVC1) fra dag 2 og fremefter. Efter denne medieændring forbedrer imidlertid dannelsen af PrE i modne blastoider. - Gentag medieændringen på dag 3. Komplet blastoiddannelse sker på dag 4.
BEMÆRK: Blastoider anses for at være fuldt udviklede, når de har gennemgået fuldstændig morfogenese baseret på morfometri af dag 7 humane blastocyster (f.eks. Et diameterområde fra 150-250 μm; en indre klynge omgivet af et epitel af trophektodermlignende celler) og har dannet polære trophektodermlignende celler (NR2F2 +/CDX2-) og PrE-lignende celler (GATA4+). Dette kan vurderes ved hjælp af immunofluorescensfarvning eller fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
3. Dannelse af blastoider i 96-brønds mikroplader med ultralav fastgørelse
- Forbered naiv hPSC-cellesuspension til blastoiddannelse ved at følge de ovenfor beskrevne trin fra 2.1.1 - 2.1.11.
- Aspirere mediet og tilsæt en passende mængde N2B27-medier indeholdende 10 μM Y-27632 for at opnå celletætheden på 70 celler pr. 100 μL af mediet.
BEMÆRK: Optimalt indledende såcellenummer kan variere mellem forskellige cellelinjer. For eksempel kan 70 celler / brønd være det optimale celletal for de fleste cellelinjer. - Centrifugering af pladen ved 200 x g i 2 min ved stuetemperatur til klyngeceller i bunden af brøndene.
- Inkuber pladen i en inkubator ved 37 °C under hypoxiske dyrkningsbetingelser. Inden for 24 timer kan aggregater af naive hPSC'er observeres (dag 0) på brøndene.
- Forbered 2x PALLY medium. Tilsæt 100 μL forvarmet 2x PALLY medium til brøndene.
- Cellekulturpladen anbrings tilbage i en hypoxisk inkubator ved 37 °C. Efter 24 timer aspirerer halvdelen af mediet (100 μL) og erstatter det med 100 μL forvarmet PALLY-medium. Gentag trinnet indtil dag 4. Sørg for ikke at aspirere aggregaterne.
BEMÆRK: På dag 2 fortsætter størstedelen af aggregaterne med at vokse. Nogle aggregater har dog små væskefyldte hulrum. På dag 4 gennemgår størstedelen af de kaviterede strukturer fuldstændig morfogenese for at danne blastocystlignende strukturer.
4. Dannelse af trofosfærer
- For trofosfæredannelse skal du følge blastoiddannelsesprotokollen fra trin 2.1.1 (MEF-udelukkelse) til trin 2.1.12 (sidste trin i såningsprotokollen).
- Når aggregater af naive hPSC'er er dannet efter 24 timer, udveksles aggregeringsmediet med PALY (uden LIF) suppleret med 3 μM SC-144 til dannelse af trofosfærer, der repræsenterer tidlig trotrophektoderm og PALLY suppleret med 2 μM XMU-MP-1 til dannelse af trofosfærer, der repræsenterer moden trotrophektoderm.
- Opdater mediet dagligt. Komplet trofosfæredannelse sker på dag 4.
5. Analyse af blastoidcellernes tilstand og dens reflekterede stadium ved hjælp af scRNAseq
- For at afhente blastoider og udføre dissociation skal du opvarme rysteinkubatoren til 37 ° C og indstille den til 100 o / min.
- Saml blastoider fra den oprindelige 96-brønds plade og overfør dem til flere brønde i en U-bund 96-brøndplade ved hjælp af en mundpipet udstyret med en glaskapillær.
BEMÆRK: Blastoider (> 70%) bør vælges ud fra de morfometriske kriterier (størrelse = 150-250 μm med en unik indre klynge) for at undgå forurening med ikke-blastoidstrukturer (< 30%). - Vask en gang med 200 μL PBS ved hjælp af en P200 ved at se under et stereomikroskop. Overfør til en brønd indeholdende 50 μL kollagenase og inkuber i 30 minutter i rysteinkubatoren.
- Overfør blastoiderne til en brønd med 100 μL 10x trypsin-EDTA og bland godt. Inkuber i 20 minutter i rysteinkubatoren.
- Dissocier blastoiderne i en enkelt celle ved hjælp af P200-pipette. Overfør cellerne til et 15 ml rør med FACS-buffer (1% FBS i PBS).
- For at fange specifikke forhold mellem analogerne af de tre slægter skal du plette TE- og PrE-analogerne med henholdsvis TROP2- og PDGFRa-antistoffer.
BEMÆRK: Antallet af PrE-celler i humane blastocysts er mindre sammenlignet med museeksplosysterne, hvilket kan afspejle udviklingsdefekter af blastocysts dannet ved in vitro-befrugtning (IVF) eller en artsforskel. I blastoider er PrE-analogerne mindre rigelige end TE- og EPI-analogerne og repræsenterer 7,4% af cellerne ved tælling af GATA4+ celler ved immunofluorescensbilleddannelse. Dissociationsprocessen kan også inducere forstyrrelser i proportionerne af de forskellige celletyper som PrE-analoger til at repræsentere 1% -2% af cellerne ved blastoiddistsociation, PDGFRa-mærkning og FACS-analyse. - FACS-sorteringsceller fra alle tre slægtsanaloger til 384-plader, der indeholder en lysisbuffer til smart-seq2-analyse. Ekskluder døde celler markeret med DAPI-farvning (udført i henhold til producentens anvisninger).
- For at evaluere celletilstandene (celletype og udviklingsstadium) skal du sammenligne de transkriptomiske data fra blastoid med de relevante kontroller.
6. Udvidet kultur til vurdering af blastoidudviklingsprogression
- Kultur humane blastoider på kældermembran matrixbelagte plader (glasbund).
- Belæg pladen med kældermembranmatrix.
- Undersøg visuelt blastoiderne for at vurdere og registrere morfologi.
BEMÆRK: Kun blastoider, der viser den klassiske hule kugleblastocystmorfologi med kompakt ICM, har potentialet til at vokse og udvikle sig yderligere. - Tilsæt 100 μL CMRL medium-1 pr. En brønd af 96-brøndspladen, og læg pladen i inkubatoren mindst 2 timer, før blastoider overføres til ligevægt.
- Ved hjælp af et stereomikroskop skal du visuelt identificere blastoiderne med god morfologi, overføre de valgte blastoider i en brønd med 96-brønds plade indeholdende 100 μl CMRL medium-1 for at fjerne sporene af blastoidmedier.
- Overfør blastoiderne til brønden, der indeholder præ-ligevægtige CMRL media-1. Læg pladen i inkubatoren og inkuber ved 37 ° C natten over.
BEMÆRK: Op til 5 blastoider kan dyrkes i en brønd med 96 brøndplader. At have for mange blastoider i en enkelt brønd kan føre til dannelse af aggregater af flere blastoider. - Den næste dag skal du visuelt inspicere blastoiderne under et mikroskop. Hvis blastoiderne er fastgjort, tilsættes 100 μL præ-ligevægtet CMRL media-1 suppleret med 5% kældermembranmatrix. Læg pladen i inkubatoren og inkuber ved 37 °C natten over.
- Den næste dag skal du overvåge blastoiderne under et mikroskop. Fjern halvdelen af mediet (100 μL), og udskift det med 100 μL præ-ligevægtet CMRL-media-2 suppleret med 5% kældermembranmatrix.
- På de følgende dage skal halvdelen af mediet (100 μL) udskiftes med præ-ligevægtig CMRL media-3 suppleret med 5% kældermembranmatrix. Læg pladen i inkubatoren og inkuber ved 37 °C natten over. Gentag hver dag i op til 4-6 dages in vitro-kultur .
BEMÆRK: Vi har dyrket blastoider i op til 6 dage under udvidede dyrkningsbetingelser, hvilket svarer til tidsækvivalenten på dag 13 af in vitro-dyrkede menneskelige embryoner.
7. Immunstainerende blastoider
- Aspirer mediet. Vask prøver 3x med PBS i 5 min.
- Tilsæt 200 μL koldt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS og fastgør prøverne i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern PFA-opløsningen og vask prøverne 3x med PBS i 10 min.
BEMÆRK: Hvis blastoider blev dyrket på mikrobrøndchips, skal blastoiderne overføres fra chippen til U-bundplader med 96 brønde i de følgende trin. - Permeabilisere og blokere blastoiderne i 100 μL blokerende opløsning pr. brønd (PBS indeholdende 0,3% Triton-X 100 og 10% normalt æselserum) i 60 minutter.
BEMÆRK: Afhængigt af antistoffernes værtsart skal du tilpasse serum i overensstemmelse hermed. - Fjern blokeringsløsningen. Tilsæt 100 μL primære antistoffer fortyndet i frisk blokerende opløsning og inkuber prøver natten over ved 4 ° C.
BEMÆRK: Koncentrationerne af primære antistoffer skal bestemmes ud fra producentens anvisninger. - Vask prøver 3x med 0,1% Triton-X 100 i PBS (vaskeopløsning) i 10 min. Der tilsættes 100 μL sekundære antistoffer i blokerende opløsning sammen med 20 μg/ml Hoechst-kerneplet, og der inkuberes prøver i 1 time ved stuetemperatur. Beskyt prøver mod lys.
BEMÆRK: Koncentrationerne af sekundære antistoffer skal bestemmes ud fra producentens anvisninger. - Vask prøver 3x med vaskeopløsning i 10 min. Til billeddannelse overføres prøverne til glasbunden μ-dias i PBS.
BEMÆRK: Monteringsmediet skal vælges ud fra det mål, der bruges til billeddannelsen. For eksempel er 80% glycerol i PBS muligt at bruge til montering af prøverne, mens du bruger oliemål.
Representative Results
Typisk er naive hPSC'er dyrket i PXGL (figur 2A) aggregerede og kaviterede strukturer, der opstår mellem 48 og 72 timer efter PALLY-induktion og når en diameter på 150-250 μm inden for 96 timer (figur 2B). Ved hjælp af optimale (1) såcelletal, (2) varighed af prækulturaggregering med N2B27 (0 til 24 timer), (3) koncentration af individuelle kemiske komponenter (især LPA) og (4) varighed af PALLY-behandling når induktionseffektiviteten 70% -80% som defineret baseret på morfometriske parametre (samlet størrelse på 150-250 μm, enkelt regelmæssigt hulrum, enkelt indre celleklynge; Figur 2C,D) og tilstedeværelsen af de tre slægter. En suboptimal indledende celletilstand og / eller induktionsbetingelser vil resultere i mindre effektiv eller ingen blastoiddannelse. For at sikre maksimal effektivitet og kun danne præimplantationsanaloger er det afgørende at anvende en kultur af høj kvalitet af naive PXGL hPSC'er. Dette kan vurderes ved at måle ved HJÆLP af FACS procentdelen af celler, der er positive for overflademarkørerne SUSD2 (naiv tilstand) og CD24 (primet tilstand). Yderligere overflademarkører, der er specifikke for de ekstraembryonale slægter uden for målet (f.eks. Amnion, ekstraembryonisk mesoderm), ville også være nyttige, men efter vores bedste overbevisning er de i øjeblikket ikke tilgængelige. Hvis den opnåede dannelseseffektivitet er lavere end de rapporterede resultater, er det vigtigt omhyggeligt at kontrollere alle komponenterne i blastoidmediet, især LPA, der rekonstitueres i PBS, og som som en GPCR-ligand kan være mere ustabil sammenlignet med syntetiske molekyler, der rekonstitueres i DMSO. I de fleste tilfælde, selvom udbyttet ikke er maksimalt, er de kaviterede strukturer stadig sammensat af de tre blastocystafstninger. Fremkomsten af tre blastocystafstninger og dannelsen af embryonal-abembryonisk akse kan bekræftes ved immunofluorescensfarvning af markører (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Figur 2E,G). Trofosfærer, som kun består af TE, hjælper med at dissekere rollen som intercellulær kommunikation yderligere. Trofosfærer kan dannes ved 50%-60% effektivitet inden for 96 timer efter induktion (figur 2H,I). Blastoiddannelse kan udføres ikke kun i hjemmelavede mikrobrøndarrays, men også i kommercielt tilgængelige ultra-lave fastgørelsesplader 96 brøndplader med optimering af induktionsbetingelser (se protokol og figur 2J). Blastoider har også kapacitet til at videreudvikle sig i yderligere 6 dage, hvilket svarer til dag 13 embryo, med in vitro-differentieringsprotokol (figur 2K).
For yderligere at karakterisere blastoidcellernes celletilstand skal der anvendes enkeltcellet RNA-sekventeringsteknologi. UMAP anvendes almindeligvis til at visualisere en fordeling af celletilstande, og der udføres uovervåget klyngeanalyse på den for at evaluere nærheden af individuelle celletilstande. Forskellige parametre i enkeltcelledataanalysen kan påvirke, hvordan celler vises i UMP'erne, hvilket fører til klynger med forskellige rumlige og relative positioner og former (figur 3A). I denne analyse viser cellerne imidlertid markant reproducerbart forskellige klyngeprofiler uanset de parametre, der bruges til at udføre klyngedannelsen og visualiseringen af dataene, hvilket gør det muligt med stor tillid at skelne mellem de tre blastocystafstamninger. Vi brugte celler fra embryoner høstet på forskellige udviklingsstadier som reference. Sammenlægningen af disse datasæt viser, at størstedelen af trophektodermanalogen fra blastoid grupperet med trophektoderm før implantation, men ikke med trofoblaster efter implantation (figur 3B). Disse resultater blev også bekræftet af et uafhængigt konsortium10.
Når Carnegie fase 7 (CS7) gastrulerende embryoner introduceres i referencekortet, er en lille population af blastoidceller (3%) grupperet med mesoderm- og amnionsslægterne af disse embryoner (figur 3C). Når amnionlignende celler introduceres i referencekortet, er en lille population af blastoidceller (< 2%) grupperet med sådanne amnionlignende celler.
Samlet set betragtes kun de strukturer, der omfatter et enkelt regelmæssigt hulrum, en enkelt indre celleklynge, en samlet størrelse fra 150-250 μm, der omfatter transkriptomiske analoger af de tre blastocyst-slægter og stort set blottet for andre slægter (f.eks. Amnion, mesoderm, ekstraembryonisk mesoderm) som humane blastoider.
Figur 1: Fire funktioner og to tilgange til generering af high-fidelity blastoider. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Blastoid- og trofosfærer afledt af aggregater af naiv hPSC. (A) Fasekontrastbilleder, der viser naive hPSC'er dyrket i PXGL-medium dyrket sammen med bestrålet MEF. Skalabjælke: 50 μm. (B) Fasekontrastbilleder, der viser den morfologiske ændring af naive hPSC-aggregater dyrket på et ikke-klæbende hydrogelmikrobrøndarray med 500 nM LPA (PALLY-medium). Skalastang: 200 μm. (C) Humane blastoider dannet på et mikrobrøndarray efter 96 timer. Skalastænger: 400 μm. (D) Kvantificering af procentdelen af mikrobrønde indeholdende en human blastoid induceret af PALLY-dyrkningstilstand med optimeret LPA-koncentration fra forskellige naive hPSC-linjer (n = 3 mikrobrøndarrays). E) Immunofluorescensfarvning af humane blastoider med epiblastmarkører (EPI) (gule) NANOG og OCT4 TE-markørerne (cyan) CDX2 og GATA3 og den primitive endodermmarkør (magenta) SOX17 og GATA4. Skalabjælke: 100 μm. (H-I) Kvantificering af cellenummeret (venstre) og procentdelen af celler (højre), der tilhører hver slægt i blastoid (96 timer) baseret på immunofluorescensfarvning af OCT4, GATA3 og GATA4. G) Immunofluorescensfarvning af humane blastoider for CDX2 (cyan) og NR2F2 (magenta). F) Fasekontrastbilleder af tidlige og sene trofosfærer på mikrobrøndarray induceret ved tilsætning af henholdsvis 3 μM SC144 (H) eller 2 μM XMU-MP-1 (I). (J) Fasekontrastbilleder, der viser den morfologiske ændring af naive hPSC-aggregater dyrket i ultralav fastgørelse 96 brøndplade med 500 nM LPA (PALLY medium). (K) Fasekontrastbillede (venstre) og immunofluorescensfarvning (højre) for OCT4 (gul), GATA3 (cyan) og GATA4 (magenta) i blastoid dyrket i postimplantationskulturtilstand i 6 dage. Vægtstang: 100 μm. Dette tal er tilpasset fra 6,10. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af blastoidernes sammensætning ved enkeltcellesekventering. (A) Uovervåget klyngeanalyse med forskellige parametre på UMAP af transkriptomet af enkeltceller afledt af blastoids forskellige tidspunkter (24 timer, 60 timer, 96 timer), naive hPSC'er, primede hPSC'er og hTSC (repræsenterer cytotrophoblast efter implantation). (B) UMAP over transkriptomet for celler afledt af blastoid (96 timer), naive hPSC'er og primede hPSC'er integreret med offentliggjorte datasæt fra humane embryoner fra præimplantations-, periimplantations- (in vitro-dyrkede blastocyster) og gastrulation (Carnegie-trin 7, dvs. mellem E16-19) stadier. Individuelle celler farves baseret på deres oprindelse i menneskelige embryoner (venstre), blastoidafledte celler eller stamceller (midten) og resultatet af uovervåget klyngeanalyse (højre). C) UMP'er af transkriptomet af celler afledt af blastoider, naive hPSC'er, primede hPSC'er og integreret med offentliggjorte datasæt fra gastrulation (Carnegie fase 7, dvs. mellem E16-19) stadium embryo. Individuelle celler farves baseret på deres oprindelse i menneskelige embryoner (venstre), blastoidafledte celler eller stamceller (midten) og resultatet af uovervåget klyngeanalyse (højre). Denne figur er tilpasset fra6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Al mediesammensætning anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
I denne undersøgelse viser vi trin for trin, hvordan man etablerer humane blastoider med høj effektivitet ved hjælp af en enkel og robust protokol. Ved aggregering af naive PXGL hPSC'er og deres tredobbelte hæmning dannes blastoider effektivt (> 70%) og genererer sekventielt de 3 blastocystanaloger inden for 4 dage. Begrænsninger i blastoidernes effektivitet og kvalitet (f.eks. Tilstedeværelsen af celler uden for målet) kan forekomme, hvis den oprindelige tilstand er suboptimal. Bemærk, at vi har målt, at PXGL hPSC'er indeholder ca. 5% af cellerne, der afspejler postimplantationsstadierne. Disse celler kan begrænse dannelsen af blastoider af høj kvalitet. Ud over den oprindelige naive PXGL-tilstand, der afspejler blastocystepyblasten, er en anden afgørende faktor det medium, der anvendes til blastoiddannelse. For hurtigt at danne blastocystlignende celler og forhindre dannelsen af off-target, postimplantationslignende celler foreslår vi, at tredobbelt vejhæmning (Hippo, ERK, TGF-β) er afgørende. Mens forskellige cellelinjer giver forskellige udbytter af blastoid ved ERK / TGF-β hæmning (generelt omkring 10% -20%), resulterer eksponering for LPA i dannelsen af lige så højt blastoidudbytte på tværs af alle cellelinjer, samtidig med at der anvendes strenge morfometriske og afstamningsspecifikationskriterier. LPA virker muligvis på hæmningen af hippovejen, som spiller en kritisk rolle i den første slægtsadskillelse mellem epiblast- og troctoderm-slægter hos mus oghumane 8,51. Den signifikante forbedring af blastoideffektiviteten ved LPA tyder på, at hippovejsmedierede indre-ydre cellespecifikationsmekanismer, der er på spil i blastocysten, koopterer under blastoiddannelsen. En nuværende begrænsning ligger i, at vi på grund af en suboptimalitet af de protokoller, der anvendes til dyrkning af human blastocyst eller blastoider på tidsækvivalent dag 7-13 (efter blastocyst/blastoiddannelse), ikke er i stand til at vurdere, i hvilket omfang vi korrekt kan modellere udviklingen efter implantationen.
Analyse af blastoidcellernes transkriptomiske tilstand kan let opnås ved hjælp af scRNAseq, passende referencekort og bioinformatiske metoder. Tidligere viste den transkriptomiske analyse, at hPSC'er dyrket i PXGL ligner mere blastocystepyblasten sammenlignet med den primede tilstand. Der kan forekomme begrænsninger i analysen af dataene, hvis referencekortet kun omfatter blastocyst-stadieceller. Referencekortet bør omfatte celler, der stammer fra embryoner efter implantation, med henblik på at vurdere tilstedeværelsen af potentielle celler uden for målgruppen. For at benchmarke blastoidceller vil et referencekort, der omfatter alle væv fra det humane koncept før og efter implantationen, i fremtiden være yderst værdifuldt. Derudover vil multi-omics enkeltcellereferencekort, for eksempel inklusive transkriptom, kromatintilgængelighed og DNA-methylering, yderligere hjælpe. Endelig vil standardiserede bioinformatiske metoder til kvantitativt at vurdere lighederne mellem celler fra embryomodeller og referencekoncepter og til positivt at identificere off-target-celler yderligere bidrage til upartisk at analysere og sammenligne resultater.
Alt i alt besidder blastoider dannet ved tredobbelt hæmning af Hippo-, TGF-β- og ERK-veje de fire egenskaber ved 1) højeffektiv morfogenese, 2) korrekt sekvens af afstamningsspecifikation, 3) høj renhed af blastocystlignende celler på transkriptomniveau, 4) kapacitet til at modellere periimplantationsudvikling. Disse egenskaber ved blastoider vil lette opbygningen af hypoteser om blastocystudvikling og implantation, men de rekapitulerer ikke tidligere stadier af embryonal udvikling. I modsætning til den begrænsede tilgængelighed og alsidighed af human blastocyst er blastoider modtagelige for genetiske og lægemiddelskærme til funktionelle undersøgelser af blastocystudvikling og implantation. I fremtiden kan en sådan grundlæggende viden bidrage til at forbedre IVF-medieformulering, udvikle præventionsmidler efter befrugtning og bedre styre tidlig graviditet.
Disclosures
Institut for Molekylær Bioteknologi, Austrian Academy of Sciences har indgivet en patentansøgning EP21151455.9, der beskriver protokollerne for human blastoiddannelse og blastoid-endometrium-interaktionsassayet. HK, AJ, HHK og NR er opfinderne af dette patent. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (EFR) under EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (ERC-Co-tilskudsaftale nr. 101002317 'BLASTOID: a discovery platform for early human embryogenesis'). H.H.K. er støttet af den østrigske videnskabsfond (FWF), Lise Meitner-programmet M3131-B. Vi takker Yasuhiro Takashima for at dele H9- og H9-GFP-cellelinjerne og Austin Smith, Peter Andrews og Ge Guo for at dele HNES1-, Shef6-, niPSC 16.2b- og cR-NCRM2-cellelinjerne. Vi takker Hossein Baharvand for at dele endometrieorganoiderne. Vi takker Joshua M. Brickman for at dele RNA isoleret fra PrE-differentierede celler og nEND-celler. Vi takker Shankar Srinivas for at dele de encellede RNA-sekventeringsdata for peri-gastrulationsembryoet. Vi takker Aleksand Bykov og Luisa Cochella for teknisk assistance til SMARTSeq2 biblioteksforberedelse. Vi takker NGS-, biooptik- og stamcellefaciliteten på IMBA for kritisk hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | in house | ||
| DMEM/F12 | in house | ||
| 100X N2 supplemen | Gibco | 17502048 | |
| 50X B27 supplement | Gibco | 17504044 | |
| 100X Glutamax | Gibco | 35050038 | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360039 | |
| MEM-Non-essential amino acids | Gibco | 11140050 | |
| 1 M Hepes | in house | ||
| 50 mM 2-Mercaptoethanol | Thermofisher | 31350010 | |
| 100X Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| PD0325901 | Medchem express | HY-10254 | |
| XAV-939 | Medchem express | HY-15147 | |
| Gö 6983 | Medchem express | HY-13689 | |
| Human recombinant Leukemia Inhibitory Factor | in house | ||
| A83-01 | Medchem express | HY-10432 | |
| 1-Oleoyl Lysophosphatidic acid (LPA) | Peprotech | 2256236 | |
| Y-27632 | Medchem express | HY-10583 | |
| CMRL medium | Gibco | 21530027 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10-828-028 | |
| Accutase | Biozym | B423201 | cell detachment solution |
| Geltrex | Thermofisher | A1413302 | growth factor basement membrane extract |
| TROP2 antibody | R&D systems | MAB650 | |
| PDGFRα antibody | R&D systems | AF307 | |
| SC-144 | Axon | 2324 | |
| XMU-MP-1 | Med Chem Express | HY-100526 | |
| Matrigel | basement membrane matrix | ||
| Countess cell counting chamber slides | Thermo fisher | cell counting slides | |
| DAPI Staining Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-570 |
References
- Rivron, N., et al. Debate ethics of embryo models from stem cells. Nature. 564 (7735), 183-185 (2018).
- Hyun, I., Munsie, M., Pera, M. F., Rivron, N. C., Rossant, J. Toward Guidelines for Research on Human Embryo Models Formed from Stem Cells. Stem Cell Reports. 14 (2), 169-174 (2020).
- Clark, A. T., et al. Human embryo research, stem cell-derived embryo models and in vitro gametogenesis: Considerations leading to the revised ISSCR guidelines. Stem Cell Reports. 16 (6), 1416-1424 (2021).
- Lovell-Badge, R., et al. ISSCR Guidelines for Stem Cell Research and Clinical Translation: The 2021 update. Stem Cell Reports. 16 (6), 1398-1408 (2021).
- Rivron, N. C., et al. Blastocyst-like structures generated solely from stem cells. Nature. 557 (7703), 106-111 (2018).
- Kagawa, H., et al. Human blastoids model blastocyst development and implantation. Nature. , 04267-04268 (2021).
- Meistermann, D., et al. Integrated pseudotime analysis of human pre-implantation embryo single-cell transcriptomes reveals the dynamics of lineage specification. Cell Stem Cell. 28 (9), 1625-1640 (2021).
- Gerri, C., et al. Initiation of a conserved trophectoderm program in human, cow and mouse embryos. Nature. 587 (7834), 443-447 (2020).
- Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. A., Niakan, K. K. Human Embryogenesis: A Comparative Perspective. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 411-440 (2020).
- Zhao, C., et al. Reprogrammed iBlastoids contain amnion-like cells but not trophectoderm. bioRxiv. , 2021.05.07.442980 (2021).
- Zijlmans, D. W. Integrated multi-omics reveal polycomb repressive complex 2 restricts human trophoblast induction. Nat. Cell Biol. 24, 858-871 (2022).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
- Guo, G., et al.
- Takashima, Y., et al. Resetting transcription factor control circuitry toward ground-state pluripotency in human. Cell. 158 (6), 1254-1269 (2014).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), New York, N.Y. 1145-1147 (1998).
- Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
- Stirparo, G. G., et al. Integrated analysis of single-cell embryo data yields a unified transcriptome signature for the human pre-implantation epiblast. Development. 145 (3), Cambridge, England. 158501 (2018).
- Castel, G., et al. Induction of Human Trophoblast Stem Cells from Somatic Cells and Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 33 (8), 108419 (2020).
- Posfai, E., et al. Evaluating totipotency using criteria of increasing stringency. Nature Cell Biology. 23 (1), 49-60 (2021).
- Nakamura, T., et al. A developmental coordinate of pluripotency among mice, monkeys and humans. Nature. 537 (7618), 57-62 (2016).
- Theunissen, T. W., et al. Molecular Criteria for Defining the Naive Human Pluripotent State. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
- Guo, G., et al. Naive Pluripotent Stem Cells Derived Directly from Isolated Cells of the Human Inner Cell Mass. Stem Cell Reports. 6 (4), 437-446 (2016).
- Rossant, J. Genetic Control of Early Cell Lineages in the Mammalian Embryo. Annual Review of Genetics. 52, 185-201 (2018).
- De Paepe, C., et al. Human trophectoderm cells are not yet committed. Human reproduction. 28 (3), 740-749 (2013).
- Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 1212-1221 (2013).
- Io, S., et al. Capturing human trophoblast development with naive pluripotent stem cells in vitro. Cell Stem Cell. 28 (6), 1023-1039 (2021).
- Guo, G., et al. Human naive epiblast cells possess unrestricted lineage potential. Cell Stem Cell. 28 (6), 1040-1056 (2021).
- Liu, X., et al. Modelling human blastocysts by reprogramming fibroblasts into iBlastoids. Nature. 591 (7851), 627-632 (2021).
- Hirate, Y., et al. Polarity-dependent distribution of angiomotin localizes Hippo signaling in preimplantation embryos. Current biology: CB. 23 (13), 1181-1194 (2013).
- Cockburn, K., Biechele, S., Garner, J., Rossant, J. The Hippo pathway member Nf2 is required for inner cell mass specification. Current Biology: CB. 23 (13), 1195-1201 (2013).
- Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature Biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
- Krendl, C., et al. GATA2/3-TFAP2A/C transcription factor network couples human pluripotent stem cell differentiation to trophectoderm with repression of pluripotency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), 9579-9588 (2017).
- Xu, R. H., et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature Methods. 2 (3), 185-190 (2005).
- Horii, M., Bui, T., Touma, O., Cho, H. Y., Parast, M. M. An Improved Two-Step Protocol for Trophoblast Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 96 (2019).
- Okae, H., et al. Derivation of Human Trophoblast Stem Cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63 (2018).
- Yamanaka, Y., Lanner, F., Rossant, J. FGF signal-dependent segregation of primitive endoderm and epiblast in the mouse blastocyst. Development. 137 (5), 715-724 (2010).
- Kuijk, E. W., et al. The roles of FGF and MAP kinase signaling in the segregation of the epiblast and hypoblast cell lineages in bovine and human embryos. Development. 139 (5), Cambridge, England. 871-882 (2012).
- Roode, M., et al. Human hypoblast formation is not dependent on FGF signalling. Developmental Biology. 361 (2), 358-363 (2012).
- Linneberg-Agerholm, M., et al. Naïve human pluripotent stem cells respond to Wnt, Nodal and LIF signalling to produce expandable naïve extra-embryonic endoderm. Development. 146 (24), Cambridge, England. (2019).
- Yu, L., et al. Blastocyst-like structures generated from human pluripotent stem cells. Nature. 591 (7851), 620-626 (2021).
- Yanagida, A., et al. Naive stem cell blastocyst model captures human embryo lineage segregation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1016-1022 (2021).
- Zappia, L., Oshlack, A. Clustering trees: a visualization for evaluating clusterings at multiple resolutions. GigaScience. 7 (7), (2018).
- Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
- Messmer, T., et al. Transcriptional Heterogeneity in Naive and Primed Human Pluripotent Stem Cells at Single-Cell Resolution. Cell Reports. 26 (4), 815-824 (2019).
- Zhou, F., et al. Reconstituting the transcriptome and DNA methylome landscapes of human implantation. Nature. 572 (7771), 660-664 (2019).
- Petropoulos, S., et al. Single-Cell RNA-Seq Reveals Lineage and X Chromosome Dynamics in Human Preimplantation Embryos. Cell. 167 (1), 285 (2016).
- Tyser, R. C. V., et al. A spatially resolved single cell atlas of human gastrulation. bioRxiv. , (2020).
- Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
- Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), Cambridge, England. 1775-1786 (2017).
- Ma, H., et al. In vitro culture of cynomolgus monkey embryos beyond early gastrulation. Science. 366 (6467), New York, N.Y. (2019).
- Nishioka, N., et al. The Hippo signaling pathway components Lats and Yap pattern Tead4 activity to distinguish mouse trophectoderm from inner cell mass. Developmental Cell. 16 (3), 398-410 (2009).
