Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

استراتيجية فعالة لتشخيص اللعاب باستخدام روبوتات السحب العكسي الكمية ل SARS-CoV-2 باستخدام روبوتات السحب مفتوحة المصدر

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63395
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 3, 4, *1,5,6, *1,2
1Center for Innovative Medical Devices and Sensors (REDDI Lab), Clemson University, 2Department of Bioengineering, Clemson University, 3Swann Medicine, 4Student Health Services, Clemson University, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Clemson University, 6Department of Chemical & Biomolecular Engineering, University of Delaware
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول طريقة تشخيص SARS-CoV-2 التي تستخدم التشغيل الآلي مفتوح المصدر لإجراء اختبار جزيئي RT-qPCR لعينات اللعاب. ويمكن تطبيق هذا النهج القابل للتطوير على مراقبة الصحة العمومية السريرية وكذلك لزيادة قدرة المختبرات الجامعية الأصغر.

Abstract

أدى ظهور الأزمة الصحية العالمية الأخيرة ل SARS-CoV-2 إلى ظهور تحديات رئيسية للبحوث الوبائية والاختبارات السريرية. تميزت جائحة كوفيد-19 بارتفاع معدل انتقال العدوى وانخفاض معدل الوفيات، واستلزمت إجراء اختبارات تشخيصية دقيقة وفعالة، لا سيما في المجموعات السكانية المغلقة مثل الجامعات السكنية. كان التوافر الأولي لاختبار الحمض النووي ، مثل مسحات البلعوم الأنفي ، محدودا بسبب ضغط سلسلة التوريد الذي أخر أيضا الإبلاغ عن نتائج الاختبار. أظهر اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائم على النسخ العكسي القائم على اللعاب (RT-qPCR) أنه قابل للمقارنة في الحساسية والخصوصية لطرق الاختبار الأخرى ، وجمع اللعاب أقل توغلا جسديا للمشاركين. ونتيجة لذلك، قمنا بتطوير اختبار تشخيصي RT-qPCR متعدد الإرسال لمراقبة السكان في جامعة كليمسون والمجتمع المحيط بها. استخدم الفحص روبوتات مناولة السوائل مفتوحة المصدر وأجهزة تدوير الحرارة بدلا من أنظمة الأتمتة السريرية المعقدة لتحسين سير العمل ومرونة النظام. تتيح أتمتة RT-qPCR القائم على اللعاب الكشف السريع والدقيق عن مجموعة واسعة من تركيزات الحمض النووي الريبي الفيروسي لكل من متطلبات الاختبار الكبيرة والصغيرة. وبلغ متوسط التحول للنظام الآلي < 9 ساعات ل 95 في المائة من العينات و < 24 ساعة ل 99 في المائة من العينات. كانت تكلفة اختبار واحد 2.80 دولار عندما تم شراء جميع الكواشف بكميات كبيرة.

Introduction

ظهر فيروس كورونا 2 المرتبط بالمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة (SARS-CoV-2)، وهو فيروس تاجي جديد، في أواخر عام 2019 وانتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم1. تسبب عدوى SARS-CoV-2 مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) ، وهو مرض شديد العدوى مع أعراض تنفسية والتهابية حادة محتملة. وتشير القابلية العالية للانتقال إلى جانب انخفاض معدل الوفيات إلى أن الفيروس سينتشر بسرعة بين السكان وسيتطلب زيادة الاختبارات التشخيصية2,3. وشجعت توصيات الصحة العمومية على إجراء فحوص سكانية واسعة النطاق لعزل الحالات وبالتالي خفض معدلات انتقال العدوى4,5,6. وعلاوة على ذلك، كشفت نماذج ترصد السكان أن زيادة تواتر الاختبار وتقليل وقت الإبلاغ كان لهما تأثير أكبر على الحد من انتقال العدوى من زيادة حساسية الاختبار7. ويرجع ذلك على الأرجح إلى أنه يمكن وضع الأفراد المصابين في الحجر الصحي في وقت مبكر، وبالتالي كسر سلاسل العدوى.

كان معيار اختبار تضخيم الحمض النووي الأصلي (NAAT) هو مسحات البلعوم الأنفي (NP) التي تمت معالجتها بواسطة RT-qPCR8. ومع ذلك، تنشأ مضاعفات مع هذا النوع من الاختبارات لعدد كبير جدا من السكان، مثل زيادة التكلفة النسبية وتفاقم ضغط سلسلة التوريد9,10. علاوة على ذلك ، يعتمد كل من جمع العينات ومعالجة طرق NAAT الشائعة (بما في ذلك مسحات NP ، ومسحات البلعوم الفموي ، ومسحات منتصف التوربينات ، ومسحات الأنف) على المعدات المتخصصة والكواشف والموظفين الطبيين 9,10.

بديل مناسب لاختبار مسحة NP RT-qPCR هو الاختبار القائم على اللعاب ، وهو أداة تشخيصية دقيقة للكشف عن SARS-CoV-2 11،12،13،14. يؤدي إجراء RT-qPCR مباشرة على عينات اللعاب إلى حساسية وخصوصية مماثلة لمسحات NP 15. إحدى المزايا الرئيسية لاختبار اللعاب على اختبار مسحة NP هي أنه يسمح بالجمع الذاتي للعينات16. هذا يقلل من الحاجة إلى الموظفين الطبيين ويزيد من سهولة جمع العينات للمرضى من خلال كونها أقل توغلا من مسحات NP. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن عينات اللعاب لا تتطلب مخازن مؤقتة لإزالة العينة من مسحة (كما هو الحال في عينات NP) ، يمكن للاختبارات القائمة على اللعاب استخدام استخراج الحمض النووي الريبي القائم على الحرارة (RNA) مباشرة ، مما يقلل من تكاليف الاختبار عن طريق إزالة الحاجة إلى مخازن مؤقتة إضافية و / أو وسائط نقل و / أو كواشف استخراج الحمض النووي الريبي 14,17.

تم إنشاء مختبر جامعة كليمسون للبحوث والتعليم في تشخيص الأمراض والتدخل (REDDI) لتلبية احتياجات الجامعة لاختبار COVID-19 والمراقبة. وفي المجموعات السكانية المغلقة، بما في ذلك الجامعات، أسفرت اختبارات الترصد المتكررة المقترنة بالتباعد الاجتماعي عن النتائج الأكثر ملاءمة في النماذج الوبائية لانتشار الأمراض18. تم تكييف بروتوكولات CDC 2019-nCOV RT-qPCR19 و SalivaDirect14 الموحدة ، وتم استخدام الأتمتة في سير العمل السريري لتقليل التكلفة وتحسين وقت التحول. وكانت المجموعات السابقة قد استخدمت روبوتات مناولة السوائل مفتوحة المصدر لخطوات استخراج الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2222، لكننا حققنا أقصى استفادة من الروبوتات لإعداد لوحات الاختبار وتحميل العينات22. هنا ، نظهر أن البروتوكول المعدل واستخدام أنظمة مناولة السوائل مفتوحة المصدر (الشكل 1) يسمح ب RT-qPCR سريع ودقيق قائم على اللعاب وهو استراتيجية فعالة لمراقبة الصحة العامة على نطاق واسع.

Protocol

تم إجراء جميع الأبحاث وفقا لجامعة كليمسون ومجالس المراجعة المؤسسية الصحية Prisma (Prisma Health IRB # Pro00099491 ، 1 يوليو 2020).

1. إعداد روبوت مناولة السوائل مفتوح المصدر

  1. قم بتركيب وحدات تصفية الهواء الجسيمي عالية الكفاءة (HEPA) (انظر جدول المواد) في الجزء العلوي من كل روبوت مناولة للسوائل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بتوصيل ماصة P20 ذات 8 قنوات بالحامل الأيسر لروبوت (روبوتات) إعداد لوحة الخلط الرئيسية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. قم بتوصيل ماصة P20 بالحامل الأيمن لروبوت (روبوتات) تحميل العينات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بتنزيل البرامج النصية المخصصة ل Python (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2) على أجهزة الكمبيوتر المناسبة.
  5. افتح TigerSaliva Full 384 Loading.py في تطبيق سطح المكتب في عينة تحميل أجهزة الكمبيوتر الروبوتية. انقر فوق معايرة وقم بإعداد كل من الماصة والبرنامج وفقا لتوجيهات البرنامج.
  6. افتح 12 Plates.py كاملا في تطبيق سطح المكتب على كمبيوتر الروبوت الرئيسي المزيج. انقر فوق معايرة وقم بإعداد كل من الماصة والبرنامج وفقا لتوجيهات البرنامج.
  7. اطبع رفوف العينات المخصصة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد (3D) لنمذجة الترسيب المنصهرة باستخدام ملف تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) (https://www.myminifactory.com/object/3d-print-141363). اطبع 16 رفا لكل روبوت تحميل عينة، لمجموعتين من ثمانية رفوف.

2. إعداد 20x متعدد الإرسال N1 + P1 مسبار / مزيج التمهيدي

  1. قم بإعداد مجموعة من 20x متعدد الإرسال N1 + P1 مسبار / مزيج التمهيدي (الحجم الإجمالي 20 مل ، الجدول 1) في أنبوب مخروطي 50 مل في بيئة معقمة بعيدا عن الحمض النووي الريبي الاصطناعي SARS-CoV-2 أو عينات المرضى.
  2. Aliquot 1.6 مل من المزيج باستخدام ماصة مصلية في أنابيب طرد مركزي معقمة 2.0 مل والتسمية بشكل مناسب.
  3. قم بتخزين الأليكوتات في ثلاجة -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

3. إعداد مزيج التحكم الإيجابي

ملاحظة: لا ينبغي إجراء مزيج التحكم الإيجابي في نفس البيئة المعقمة مثل مزيج المسبار / التمهيدي أو مكونات المزيج الرئيسي الأخرى. يجب استخدام حاوية منفصلة من الماء الخالي من النوكليز.

  1. قم بتخفيف الحمض النووي الريبي الاصطناعي SARS-CoV-2 (N1) من 1,000,000 نسخة جينية / ميكرولتر (cpμ) إلى 10,000 cpμ عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول المخزون إلى 990 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. Aliquot 25 ميكرولتر من 10000 cpμ في أنابيب 0.2 مل معقمة والتسمية بشكل مناسب. قم بتخزين الأليكوتات غير المستخدمة عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب تخزين الحمض النووي الريبي الاصطناعي عند -80 درجة مئوية لمنع التدهور.
  2. قم بتخفيف الحمض النووي الاصطناعي Hs_RPP30 (P1) من 200000 cpμ إلى 10000 cpμ عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول المخزون إلى 950 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. Aliquot 25 ميكرولتر من 10000 cpμ في أنابيب 0.2 مل معقمة والتسمية بشكل مناسب. قم بتخزين الأليكوتات غير المستخدمة عند -80 درجة مئوية.
  3. قم بتخفيف كل مكون إلى تركيز نهائي قدره 200 cpμ عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من كل من SARS-CoV-2 و Hs_RPP30 10000 cpμ مخزون إلى 960 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز ، ليصبح المجموع 1000 ميكرولتر. Aliquot 20 μL من التحكم الإيجابي المختلط 200 cpμ في أنابيب 0.2 مل والتسمية بشكل مناسب. قم بتخزين الأليكوتات على درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

4. إعداد لوحات المزيج الرئيسي

ملاحظة: اصنع مزيجا رئيسيا في بيئة معقمة بعيدا عن الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 الاصطناعي أو عينات المرضى. يجب إذابة جميع المكونات بالكامل قبل إضافتها إلى الخليط ؛ بدون ذوبان الجليد بشكل صحيح ، قد تكون التركيزات غير صحيحة. يشار إلى عدم كفاية ذوبان الجليد من خلال وجود الجليد أو لون غير متساو من الكواشف. يخزن على كتلة الفريزر أثناء تحضير الخليط.

  1. قم بإعداد مجموعة من المزيج الرئيسي متعدد الإرسال (الحجم الإجمالي 48 مل ، الجدول 2) في أنبوب مخروطي 50 مل.
  2. تجانس الخليط عن طريق قلب الأنبوب أكثر من 3x. لا تخلط عن طريق السحب لأعلى ولأسفل أو الدوامة لأن هذا سيؤدي إلى إتلاف الإنزيم.
  3. املأ الأعمدة 1-4 من خزان بئر عميق معقم مكون من 96 بئرا عن طريق نقل 1.48 مل من المزيج الرئيسي إلى كل بئر. واحد 50 مل مخروطي يملأ أربعة أعمدة ، وهو ما يكفي ل 12 لوحة.
  4. قم بتغطية خزان البئر العميق بختم رقائق معدنية وضعه في روبوت مناولة السوائل الرئيسي المخصص للمزيج. ضع خزان البئر العميق المملوء على سطح السفينة 10 ، وضع ستة ألواح فارغة من 384 بئرا على الطوابق 1-6 ، وصندوق نصائح P20 على سطح السفينة 11. اكتشف لوحة البئر العميقة وصناديق الأطراف وأغلق الروبوت.
  5. قم بتهيئة بروتوكول تشغيل Python المخصص بالنقر فوق بدء التشغيل في تطبيق سطح مكتب الروبوت.
  6. بعد 40 دقيقة ، سيتوقف الجري مؤقتا. قم بتغطية لوحات البئر المملوءة 384 بأختام رقائق أثناء بقائها في الروبوت واضغط لأسفل باستخدام الأسطوانة لضمان الالتصاق. قم بتسمية حافة كل لوحة بمعرف دفعة.
  7. ضع ست لوحات جديدة فارغة من 384 بئرا على الطوابق من 1 إلى 6 واستأنف بروتوكول التشغيل بالنقر فوق استئناف التشغيل. بعد اكتمال الجري ، قم بتغطية المجموعة النهائية المكونة من 384 لوحة بئر بأختام رقائق معدنية.
  8. ماصة 2 ميكرولتر من المزيج الرئيسي المتبقي في أعمدة 1-3 و 22-24 من لوحة فارغة من 384 بئر لمراقبة جودة الدفعة. ختم مع ختم واضح بصريا وتشغيل على دورة حرارية (القسم 10.1-10.2). إذا كانت أي آبار لها قيم دورة عتبة N1 (Ct) أو إذا كان أكثر من 10 آبار لها قيم P1 Ct ، فإن الدفعة ملوثة ولا يمكن استخدامها.
  9. قم بتخزين لوحات المزيج الرئيسية المحضرة على درجة حرارة 4 درجات مئوية واستخدمها في غضون 7 أيام من التحضير.

5. جمع العينات ، والمدخول ، والمعالجة الحرارية

  1. اطلب من المشاركين تجنب الأكل أو الشرب أو التدخين أو إجراء نظافة الأسنان قبل 30 دقيقة من جمع اللعاب. اطلب من المشاركين جمع ما لا يقل عن 1 مل من اللعاب الذي يتجمع بشكل طبيعي في الفم وإيداعه في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل بدون مواد حافظة ، ثم قم بتغطية الأنبوب (الملف التكميلي 3).
  2. تطهير الجزء الخارجي من أنابيب جمع اللعاب بنسبة 70٪ من الإيثانول أو مناديل التطهير ونقلها إلى المختبر لاختبارها.
  3. سجل وصول العينة عن طريق مسح كل نموذج من الباركود في جدول بيانات المدخول اليومي (الملف التكميلي 4).
  4. عالج العينات الممسوحة ضوئيا بالحرارة لمدة 30 دقيقة في فرن 95 درجة مئوية. قم بإزالة العينات أثناء ارتداء قفازات مقاومة للحرارة.
    ملاحظة: العينات غير المعالجة مستقرة في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 72 ساعة. بمجرد المعالجة الحرارية ، يجب تخزين العينات عند 4 درجات مئوية ، إذا لم تتم معالجتها على الفور.

6. عينة التعيين

  1. افتح جداول بيانات تحميل العينات اليومية لكل روبوت تحميل عينة (الملف التكميلي 5) على الكمبيوتر في محطة تعيين العينة.
  2. قم بتعيين 188 عينة لكل صفيحة 384 بئر على النحو التالي: تعتبر العينات 1-48 الربع 1 ، والعينات 49-96 الربع 2 ، والعينات 97-144 الربع 3 ، والعينات 145-188 تعتبر الربع 4. يتم تحليل العينة في نسختين.
  3. صواني الملصقات مع اسم اللوحة والتاريخ ورقم الربع. امسح العينات ضوئيا بالترتيب في جدول بيانات تحميل العينة.
    ملاحظة: قد يلزم تشغيل العينات من اللوحات السابقة يدويا، كما هو محدد في الشكل 3. ارجع إلى الأقسام 8.1 إلى 8.3 للحصول على تعليمات التعيين اليدوي للعينات والتحميل.

7. روبوتات تحميل عينة التشغيل

  1. في محطة تحميل العينات ، اصطف مجموعتين كاملتين من ثمانية رفوف مطبوعة 3D تتوافق مع موضع سطح السفينة في الروبوت.
  2. Uncap الربع 1 أنابيب ووضعها في رفوف مطبوعة 3D ، بدءا من الموقف A1 في الرف 1. املأ كل رف من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل. استمر في نمط التحميل هذا في الحامل 2 ، ثم انتقل إلى الرفوف 4 و 5 (راجع الشكل 2C).
    ملاحظة: لا يتم ترقيم الرفوف على التوالي بسبب معلمات برنامج الروبوت.
  3. ضع رفوف عينة ربع 1 محملة على الطوابق 1 و 2 و 4 و 5 و 7 و 8 و 10 و 11. ضع نصائح P20 على الطابقين 3 و 9. لتبسيط عملية الإعداد ، قم بتحميل المواد من الخلف إلى الأمام في الروبوت.
  4. خذ لوحة خلط رئيسية مسبقة الصنع من 4 درجات مئوية ، وقم بتسميتها باسم اللوحة واستخدم شفرة حادة لقطع خط في الرقائق حول آبار التحكم (N23/24 و O23/24 و P23/24).
  5. ضع لوحة الخلط الرئيسية على سطح السفينة 6 وقشر غطاء الرقائق ، تاركا وراءه المستطيل الصغير الذي يغطي آبار التحكم. اكشف عن صناديق الأطراف وأغلق الروبوت.
  6. قم بتهيئة بروتوكول تشغيل Python المخصص بالنقر فوق بدء التشغيل من خلال تطبيق سطح مكتب الروبوت. يستغرق كل ربع سنة 24.5 دقيقة للتحميل على اللوحة. تعيين مؤقت كتذكير.
  7. أثناء تشغيل الروبوت ، قم بفك الغطاء وتحميل أنابيب عينة الربع 2 في المجموعة الثانية من الرفوف المطبوعة ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في القسم 7.2.
  8. عندما يتوقف الروبوت مؤقتا ، قم بإزالة رفوف الربع 1 ، واستبدلها برفوف الربع 2. انقر فوق استئناف تشغيل في تطبيق سطح المكتب.
  9. قم بتلخيص أنابيب عينة الربع 1 وتخزينها في ثلاجة 4 درجات مئوية أثناء انتظار النتائج.
    كرر عملية التحميل هذه للربعين 3 و4.
  10. انقل اللوحة المحملة إلى خزانة السلامة الأحيائية. لتقليل التلوث، حافظ على تغطية اللوحة أثناء النقل.

8. تحميل عينة يدوية

ملاحظة: قم بإجراء تشغيل يدوي واحد على العينات المتكررة (N1 Rerun أو Rerun، راجع الشكل 3) في حالة عدم كفاية التحميل الروبوتي.

  1. جمع أي عينات متكررة وتعيينها كآخر العينات في الربع 4 (انظر القسم 6.2). قم بترقيم العينات ومسح الباركود ضوئيا وأدخل موقع العينة الأصلي والنتيجة في جدول بيانات تحميل العينة.
  2. نقل العينات المتكررة إلى خزانة السلامة الأحيائية. لا تقم بتحميل أنابيب العينات المتكررة في رفوف تحميل الروبوت.
  3. ماصة 2 ميكرولتر من كل عينة متكررة إلى الآبار الصحيحة بعد مخطط تخطيط اللوحة (الملف التكميلي 6). استخدم ماصة مخصصة لإضافة عينات المرضى. حافظ على تغطية آبار التحكم بورق القصدير مع إضافة عينات لتقليل التلوث.

9. إضافة عناصر تحكم إلى لوحات الاختبار

  1. قشر غطاء الرقائق فوق آبار التحكم باستخدام الملقط.
  2. ماصة 2 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكليز (بدون تحكم في القالب) إلى الآبار N23-N24 و 2 ميكرولتر من 200 cpμ التحكم الإيجابي المختلط (راجع القسم 3) إلى الآبار O23-O24. ماصة 2 ميكرولتر من السيطرة على عينة المريض الإيجابية المؤكدة في الآبار M23-M24 كعنصر تحكم إضافي. اترك الآبار P23-P24 فارغة لمراقبة جودة دفعة المزيج الرئيسي.
  3. قم بتغطية اللوحة بختم شفاف بصريا واستخدم بكرة قضيب للالتصاق بالختم لجميع الآبار. دوامة اللوحة عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لتخلط جيدا. جهاز طرد مركزي اللوحة في 500 × غرام لمدة 1 دقيقة.

10. أداء RT-qPCR

  1. إنشاء برنامج بروتوكول في برنامج التدوير الحراري وفقا للشروط الموضحة (الجدول 3). احفظ البروتوكول للألواح المستقبلية. ضع اللوحة المختومة في جهاز التدوير الحراري وقم بتشغيل البروتوكول.
  2. تصدير قيم Ct كملف .xslx ونسخ القيم إلى نموذج تحميل جدول البيانات (الملف التكميلي 5).
    ملاحظة: تم تصميم هذه الأوراق خصيصا لملفات إخراج Ct من برنامج الشركة المصنعة وقد تحتاج إلى تعديل لقبول تنسيقات أخرى.

11. تحديد صلاحية اللوحة

  1. التحقق من صحة كل من التحكم الإيجابي و / أو العينات الإيجابية المعروفة والتحكم السلبي لاعتبار نتائج اللوحة صالحة. تقييم آبار التحكم مع المعايير التالية.
    1. للتحكم الإيجابي ، تحقق مما إذا كان بئر تحكم إيجابي واحد على الأقل (O23 / O24) ينتج قيم Ct تتراوح بين 22-28 لكل من مجسات P1 و N1. وبدلا من ذلك، تنتج آبار العينة الإيجابية المعروفة (M23/M24) قيمتين P1 و N1 Ct <33 على مسبارين P1 و N1.
    2. للتحكم السلبي، تحقق من عدم وجود قيم N1 أو P1 Ct في أي من بئري التحكم السلبيين (N23/N24). تأكد من أن قيم Ct لها منحنيات تضخيم صالحة قبل إبطال اللوحة.

12. تفسير نتائج العينات

  1. حدد نتيجة المريض باتباع الرسم البياني (الشكل 3) وأبلغ عن العينات التي تم حلها.
    1. تقييم نتيجة P1 على أنها صالحة أو غير صالحة. إذا أنتج P1 نتيجة Ct <33 ، ففكر في البئر VALID وانتقل إلى النتيجة من N1. إذا كان P1 ينتج نتيجة Ct > = 33 أو لا توجد قيمة Ct ، ففكر في البئر غير صالح.
      1. قم بتقييم نتيجة N1 على أنها نعم أو لا أو لا*. إذا أنتج N1 نتيجة Ct <33 ، فإن البئر هو نعم. إذا لم ينتج N1 قيمة Ct ، فإن البئر لا. إذا كان N1 ينتج Ct > = 33 ، فإن البئر لا *. تأكد من أن جميع قيم N1 Ct مقترنة بمنحنى تضخيم حقيقي. إذا كانت قيمة Ct ل N1 لا تحتوي على منحنى تضخيم ، فإن البئر لا.
      2. تحديد العينات المتكررة (N1 Rerun أو Rerun)، وتسميتها برقم عينة داخلي ونوع العينة وإعادتها إلى سير عمل التحميل (القسم 8.1-8.3).

13. تنظيف المختبرات

  1. روبوتات مناولة السوائل
    1. نظف جميع الجوانب بمطهر متوسط المستوى. لا تستخدم الإيثانول لأنه سيؤدي إلى تحلل البلاستيك.
    2. امسح طرف طرف الماصة وسلة المهملات برفق باستخدام الكحول (70٪ إيثانول أو 100٪ إيزوبروبانول). امسح لوحة المفاتيح والماوس.
  2. مجلس الوزراء السلامة الأحيائية
    1. نظف جميع الأسطح بمطهر متوسط المستوى. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.

Representative Results

حددنا نطاق الكشف عن مجسات RT-qPCR والاشعال لمحتوى الحمض النووي الاصطناعي لكل من SARS-CoV-2 (N1) و Hs_RPP30 (P1). تم إجراء تخفيف تسلسلي 10 أضعاف للتركيزات المعروفة من الحمض النووي الريبي الاصطناعي SARS-CoV-2 والحمض النووي Hs_RPP30 الاصطناعي في الماء. تم استخدام الصيغة التالية لتحويل الوزن الجزيئي إلى رقم نسخة الجين

رقم نسخة الجين = (نانوغرام * 6.0221 × 1023) / ((الطول في أزواج القاعدة * 660 جم / مول) * 1 × 109 نانوغرام / جم)

وتم تنفيذ RT-qPCR. بعد إجراء RT-qPCR ، أظهرت المنحنيات الخطية للكشف عن N1 (الشكل 4A) والكشف P1 (الشكل 4B) معاملات ارتباط جيدة عبر مجموعة واسعة من تركيزات نسخ الجينات (R2 = 0.9975 و R2 = 0.9884 ، على التوالي). تشير هذه النتيجة إلى أن الجمع بين مجموعات التمهيدي والمسبار ليس مثبطا ويمكن أن يكتشف بدقة الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في نسخة جينية واحدة / ميكرولتر (Cq = 33). نسخة جينية واحدة تعادل تقريبا نسخة فيروسية واحدة. ومع ذلك ، لم نحدد أعداد النسخ الفيروسية الكمية في اللعاب بسبب الطبيعة شبه الكمية ل RT-qPCR. حاولنا محاكاة عينات اللعاب الإيجابية عن طريق رفع الحمض النووي الريبي الاصطناعي SARS-CoV-2 من التركيزات المعروفة إلى لعاب خال من الفيروسات (معالج حراريا وغير معالج حراريا على حد سواء) لكننا لم نتمكن من إنتاج تضخيم N1 بتركيزات منخفضة من الحمض النووي الريبي (البيانات غير معروضة). قد يكون هذا بسبب تدهور RNase أو عوامل مربكة أخرى.

كما تم تقييم التباين بين وداخل الفحص بين طرق تحميل العينات الآلية واليدوية. ولتقييم التباين بين المقايسات، تم تحميل 20 عينة إيجابية فريدة باستخدام الدليل (الموصوف في القسم 8-1-8-3) والآلي (الموصوف في القسم 7-1-7-11). تمت مقارنة قيم N1 Ct لتحديد ما إذا كانت روبوتات مناولة السوائل وتحميل العينات اليدوي قد أنتجا نتائج مكافئة (الشكل 5A). أنتجت العلاقة الخطية بين الطرق اليدوية والآلية معامل ارتباط مرتفع (R2 = 0.9088) ، مما يشير إلى أن كلتا الطريقتين متساويتان وظيفيا. مع زيادة قيم N1 Ct ، زاد أيضا تباين قيم Ct. من المحتمل أن يكون هذا الاتجاه بسبب التوزيع غير المتجانس للجسيمات الفيروسية داخل اللعاب ، والذي يكون أكثر وضوحا عند وجود عدد أقل من الجسيمات. لتقييم التباين داخل المقايسة ، أجريت مقارنة بين قيم N1 Ct من آبار مكررة لعينات اللعاب الفريدة باستخدام كلتا الطريقتين لتحميل العينات (الشكل 5B). أنتجت العلاقة الخطية بين النسخ المتماثلة لتحميل العينات الآلي (R2 = 0.9622) معامل ارتباط أعلى قليلا من معامل التحميل اليدوي (R2 = 0.9589) ، مما يشير إلى قابلية عالية للتكرار للكشف عن SARS-CoV-2 لكلتا طريقتي التحميل.

وأخيرا، أجري تقييم للحد من لزوجة اللعاب فيما يتعلق بطرق المعالجة الحرارية (الشكل 6). تم الحصول على اللعاب من مصدر واحد للقضاء على تباين العينة. قد يكون التباين الأكبر في قيم P1 Ct ضمن طريقة معالجة حرارية واحدة مؤشرا على ارتفاع لزوجة العينة حيث لا يمكن شفط اللعاب اللزج وتوزيعه بدقة. أنتجت كل من طرق المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة و 60 دقيقة انخفاضا كبيرا في تباين العينة عند مقارنتها بعدم وجود تحكم في المعالجة (p = 0.0006 و p = 0.0429 ، على التوالي). لم يكن هناك فرق كبير بين 30 دقيقة و 60 دقيقة (p = 0.2245) ؛ لذلك ، تم تنفيذ طريقة المعالجة الحرارية لمدة 30 دقيقة لتقليل وقت المعالجة.

Figure 1
الشكل 1: سير العمل المختبري باستخدام نظام التشخيص RT-qPCR القائم على اللعاب . (أ) يتم جمع العينات ومعالجتها حراريا عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يتم فرز العينات المعالجة وتتبعها بمعلومات المريض من خلال نظام جداول بيانات داخلي. يقوم روبوت مناولة للسوائل بتحميل العينات في آبار مكررة من ألواح الخلط الرئيسية المعدة. يقوم الفني يدويا بتحميل عناصر التحكم وإغلاق اللوحة ووضع اللوحة في جهاز تدوير حراري للمعالجة. يتم تحليل النتائج من خلال نظام كمبيوتر آلي والتحقق منها من قبل فني. (ب) يقوم فني بإعداد الكواشف للمزيج الرئيسي الذي يضاف إلى خزان بئر عميق في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية. يتم تحميل خزانات الآبار العميقة المملوءة في روبوت مخصص للتعامل مع السوائل. يتم ختم الألواح المكتملة بورق القصدير ، وتصنيفها ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية .

Figure 2
الشكل 2: التخطيطات المستخدمة لروبوت مناولة السوائل . (أ) تخطيط سطح السفينة لروبوت (روبوتات) إعداد لوحة المزيج الرئيسي. باستخدام ماصة ذات ثماني قنوات ، تمت برمجة الروبوت لالتقاط أطراف الماصة ، وشفط المزيج الرئيسي من خزان بئر عميق مكون من 96 بئرا ، وتوزيع المزيج الرئيسي في ألواح فارغة من 384 بئرا ، وإخراج أطراف الماصة إلى صندوق نفايات. يتكرر هذا لمدة ست لوحات لكل تشغيل. (ب) إعداد سطح السفينة لروبوت (روبوتات) تحميل العينات. باستخدام ماصة أحادية القناة ، تتم برمجة الروبوت لالتقاط طرف ماصة ، وشفط عينة من اللعاب ، وتوزيع عينة من اللعاب في آبار مكررة من لوحة خلط رئيسية مكونة من 384 بئرا ، وإخراج طرف الماصة إلى صندوق نفايات. يتكرر هذا ل 48 عينة لكل تشغيل. (ج) عينة أنبوب تحميل النظام لرفوف مطبوعة 3D. تشير الأسهم الحمراء إلى ترتيب التحميل داخل الحامل، وتشير الأرقام المربعة البيضاء إلى ترتيب تحميل مجموعة الرفوف بأكملها. سيقوم الإعداد بأكمله بتحميل 188 عينة في نسختين في لوحة 384 بئرا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نموذج المخطط الانسيابي الناتج. تم تحديد العينات التي تحتوي على P1 صالح و N1 إيجابي على أنها عينات لعاب بشري إيجابية ل SARS-CoV-2. واعتبرت نتائج العينات الصحيحة والإيجابية/السلبية حاسمة. تم تصنيف العينات التي لم تسفر عن نتائج حاسمة في التشغيل الأول على أنها إعادة تشغيل (يشار إليها ب RR) أو N1 Rerun (يشار إليها N1 RR). لم يكن لعينات إعادة التشغيل تضخيم P1 صالح ، وكان لعينات N1 Rerun تضخيم N1 إيجابي في نسخة متماثلة واحدة. إذا لم يكن بالإمكان إنتاج تضخيم P1 صالح عن طريق تشغيل يدوي لاحق ، أو كان لكلا النسختين المتماثلتين قيم N1 Ct أعلى من العتبة الإيجابية (Ct >33) ، اعتبرت نتائج العينة غير حاسمة. ولأغراض سريرية، اعتبرت عينات المرضى التي لم تصل إلى المختبر، أو التي لم تصل إلى المختبر، أو التي لم تكن لديها كمية كافية من اللعاب للماصة، أو التي تعرضت للتلف غير صالحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الكشف RT-qPCR عن الحمض النووي الريبي الاصطناعي N1 (SARS-CoV-2) والحمض النووي الاصطناعي P1 (Hs_RPP 30). تم رسم المنحنيات القياسية مع الانحرافات المعيارية لتحديد نطاق الكشف الدقيق باستخدام هذا الجمع بين المسبار / التمهيدي. (أ) تم رسم متوسط قيم Ct (n = 4) التي تم الحصول عليها في التخفيفات ذات الصلة مقابل الكمية المقدرة من الحمض النووي الريبي الاصطناعي (1x100 إلى 1x104 نسخ RNA في 10 ميكرولتر من تفاعل RT-qPCR). (ب) تم رسم متوسط قيم Ct (n = 3) التي تم الحصول عليها في التخفيفات ذات الصلة مقابل الكمية المقدرة من الحمض النووي الاصطناعي (1 × 100 إلى 1 × 104 نسخ جينية في 10 ميكرولتر من تفاعل RT-qPCR). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقارنة بين قيم نقل اللعاب اليدوي والآلي SARS-CoV-2 (N1) Ct. تم تحميل عينات اللعاب الإيجابية المعروفة SARS-CoV-2 (n = 20) في نسختين في لوحة خلط رئيسية RT-qPCR بواسطة روبوت مناولة السوائل. العينات لها قيمة Ct تتراوح بين 18-32 ل N1. ثم تم تحميل نفس العينات يدويا في آبار مكررة في موقع لوحة مختلف. (أ) تم نقل قيم N1 Ct التي تم الحصول عليها من عينات فريدة باستخدام كل من تحميل العينة الروبوت والعينة اليدوي لتحديد التباين بين الفحص بين التحميل اليدوي والروبوت. (ب) تم تحديد التباين داخل الفحص أيضا باستخدام النسخ المتماثل المنقول لقيم N1 Ct التي تم الحصول عليها من كل من تحميل العينات الروبوتية واليدوية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تقييم طرق المعالجة الحرارية للحد من اللزوجة في اللعاب. تم جمع اللعاب السلبي SARS-CoV-2 من مصدر واحد وتم معالجة aliquots حراريا إما لمدة 0 دقيقة أو 30 دقيقة أو 60 دقيقة عند 95 درجة مئوية. تم رسم قيم P1 Ct من النسخ المتماثلة التقنية (n = 12) لكل حالة لتحديد التباين بين طرق العلاج. تم تقييم المقارنات الزوجية بين المجموعات باستخدام اختبار t غير مقترن (*** يشير إلى p <0.001 ، * يشير إلى p <0.05). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: مقارنة N1 Ct في عينات اللعاب منخفضة P1 Ct. تم اختيار العينات الإيجابية ذات P1 Ct المنخفض ومقارنتها مع N1 Ct (n = 106). تراوحت قيم N1 Ct بين 14-33 ، مما يشير إلى أن الفحص له نطاق ديناميكي في عينات اللعاب يمكن مقارنته بالمنحنى القياسي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

مكون التسلسل (5'→3') تركيز المخزون حجم
2019-nCoV-N1 التحقيق /5FAM/ACCCCGCAT/ZEN/TACGTTTGGTGGACC/3IABkFQ 50 ميكرومتر 500 ميكرولتر
2019-nCoV-N1-For GACCCCAAAATCAGCGAAAT 100 ميكرومتر 2000 ميكرولتر
2019-nCoV-N1-Rev TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG 100 ميكرومتر 2000 ميكرولتر
Hs RPP30 Cy5 التحقيق /5Cy5/TTCTGACCT/ZEN/GAAGGCTGCGCG/3IABkFQ 50 ميكرومتر 500 ميكرولتر
Hs-RPP30-For AGATTTGGACCTGCGAGCG 100 ميكرومتر 2000 ميكرولتر
Hs-RPP30-Rev GAGCGGCTGTCTCCACAAGT 100 ميكرومتر 2000 ميكرولتر
الماء - - 11000 ميكرولتر

الجدول 1: مكونات مزيج المسبار/التمهيدي N1+P1.

مكون تركيز المخزون الحجم لكل تفاعل التركيز النهائي حجم الدفعة
لونا وارمستارت آر تي إنزيم ميكس 20X 0.5 ميكرولتر 1X 3 مل
لونا العازلة رد الفعل ميكس 2X 5.0 ميكرولتر 1X 30 مل
N1 + P1 التمهيدي / مسبار ميكس nCoV N1 F: 10 ميكرومتر 0.5 ميكرولتر 500 نانومتر 3 مل
nCoV N1 R: 10 ميكرومتر 500 نانومتر
مسبار nCoV N1: 2.5 ميكرومتر 125 نانومتر
RPP_30 P1 F: 10 ميكرومتر 500 نانومتر
RPP_30 P1 R: 10 ميكرومتر 500 نانومتر
التحقيق RPP_30 P1: 2.5 ميكرومتر 125 نانومتر
مياه خالية من النوكليز --- 2 ميكرولتر --- 12 مل
المجموع الفرعي --- 8 ميكرولتر --- 48 مل
قالب 2 ميكرولتر

الجدول 2: مكونات المزيج الرئيسي المتعدد الإرسال SARS-CoV-2.

مرحلة درجة الحرارة (°C) مدة عدد الدورات
النسخ العكسي 55 10 دقائق 1
التشبع الأولي 95 1 دقيقة 1
هبوط 95 10 ثوان 3
72 30 ثانية
95 10 ثوان 3
69 30 ثانية
95 10 ثوان 3
66 30 ثانية
التضخيم الرئيسي 95 10 ثوان 40
65 30 ثانية

الجدول 3: بروتوكول RT-qPCR الهبوطي. شروط التدوير الحراري للفحص التشخيصي RT-qPCR SARS-CoV-2 المكون من خطوة واحدة.

خطوة الهبوط لا توجد خطوة هبوط
يعني N1 Ct متوسط P1 Ct يعني N1 Ct متوسط P1 Ct
نموذج 1 19.65 22.7 27.8 28.3
نموذج 2 22.24 24.9 28.77 30.5
نموذج 3 18.85 19.2 24.65 25.9
نموذج 4 25.56 22.8 31.93 29.2
نموذج 5 22.34 24.8 38.48 40.0 (فشل الكشف)

الجدول 4: مقارنة قيم Ct للهبوط لخمس عينات موجبة مقابل قيم Ct للهبوط.

عينة لعاب النمر فحص SARS-CoV-2 القائم على اللعاب المتاح تجاريا
N1 قيراط P1 Ct قيمة كوفيد-19 قيمة RNaseP
د11 16.4 18.1 20.86 23.4
ه١١ 18.9 19.1 25.6 21.2
إف 11 19.5 18.4 22.8 22.2
جي 11 22.2 19.1 23.7 22.9
إتش11 26.4 21.3 32.2 26.7
أ١٢ 14.8 16.5 29.15 19
ب١٢ 24 19.6 31.05 21.35
ج١٢ 14.9 17.5 20.84 18.9

الجدول 5: مقارنة بين نتائج TigerSaliva Ct ونتائج فحص SARS-CoV-2 القائمة على اللعاب المتاحة تجاريا. تم إجراء كلا الاختبارين على نفس عينات اللعاب (n = 8).

الملف التكميلي 1: برنامج نصي مخصص لإنشاء لوحة المزيج الرئيسية للروبوت.

الملف التكميلي 2: برنامج نصي مخصص لمعالجة اللعاب على روبوتات تحميل العينات.

الملف التكميلي 3: تعليمات لجمع عينات اللعاب عالية الجودة ذاتيا من المشاركين. يمكن العثور على مزيد من التفاصيل في وصف الفيديو القصير لعملية الاختبار المتاحة في https://www.clemson.edu/centers-institutes/reddilab/index.html. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: جدول بيانات عينة المدخول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: نموذج تحميل جدول البيانات. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: نموذج مخطط تخطيط لوحة 384 بئر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تم تقييم الفحص الموصوف في البروتوكول من خلال دراسة تحقق مستقلة. وجد أن الفحص كان له خصوصية بنسبة 98.9٪ (1.1٪ إيجابية كاذبة) وحساسية 90.0٪ (10.0٪ سلبية كاذبة) عند تقييمها مقابل مسحات البلعوم الأنفي المقترنة المأخوذة في نفس الوقت (n = 837 ؛ 817 سلبية ، 20 إيجابية). الأهم من ذلك ، تم إعادة اختبار ثلاثة مشاركين ثبتت إصابتهم ب TigerSaliva وسلبية مع مسحة البلعوم الأنفي بمسحات بعد 48 ساعة وعادوا بنتائج إيجابية ، مما يشير إلى أن TigerSaliva قد يكون قادرا على اكتشاف عدوى SARS-CoV-2 في وقت مبكر من أثناء المرض.

قمنا بمحاكاة عينات اللعاب الإيجابية عن طريق رفع اللعاب الخالي من الفيروسات (المعالج حراريا وغير المعالج حراريا على حد سواء) مع تركيزات معروفة من الحمض النووي الريبي الاصطناعي SARS-CoV-2 وأجرينا تخفيفا بمقدار 10 أضعاف لتحديد حد Ct في اللعاب. لم يكن من الممكن اكتشاف جين N1 أقل من 10000 نسخة جينية (حوالي Ct = 28) في عينات إيجابية محاكاة. نحن نشك في أن هذا يرجع إلى تدهور RNase أو عوامل مربكة أخرى. ومع ذلك ، من المحتمل أن يختلف تفاعل اللعاب مع الحمض النووي الريبي الاصطناعي العاري عن التفاعل مع الجسيمات الفيروسية ، حتى بعد تشويهها بالحرارة. تم تحديد عينات اللعاب الإيجابية باستخدام Ct >30 وحصلت المختبرات الخارجية على بيانات التسلسل الجيني SARS-CoV-2 من هذه العينات. نتوقع أن البروتينات الفيروسية توفر الحماية من تدهور الحمض النووي الريبي في عينات لعاب المرضى.

الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تنفيذ الأتمتة لإعداد المزيج الرئيسي ومعالجة عينات اللعاب (القسمان 4 و 7 على التوالي). وهذا يسمح بتداخل عمليات المهام ، مما يقلل بشكل كبير من وقت الإنجاز. خطوة حاسمة أخرى هي تفسير النتائج السريرية (القسمان 11 و 12). كما أدى إنشاء فئات النتائج الوسيطة (إعادة التشغيل وإعادة تشغيل N1) إلى تقليل حدوث نتائج اختبار غير حاسمة.

لقد أظهرنا أن التباين بين طرق تحميل عينات اللعاب اليدوية والآلية لا يكاد يذكر (الشكل 5A) وأن الأتمتة قد تحسن من قابلية تكرار الكشف عن SARS-CoV-2 (الشكل 5B). يجب تفضيل الأتمتة لتسهيل الاختبار عند تصميم وتوسيع المختبرات السريرية25. تم تحسين سير العمل في المختبر من خلال تنفيذ المهام الآلية للروبوت26. تسمح القدرات مفتوحة المصدر لروبوتات مناولة السوائل بتنفيذ برمجة نصية مخصصة لتصميم البروتوكول. وهذا يجعل روبوتات مناولة السوائل نظاما غير مكلف وقابلا للتعديل بدرجة عالية مقارنة بطرق الأتمتة السريرية التقليدية. كما أنها استراتيجية مثالية لتنفيذ المهام المختبرية المتكررة للغاية. يترجم المستوى العالي من قابلية التخصيص للنظام إلى حرية تغيير أدوات المختبر (على سبيل المثال ، أنابيب التجميع أو أطراف الماصة أو لوحات 384 بئرا) في حالة النقص. لذلك ، فإن الأتمتة باستخدام روبوتات مناولة السوائل قابلة للتطبيق لكل من المراقبة والأبحاث على نطاق واسع وصغير.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لاستراتيجية الاختبار هذه في وقت تسليم أقصر بكثير مقارنة بالمختبرات السريرية الأخرى. يلعب استخدام روبوتات مناولة السوائل الآلية دورا رئيسيا في تقليل وقت الاستجابة ، ولكن الاستخدام المتزامن للروبوتات وأجهزة التدوير الحراري مفيد أيضا في زيادة كفاءة الاختبار إلى أقصى حد. يجب تشغيل روبوت واحد وجهاز تدوير حراري كزوج ، حيث يتم استخدام كلا الجهازين جنبا إلى جنب لتحميل العينات دون انقطاع وتحليل نتائج العينات. بمجرد إنشاء تدفق ثابت للعينات المعينة ، يمكن تشغيل جميع أزواج الماكينات في وقت واحد. الاستخدام المتزامن المستمر للروبوتات وأجهزة إعادة التدوير الحراري يزيد بشكل كبير من قدرة الاختبار وكفاءته ، وهو أمر بالغ الأهمية لاستيعاب حجم الاختبار المرتفع.

وعلى النقيض من بروتوكولات SARS-CoV-2 RT-qPCR الأخرى المعمول بها، قمنا بتضمين خطوة هبوط في بروتوكول التدوير الحراري لتحسين تلدين مجموعات المسبار والتمهيدي للجينات المستهدفة27، مما يقلل من خطر فشل التضخيم. أظهرت النتائج أن الهبوط حسن من اكتشاف العينات الإيجابية دون المخاطرة بفقدان ربط تمهيدي محدد (الجدول 4). قررنا أن مجموعة واسعة من نسخ الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 (الشكل 4A) ونسخ الحمض النووي Hs_RPP30 (الشكل 4B) يمكن اكتشافها في وقت واحد بواسطة فحص RT-qPCR.

أحد القيود المفروضة على روبوتات مناولة السوائل هو إمكانية التلوث المتبادل من العينات الإيجابية أثناء نقل اللعاب. اللعاب هو سائل لزج مرن28 وقد يخيط عبر الآبار المجاورة بعد الاستغناء عنه من طرف الماصة. علاوة على ذلك، قد يسبب عدم تجانس اللعاب29 توزيعا غير متساو للجسيمات الفيروسية في جميع أنحاء العينة. هذا يزيد من إمكانية كل من الإيجابيات والسلبيات الخاطئة ، مما يستلزم تعيين عينات N1 Rerun و Rerun. ومع ذلك ، فإن 14.1٪ من العينات التي تم تعيينها في البداية على أنها N1 Rerun تم حلها على أنها إيجابية ل SARS-CoV-2 وكانت أكثر عرضة بأكثر من 30 مرة من عينات Rerun لحلها على أنها إيجابية بعد إعادة الاختبار. وبالتالي ، فإن التمييز بين Rerun و N1 Rerun (الشكل 3) سمح بفصل أكثر دقة للعينات الإيجابية المحتملة ، مما زاد من حساسية وخصوصية الفحص التشخيصي لدينا. المعلمات الأخرى الناتجة لاختبار اللعاب التشخيصي لم تجعل هذا التمييز12،14،24،30،31.

قد يكون من الصعب ماصة عينات اللعاب بسبب عدم التجانس واللزوجة32. تعمل المعالجة الحرارية على تشويه البروتينات الموجودة في المصفوفة الحيوية للعاب بشكل كاف، مما يقلل من اللزوجة ويلغي الحاجة إلى كواشف استخراج الحمض النووي الريبي9، التي كانت نادرة خلال المراحل المبكرة من الجائحة10. كما أن المعالجة الحرارية الموسعة تعطل الفيروسات الحالية33 مما يسمح بالمعالجة المختبرية بمستويات أقل من السلامة الأحيائية. ونتيجة لذلك، تم تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي القائم على الحرارة (الموصوف في القسم 5.4) لتقليل اللزوجة من خلال تمسخ البروتين (الشكل 6). بناء على النتائج ، نفترض أن المعالجة الحرارية قد تؤدي أيضا إلى تجانس عينات اللعاب بالإضافة إلى تمسخ المصفوفة الحيوية للبروتين. مجموعات أخرى جمعت بين المعالجة الحرارية ومعالجة بروتين K لزيادة التجانس9،14،34. لقد اخترنا عدم تنفيذ هذه الخطوة لأنها قد تشوه بروتينات الفيروسات بمعدل يترك الحمض النووي الريبي الفيروسي عرضة للتحلل الحراري35. علاوة على ذلك ، قد يخفي تخفيف العينة باستخدام بروتين K عينات إيجابية تحتوي على جزيئات فيروسية أقل وبالتالي تقليل الحساسية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت مقارنة نتائج الفحص بفحص SARS-CoV-2 القائم على اللعاب المتاح تجاريا (Logix Smart COVID-19) والذي يستخدم استخراج الحمض النووي الريبي من الخرز المغناطيسي (الجدول 5). وقد وجد أن الفحص الحالي كان أكثر ملاءمة للكشف عن العينات الإيجابية الضعيفة مقارنة بالفحص المتاح تجاريا.

من الصعب تحديد عدد نسخ الفيروس في اللعاب باستخدام RT-qPCR فقط ، لأن qPCR شبه كمي. هناك اختلاف متأصل بين قيم Ct التي تنشأ من القيود التقنية. يمكن تحديد عدد النسخ الجينية من قيم Ct (الشكل 4) وهو يعادل تقريبا عدد النسخ الفيروسية. أحد الحلول الممكنة لتحديد عدد النسخ الفيروسية في عينات اللعاب هو ddPCR ، والذي يوفر تكميليا ثابتا للنسخ الجينية في التفاعل. ومع ذلك ، نعتقد أنه من الكافي توفير نتائج نوعية للأطباء ويمكن مقارنة المحتوى الفيروسي النسبي عبر العينات التي تتم معالجتها بأساليبنا.

على الرغم من بعض القيود التي تنشأ عند استخدام اللعاب ، فإن فحص SARS-CoV-2 بواسطة RT-qPCR القائم على اللعاب يثبت أنه طريقة فعالة للكشف السريع والموثوق به عن الحمض النووي الريبي الفيروسي على أي نطاق من الاختبارات. هذا صحيح بشكل خاص عندما يقترن باستخدام أنظمة مناولة السوائل مفتوحة المصدر. يمكن تعديل نهج الاختبار هذا للكشف عن تسلسلات الأحماض النووية الأخرى ذات الصلة بالتشخيص ، مثل عوامل الأمراض المعدية أو علامات المرض أو الفيروسات الأخرى. وهذا يجعل الفحص قابلا للتطبيق على كل من الجهود التشخيصية السريرية والبحثية.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه. يندرج الفحص الموصوف في البروتوكول تحت SalivaDirect EUA المقدم من كلية ييل للصحة العامة.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون إدارة كليمسون والطاقم الطبي وموظفي المختبر السريري في مختبر REDDI الذين ساعدوا في تنفيذ وإدارة اختبار SARS-CoV-2. نشكر الدكتور فيليب باكهولتس والدكتورة كارولين بانيستر من جامعة ساوث كارولينا على الاستشارات الأولية للمشروع والاتصالات الصناعية لشراء المعدات. نشكر العديد من الطلاب والأساتذة والموظفين على مساعدتهم في جمع العينات. شكرا لطلاب Creative Inquiry على جمع بيانات المنحنى القياسية. تم تلقي تمويل هذه الدراسة من منحة المعاهد الوطنية للصحة P20GM121342 (الممنوحة ل DD و LGP) ، وإدارة كليمسون الرياضية ، ونائب رئيس جامعة كليمسون للبحوث ، وحاكم ولاية كارولينا الجنوبية ولجنة مراجعة السندات المشتركة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% EtOH Fisher scientific 22-032-601
20 uL Filtered Pipette Tips Opentrons 20uL tips
2mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 14-666-313 Alternate product may be used
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells Thermo Scientific AB3384 Alternate product may be used
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates Fisher Scientific 50-828-743 For mastermix preparation
Clear PCR Sealing Sheets Thermo Scientific AB0558 Alternate product may be used
DPEC Treated Water Ambion (Thermo Scientific) AM9916
Flip Cap 50 mL Conical Tubes VWR 75845-210 For sample collection
Foil PCR Sealing Sheets Thermo Scientific AB0626 For storage of mastermix plates, Alternate product may be used
HS_RPP30 Synthetic DNA Integrated DNA Technologies 299788131 P1 positive control
Luna Buffer Probe One-Step Reaction New England Biolabs M3006B
Luna WarmStart RT Enzyme Mix New England Biolabs M3002B
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006830
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol Integrated DNA Technologies 10006832 Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006831
Opentron HEPA Filter Module Opentrons N/A Not required, but useful to reduce contamination
Opentron Multichannel Attachment, P20 Opentrons 999-00005 For mastermix preparation
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot Opentrons OT-2
Opentron Pipette Attachment, P20 Opentrons 999-0000215 For sample loading
Oven Memmert UF450 PLUS 208V-3PH
PCR Tubes (rnase, dnase free) Fisher Scientific 14-230-225 For aliquots of positive and neg controls
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes) VWR 10808-952
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes) VWR 10808-956
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol Integrated DNA Technologies 10007062 Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore
RNAse P Forward Primer, 100nmol Integrated DNA Technologies 10006836
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol Integrated DNA Technologies 10006837
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2 Twist Biosciences 102024 / 103907 / 103909 N1 Positive Control
Scanners Code CR1500 Only required when scaling up
Small HEPA Filtered Hood Erlab Captair Bio 321 For mastermix preparation
Thermocycler CFX384 Touch Biorad CFX384 Touch Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus
X-acto Knife Set Staples N/A To cut foil for keeping control wells covered

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhu, N., et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New England Journal Medicine. 382 (8), 727-733 (2020).
  2. Chen, J. Pathogenicity and transmissibility of 2019-nCoV-A quick overview and comparison with other emerging viruses. Microbes and Infection. 22 (2), 69-71 (2020).
  3. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. The Lancet. Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  4. Honein, M. A., et al. Summary of Guidance for Public Health Strategies to Address High Levels of Community Transmission of SARS-CoV-2 and Related Deaths, December 2020. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (49), 1860-1867 (2020).
  5. World Health Organization. Surveillance strategies for COVID-19 human infection: interim guidance. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/332051 (2020).
  6. Screening testing for early detection of SARS-CoV-2 infection. Division of viral diseases. Centers for Disease Control. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/tsting-overview.html#PublicHealthSurveillance (2020).
  7. Larremore, D. B., et al. Test sensitivity is secondary to frequency and turnaround time for COVID-19 screening. Science Advances. 7 (1), 5393 (2021).
  8. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  9. Chu, A. W., et al. Evaluation of simple nucleic acid extraction methods for the detection of SARS-CoV-2 in nasopharyngeal and saliva specimens during global shortage of extraction kits. Journal of clinical virology: the official publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 129, 104519 (2020).
  10. Guan, D., et al. Global supply-chain effects of COVID-19 control measures. Nature Human Behaviour. 4 (6), 577-587 (2020).
  11. Bastos, M. L., Perlman-Arrow, S., Menzies, D., Campbell, J. R. The Sensitivity and Costs of Testing for SARS-CoV-2 Infection With Saliva Versus Nasopharyngeal Swabs: A Systematic Review and Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 174 (4), 501-510 (2021).
  12. Pasomsub, E., et al. Saliva sample as a non-invasive specimen for the diagnosis of coronavirus disease 2019: a cross-sectional study. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 27 (2), (2021).
  13. To, K. K., et al. Consistent Detection of 2019 Novel Coronavirus in Saliva. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of The Infectious Diseases Society of America. 71 (15), 841-843 (2020).
  14. Vogels, C. B., et al. SalivaDirect: A simplified and flexible platform to enhance SARS-CoV-2 testing capacity. Med (New York, N.Y.). 2 (3), 263-280 (2021).
  15. Griesemer, S. B., et al. Evaluation of Specimen Types and Saliva Stabilization Solutions for SARS-CoV-2 Testing. Journal of Clinical Microbiology. 59 (5), 1418-1420 (2021).
  16. Wehrhahn, M. C., et al. Self-collection: An appropriate alternative during the SARS-CoV-2 pandemic. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 128, 104417 (2020).
  17. Barza, R., Patel, P., Sabatini, L., Singh, K. Use of a simplified sample processing step without RNA extraction for direct SARS-CoV-2 RT-PCR detection. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of the Pan American Society for Clinical Virology. 132, 104587 (2020).
  18. Paltiel, A. D., Zheng, A., Walensky, R. P. Assessment of SARS-CoV-2 Screening Strategies to Permit the Safe Reopening of College Campuses in the United States. JAMA Network Open. 3 (7), 2016818 (2020).
  19. Centers for Disease Control. 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Primers and Probes. U.S. Department of Health and Human Services. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html (2020).
  20. Cresswell, K., Ramalingam, S., Sheikh, A. Can Robots Improve Testing Capacity for SARS-CoV-2. Journal of Medical Internet Research. 22 (8), 20169 (2020).
  21. Villanueva-Cañas, J. L., et al. Implementation of an open-source robotic platform for SARS-CoV-2 testing by real-time RT-PCR. PLoS One. 16 (7), 0252509 (2021).
  22. Robot Boosts COVID-19 Testing Efficiency. University of South Carolina College of Pharmacy. , Available from: https://sc.edu/study/colleges_schools/pharmacy/about/news/2020/robot-boosts-testing-effort.php (2020).
  23. Matic, N., et al. Practical challenges to the clinical implementation of saliva for SARS-CoV-2 detection. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of The European Society of Clinical Microbiology. 40 (2), 447-450 (2021).
  24. Sahajpal, N. S., et al. SalivaSTAT: Direct-PCR and Pooling of Saliva Samples Collected in Healthcare and Community Setting for SARS-CoV-2 Mass Surveillance. Diagnostics. 11 (5), Basel, Switzerland. 904 (2021).
  25. Genzen, J. R., et al. Challenges and Opportunities in Implementing Total Laboratory Automation. Clinical Chemistry. 64 (2), 259-264 (2018).
  26. Archetti, C., Montanelli, A., Finazzi, D., Caimi, L., Garrafa, E. Clinical Laboratory Automation: A Case Study. Journal of Public Health Research. 6 (1), 881 (2017).
  27. Hecker, K. H., Roux, K. H. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. BioTechniques. 20 (3), 478-485 (1996).
  28. Bhat, P. P., et al. Formation of beads-on-a-string structures during break-up of viscoelastic filaments. Nature Physics. 6, 625-631 (2010).
  29. Miller, C. S., et al. Current developments in salivary diagnostics. Biomarkers in Medicine. 4 (1), 171-189 (2010).
  30. Moreno-Contreras, J., et al. Saliva Sampling and Its Direct Lysis, an Excellent Option To Increase the Number of SARS-CoV-2 Diagnostic Tests in Settings with Supply Shortages. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 01659 (2020).
  31. Wang, W., et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 323 (18), 1843-1844 (2020).
  32. Landry, M. L., Criscuolo, J., Peaper, D. R. Challenges in use of saliva for detection of SARS CoV-2 RNA in symptomatic outpatients. Journal of Clinical Virology: The Official Publication of The Pan American Society for Clinical Virology. 130, 104567 (2020).
  33. Lista, M. J., et al. Resilient SARS-CoV-2 diagnostics workflows including viral heat inactivation. PLoS One. 16 (9), 0256813 (2021).
  34. Brotons, P., et al. Validation and implementation of a direct RT-qPCR method for rapid screening of SARS-CoV-2 infection by using non-invasive saliva samples. International Journal of Infectious Diseases: IJID: Official Publication of The International Society for Infectious Diseases. 110, 363-370 (2021).
  35. Batéjat, C., Grassin, Q., Manuguerra, J. C., Leclercr, I. Heat inactivation of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Journal of Biosafety and Biosecurity. 3 (1), 1-3 (2021).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 180،
استراتيجية فعالة لتشخيص اللعاب باستخدام روبوتات السحب العكسي الكمية ل SARS-CoV-2 باستخدام روبوتات السحب مفتوحة المصدر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ham, R. E., Smothers, A. R., King,… More

Ham, R. E., Smothers, A. R., King, K. L., Napolitano, J. M., Swann, T. J., Pekarek, L. G., Blenner, M. A., Dean, D. Efficient SARS-CoV-2 Quantitative Reverse Transcriptase PCR Saliva Diagnostic Strategy utilizing Open-Source Pipetting Robots. J. Vis. Exp. (180), e63395, doi:10.3791/63395 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter