Bioengineering

Экспериментальный рабочий процесс и анализ данных для наноиндентации мягкого вещества

Published: January 18, 2022 doi: 10.3791/63401

Giuseppe Ciccone¹, Mariana Azevedo Gonzalez Oliva¹, Nelda Antonovaite², Ines Lüchtefeld³, Manuel Salmeron-Sanchez¹, Massimo Vassalli¹

¹Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, ²Optics 11 life, ³Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

Summary

Протокол представляет собой полный рабочий процесс для экспериментов с наноиндентированием мягких материалов, включая гидрогели и клетки. Во-первых, подробно описаны экспериментальные этапы получения данных силовой спектроскопии; затем анализ таких данных детализируется с помощью недавно разработанного программного обеспечения Python с открытым исходным кодом, которое можно бесплатно загрузить с GitHub.

Abstract

Наноиндентация относится к классу экспериментальных методов, где микрометрический силовой зонд используется для количественной оценки локальных механических свойств мягких биоматериалов и клеток. Этот подход приобрел центральную роль в области механобиологии, проектирования биоматериалов и тканевой инженерии, чтобы получить надлежащую механическую характеристику мягких материалов с разрешением, сопоставимым с размером одиночных клеток (мкм). Наиболее популярной стратегией получения таких экспериментальных данных является использование атомно-силового микроскопа (АСМ); в то время как этот прибор предлагает беспрецедентное разрешение в силе (вплоть до pN) и пространстве (суб-нм), его удобство использования часто ограничено его сложностью, которая предотвращает рутинные измерения интегральных показателей механических свойств, таких как модуль Юнга (E). Новое поколение наноиндентаторов, таких как те, которые основаны на технологии оптического зондирования волокна, недавно приобрело популярность благодаря своей простоте интеграции, позволяя применять силы sub-nN с пространственным разрешением μm, поэтому они подходят для исследования локальных механических свойств гидрогелей и ячеек.

В этом протоколе представлено пошаговое руководство, подробно описывающее экспериментальную процедуру получения данных наноиндентирования на гидрогелях и клетках с использованием коммерчески доступного наноиндентера с оптическим волоконным зондированием с наконечником. Принимая во внимание, что некоторые этапы являются специфическими для инструмента, используемого в настоящем документе, предлагаемый протокол может быть принят в качестве руководства для других устройств наноиндентирования, при условии, что некоторые этапы адаптированы в соответствии с руководящими принципами производителя. Кроме того, представлено новое программное обеспечение Python с открытым исходным кодом, оснащенное удобным графическим пользовательским интерфейсом для анализа данных наноиндентации, которое позволяет проводить скрининг неправильно полученных кривых, фильтрацию данных, вычисление точки контакта с помощью различных численных процедур, обычное вычисление E, а также более продвинутый анализ, особенно подходящий для одноклеточных наноиндентационных данных.

Introduction

Фундаментальная роль механики в биологии в настоящее время установлена ^1,2. От целых тканей до одиночных клеток механические свойства могут информировать о патофизиологическом состоянии исследуемого биоматериала ^3,4. Например, ткань молочной железы, пораженная раком, жестче, чем здоровая ткань, концепция, которая лежит в основе популярного пальпационного теста⁵. Примечательно, что недавно было показано, что коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19), вызванная тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), подчеркивается изменениями механических свойств клеток крови, включая снижение деформируемости эритроцитов и снижение жесткости лимфоцитов и нейтрофилов по сравнению с клетками крови у SARS-CoV-2-наивных лиц⁶.

В целом, механика клеток и тканей по своей природе переплетена: каждая ткань обладает специфическими механическими свойствами, которые одновременно влияют и зависят от свойств составляющих клеток и внеклеточного матрикса (ECM)⁵. Из-за этого стратегии изучения механики в биологии часто включают инженерные субстраты с физиологически значимыми механическими стимулами для выяснения поведения клеток в ответ на эти стимулы. Например, основополагающая работа Энглера и его коллег продемонстрировала, что приверженность линии мезенхимальных стволовых клеток контролируется эластичностью матрицы, как это изучалось на мягких и жестких двумерных полиакриламидных (PAAm) гидрогелях⁷.

Существует множество стратегий для механической характеристики исследуемого биоматериала, варьирующихся по пространственному масштабу (т.е. от локального к объемному) и по способу деформации (например, осевой или сдвиговой), следовательно, давая различную информацию, которая требует тщательной интерпретации 3,8,9,10. Механика мягких биоматериалов обычно выражается в терминах жесткости. Однако жесткость зависит как от свойств материала, так и от геометрии, тогда как модули упругости являются фундаментальными свойствами материала и не зависят от геометрии материала¹¹. Таким образом, различные модули упругости связаны с жесткостью данного образца, и каждый модуль упругости охватывает сопротивление материала определенному режиму деформации (например, осевой против сдвига) при различных граничных условиях (например, свободное расширение против удержания)^11,12. Эксперименты с наноиндентированием позволяют количественно оценить механические свойства через Е, что связано с одноосной деформацией (отступом), когда биоматериал не ограничен латерально 10,11,12.

Наиболее популярным методом количественной оценки Е биологических систем на микроуровне является AFM 13,14,15,16. AFM является чрезвычайно мощным инструментом с силовым разрешением вплоть до уровня pN и пространственным разрешением вплоть до суб-нм масштаба. Кроме того, AFM предлагает чрезвычайную гибкость с точки зрения соединения с дополнительными оптическими и механическими инструментами, расширяя свои возможности по извлечению большого количества информации из исследуемого биоматериала¹³. Эти привлекательные особенности, однако, имеют барьер для входа, представленный сложностью экспериментальной установки. AFM требует обширной подготовки, прежде чем пользователи смогут получить надежные данные, и его использование для повседневной механической характеристики биологических материалов часто неоправданно, особенно когда его уникальная сила и пространственное разрешение не требуются.

Из-за этого новый класс наноиндеттеров недавно приобрел популярность из-за их простоты использования, в то же время предлагая сопоставимые с AFM данные с разрешением силы sub-nN и пространственным разрешением мкм, отражая силы, оказываемые и воспринимаемые клетками по соответствующим масштабам длины². В частности, наконечники наноиндентации на основе технологии оптического зондирования^{волокна 17,18} завоевали популярность среди исследователей, работающих в области механобиологии и за ее пределами; и было опубликовано множество работ, сообщающих о механических свойствах биоматериалов с использованием этих устройств, включая клетки ^19,20, гидрогели ^8,21 и ткани ^22,23. Несмотря на возможности этих систем исследовать локальные динамические механические свойства (т.е. модуль хранения и потерь), квазистатические эксперименты, дающие E, остаются наиболее популярным выбором 8,19,20,21. Короче говоря, квазистатические эксперименты с наноиндентированием состоят из отступа образца с постоянной скоростью до заданной точки, определяемой либо максимальным смещением, силой или глубиной отступа, и регистрации как силы, так и вертикального положения консольного аппарата в так называемых кривых расстояния силы (F-z). Затем кривые F-z преобразуются в кривые с отступом по силе (F-δ) путем идентификации точки контакта (CP) и оснащаются соответствующей моделью контактной механики (обычно моделью Герца¹³) для вычисления E.

Хотя работа наноиндеттеров с наконечниками напоминает измерения AFM, есть особенности, которые стоит учитывать. В этой работе представлено пошаговое руководство по надежному получению кривых F-z из клеток и тканевых гидрогелей с использованием коммерчески доступного наноиндентера с наконечником, чтобы стимулировать стандартизацию экспериментальных процедур между исследовательскими группами, использующими это и другие подобные устройства. Кроме того, даются советы о том, как наилучшим образом подготовить образцы гидрогеля и клетки для проведения экспериментов по наноиндентации, а также советы по устранению неполадок вдоль экспериментального пути.

Кроме того, большая часть изменчивости результатов наноиндентирования (т.е. E и его распределение) зависит от конкретной процедуры, используемой для анализа данных, которая является нетривиальной. Для решения этой проблемы приведены инструкции по использованию недавно разработанного программного обеспечения с открытым исходным кодом, запрограммированного на Python и оснащенного удобным графическим интерфейсом пользователя (GUI) для пакетного анализа кривых F-z . Программное обеспечение позволяет проводить быстрый скрининг данных, фильтрацию данных, вычисление CP с помощью различных численных процедур, обычное вычисление E, а также более продвинутый анализ, называемый спектрами упругости²⁴, позволяющий оценить объемный модуль Юнга клетки, модуль Юнга актиновой коры и толщину коры актина. Программное обеспечение может быть свободно загружено с GitHub и может быть легко адаптировано для анализа данных, поступающих из других систем, путем добавления соответствующего парсера данных. Подчеркивается, что этот протокол может быть использован для других устройств наноиндентации с наконечниками и других наноиндентационных устройств в целом, при условии, что некоторые этапы адаптированы в соответствии с руководящими принципами конкретного инструмента. Протокол схематично обобщен на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка субстратов/клеток для измерений наноиндентов

Следуйте шагам, приведенным в Дополнительном протоколе для получения гидрогелей/клеток PAAm для экспериментов по наноиндентированию. Процедура обобщена на рисунке 2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогели PAAm были выбраны, поскольку они являются наиболее распространенными гидрогелями, используемыми в области механобиологии. Однако протокол в равной степени применим к любому типу гидрогеля²⁵ (см. Обсуждение, модификации метода).

2. Запуск устройства, выбор зонда и калибровка зонда

Выполните действия, описанные в Дополнительном протоколе для запуска устройства. Для получения технической информации о работе волоконно-оптических наконечников с верхними наноиндентами, проверьте эти ссылки^17,18.
Выберите наноиндентационный зонд, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все коммерчески доступные датчики, такие как те, которые используются в этом протоколе, оснащены сферическим наконечником (рисунок 3A). Поэтому выбор сужается до двух переменных: жесткости консольного аппарата и радиуса наконечника (рисунок 3B).
1. Выберите жесткость консольного аппарата (k в Н/м), которая соответствует ожидаемой жесткости образца для достижения наилучших результатов¹⁵ (см. Рисунок 3C и Обсуждение, критические шаги в протоколе). Для ячеек выберите зонд с k в диапазоне 0,01-0,09 Н/м. Для гидрогелей выберите зонд с k в диапазоне 0,1-0,9 Н/м, который дает оптимальные результаты для гелей с ожидаемым Е от нескольких кПа до 100 кПа (см. Репрезентативные результаты).
2. Выберите радиус наконечника (R в мкм) в соответствии с требуемым пространственным разрешением процесса отступа. Для небольших клеток, таких как клетки эмбриональной почки человека 293T (HEK293T) (средний диаметр ~ 10-15 мкм²⁶), выберите сферу с R = 3 мкм. Для гидрогелей выберите сферу с R = 10-250 мкм, чтобы исследовать механические свойства биоматериала на большой площади контакта и избежать локальных неоднородностей.
3. Обратитесь к рисунку 3C и любым дополнительным рекомендациям производителя, чтобы выбрать подходящий зонд.
После того, как зонд выбран, выполните действия, описанные в Дополнительном протоколе , чтобы установить его на наноиндентер.

3. Калибровка зонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги специфичны для наконечников наноиндентационных устройств, основанных на технологии оптического зондирования волокна, и они подробно описаны для программного обеспечения версии 3.4.1. Для других устройств наноиндентации выполните действия, рекомендованные производителем устройства.

В главном окне программного обеспечения нажмите Инициализировать. Появится меню калибровки. Введите данные зонда (можно найти на боковой стороне коробки зонда; k в Н/м, R в мкм и калибровочный коэффициент в воздухе) во входных коробках.
Приготовьте калибровочную тарелку: толстую стеклянную чашку Петри с плоским дном (см. Обсуждение, критические шаги в протоколе). Наполните блюдо той же средой, что и блюдо с образцом (это также может быть воздух). Сопоставьте температуру среды с температурой образца.
Поместите калибровочную тарелку под зонд. При необходимости выдвиньте зонд из держателя наноиндентатора и держите его в одной руке, чтобы освободить место для размещения калибровочной тарелки. Сдвиньте зонд обратно на место.
Выполните следующие два шага для калибровки в жидкости. При измерении на воздухе используйте предоставленную полиэтиленовую подложку из политетрафторэтилена для калибровки и перейдите к шагу 5.
1. Добавьте к зонду каплю 70% этанола с помощью пипетки Пастера с концом пипетки в легком контакте со стеклянным наконечником, чтобы капля скользила по консольному и сферическому наконечнику²⁷ (см. Обсуждение, критические шаги в протоколе).
2. Вручную сдвиньте руку наноиндентера вниз, пока зонд не будет полностью погружен, но все еще далеко от дна чашки Петри. При необходимости добавьте в калибровочную посуду больше среды. Подождите 5 минут, чтобы в жидкости были достигнуты равновесные условия.
В меню Инициализация программного обеспечения нажмите кнопку Scan Wavelength(Длина волны сканирования). На экране интерферометра будет показан индикатор выполнения, а в окне Live Signal в программном обеспечении компьютера будет отображаться рисунок, показанный на рисунке S1A, слева. Чтобы проверить, было ли выполнено оптическое сканирование, перейдите на панель «Сканирование по длине волны » на блоке интерферометра. В случае успеха должна быть видна синусоида (рисунок 1A, справа). См. раздел Обсуждение (устранение неполадок метода), если появляется ошибка.
В меню «Инициализация » нажмите « Найти поверхность», которая будет постепенно опускать зонд до тех пор, пока не будет достигнут установленный порог в изгибе консольного устройства. Зонд перестает двигаться при контакте со стеклянной чашкой Петри.
Проверьте, находится ли зонд в контакте с поверхностью. Переместите зонд вниз на 1 мкм с помощью кнопки со стрелкой y вниз в главном окне программного обеспечения. Наблюдайте за зеленым сигналом (отклонением консольа) в Интерактивном окне программного обеспечения для изменений базовой линии с каждым шагом, когда консоль находится в контакте с подложкой (рисунок S1B). Если изменений нет, консоль не контактирует (см. следующий шаг).
Увеличьте пороговое значение в меню Параметры на вкладке Найти Surface со значения по умолчанию 0,01 на шаг 0,01 за раз и повторяйте шаг Найти Surface до тех пор, пока не вступит в контакт. В качестве альтернативы, опустите зонд для контакта небольшими шагами 1 мкм до тех пор, пока зеленая базовая линия не начнет смещаться на каждом шаге вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для самых мягких консольных устройств (k = 0,025 ^Нм-1) увеличьте пороговое значение в меню «Параметры» на вкладке «Найти поверхность» априори выполнения шага 6. Начните с порогового значения 0,06 или 0,07 и при необходимости увеличьте его до 0,1. Это связано с тем, что шум окружающей среды, вероятно, заставит консоль согнуться выше порога перед контактом. Для мягких зондов уменьшение скорости приближения (мкм/с) в том же меню также улучшает процедуру.
В меню Инициализация выберите Калибровать.
Проверьте окно Live Signal программного обеспечения и убедитесь, что сигналы смещения пьезо и отклонения консольного устройства движутся вверх одновременно (рисунок S1C).
1. Если есть несоответствие во времени, зонд не полностью контактирует со стеклом. Двигайтесь вниз по зонду с шагом 1 мкм до тех пор, пока не изменится базовая линия консольного сигнала (см. шаг 7), и повторите шаг 9.
2. Если консольный сигнал вообще не изменяется на этапе калибровки , то зонд находится далеко от поверхности. Увеличивайте порог контакта итеративно (см. шаг 8) до тех пор, пока поверхность не будет найдена правильно, и повторяйте калибровку с самого начала, начиная со сканирования длины волны.
После завершения калибровки проверьте старый и новый коэффициенты калибровки во всплывающем окне. Если новый калибровочный коэффициент находится в правильном диапазоне, нажмите «Использовать новый фактор». Если калибровка не удалась, и новый коэффициент либо NaN, либо не находится в ожидаемом диапазоне, см. Обсуждение (устранение неполадок метода) для разрешения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Новый коэффициент должен быть ~n раз ниже, чем тот, который предусмотрен на коробке зонда, если калибровка проводилась в жидкой среде с показателем преломления n (n = 1,33 для воды). Если калибровка проводилась на воздухе, то новый и старый калибровочные коэффициенты должны быть примерно равны.
Проверьте, правильно ли откалиброван круг демодуляции, как показано ниже. Перейдите на вкладку Демодуляция на рабочем столе интерферометра. Осторожно нажмите на оптический стол или на наноиндентатор, чтобы вызвать достаточно шума. Белый круг, состоящий из дискретных точек данных, должен приблизительно закрывать красный круг (рисунок S1D).
Если белый круг не перекрывается красным или на дисплее интерферометра появляется предупреждение, круг демодуляции нуждается в повторной калибровке. Это можно сделать двумя способами, как описано ниже.
1. Непрерывно нажимайте на корпус наноиндентера, чтобы вызвать один полный круг шума, и нажмите кнопку Calibrate на интерферометре.
2. Войдите в контакт со стеклянной подложкой и нажмите Calibrate в меню Инициализация главного окна программного обеспечения. Не сохраняйте калибровочный коэффициент. На этом этапе проверьте еще раз и убедитесь, что белый круг перекрывается с красным кругом.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Если сигнал не просто слегка смещен от круга демодуляции, а стал очень маленьким или вообще не виден, это означает, что консоль приклеена к оптическому волокну. Следуйте инструкциям по устранению этой проблемы (см. Обсуждение, устранение неполадок метода) и повторите шаги 13.1 или 13.2. Как только консоль вернется в горизонтальное положение (рисунок 3A), сигнал восстановится в круг демодуляции.
Проверьте калибровку, выполнив отступ на стеклянной подложке непосредственно после калибровки, как описано ниже.
1. Загрузите или создайте файл эксперимента, щелкнув Настроить эксперимент и добавьте шаг Найти Surface и шаг Отступа . Для этапа отступа используйте настройки режима смещения по умолчанию и измените максимальное смещение на калибровочное расстояние (3000 нм), чтобы сместить зонд против жесткой подложки.
2. Нажмите « Запустить эксперимент» и проверьте круг демодуляции в окне интерферометра. Проверьте белый сигнал и убедитесь, что он находится поверх красного круга во время отступа.
3. Проверьте результаты в главном окне программного обеспечения на графике данных о времени и убедитесь, что смещение пьезо (синяя линия) равно отклонению консольного аппарата (зеленая линия), поскольку отступ начинает контактировать и не ожидается деформации материала. Если сигналы не параллельны, см. Обсуждение (устранение неполадок метода).
Измените локальный путь в меню калибровки, установив для параметра Путь сохранения калибровки соответствующий каталог.
Когда зонд будет успешно откалиброван, переместите пьезо вверх на 500 мкм.

4. Измерение модуля Юнга мягких материалов

Наноиндентирование гидрогелей
1. Загрузите чашку Петри, содержащую образец (образцы), на ступень микроскопа и вручную переместите зонд наноиндентатора в желаемое положение x-y над образцом.
2. Вручную сдвиньте зонд в раствор, позаботившись о том, чтобы оставить 1-2 мм между зондом и поверхностью образца на этом этапе. Подождите 5 минут, пока зонд уравновесится в среде.
3. Сфокусируйте z-плоскость оптического микроскопа так, чтобы зонд был хорошо виден.
4. Выполните один отступ для настройки экспериментальных параметров, как описано ниже.
  1. Настройте новый эксперимент в главном окне программного обеспечения. Нажмите настроить эксперимент, после чего откроется новое окно. Добавьте шаг Найти Surface . При необходимости все параметры шага Find Surface можно изменить в меню «Параметры» программы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Find Surface будет опускать зонд до тех пор, пока поверхность не будет найдена, а затем он втягивает зонд на расстояние, определенное Z Над поверхностью (мкм), над поверхностью образца. Если выбранный консоль слишком жесткий для образца или образец липкий, после стадии зонд, вероятно, все еще будет контактировать с образцом, что приведет к кривой без исходного уровня (рисунок 4C). Чтобы решить эту проблему, увеличьте Z Над поверхностью (мкм).
  2. Добавьте шаг отступа . Выберите вкладку Профиль и нажмите « Контроль перемещения». Оставьте профиль отступа по умолчанию.
  3. Нажмите «Запустить эксперимент» в главном окне программного обеспечения. Это позволит найти поверхность и выполнить одинарный отступ. Если одиночный отступ выглядит не так, как ожидалось, настройте экспериментальные параметры, как показано на рисунке 4 и Обсуждение (устранение неполадок метода).
5. Как только отступ будет выглядеть должным образом, настройте сканирование матрицы таким образом, чтобы достаточная область образца была с отступом. Щелкните Настроить эксперимент, добавьте шаг Find Surface с ранее определенными экспериментальными параметрами и добавьте шаг Matrix Scan .
6. Для плоских гидрогелей сконфигурируйте матричное сканирование, содержащее 50-100 точек (т.е. 5 x 10 или 10 x 10 в x и y), расположенных на расстоянии 10-100 мкм (т.е. dx = dy = 10-100 мкм). Нажмите « Использовать положение рабочей области », чтобы начать сканирование матрицы с текущего положения этапа. Убедитесь, что установлен флажок Автоматический поиск поверхности , чтобы найти поверхность при каждом отступе с использованием заданных экспериментальных параметров.
  1. Чтобы избежать чрезмерной выборки, установите размер шага, по крайней мере, в два раза превышающий радиус контакта (где δ — глубина отступа).
  2. Настройте профиль матричного сканирования в системе управления перемещением. Убедитесь, что профиль не нарушает допущения модели Герца (см. Обсуждение, критические шаги в протоколе).
  3. Оставьте число сегментов равным 5, что является значением по умолчанию, и используйте профиль смещения по умолчанию. При необходимости измените профиль смещения с точки зрения максимального смещения и времени для каждого наклонного сегмента, что повлияет на максимальную глубину отступа и скорость деформации соответственно. Не превышать скорость деформации > 10 мкм/с (см. Обсуждение, ограничения метода).
  4. Введите значение скорости приближения, которое определяет, как быстро зонд смещается к образцу перед контактом. Сопоставьте скорость втягивания со скоростью захода на посадку (см. примечание ниже).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для мягких консольных аппаратов и шумных сред рекомендуется скорость захода на посадку 1000-2000 нм/с. Для более жестких консольных и контролируемых сред этот показатель может быть увеличен.
  5. Сохраните настроенный эксперимент в нужном пути эксперимента и выберите каталог, в котором будут сохранены данные, в поле Путь сохранения на вкладке Общие окна Настройка эксперимента . Нажмите Кнопка Запустить эксперимент.
7. После завершения матричного сканирования поднимите зонд на 200-500 мкм и переместите зонд в другую область образца, достаточно удаленную от первой области.
8. Повторите эксперимент по меньшей мере два раза, чтобы по каждому образцу было получено достаточно данных (т.е. не менее двух матричных сканирований на образец, содержащих по 50-100 кривых каждая).
Наноиндентация клеток
1. Загрузите образец на микроскоп, как описано выше.
2. Для одноэлементного отступа сфокусируйте z-плоскость так, чтобы и ячейки, и зонд были видны при 20-кратном или 40-кратном увеличении, в зависимости от размера ячейки и распространения.
3. Переместите зонд над ячейкой с отступом.
4. Настройте новый эксперимент в главном окне программного обеспечения. Нажмите настроить эксперимент, после чего откроется новое окно. Добавьте шаг Найти поверхность и отступ с параметрами по умолчанию в режиме смещения.
5. Нажмите «Запустить эксперимент», который найдет поверхность и выполнит один отступ. Проверьте, был ли отступ успешным. Если кривая выглядит не так, как ожидалось, отрегулируйте экспериментальные параметры (см. Рисунок 4 и Обсуждение, устранение неполадок метода).
6. Если отступ выполнен успешно, добавьте в эксперимент сканирование матрицы. Следуйте шагам, приведенным для экспериментов с наноиндентированием гидрогелей; настроить сканирование матрицы таким образом, чтобы размер шага позволял сделать отступ небольшой площади ячейки; 25 точек, расположенных на расстоянии 0,5-5 мкм для клеток HEK293T.
  1. В зависимости от размера ячейки, адаптируйте сканирование матрицы, чтобы наконечник не отступал за пределы ячейки, т. Е. Выполняя другую геометрию карты или исследуя меньшее количество точек.
7. Нажмите «Запустить эксперимент» и дождитесь его завершения.
8. Как только сканирование матрицы будет завершено, поднимите зонд вне контакта (50 мкм в плоскости z ).
9. Переместите зонд над новой ячейкой и повторите процесс (см. Обсуждение, критические шаги в протоколе).
Очистка зонда и выключение прибора
1. Выполните действия, приведенные в Дополнительном протоколе , чтобы очистить зонд и выключить устройство наноиндентирования.

5. Анализ данных

Загрузка и установка программного обеспечения
1. Выполните действия, приведенные в Дополнительном протоколе, чтобы загрузить и установить программное обеспечение для анализа данных^28,29.
Скрининг кривых F-z и получение очищенного набора данных в формате JSON
1. Запустите prepare.py из командной строки на лабораторном компьютере, как описано в шагах 2–3.
2. Если вы используете компьютер с Windows, удерживайте клавишу Shift, щелкнув правой кнопкой мыши папку NanoPrepare , и выберите команду Открыть окно PowerShell здесь. Введите команду python prepare.py и нажмите клавишу ENTER . На экране появится графический интерфейс пользователя (рисунок S2).
3. Если вы используете компьютер MacOS, щелкните правой кнопкой мыши папку NanoPrepare и выберите Новый терминал в папке. Введите команду python3 prepare.py и нажмите клавишу Enter , которая запустит графический интерфейс пользователя (рисунок S2).
4. Выберите формат данных O11NEW из раскрывающегося списка. Если данные загружены неправильно, перезапустите графический интерфейс и выберите O11OLD.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Формат O11NEW работает для данных, полученных с помощью наконечников оптических волоконно-чувствительных наноиндентационных устройств с программным обеспечением версии 3.4.1. Этот формат также будет работать для предыдущих версий программного обеспечения, по крайней мере, тех, которые принадлежат наноиндентам, установленным в 2019-2020 годах.
5. Нажмите Загрузить папку. Выберите папку, содержащую анализируемые данные — сканирование одной матрицы или сканирование нескольких матриц. Верхний график (необработанные кривые) будет заполнен загруженным набором данных. Чтобы визуализировать конкретную кривую, нажмите на нее. Это выделит его зеленым цветом и покажет на нижнем графике (Текущая кривая).
6. Очистите набор данных с помощью вкладок, присутствующих в правой части графического интерфейса пользователя, как описано ниже.
  1. Используйте кнопку Сегмент, чтобы выбрать правильный сегмент для анализа, который является прямым сегментом кривых F-z . Конкретное число зависит от количества сегментов, выбранных в программном обеспечении наноиндентирования при выполнении экспериментов.
  2. Используйте кнопку Обрезать 50 нм , чтобы обрезать кривые на 50 нм в крайнем левом углу (если отмечен галочкой L ), вправо (если отмечен галочкой R) или с обеих сторон (если отмечены галочки R и L). Нажмите эту кнопку несколько раз, чтобы обрезать столько, сколько требуется. Используйте его для удаления артефактов, присутствующих в начале/конце кривых F-z .
  3. Проверьте вкладку Cantilever на наличие постоянной пружины, геометрии наконечника и радиуса наконечника. Проверьте вкладку, чтобы убедиться, что метаданные прочитаны правильно.
  4. Вкладка Скрининг используется для установки порогового значения силы, которое отбрасывает все кривые, не достигающие заданной силы. Отброшенные кривые будут выделены красным цветом.
  5. Используйте переключатель вручную, чтобы вручную удалить неправильно полученные кривые. Удалите все кривые, нажав на конкретную кривую и выбрав OUT, который выделит кривую красным цветом.
7. Нажмите сохранить JSON. Введите соответствующее имя для очищенного набора данных, который представляет собой один JSON-файл. Отправьте JSON-файл на компьютер, на котором было установлено программное обеспечение NanoAnalysis.

6. Формальный анализ данных

Запустите файл nano.py из командной строки, перейдя в папку NanoAnalysis и запустив терминал, как объяснялось ранее. Введите команду python nano.py или python3 nano.py (в зависимости от операционной системы) и нажмите клавишу Enter . На экране появится графический интерфейс пользователя (рисунок S3).
В левом верхнем углу графического интерфейса нажмите Загрузить эксперимент и выберите файл JSON. Это заполнит список файлов и график необработанных кривых , показывающий набор данных в терминах кривых F-z . Оси F и z отображаются относительно координат CP, которые вычисляются в фоновом режиме при загрузке набора данных (см. следующее примечание). В поле Статистика установите значения трех параметров: N_{активировано}, N _failedи N_{исключено}.
ПРИМЕЧАНИЕ:_{Активированное} N представляет собой число кривых, которые будут проанализированы в последующем анализе спектров Герца/упругости и появятся черным цветом на графике raw Curves . N_failedпредставляет собой количество кривых, на которых не удалось найти надежный CP и которые отображаются синим цветом на графике. Эти кривые будут автоматически отбрасываться при последующем анализе. При открытии программного обеспечения некоторые кривые могут быть автоматически перемещены в неисправный набор. Это связано с тем, что CP рассчитывается при открытии программного обеспечения с алгоритмом Threshold по умолчанию (см. Ниже). N_{исключено} представляет кривые, которые вручную выбраны для исключения из анализа и будут отображаться красным цветом на графике (см. ниже).
Проверьте, является ли количество неисправных, исключенных и активированных кривых разумным. Проверьте график необработанных кривых , чтобы визуализировать кривые.
Чтобы визуализировать конкретную кривую более подробно, нажмите на нее. Это выделит его зеленым цветом и покажет на графике Текущей кривой . После выбора одной кривой параметры R и k (которые должны быть одинаковыми для всех кривых) будут заполнены в поле Статистика графического интерфейса.
Измените состояние заданной кривой с помощью поля Переключить . Щелкните конкретную кривую, состояние которой вы хотите изменить, а затем выберите Активировано, Не удалось или Исключено. Счетчик в поле Статистика обновляется автоматически.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить представление набора данных на графике необработанных кривых, используйте поле Вид. Нажмите «Все», чтобы отобразить все кривые (т. Е. Активированные, неудачные и исключенные в соответствующих цветах). Нажмите «Не удалось», чтобы отобразить активированные и неудачные кривые, и нажмите «Активировано», чтобы отобразить только активированные кривые. Чтобы сбросить состояние всех кривых между активированным и исключенным, нажмите «Активировано» или «Исключено» в поле «Сброс».
После дальнейшей очистки набора данных следуйте описанному ниже конвейеру анализа данных.
1. Фильтруйте любые шумы, присутствующие в кривых, используя фильтры, реализованные в графическом интерфейсе (Filtering Box), а именно пользовательский фильтр, называемый фильтром Prominency, фильтр Savitzky Golay ^30,31 (SAVGOL) и фильтр сглаживания, основанный на вычислении медианы данных в данном окне (медианный фильтр). Дополнительные сведения о фильтрах см. в разделе Обсуждение (критические шаги в протоколе).
2. Проверьте отфильтрованные кривые на графике «Текущая кривая ». Отфильтрованная кривая показана черным цветом, тогда как нефильтрованная версия кривой показана зеленым.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется фильтровать данные как можно меньше, чтобы сохранить особенности исходного сигнала. Чрезмерная фильтрация может сгладить любые различия, присутствующие в данных. Работы с активированным фильтром проминантности достаточно для герцового анализа данных наноиндентации. Если данные особенно шумные, то дополнительно могут быть применены фильтры SAVGOL или медианы.
3. Выберите алгоритм, чтобы найти CP. В поле Точка контакта выберите одну из ряда числовых процедур, реализованных в программном обеспечении, а именно: Goodness of Fit (GoF)³², Ratio of Variances (RoV)³², Second derivative³³ или Threshold³³. Подробности об алгоритмах см. в разделе Обсуждение, критические шаги в протоколе.
  ПРИМЕЧАНИЕ: CP - это точка, в которой зонд вступает в контакт с материалом, и его необходимо идентифицировать для преобразования данных F-z в данные F-δ (для мягких материалов δ конечна и должна быть рассчитана). Выбранный алгоритм будет применен ко всем активным кривым набора данных, а кривые, на которых алгоритм не сможет надежно найти CP, будут перемещены в неисправное множество.
4. Настройте параметры алгоритма в соответствии с вашим набором данных, чтобы CP был расположен правильно, как описано в Обсуждении, критических шагах в протоколе. Чтобы увидеть, где CP был найден на одной кривой, выберите кривую, нажав на нее, и нажмите «Проверить». Проверьте всплывающее окно, которое показывает, где находится CP.
5. Проверьте, имеет ли появляющаяся красная линия, которая является параметром, вычисленным алгоритмом в выбранной интересующей области, максимальное или минимальное значение, соответствующее местоположению CP (например, для GoF параметром является R²). При необходимости повторите этот процесс для всех кривых.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Оси всплывающего окна находятся в абсолютных координатах, так что местоположение CP может быть показано. И наоборот, оси графика Raw Curves и Current Curve показаны относительно CP, т.е. местоположение CP равно (0,0).
6. Нажмите на Анализ Герца. Это приведет к созданию трех графиков, описанных ниже.
  1. Проверьте отдельные кривые F-δ в наборе данных вместе со средним соответствием Герца (красная пунктирная линия). Отрегулируйте отступ в нм, до которого установлена модель Hertz, в поле Результаты в разделе Максимальное отступ (нм). Установите максимум ~10% от R , чтобы модель Герца была действительной (см. Обсуждение, критические шаги в протоколе).
  2. Проверьте среднюю кривую F-δ с полосой ошибок, показывающей одно стандартное отклонение (SD) вместе со средним соответствием Герца (красная пунктирная линия). Визуализируйте среднее соответствие Герца на графике необработанных кривых для справки и соответствие Герца для каждой кривой на текущей кривой.
  3. Проверьте диаграмму рассеяния E , полученную в результате подгонки модели Герца к каждой отдельной кривой.
7. Щелкните имя файла, кривую F-z , кривую F-δ или точку на точечной диаграмме, чтобы выделить кривую на каждом графике. Если точка данных на точечной диаграмме находится за пределами распределения данных, щелкните по ней и проверьте кривую, к которой она принадлежит. Убедитесь, что CP расположен правильно, нажав кнопку Проверить . При необходимости исключите кривую из анализа.
8. Проверьте поле Результаты для вычисляемого среднего значения E и его SD (E_γ ± σ) и убедитесь, что они разумны для данного эксперимента.
9. В поле Сохранить нажмите на Hertz. Во всплывающем окне введите имя файла и каталог. После этого нажмите «Сохранить». Будет создан файл .tsv. Откройте файл .tsv в любом дополнительном программном обеспечении и используйте значения для статистического анализа и дальнейшего построения графиков.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Файл содержит E, полученный из каждой кривой, а также среднее значение E и его SD. Кроме того, файл содержит метаданные, связанные с анализом, включая количество анализируемых кривых, R, k и максимальный отступ, используемый для модели Герца.
10. Этот шаг является необязательным. Нажмите на Average F-Ind , чтобы экспортировать среднюю силу и среднее отступ вместе с одним SD в силе.
11. Для получения данных о наноиндентации клеток нажмите « Анализ спектров упругости» (см. Репрезентативные результаты и обсуждение). Осмотрите два полученных графика, а именно: E как функцию глубины отступа (E(δ)) для каждой кривой и средний E(δ) с полосой ошибок, показывающей один SD (сплошная красная линия и затененная область), установленную моделью (черная пунктирная линия), которая позволяет оценить модуль Юнга актиновой коры клетки, модуль Юнга объемной массы клетки, и толщину актиновой коры. Кроме того, проверьте среднее значение E(δ) на верхнем графике красным цветом.
12. Убедитесь, что установлен флажок Интерполировать , что гарантирует, что производная, необходимая для выполнения анализа спектров упругости, вычисляется на интерполированном сигнале (см. Репрезентативные результаты).
13. Осмотрите поле «Результаты », сообщив о модуле Юнга коры (E₀ ± σ), модуле Юнга (E_b ± σ) и толщине коры (d₀ ± σ).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Спектры средней упругости могут сначала казаться шумными, с заметными синусоидальными колебаниями. В результате уравнение (3) может быть установлено неправильно. В этом случае итеративное увеличение длины окна сглаживающего фильтра SAVGOL³⁴ решает эту проблему.
14. Как только анализ будет завершен, нажмите на ES в поле Сохранить . Это приведет к экспорту файла .tsv в указанном каталоге, содержащего среднюю эластичность в зависимости от средней глубины отступа и радиуса контакта, метаданные, связанные с экспериментом (см. выше), и предполагаемые параметры модели, описанные выше. Наконец, также сообщается о средней эластичности, не учитывающей зависимость от δ и его SD.
15. Закройте программное обеспечение и введите сохраненные результаты в любое другое предпочтительное программное обеспечение для дальнейшего построения данных и выполнения статистического анализа.
16. Этот шаг является необязательным: экспортируйте графики из графического интерфейса, щелкнув правой кнопкой мыши на графике и выбрав Экспорт. Экспортируйте график в .svg, чтобы такие параметры, как шрифт, размер шрифта, стиль линии и т. Д. может быть отредактирован в другом программном обеспечении по выбору.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательские алгоритмы и фильтры CP могут быть запрограммированы и добавлены к уже существующим. Подробную информацию см. в Дополнительном примечании 1 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

По протоколу получается набор кривых F-z . Набор данных, скорее всего, будет содержать хорошие кривые и кривые, которые должны быть отброшены, прежде чем продолжить анализ. В общем, кривые должны быть отброшены, если их форма отличается от той, что показана на рисунке 4A. На рисунке 5AI показан набор данных из ~100 кривых, полученных на мягком гидрогеле PAAm ожидаемого E 0,8 кПа³⁵ , загруженном в графический интерфейс NanoPrepare. Большинство кривых представляют собой четкую, плоскую базовую линию, переходную область и наклонную область, пропорциональную кажущейся жесткости материала¹³. Однако меньшинство кривых показывают изменения по сравнению с формой, показанной на рисунке 4A, такие как отсутствие базовой линии, пропущенный контакт или наклонная базовая линия. Эти кривые могут быть легко удалены из набора данных с помощью NanoPrepare (рисунок 5AII, красные кривые), а чистый набор данных сохранен в стандартном формате JSON (рисунок 5AIII). Чистый набор данных загружается в NanoAnalysis (рисунок 5BIV), который был разработан таким образом, чтобы он пакетно обрабатывал все кривые. Это означает, что каждый шаг рабочего процесса применяется ко всему набору данных. После загрузки кривые могут быть отфильтрованы для удаления случайного шума с помощью одного или нескольких фильтров, описанных в обсуждении критических шагов в протоколе (рисунок 5BV). Затем CP находится с использованием одного из алгоритмов, реализованных в программном обеспечении и подробно описанных в обсуждении критических шагов в протоколе (рисунок 5BVI). После идентификации CP данные F-z преобразуются в данные F-δ . Поскольку программное обеспечение было разработано в первую очередь для анализа данных от устройств наноиндентации наконечников на основе оптического зондирования волокна, которые используют зонды, имеющие сферический наконечник, анализ Герца основан на модели Герца, аппроксимирующей контакт между сферой радиуса R и бесконечно расширенным линейным упругим однородным изотропным (LEHI) полупространством¹³:

Equation 2

где F — сила, δ — отступ, E — модуль Юнга, а ν — отношение Пуассона, принятое за 0,5 при условии несжимаемости. Таким образом, путем подгонки кривых F-δ уравнению (1) можно оценить E (см. Обсуждение критических шагов в протоколе для допущений модели Герца) (рисунок 5BVII).

В дополнение к герцовому анализу программное обеспечение может выполнять более сложный анализ, а именно спектры упругости, что особенно полезно для данных наноиндентации клеток; а также может быть использован в качестве инструмента для оценки влияния подстилающей подложки на механические свойства, полученные с помощью модели Герца. Ниже этот подход кратко излагается. Полную информацию можно найти в оригинальной публикации²⁴.

Отталкиваясь от модели Оливера-Фарра³⁶, описывающей отступ осесимметричного перфоратора произвольной геометрии и упругого полупространства, можно вывести E(δ) для конкретного случая сферического индентора. Принимая ν как 0,5, E(δ) имеет вид²⁴:

Equation 3

Вычисление E(δ) для каждой кривой F-δ с использованием уравнения (2) дает набор кривых, а именно спектры упругости (ES). Взяв среднее значение всех кривых в наборе данных, получается среднее значение ES (рисунок 5BVIII, красная сплошная линия). Средняя ES является полезным инструментом, поскольку она предоставляет информацию о том, как E изменяется в зависимости от δ в наборе данных. В конкретном случае экспериментов с наноиндентированием клеток толщина ячейки априори не известна, что означает, что выбор подходящего диапазона подгонки для анализа Герца несколько произволен. Используя среднюю ES, эффекты подложки на кажущуюся E(δ) становятся очевидными, что означает, что инструмент может быть использован для выбора подходящего диапазона подгонки, соответствующего точке, где E(δ) начинает увеличиваться после его распада. Кроме того, ранее было продемонстрировано, а также вычислительно и экспериментально подтверждено, что простая двухслойная модель эффективна при оценке толщины коры актина (d₀), модуля Юнга актиновой коры (E₀) и модуля Юнга (E_b)²⁴. Модель описывает ячейку как двухслойную, с самым внешним слоем толщины d₀и модулем E_0,и внутренним слоем бесконечной толщины с модулем упругости E_b0:

Equation 4

где R — радиус наконечника, а Λ — феноменологический параметр, который был определен как 1,74 из моделирования конечно-элементного анализа²⁴. Эта процедура реализована в программном обеспечении NanoAnalysis, которое позволяет уместить среднюю ЭС с уравнением (3) для получения оценки E₀, E_b и d₀ (рисунок 5BVIII, черная пунктирная линия). Для получения полной методологической информации обратитесь к оригинальной публикации²⁴.

Чтобы продемонстрировать жизнеспособность протокола, эластичность гидрогелей PAAm известного E (измеренного AFM)³⁵ была подготовлена и испытана с использованием процедуры, предложенной в части 1 протокола. Для каждого геля были получены две карты жесткости в двух различных областях образца с использованием коммерческого наноиндентера с наконечником, имеющим R = 52 мкм и k = 0,46 Н/м. Каждая карта состояла из 50 отступов, выполненных при контроле смещения, а размер шага в x и y был установлен на 20 мкм, чтобы избежать чрезмерной выборки. На рисунке 6A показана средняя кривая F-δ вместе со средней моделью Герца для мягкого гидрогеля PAAm (ожидаемый E 0,8 кПа) и жесткого гидрогеля PAAm ( ожидаемый E 8 кПа)³⁵. Выполняя анализ Герца с помощью программного обеспечения NanoAnalysis и отображая индивидуальные значения E, ожидаемый E был извлечен для обоих гидрогелей (рисунок 6B).

Кроме того, были проведены эксперименты по наноиндентированию на клетках HEK293T. Шесть отдельных ячеек были с отступом путем выполнения матричного сканирования с размером шага x и y , установленным на 0,5 мкм на каждой ячейке, и получением минимум 25 кривых на каждой ячейке. В результате получился проанализированный набор данных, содержащий ~200 кривых. Выбранный зонд имел R = 3,5 мкм и k = 0,02 Н/м.

На рисунке 7A показана средняя кривая Герца и соответствующая средняя модель Герца, построенная с использованием среднего значения E , полученного из уравнения подгонки (1) к каждой отдельной кривой в NanoAnalysis до отступа 200 нм. Было установлено, что E составляет 915 ± 633 Па (среднее ± SD), что соответствует значениям, указанным в литературе²⁴. Несмотря на широкое использование, модель Герца не полностью отражает эволюцию силы с увеличением глубины отступа для экспериментов с наноиндентированием клеток (рисунок 7A). Из-за этого ES является особенно подходящим инструментом для изучения механических свойств отдельных клеток.

На рисунке 7B показано среднее значение ES вместе с уравнением (3), установленным с отступом 200 нм. Средняя ES начинает увеличиваться при глубине отступа ~200 нм, что указывает на вклад подложки в исследуемый видимый E (рисунок S4). Из-за этого 200 нм был выбран в качестве диапазона подгонки как для модели Hertz (рисунок 7A), так и для двухслойной модели (рисунок 7B). Подгонка уравнения (3) к средней ЭС позволила извлечь важную информацию, которая в противном случае оставалась бы недоступной из простых экспериментов по наноиндентированию, проанализированных с использованием модели Герца. В частности, модуль E₀ актиновой коры был оценен в 5,794 ± 0,095 кПа, толщина актиновой коры d₀ была обнаружена на уровне 311 ± 3 нм, а объемный модуль E_b оказался равным 0,539 ± 0,002 кПа (среднее ± SD). Все значения соответствуют предыдущим экспериментам, проведенным с использованием AFM на той же ячейке типа²⁴, и значениям, которые были сообщены в литературе^37,38. В частности, ожидается, что актиновая кора будет между 300-400 нм для адгезивных клеток³⁷ и до 10 раз жестче, чем основная часть клетки³⁸.

Независимо от двухслойной модели, прямое сравнение результатов, полученных с помощью стандартной модели Герца и подхода ES, приведено на рисунке 7C, который показывает перекрывающиеся распределения с сопоставимыми средними значениями.

Рисунок 1: Обзор протокола. Протокол состоит из следующих частей: (А) Часть 1: Подготовка образца (гидрогелей или клеток) для экспериментов с наноиндентированием. (B) Часть 2: Выбор правильного зонда и калибровка зонда. (C) Часть 3: Проведение экспериментов с наноиндентированием путем получения карт жесткости на образце. (D) Часть 4: Анализ данных, который состоит из i) очистки полученного набора данных с помощью первого графического интерфейса (NanoPrepare) и сохранения очищенного набора данных и связанных с ним метаданных в виде стандартного JSON-файла; и ii) анализ очищенного набора данных во втором графическом интерфейсе (NanoAnalysis), который состоит из фильтрации данных, идентификации CP и подгонки модели для оценки модуля Юнга E образца. Результаты сохраняются для дальнейшего построения графиков и статистического анализа, который может быть выполнен в любом программном обеспечении по выбору. Создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пробоподготовка. (A) Этапы, предлагаемые для подготовки плоских гидрогелей PAAm для экспериментов по наноиндентированию. К ним относятся: I) выливание раствора гидрогеля на гидрофобную стеклянную горку и покрытие ее силанизированным покровным листом; II) ожидание полимеризации в течение 20 мин и отслаивание покровно-гелевого композита со стеклянной горки; и III) присоединение покровно-гелевого композита к чашке Петри и добавление соответствующего раствора (очищенной воды в контексте настоящего протокола) для экспериментов с наноиндентированием. Такое же обоснование может быть адаптировано и применено к любому другому типу гидрогеля. (B) Шаги, предложенные для подготовки клеток к экспериментам с наноиндентированием. К ним относятся: I) посев клеток и ожидание клеточной адгезии; II) сыворотка голодающих клеток для синхронизации клеточной популяции с точки зрения клеточного цикла (необязательно); и III) ожидание того, что клетки будут находиться в прилипшем состоянии при желаемом слиянии, прежде чем начинать эксперименты по наноиндентации. Создано с помощью Biorender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Обзор и выбор наноиндентационного зонда. (A) Схема наконечника-верхнего зонда (слева) и изображение наконечника-верхнего зонда со сферическим наконечником радиусом 250 мкм (справа). Все компоненты помечены на фото. (B) Увеличенная схема консольного и сферического наконечника. Консоль рассматривается как пружина Хука с упругой константой k (показана под углом для целей представления). Наконечник определяется его радиусом, R. Когда образец имеет отступ, зонд смещается на величину z из его опорного положения z₀, что приводит к изгибу консольного изгиба d от его опорного изгиба d₀. К образцу прилагается сила F = k (d - d₀), что приводит к отступу δ = (z - z₀) - (d - d₀). (C) Жесткость кантилевера k следует выбирать в соответствии с ожидаемой эластичностью подложки. График был получен с учетом контакта Герца с отступом 1 мкм, предполагая, что энергия поровну распределяется между изгибом консолью и отступом субстрата (т.е. d = δ). Чем больше радиус наконечника, тем жестче должен быть консоль, чтобы достичь того же углубления для подложки с заданным E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Морфологические характеристики кривых F-z . (A) Успешный эксперимент приводит к тому, что сегмент подхода кривой F-z имеет четкую базовую линию (наконечник приближается к образцу, но не контактирует); переходная область, в которой наконечник сначала контактирует с образцом; и область, где сила увеличивается с смещением, где наконечник постепенно отступает образец. Наклон этой области пропорционален кажущейся жесткости материала¹³, что означает, что кривые, принадлежащие жестким биоматериалам (например, сильно сшитым гелям), будут круче, чем те, которые принадлежат более мягким биоматериалам (например, слабо сшитым гелям и клеткам). (B) Кривая приближения, при которой наконечник никогда не соприкасался с образцом. См. раздел Устранение неполадок метода в обсуждении для разрешения. (C) Кривая приближения, в которой наконечник начал контактировать с образцом. См. раздел Устранение неполадок метода в обсуждении для разрешения. Показанные данные взяты из эксперимента, проведенного на мягком гидрогеле PAAm ожидаемого E 0,8 кПа³⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Рабочий процесс анализа данных с использованием графических интерфейсов Python. (A) Пример набора данных кривых F-z , полученных с использованием коммерчески доступного наноиндентера на мягком гидрогеле PAAm ( ожидаемый E 0,8 кПа³⁵), был загружен в NanoPrepare. Кривые, которые не следуют фигуре, описанной на рисунке 4A , исключаются из набора данных, а чистый набор данных и связанные с ним метаданные сохраняются в виде стандартного JSON-файла. (B) Чистый набор данных загружается во второй графический интерфейс (NanoAnalysis), где кривые могут быть отфильтрованы путем применения одного или нескольких фильтров для удаления шума (см. Обсуждение, критические шаги в протоколе). Кроме того, выбирается алгоритм CP для автоматического поиска CP для всех кривых (см. Обсуждение, критические шаги в протоколе). Затем выполняется анализ Герца, в результате чего для каждого отступа дается кривая F-δ , которая оснащена моделью Герца для получения диаграммы рассеяния E. Полученные результаты можно сохранить для дальнейшего построения графиков. Для клеток может быть выполнен дополнительный анализ, называемый спектрами упругости²⁴ . Все показанные графики были напрямую экспортированы из графических интерфейсов NanoPrepare и NanoAnalysis. Подробная информация о каждом шаге рабочего процесса приведена в основном тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Эластичность гидрогелей PAAm. (A) Средняя кривая F-δ из набора ~100 кривых, полученных на мягком гидрогеле PAAm ( ожидаемый E 0,8 кПа³⁵) и жестком гидрогеле PAAm ( ожидаемый E 8 кПа³⁵). Сплошные линии показывают среднее значение, а затененная полоса показывает один SD. Пунктирная линия показывает модель Герца, построенную с использованием среднего E из программного обеспечения NanoAnalysis, полученного путем подгонки модели Герца к каждой кривой до максимального отступа 2000 нм (~4% R, R = 52 мкм, k = 0,46 Н/м). Кривые сглаживали с помощью фильтра проминези с параметрами по умолчанию, а CP идентифицировали с помощью алгоритма^{RoV 32}. (B) Индивидуальные значения E , полученные в результате анализа, выполненного в NanoAnalysis, построенного для статистического сравнения. График дождевого облака был получен с помощью модуля Python, описанного в ссылке³⁹. p < 0,0001, двуххвостый непарный t-тест, α=0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Эластичность ячеек HEK293T. (A) Средняя кривая F-δ из набора ~200 кривых, полученных на шести отдельных ячейках HEK293T. Сплошная синяя линия показывает среднее значение, а затененная полоса показывает один SD. Пунктирная линия показывает модель Герца, построенную с использованием среднего значения E, вычисленного с помощью программного обеспечения NanoAnalysis, полученного путем подгонки модели Герца к каждой кривой до максимального отступа 200 нм (~6% R, R = 3,5 мкм, k = 0,02 Н/м). Кривые сглаживались с помощью фильтра проминезии с параметрами по умолчанию и фильтра SAVGOL³⁴ с порядком 3 и длиной окна 80 нм, а CP был идентифицирован с помощью алгоритма Threshold³³. Используя модель Герца, клетка рассматривается как однородная сфера с модулем Юнга E, как схематично показано во вставке (ядро изображено в изобразительных целях). (B) Средние спектры упругости, рассчитанные на основе того же набора данных, описанного в пункте (A). Сплошная красная линия показывает среднее значение, а затененная полоса показывает один SD. Путем подгонки двухслойной модели к средним спектрам упругости вычисляются оценки E₀, E_b и d₀. Для показанного набора данных: E₀= 5,79 ± 0,09 кПа, E_b = 0,539 ± 0,002 кПа и d₀ = 311 ± 3 нм (среднее ± SD). С) Сопоставление модели Герца и подхода к спектрам упругости с точки зрения распределения Е. Для спектров упругости распределение представляет собой значения E от средних спектров упругости, независимо от глубины отступа (до максимального отступа 200 нм). Непрерывные линии, наложенные на гистограммы, являются оценками плотности ядра Гаусса нижележащих распределений. E = 915 ± 633 Па (Герц) и E = 890 ± 297 Па (спектры упругости) (среднее ± SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок S1: Процедура калибровки. (A) Успешное сканирование длины волны. Сигналы отклонения консольного аппарата и смещения пьезо во время сканирования длины волны (слева). Синусоидальная волна на экране интерферометра в конце сканирования длины волны (справа). (B) Найти поверхностную процедуру. Прогиб консольного аппарата и смещение пьезосигнала сигнализируют о том, как зонд опускается с шагом 1 мкм после контакта с жесткой подложкой. (C) Калибровка геометрических коэффициентов. Во время отступа жесткой подложки отклонение консольного аппарата следует за смещением консольного аппарата (зеленая и синяя линии соответственно). Отступ должен быть приблизительно равен нулю (красная линия). Если отклонение отстает от смещения во времени (зеленая пунктирная линия), зонд не полностью контактирует с жесткой подложкой. (D) Сигнал демодуляции. Сигнал демодуляции на экране интерферометра в конце процедуры калибровки (слева) и при постукивании по наноиндентеру (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S2: Графический интерфейс NanoPrepare. Скриншоты графического интерфейса NanoPrepare. Подробная информация о функциональности каждого виджета приведена в основном Протоколе и Обсуждении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S3: Графический интерфейс наноанализа. Скриншоты графического интерфейса NanoAnalysis. Подробная информация о функциональности каждого виджета приведена в основном Протоколе и Обсуждении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное примечание 1: Добавление пользовательских фильтров и алгоритмов CP в программное обеспечение NanoAnalysis. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный протокол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Рисунок S4: Глубинная зависимость средних спектров упругости. На графике показаны средние спектры упругости (сплошная красная линия) вместе с одним SD (σ(E(δ)). После начального распада средние спектры упругости начинают увеличиваться, что в основном связано с воздействием жесткой подстилающей подложки на исследуемый видимый модуль упругости. Максимальная глубина отступа, используемая для подгонки модели Герца к кривым F-δ, а модель распада до средних спектров упругости должна быть выбрана таким образом, чтобы базовая подложка не влияла на результаты (диапазон fit). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол показывает, как надежно получать данные наноиндентации силовой спектроскопии с использованием коммерчески доступного наноиндентера с наконечником как на гидрогелях, так и на отдельных клетках. Кроме того, приведены инструкции по использованию программного обеспечения с открытым исходным кодом, запрограммированного на Python, содержащего точный рабочий процесс для анализа данных наноиндентирования.

Критические шаги в протоколе
Было определено, что следующие шаги имеют особое значение при следовании этому протоколу.

Пробоподготовка

Крайне важно, чтобы перед началом измерений образец готовился с учетом ограничений измерения. То есть образец должен прилипать к поверхности и быть максимально плоским. Это особенно важно при подготовке образцов, которые естественным образом не прилипают к поверхностям, как это делают клетки, такие как гидрогели. Во-первых, образец не должен плавать в растворе, так как это будет мешать измерениям и потенциально повредить зонд. Для этого рекомендуется химическая функционализация покровного листа, чтобы гидрогель можно было полимеризовать, приклеив к поверхности, которую впоследствии можно приклеить к чашке Петри во время погружения. Кроме того, поверхность образца должна быть как можно более плоской, чтобы обеспечить когерентное обнаружение поверхности зондом и избежать повреждения зонда при перемещении в x и y во время матричного сканирования. Раствор гидрогеля может быть полимеризован на гидрофобном стеклянном предметном стекле, что делает полученный гидрогель плоским, не прилипая к нему. Если эти соображения не будут соблюдены, будет трудно получить чистые данные F-z.

В случае клеточной подготовки лучше всего делать отступы клеток со сходной морфологией для улучшения однородности данных. В случае, если клетки растут в гетерогенной популяции, может быть введен этап голодания сыворотки до измерения, чтобы помочь синхронизации клеточного цикла и, следовательно, удалить потенциальные экспериментальные^{путаницы} ^40,41. В случае неадгезивных клеток или органоидных культур необходимо выполнить дополнительные шаги для обеспечения стабильности и адгезии биологического образца во время проведения измерений. Дополнительные шаги могут включать химическое связывание клеток с культуральными пластинами или использование тканевых клеев, которые в настоящее время широко коммерчески доступны.

Эксперименты с наноиндентированием

Важно, чтобы консоль с правильным k выбиралась в зависимости от ожидаемого образца E¹⁵. Это связано с тем, что если консоль слишком жесткая, образец будет сжат, но не произойдет значительного изгиба кантилевера. И наоборот, если консоль слишком мягкая по отношению к образцу, консоль будет чрезмерно изгибаться с минимальным отступом. Оба случая приведут к просчету Е при последующем анализе.

Для калибровки зонда зонд должен быть влажным перед установкой в калибровочную чашку, чтобы свести к минимуму поверхностное натяжение при столкновении с жидкостью калибровочной чашки. Невыполнение этого требования может привести к улавливанию пузырьков воздуха или прижать консоль к оптическому волокну. Это также может привести к повреждению зонда.

Для калибровки рекомендуется использовать толстую стеклянную чашку Петри. Стекло бесконечно жесткое по сравнению с консольным, что позволяет точно калибровать k консольного стекла при отступе стекла. Кроме того, вес стекла обеспечивает стабильную подложку, которая более устойчива к шуму (например, воздушному потоку и акустическим колебаниям) по сравнению с более легкой пластиковой чашкой Петри. Калибровка выполняет процедуру линеаризации интерферометрического сигнала, измеренного на детекторе (V/t), что означает, что сигнал будет преобразован в линейный консольный изгиб (мкм/т) с использованием единичного круга (круга демодуляции) в качестве инструмента^{линеаризации 18}. Чувствительность отклонения (мкм/В) устанавливается по умолчанию в интерферометре и используется для преобразования V в мкм. Во время этой процедуры также определяется калибровочный коэффициент, который возникает из-за несоответствия положения между сферическим наконечником и положением волокна, где происходит считывание сигнала (рисунок 3A). При отступе на жестком подложке, похожем на стекло, отклонение, измеренное волокном, примерно равно расстоянию, смещенному пьезо, что означает, что глубина отступа составляет примерно ноль. Принимая их соотношение, получается калибровочный коэффициент. Важно, чтобы калибровка прибора была выполнена правильно, и чтобы все проверки были выполнены, прежде чем продолжать получать данные F-z .

При настройке профиля отступов полезно иметь в виду допущения модели Герца, которые будут использоваться позже для анализа данных. Модель Герца получена при условии, что образец представляет собой бесконечно расширенное полупространство LEHI, что приводит к следующим практическим последствиям: i) применяемые деформации не должны превышать 20% (как правило, δ не должны превышать 10% от R наконечника) и ii) δ должны быть менее 10% толщины образца и малы по сравнению с размерами другого образца¹³.

Максимальное смещение (или глубина/сила отступа в зависимости от режима работы) может быть отрегулировано в зависимости от результирующей δ и от того, желательны ли поверхностные или объемные механические свойства. Если выборка была отрезана до несколько большего δ, модель Герца все еще может быть установлена до максимального δ, которое лежит в пределах ее предположений в программном обеспечении NanoAnalysis, и среднего ES, используемого для оценки этого диапазона (см. Репрезентативные результаты).

Для экспериментов с наноиндентацией клеток сложно выполнить несколько матричных сканирований на одной и той же клетке. Однако, если клетка достаточно велика, может быть возможно найти другую подходящую область и повторить процедуру на той же клетке, например, эксперимент, в котором пользователь хочет обнаружить различия в механических свойствах определенной области клетки по сравнению с другой. Обычно выполняется карта на клетку, и минимум пять клеток вдавливаются в каждое биологическое состояние. Желательно повторить эксперимент не менее трех раз, чтобы по каждому образцу было получено достаточно данных (т.е. три реплики для каждого биологического состояния).

Критически важно, что полученные кривые должны представлять собой плоскую базовую линию, переходную область и наклонную область. Кривые, которые не представляют собой базовую линию, не могут быть впоследствии проанализированы из-за неопределенности в отношении местоположения CP. Если кривые отклоняются от формы, показанной на рисунке 4A, порог контакта должен быть оптимизирован перед продолжением эксперимента (см. устранение неполадок метода ниже).

Необходимо получить достаточные данные для обеспечения статистически достоверных результатов, учитывая характер метода, который исследует механические свойства локально.

Анализ данных

Программное обеспечение, описанное в этом протоколе, обычно используется для анализа данных наноиндентации и используется для получения результатов, опубликованных в нескольких рецензируемых журналах (например, наноиндентирование гидрогелей ^8,21, наноиндентирование клеток^24,42). Анализ наноиндентационных данных нетривиален. Особое внимание предлагается уделить следующим частям:

Скрининг набора данных: набор данных должен быть тщательно проверен в программном обеспечении NanoPrepare, и все неудачные кривые должны быть удалены перед сохранением очищенного набора данных в виде файла JSON. Кривые по-прежнему могут быть исключены из анализа в программном обеспечении NanoAnalysis, но файл JSON не может быть изменен. Таким образом, для обеспечения согласованности между очищенным и проанализированным набором данных рекомендуется тщательно выполнять процесс скрининга в программном обеспечении NanoPrepare.

Фильтрация данных: использование фильтров полезно, когда данные зашумлены, и рекомендуется при выполнении анализа ES. Используются три основных фильтра, как описано ниже.

Выдаемость: Этот фильтр удаляет заметные пики в пространстве Фурье, чтобы устранить инструментальные колебания, типичные для коммерчески доступных наноиндентаторов с наконечниками. Фильтр основан на трех параметрах: Prominency (a.u.): пиковая проминантность в пространстве Фурье; Минимальная частота (каналы): минимальная частота, подлежащая фильтрации; Полоса (% от пиковой позиции): ширина вокруг отфильтрованной частоты в процентах от пиковой позиции. Активируйте этот фильтр для данных, поступающих из коммерчески доступных наноиндентаторов с наконечниками, нажав на флажок и оставив параметры по умолчанию.

Savitzky Golay (SAVGOL), алгоритм из библиотеки SciPy³⁴ (scipy.signal.savgol_filter): Этот фильтр сглаживает данные на основе локального полиномиального приближения наименьших квадратов. Активируйте этот фильтр, если данные особенно шумные. Измените порядок многочлена и длину окна фильтра в графическом интерфейсе в зависимости от того, насколько шумны данные. Для получения более подробной информации см. ссылки^30,31. Активируйте этот фильтр для анализа ES.

Медианный фильтр, алгоритм из библиотеки SciPy³⁴ (scipy.signal.medfilt): Этот фильтр сглаживает данные на основе замены каждой точки медианой, рассчитанной вокруг этой точки в данном окне. Измените длину окна в графическом интерфейсе в зависимости от того, насколько шумными являются данные. Этот фильтр используется в качестве альтернативы фильтру SAVGOL.

Активация фильтра проминантности помогает удалить инструментальный шум (низкочастотные колебания), типичный для коммерческих наноиндеттеров с наконечниками. В общем, активация других фильтров, таких как SAVGOL³⁴ , при выполнении простого анализа Герца не требуется. При вычислении ЭС рекомендуется активировать как фильтр проминантности, так и фильтр³⁴ SAVGOL, с окном сглаживания в зависимости от уровня шума, присутствующего в данных. Это связано с тем, что ES содержит производный член (уравнение 2), который очень чувствителен к шуму. Например, результаты на фиг.7 были получены с использованием фильтра проминенности вместе с фильтром SAVGOL³⁴ с окном 80 нм и полиномиальным порядком 3. Однако важно не слишком сглаживать данные, поскольку это может скрыть любые различия, присутствующие между наборами данных.

Идентификация CP: Наиболее важной частью анализа является идентификация CP, которая сильно влияет как на абсолютное значение E, так и на его распределение^32,33. Четыре алгоритма, основанные на автоматических процедурах поиска, которые находят CP для устранения человеческой предвзятости, были реализованы в программном обеспечении NanoAnalysis. Все алгоритмы были задокументированы в литературе ^32,33. Как правило, каждая точка в интересующей области тестируется как пробный CP, в то время как вычисляется параметр, специфичный для алгоритма. Точка, возвращающая оптимизированный параметр, который может быть его максимальным или минимальным значением в зависимости от алгоритма, принимается за CP³². Эти процедуры были реализованы для устранения предвзятости человека и использования статистического подхода к этой проблеме. Поскольку каждый алгоритм вычисляет CP на основе оптимизации заданного параметра, идентифицированный CP будет немного отличаться для каждого алгоритма. Таким образом, крайне важно поддерживать один и тот же алгоритм CP и конкретные параметры (например, длину окна для алгоритма RoV) между наборами данных, которые нужно сравнить, поскольку относительные различия в E будут сохранены. Различные алгоритмы CP и их параметры кратко изложены ниже.

Goodness of Fit (GoF): Подход, основанный на установке модели механики контакта (Hertz) из каждой пары (z, F) в интересующей области и выборе подгонки, имеющей наибольшее значение ^R2. Он хорошо работает там, где очевиден переход между бесконтактным и контактным, что происходит с жесткими материалами, такими как сильно сшитые гидрогели. Алгоритм вычислительно дорогой и, как правило, самый медленный. Здесь он был реализован таким образом, что модель Герца устанавливается только до максимального δ около 10% R, поскольку было показано, что это дает более точные результаты³².

Ratio of Variances (RoV): Подход, основанный на вычислении соотношения дисперсии сигнала отклонения (силы) в бесконтактной и контактной области³².

Вторая производная: подход, основанный на второй производной сигнала отклонения (силы)³³. Он хорошо работает, когда сигнал чистый. Если сигнал слишком шумный, такой подход не рекомендуется.

Порог: Подход, основанный на среднем отклонении (силе) в бесконтактной области³³. Короче говоря, начиная со значения силы, выбранного пользователем рядом с областью контакта, алгоритм повторяет каждую точку к базовой линии, пока не найдет первую точку, значение силы которой больше среднего значения базовой линии. Эта точка выбирается как CP. Этот алгоритм очень надежен и является рекомендуемым для использования.

Подробная информация о том, как использовать каждый алгоритм, приведена ниже. Алгоритмы CP включают числовые константы, которые необходимо изменить в графическом интерфейсе в соответствии с конкретным набором данных. В частности, следующие параметры являются общими для метода GoF, RoV и Второй производной, что позволяет выбрать подобласть кривых (область интереса или ROI), где будет осуществляться поиск CP:

Безопасный порог (nN): он определяет максимальную силу в nN (и соответствующую z-точку ), из которой будет осуществляться поиск CP. Это правая граница ROI, значение которой по умолчанию равно 10 нН. Все кривые, максимальная сила которых ниже этого порога, будут автоматически перемещены в неисправный набор. Измените это значение на значение силы, немного превышающее переход от бесконтактного к контактному.

Диапазон X (нм): определяет диапазон в нм от точки z , соответствующей безопасному порогу. Это левая граница ROI. Значение по умолчанию 1000 нм является хорошей отправной точкой, но если CP обнаружен слишком поздно на кривой (т. е. в наклонной области), увеличьте это значение. И наоборот, если CP обнаружен слишком рано (т.е. в базовом уровне), уменьшите это значение.

Параметры, специфичные для каждого алгоритма, обобщены здесь. Для GoF Window Fit (nm) представляет собой окно в нм от пробного CP, до которого установлена модель Hertz. Этот показатель ограничен значением 10% от R. Для RoV Window RoV (nm) представляет собой окно в нм слева и справа от пробного CP, над которым вычисляется дисперсия сигнала отклонения (силы). Для второй производной Window P (nm) представляет собой окно, переданное фильтру³⁴ SAVGOL, используемому для вычисления второй производной сигнала отклонения (силы). Значения по умолчанию были установлены при тестировании различных алгоритмов, и, как правило, их изменять не требуется.

Для порогового алгоритма могут быть изменены следующие параметры:

Порог выравнивания (nN): сила (F_0), из которой будет искать CP, начиная с этой точки и двигаясь к базовому уровню. Все кривые, максимальная сила которых ниже этого порога, будут автоматически перемещены в неудачный набор. Его значение по умолчанию — 10 нН; однако измените это значение на значение силы, немного превышающее переход от бесконтактного к контактному. Соответствующая точка z (z₀) сохраняется для последующего использования в алгоритме (см. ниже).

Выровнять левый шаг (нм): Этот параметр определяет сдвиг для добавления влево z₀(значение по умолчанию 2,000 нм), что приводит к вычислению точки, определенной (z₀ - выравнивание по левому шагу). Эта точка является точкой, вокруг которой будет вычисляться среднее значение базового уровня (см. ниже).

Средняя площадь (нм): Этот параметр определяет среднюю область слева и справа от (z₀ - выровнять левый шаг), над которой будет вычисляться среднее значение базовой линии. Его значение по умолчанию равно 100 нм, и его изменять не требуется.

Итерируя вниз от F₀, CP принимается за первую точку, значение которой выше силы, определенной средним значением базовой линии.

Примечание о ЭС и шуме: средняя ЭС может сначала казаться шумной с заметными синусоидальными колебаниями, и в результате уравнение (3) может не подходить правильно. Если это так, то увеличение окна сглаживающего фильтра SAVGOL³⁴ обычно решает эту проблему.

Модификации и устранение неполадок метода

Устранение неполадок метода

Устранение неполадок сканирования по длине волны
Если после выполнения сканирования длины волны на дисплее интерферометра появляется сообщение об ошибке, причиной могут быть следующие проблемы: i) Окружающая среда может быть загрязнена шумом. Избавиться от любых источников шума, включая воздушный поток, громкие звуки и механические вибрации; ii) Зонд может быть неправильно подключен. Отключите и снова подключите зеленый оптоволоконный разъем; iii) Консоль может быть грязной. Очистите его, погрузив зонд в чашку Петри, содержащую изопропанол, на несколько минут, а затем воду; iv) На консольном суставе может присутствовать пузырь воздуха. Погрузите зонд в чашку Петри, содержащую изопропанол, и создайте некоторый поток, пипетируя жидкость вверх и вниз; v) Консоль может быть согнута/приклеена к волокну, которое можно увидеть под микроскопом. Отпустите его, осторожно коснувшись консольной салфеткой. Будьте особенно осторожны при прикосновении к консольному устройству, так как применение чрезмерной силы может сломать его; vi) Консоль отсутствует в зонде, который можно увидеть под микроскопом. Единственным решением является использование нового зонда. Повторите попытку сканирования по длине волны, которое теперь должно быть успешным.

Поиск и устранение неисправностей при калибровке
Если калибровка не удалась и новый коэффициент либо NaN, либо не находится в ожидаемом диапазоне, причиной могут быть следующие проблемы: i) Наконечник не полностью контактирует с подложкой. Убедитесь, что наконечник находится в контакте с субстратом, выполнив шаги, указанные в Протоколе; ii) Силы притяжения между наконечником и поверхностью стекла (поведение защелкивания) приводят к калибровке чрезмерно изогнутого консольного устройства. Очистите зонд, вставив его в изопропанол в течение 5 мин, а затем воду. Очистить посуду изопропанолом; iii) Наконечник/тарелка могут быть загрязнены: очистите зонд, вставив его в изопропанол в течение 5 минут, а затем воду. Очистить посуду изопропанолом; iv) Консоль может быть согнута/приклеена к волокну. Отпустите его, осторожно прикоснувшись к нему салфеткой. Повторите сканирование по длине волны и калибровку после устранения неполадок.

Устранение неполадок с контактами
Если кривые отклоняются от формы, показанной на рисунке 4A, экспериментальные параметры необходимо скорректировать перед продолжением эксперимента. Две из наиболее распространенных проблем:

Кривая приближения, где наконечник никогда не вступает в контакт с образцом (рисунок 4B). Это происходит, когда порог контакта установлен на слишком низкое значение, а шум заставляет консоль изгибаться на величину, соответствующую заданному порогу. Чтобы решить эту проблему, перейдите в меню Options и медленно увеличьте пороговое значение на шагах 0,01 и выполните отступ, пока кривая не будет похожа на кривую, показанную на рисунке 4A. Снижение скорости в том же меню также может помочь решить эту проблему.

Кривая приближения, где наконечник начал контактировать с образцом (рисунок 4C). Это происходит, когда порог контакта установлен на слишком высокое значение, и консоль не изгибается на величину, соответствующую заданному порогу при первом прикосновении к образцу. Чтобы решить эту проблему, медленно уменьшите пороговое значение в меню Options на шагах 0,01 и выполните отступ, пока кривая не будет похожа на кривую, показанную на рисунке 4A. Этот вопрос особенно проблематичен, поскольку отсутствие базового уровня препятствует правильному вычислению CP, что в конечном итоге приводит к просчету E.

Модификации метода
Протокол может быть расширен для количественной оценки Е различных типов гидрогелей. Гидрогели PAAm были выбраны для этого протокола, поскольку они являются наиболее распространенными гидрогелями, используемыми в области механобиологии. Однако протокол в равной степени применим к любому типу упругого гидрогеля²⁵, как синтетического, например, полиэтиленгликоля (ПЭГ)⁴³, так и желатина метакрилоила (^GelMA)44,45; и натуральные, такие как коллаген⁴⁶. Кроме того, нет никаких ограничений на размеры образца для испытания в разумных пределах. Например, этот протокол использовался для количественной оценки E синтетических гидрогелей ПЭГ, которые впоследствии были испытаны с использованием объемного реометра и должны были быть ~15 мм в диаметре и ~2 мм в толщине⁸. Протокол также был реализован для характеристики E мембран PDMS, которые были полимеризованы в чашке Петри (результаты не опубликованы).

Помимо стандартного углубления одиночных клеток, выполняемого с использованием обычного перевернутого фазово-контрастного микроскопа, наноиндеттеры с наконечниками совместимы со сложными системами визуализации и используются для зондирования субклеточных структур локальной эластичности, таких как ядро клетки и цитоплазма⁴⁷. В то время как шаги должны быть скорректированы в зависимости от конкретной оптической системы, этот протокол имеет общую применимость в отношении проведения экспериментов по наноиндентированию и анализа полученных данных.

Кроме того, протокол не ограничивается измерением механических свойств клеток и гидрогелей и может быть адаптирован для измерения локальных эластических свойств более сложных систем, включая органоиды⁴⁸, сфероиды⁴⁹ и целые ткани, такие как почки, печень, селезенка и матка²³. Читатель направляется к ссылкам 23,48,49 для уточнений по проведению экспериментов по наноиндентированию на таких образцах. Один из аспектов, который следует учитывать, заключается в том, что управление перемещением работает в режиме разомкнутого контура и не получает обратной связи от образца. Таким образом, постоянное напряжение/деформация и скорость не обеспечиваются, и более мягкие части образца будут вдавливаться больше и быстрее по сравнению с более жесткими областями. Это относится к механически гетерогенным образцам, таким как ткани, где более целесообразно выбрать либо контроль отступа (режим I), либо контроль нагрузки (режим P), обеспечивая постоянное напряжение/деформацию и скорость в механически гетерогенных областях образца.

Ограничения метода
Появляется все больше доказательств того, что вязкоупругость, помимо эластичности, играет важную роль в регулировании физиологически и патологически значимых процессов. Это связано с тем, что клетки, ECM и ткани являются вязкоупругими, а эластичность представляет собой только один компонент их механического поведения 50,51,52,53. В то время как наноиндеттеры с наконечниками обеспечивают функциональность для характеристики вязкоупругости, включая расслабление напряжения, соответствие ползучести и динамический механический анализ для извлечения как модуля хранения, так и модуля потерь в различных частотных (временных) режимах, этот протокол фокусируется только на упругости, которая остается наиболее изученной механической переменной в контексте механобиологии и тканевой инженерии (например, см. ссылку³).

Основное предположение, имеющее последствия как для экспериментов, так и для анализа данных, заключается в том, что отступ субстрата ведет себя как твердое тело LEHI. Это означает, что реакция напряжения-деформации является линейной, нет зависимости от времени поведения, а образец механически однородный и изотропный. Основываясь на этих предположениях, механические свойства подложки количественно оцениваются через модуль Юнга в соответствии с конкретной моделью контактной механики, в данном случае моделью Герца (уравнение 1). Для малых квазистатических сил/деформаций химически сшитые гидрогели, такие как гели PAAm, используемые в настоящем протоколе³⁵ , ведут себя почти так же, как упругие твердые вещества, а вязкоупругие эффекты минимальны и незначительны⁵³. С другой стороны, клетки не являются твердыми телами LEHI и демонстрируют сложное механическое поведение⁹. Модуль юнга клеток сильно зависит от скорости деформации (т.е. скорости) процедуры отступа, однако четкой тенденции не установлено, и дополнительные переменные, такие как размер наконечника и максимальная глубина отступа, влияют на эту связь⁹. Тем не менее, для квазистатических деформаций, таких как те, которые используются в этом протоколе (v = 5 мкм/с), клетки показывают выраженный упругий отклик, а диссипативные эффекты минимальны⁹. Зависимость скорости деформации может быть зафиксирована более сложными моделями с учетом зависящих от времени переменных, к которым относится считыватель⁵⁴.

Кроме того, следуя тому же базовому предположению, отношение Пуассона (ν) принимается за 0,5 как в анализе Герца, так и в анализе ES. При сравнении образцов это влияет только на результаты в качестве коэффициента; однако было показано, что ν является частотно-зависимой величиной для клеток⁵⁵ и отклоняется от 0,5 для гидрогелей⁵⁶.

Еще одно ограничение протокола заключается в том, что программное обеспечение не обеспечивает количественную оценку E с помощью более сложных моделей контактной механики. Модель Герца является наиболее используемой моделью контактной механики в экспериментах AFM и чрезвычайно эффективна^13,15; однако он не учитывает более сложные события, такие как силы притяжения на короткой или большой дистанции между наконечником и образцом. Более сложные модели, такие как модель Джонсона-Кендалла-Робертса, могут захватывать эти модели поведения¹³, но не реализованы в программном обеспечении. Для обзора различных моделей контактной механики различной сложности читатель направляется к ссылке¹³.

Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам
Наиболее распространенным подходом к количественной оценке локальных упругих свойств биоматериалов и одиночных клеток на микроуровне является AFM 13,14,15,16. Несмотря на то, что AFM является мощным и универсальным инструментом, он требует обширного обучения из-за его сложной настройки, прежде чем пользователи смогут надежно выполнять эксперименты. Наноиндеттеры с наконечниками предлагают готовое решение, в то же время позволяя применять силы nN с разрешением μm для исследования локальных механических свойств биоматериалов (например, ссылки 8,19,20,21). В то время как существуют стандартизированные протоколы для использования AFM в контексте механобиологии¹⁶ и тканевой инженерии¹⁴, не существует протоколов, подробно описывающих работу наноиндентерных устройств с наконечниками. Этот протокол позволяет неопытному пользователю проводить эксперименты по наноиндентированию как на гидрогелях, так и на клетках, следуя рекомендациям, которые предназначены для стандартизации экспериментального рабочего процесса в сообществе. Кроме того, анализ данных экспериментов с наноиндентированием является нетривиальным и останется в значительной степени недоступным для пользователей, не имеющих опыта программирования. Приведены инструкции по использованию интуитивно понятного программного обеспечения, позволяющего очистить и сохранить полученный набор данных в легком и стандартном формате и выполнить как стандартный герц-анализ, так и анализ ES²⁴ несколькими щелчками мыши и воспроизводимым способом.

Следуя этому протоколу, получаются результаты, сопоставимые с результатами, полученными с использованием АСМ, как для Е гидрогелей (результаты на фиг.6 по сравнению с теми, что указаны в ссылке³⁵), так и для механических свойств ячеек (результаты на Фиг.7 по сравнению с указанными в ссылке²⁴) при доле сложности. Способ имеет общую применимость и может быть адаптирован к различным типам наноимдентов при условии, что некоторые этапы модифицируются на основе конкретного устройства.

Важность и потенциал применения метода в конкретных областях исследований
Характеристика эластических свойств клеток, гидрогелей и тканей является стандартной практикой во многих исследовательских лабораториях, специализирующихся на механобиологии, тканевой инженерии / регенеративной медицине и за ее пределами³. Этот протокол может быть использован для количественной оценки эластических свойств одиночных клеток, гидрогелей и адаптирован для тканей и более сложных биоматериалов в контексте физиологически значимых процессов, отмеченных изменением механических свойств. Например, чтобы имитировать динамику нативного ECM, было показано, что разлагаемые 3D PEG-ламининовые гидрогели позволяют клеткам ремоделировать окружающую среду, что приводит к снижению Е гелей ~ 50% в течение 9 дней по сравнению с теми же гелями без клеток²¹. Протокол имеет общую применимость и не ограничивается образцами и оптической установкой, описанными в настоящем документе. Предполагается, что этот протокол облегчит использование наноиндентаторов в исследовательских лабораториях, специализирующихся на изучении механических свойств в физиологии и болезнях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

GC и MAGO признают всех членов CeMi. MSS признает поддержку через грант программы EPSRC (EP/P001114/1).

GC: программное обеспечение (вклад в разработку программного обеспечения и алгоритмов), формальный анализ (анализ данных наноиндентации), валидация, исследование (эксперименты по наноиндентации на полиакриламидных гелях), курирование данных, написание (оригинальный проект, обзор и редактирование), визуализация (рисунки и графики). MAGO: исследование (подготовка гелей и образцов клеток, эксперименты по наноиндентации на клетках), написание (оригинальный черновик, обзор и редактирование), визуализация (рисунки и графики). NA: валидация, написание (рецензирование и редактирование). IL: программное обеспечение (вклад в разработку программного обеспечения и алгоритмов), валидация, написание (рецензирование и редактирование); MV: концептуализация, программное обеспечение (проектирование и разработка оригинального программного обеспечения и алгоритмов), валидация, ресурсы, написание (оригинальный проект, рецензирование и редактирование), надзор, администрирование проекта, приобретение финансирования MSS: ресурсы, написание (обзор и редактирование), надзор, администрирование проекта, приобретение финансирования. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm coverslips	VWR	631-1577P
35 mm cell treated culture dishes	Greiner CELLSTAR	627160
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Acrylsilane	Alfa Aesar	L16400
Ammonium Persulfate	Merk	7727-54-0
Bisacrylamide	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optics 11 Life		no catologue number
Ethanol			general
Fetal bovine serum	Gibco	16140071
High glucose DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			general
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Microscope glass slides	VWR	631-1550P
MilliQ system	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer	Optics11 Life		no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
RainX rain repellent	RainX	26012
Standard petri dishes (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	110-18-9
Vaccum dessicator	Thermo Scientific	531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional)	Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature. Reviews. Materials. 5, 351-370 (2020).
Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: Principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary. Reviews. Systems. Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: Forcing tumour progression. Nature Reviews Cancer. 9 (2), 108-122 (2009).
Kubánková, M., et al. Physical phenotype of blood cells is altered in COVID-19. Biophysical Journal. 120 (14), 2838-2847 (2021).
Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
Ciccone, G., et al. What caging force cells feel in 3D hydrogels: A rheological perspective. Advanced Healthcare Materials. 9 (17), 2000517 (2020).
Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering B Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
Humphrey, J. D., Delange, S. L. An Introduction to Biomechanics Solids and Fluids, Analysis and Design. , Springer-Verlag. New York. 271-371 (2004).
Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1, 41-57 (2019).
Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
Whitehead, A. J., Kirkland, N. J., Engler, A. J. Atomic force microscopy for live-cell and hydrogel measurement. Methods in Molecular Biology. 2299, Clifton, N.J. 217-226 (2021).
Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: An optomechanical fiber sensor for nanoindentation. The Review of Scientific Instruments. 83 (11), 115110 (2012).
Van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink Ac, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12 (12), 3066-3073 (2016).
Baldini, F., et al. Biomechanics of cultured hepatic cells during different steatogenic hits. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 97, 296-305 (2019).
Emig, R., et al. Piezo1 channels contribute to the regulation of human atrial fibroblast mechanical properties and matrix stiffness sensing. Cells. 10 (3), 663 (2021).
Dobre, O., et al. A hydrogel platform that incorporates laminin isoforms for efficient presentation of growth factors - Neural growth and osteogenesis. Advanced Functional Materials. 31 (21), 2010225 (2021).
Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Scientific Reports. 8 (1), 12517 (2018).
Wu, G., Gotthardt, M., Gollasch, M. Assessment of nanoindentation in stiffness measurement of soft biomaterials: kidney, liver, spleen and uterus. Scientific Reports. 10 (1), 18784 (2020).
Lüchtefeld, I., et al. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 147 (2020).
Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
Blumlein, A., Williams, N., McManus, J. J. The mechanical properties of individual cell spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 7346 (2017).
Mirsandi, H., et al. Influence of wetting conditions on bubble formation from a submerged orifice. Experiments in Fluids. 61, 83 (2020).
Vassalli, M., Ciccone, G. CellMechLab/NanoPrepare: v0.1.1. Zendo. , (2021).
Vassalli, M., Ciccone, G., Lüchtefeld, I. CellMechLab/nanoindentation: v1.0.0. Zendo. , (2021).
Savitzky, A., Golay, M. J. E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry. 36 (8), 1627-1639 (1964).
Schafer, R. W. What is a savitzky-golay filter. IEEE Signal Processing Magazine. 28 (4), 111-117 (2011).
Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis-I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
Virtanen, P., et al. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. Nature Methods. 17 (3), 261-272 (2020).
Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 (2010).
Pharr, G. M., Oliver, W. C., Brotzen, F. R. On the generality of the relationship among contact stiffness, contact area, and elastic modulus during indentation. Journal of Materials Research. 7 (3), 613-617 (1992).
Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
Kunda, P., Pelling, A. E., Liu, T., Baum, B. Moesin controls cortical rigidity, cell rounding, and spindle morphogenesis during mitosis. Current Biology: CB. 18 (2), 91-101 (2008).
Allen, M., Poggiali, D., Whitaker, K., Marshall, T. R., Kievit, R. A. Raincloud plots: a multi-platform tool for robust data visualization. Wellcome Open Research. 4, 63 (2019).
Clark, A. G., Paluch, E. Mechanics and regulation of cell shape during the cell cycle. Results and Problems in Cell Differentiation. 53, 31-73 (2011).
Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 1524, Clifton, N.J. 97-105 (2017).
Hodgkinson, T., et al. The use of nanovibration to discover specific and potent bioactive metabolites that stimulate osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells. Science Advances. 7 (9), 7921 (2021).
Kloxin, A. M., Kloxin, C. J., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 22 (31), 3484-3494 (2010).
Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
Sarrigiannidis, S. O., et al. A tough act to follow: collagen hydrogel modifications to improve mechanical and growth factor loading capabilities. Materials Today. Bio. 10, 100098 (2021).
Karoutas, A., et al. The NSL complex maintains nuclear architecture stability via lamin A/C acetylation. Nature Cell Biology. 21 (10), 1248-1260 (2019).
Ryu, H., et al. Transparent, compliant 3D mesostructures for precise evaluation of mechanical characteristics of organoids. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 33 (25), 2100026 (2021).
Carvalho, D. T. O., Feijão, T., Neves, M. I., Da Silva, R. M. P., Barrias, C. C. Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs Biofabrication Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs. Biofabrication. 13 (3), 035008 (2021).
Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
Cantini, M., Donnelly, H., Dalby, M. J., Salmeron-Sanchez, M. The plot thickens: The emerging role of matrix viscosity in cell mechanotransduction. Advanced Healthcare Materials. 9 (8), 1901259 (2020).
Elosegui-Artola, A. The extracellular matrix viscoelasticity as a regulator of cell and tissue dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 72, 10-18 (2021).
Chaudhuri, O. Viscoelastic hydrogels for 3D cell culture. Biomaterials Science. 5 (8), 1480-1490 (2017).
Nguyen, T. D., Gu, Y. Determination of strain-rate-dependent mechanical behavior of living and fixed osteocytes and chondrocytes using atomic force microscopy and inverse finite element analysis. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (10), 101004 (2014).
Mokbel, M., Hosseini, K., Aland, S., Fischer-Friedrich, E. The Poisson Ratio of the Cellular Actin Cortex Is Frequency Dependent. Biophysical Journal. 118 (8), 1968-1976 (2020).
Javanmardi, Y., Colin-York, H., Szita, N., Fritzsche, M., Moeendarbary, E. Quantifying cell-generated forces: Poisson's ratio matters. Communications Physics. 4, 237 (2021).

Bioengineering

Экспериментальный рабочий процесс и анализ данных для наноиндентации мягкого вещества

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.