Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Eksperimentell og dataanalyse Arbeidsflyt for Soft Matter Nanoindentation

Published: January 18, 2022 doi: 10.3791/63401
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 1
1Centre for the Cellular Microenvironment, James Watt School of Engineering, University of Glasgow, 2Optics 11 life, 3Laboratory of Biosensors and Bioelectronics, ETH Zürich

Summary

Protokollen presenterer en komplett arbeidsflyt for nanoindentasjonseksperimenter med mykt materiale, inkludert hydrogeler og celler. For det første er de eksperimentelle trinnene for å skaffe kraftspektroskopidata detaljert; deretter er analysen av slike data detaljert gjennom en nyutviklet åpen kildekode Python-programvare, som er gratis å laste ned fra GitHub.

Abstract

Nanoindentation refererer til en klasse av eksperimentelle teknikker der en mikrometrisk kraftsonde brukes til å kvantifisere de lokale mekaniske egenskapene til myke biomaterialer og celler. Denne tilnærmingen har fått en sentral rolle innen mekanobiologi, biomaterialdesign og vevsteknikk, for å oppnå en riktig mekanisk karakterisering av myke materialer med en oppløsning som kan sammenlignes med størrelsen på enkeltceller (μm). Den mest populære strategien for å skaffe slike eksperimentelle data er å bruke et atomkraftmikroskop (AFM); Mens dette instrumentet tilbyr en enestående oppløsning i kraft (ned til pN) og rom (sub-nm), er brukervennligheten ofte begrenset av dens kompleksitet som forhindrer rutinemessige målinger av integrerte indikatorer på mekaniske egenskaper, for eksempel Youngs modul (E). En ny generasjon nanoindenters, som de som er basert på optisk fibersensorteknologi, har nylig blitt populær for sin enkle integrasjon, samtidig som den tillater å anvende sub-nN-krefter med μm romlig oppløsning, og er derfor egnet til å undersøke lokale mekaniske egenskaper til hydrogeler og celler.

I denne protokollen presenteres en trinnvis veiledning som beskriver den eksperimentelle prosedyren for å skaffe nanoindentasjonsdata på hydrogeler og celler ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ferrule-top optisk fiberfølende nanoindenter. Mens noen trinn er spesifikke for instrumentet som brukes her, kan den foreslåtte protokollen tas som en veiledning for andre nanoindentasjonsenheter, gitt at noen trinn er tilpasset i henhold til produsentens retningslinjer. Videre presenteres en ny åpen kildekode Python-programvare utstyrt med et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt for analyse av nanoindentasjonsdata, noe som muliggjør screening av feil oppkjøpte kurver, datafiltrering, beregning av kontaktpunktet gjennom forskjellige numeriske prosedyrer, konvensjonell beregning av E, samt en mer avansert analyse spesielt egnet for enkeltcellede nanoindentasjonsdata.

Introduction

Mekanikkens grunnleggende rolle i biologi er i dag etablert 1,2. Fra hele vev til enkeltceller kan mekaniske egenskaper informere om den patofysiologiske tilstanden til biomaterialet som undersøkes 3,4. For eksempel er brystvev påvirket av kreft stivere enn sunt vev, et konsept som er grunnlaget for den populære palpasjonstesten5. Spesielt har det nylig blitt vist at koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) forårsaket av alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) understrekes av endringer i de mekaniske egenskapene til blodceller, inkludert redusert erytrocyttdeformabilitet og redusert lymfocytt- og nøytrofil stivhet sammenlignet med blodceller fra SARS-CoV-2-naive individer6.

Generelt er mekanikken til celler og vev iboende sammenflettet: hvert vev har spesifikke mekaniske egenskaper som samtidig påvirker og avhenger av de av bestanddelene celler og ekstracellulær matrise (ECM)5. På grunn av dette involverer strategier for å studere mekanikk i biologi ofte ingeniørsubstrater med fysiologisk relevante mekaniske stimuli for å belyse celleadferd som svar på disse stimuliene. For eksempel viste det banebrytende arbeidet av Engler og kolleger at mesenkymal stamcellelinageforpliktelse styres av matriseelastisitet, som studert på myke og stive todimensjonale polyakrylamid (PAAm) hydrogeler7.

Mange strategier for mekanisk karakterisering av biomaterialet som undersøkes eksisterer, varierende i romlig skala (dvs. lokal til bulk) og i deformasjonsmodus (f.eks. Aksial vs skjær), og gir følgelig forskjellig informasjon, som trenger nøye tolkning 3,8,9,10. Mekanikken til myke biomaterialer uttrykkes ofte i form av stivhet. Stivhet avhenger imidlertid av både materialegenskaper og geometri, mens elastiske moduler er grunnleggende egenskaper til et materiale og er uavhengige av materialets geometri11. Som sådan er forskjellige elastiske moduler relatert til stivheten til en gitt prøve, og hver elastisk modul omfatter materialets motstand mot en bestemt deformasjonsmodus (f.eks. Aksial vs skjær) under forskjellige grensebetingelser (f.eks. Fri ekspansjon vs innesperring) 11,12. Nanoindentasjonseksperimenter tillater kvantifisering av mekaniske egenskaper gjennom E som er forbundet med uniaxial deformasjon (innrykk) når biomaterialet ikke er lateralt begrenset10,11,12.

Den mest populære metoden for å kvantifisere E av biologiske systemer i mikroskala er AFM13,14,15,16. AFM er et ekstremt kraftig verktøy med kraftoppløsning ned til pN-nivå og romlig oppløsning ned til sub-nm-skalaen. Videre tilbyr AFM ekstrem fleksibilitet når det gjelder kobling med komplementære optiske og mekaniske verktøy, og utvider mulighetene til å trekke ut et vell av informasjon fra biomaterialet som undersøkes13. Disse attraktive funksjonene kommer imidlertid med en inngangsbarriere representert av kompleksiteten i det eksperimentelle oppsettet. AFM krever omfattende opplæring før brukerne kan skaffe seg robuste data, og bruken av den til daglig mekanisk karakterisering av biologisk materiale er ofte uberettiget, spesielt når dets unike kraft og romlige oppløsninger ikke er nødvendig.

På grunn av dette har en ny klasse nanoindenters nylig blitt populær på grunn av deres brukervennlighet, samtidig som de tilbyr AFM-sammenlignbare data med sub-nN-kraftoppløsning og μm romlig oppløsning, som reflekterer krefter som utøves og oppfattes av celler over relevante lengdeskalaer2. Spesielt har ferrule-top nanoindentation enheter basert på optisk fiber sensing teknologi17,18 fått popularitet blant forskere som er aktive innen mekanobiologi og utover; Og et vell av arbeider som rapporterer de mekaniske egenskapene til biomaterialer ved hjelp av disse enhetene, inkludert celler19,20, hydrogeler8,21 og vev22,23 er publisert. Til tross for disse systemenes evner til å undersøke lokale dynamiske mekaniske egenskaper (dvs. lagrings- og tapsmodul), er kvasi-statiske eksperimenter som gir E fortsatt det mest populære valget 8,19,20,21. Kort sagt består kvasi-statiske nanoindentasjonseksperimenter av å rykke inn prøven med en konstant hastighet opp til et settpunkt definert enten ved maksimal forskyvning, kraft eller innrykksdybde, og registrere både kraften og den vertikale posisjonen til utkrageren i såkalte kraftavstand (F-z) kurver. F-z-kurver konverteres deretter til kraftinnrykkskurver (F-δ) gjennom identifisering av kontaktpunktet (CP), og utstyrt med en passende kontaktmekanikkmodell (vanligvis Hertz modell13) for å beregne E.

Mens driften av ferrule-top nanoindenters ligner AFM-målinger, er det spesifikasjoner verdt å vurdere. I dette arbeidet er det gitt en trinnvis veiledning for robust å skaffe F-z-kurver fra celler og vevlignende hydrogeler ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ferrule-top nanoindenter for å oppmuntre til standardisering av eksperimentelle prosedyrer mellom forskningsgrupper som bruker denne og andre lignende enheter. I tillegg gis råd om hvordan man best kan forberede hydrogelprøver og celler for å utføre nanoindentasjonseksperimenter, sammen med feilsøkingstips langs eksperimentveien.

Videre avhenger mye av variasjonen i nanoindentasjonsresultater (dvs. E og dens fordeling) av den spesifikke prosedyren som brukes til å analysere data, noe som ikke er trivielt. For å løse dette problemet gis instruksjoner for bruk av en nyutviklet åpen kildekode-programvare programmert i Python og utstyrt med et brukervennlig grafisk brukergrensesnitt (GUI) for batchanalyse av F-z-kurver . Programvaren muliggjør rask datascreening, filtrering av data, beregning av CP gjennom forskjellige numeriske prosedyrer, den konvensjonelle beregningen av E, samt en mer avansert analyse kalt elastisitetsspektra24, som gjør det mulig å estimere cellens bulk Youngs modul, aktin cortex Youngs modul og aktinbarkens tykkelse. Programvaren kan fritt lastes ned fra GitHub og kan enkelt tilpasses for å analysere data som kommer fra andre systemer ved å legge til en passende dataparser. Det understrekes at denne protokollen kan brukes til andre ferrule-top nanoindentation enheter, og andre nanoindentation enheter generelt, gitt noen trinn er tilpasset i henhold til det spesifikke instrumentets retningslinjer. Protokollen er skjematisk oppsummert i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av substrater/celler for nanoindentasjonsmålinger

  1. Følg trinnene gitt i tilleggsprotokollen for fremstilling av PAAm-hydrogeler / celler for nanoindentasjonseksperimenter. Prosedyren er oppsummert i figur 2.
    MERK: PAAm-hydrogeler er valgt fordi de er de vanligste hydrogelene som brukes innen mekanobiologi. Protokollen er imidlertid like anvendelig for alle typer hydrogel25 (se Diskusjon, modifikasjoner av metoden).

2. Starte opp enheten, sondevalg og sondekalibrering

  1. Følg trinnene i tilleggsprotokollen for å starte enheten. For tekniske detaljer om driften av optiske fiber ferrule-top nanoindenters, sjekk disse referansene17,18.
  2. Velg nanoindentasjonssonden som beskrevet nedenfor.
    MERK: Alle kommersielt tilgjengelige sonder, for eksempel de som brukes i denne protokollen, er utstyrt med en sfærisk spiss (figur 3A). Valget snevres derfor inn til to variabler: utkragers stivhet og spissradius (figur 3B).
    1. Velg en utkragers stivhet (k i N/m) som samsvarer med forventet prøvestivhet for best resultat15 (se figur 3C og Diskusjon, kritiske trinn i protokollen). For celler velger du en sonde med k i området 0,01-0,09 N/m. For hydrogeler velger du en sonde med k i området 0,1-0,9 N/m, som gir optimale resultater for geler med forventet E mellom noen få kPa og 100 kPa (se Representative resultater).
    2. Velg spissradiusen (R i μm) i henhold til ønsket romlig oppløsning av innrykksprosessen. For små celler som Human Embryonic Kidney 293T (HEK293T) celler (gjennomsnittlig diameter på ~ 10-15 μm26) velg en kule med R = 3 μm. For hydrogeler velger du en kule med R = 10-250 μm for å undersøke biomaterialets mekaniske egenskaper over et stort kontaktområde og unngå lokale heterogeniteter.
    3. Se figur 3C og eventuelle ytterligere produsentens retningslinjer for å velge riktig sonde.
  3. Når sonden er valgt, følg trinnene i tilleggsprotokollen for å montere den på nanoindenteren.

3. Sondekalibrering

MERK: Følgende trinn er spesifikke for ferrule-top nanoindentation enheter basert på optisk fiber sensing teknologi, og de er detaljert for programvareversjon 3.4.1. For andre nanoindentasjonsenheter, følg trinnene som anbefales av enhetsprodusenten.

  1. I programvarens hovedvindu klikker du på Initialiser. En kalibreringsmeny vises. Skriv inn sondedetaljene (finner du på siden av sondens boks; k i N/m, R i μm og kalibreringsfaktoren i luft) i inndataboksene.
  2. Forbered kalibreringsfatet: en tykk petriskål i glass med flat bunn (se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen). Fyll fatet med samme medium som prøveretten (dette kan også være luft). Match temperaturen på mediet med prøven.
  3. Plasser kalibreringsskålen under sonden. Skyv om nødvendig sonden ut fra nanoindenterens armholder og hold den i den ene hånden for å gi plass til plassering av kalibreringsskålen. Skyv sonden tilbake på plass.
  4. Utfør de neste to trinnene for kalibrering i væske. Ved måling i luft bruker du det medfølgende polytetrafluoretylensubstratet for kalibrering og hopper til trinn 5.
    1. Prewet sonden med en dråpe 70% etanol ved hjelp av en Pasteur pipette med enden av pipetten i lett kontakt med glass ferrule, for dråpen å gli over cantilever og sfærisk spiss27 (se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen).
    2. Skyv nanoindenterens arm manuelt nedover til sonden er helt nedsenket, men fortsatt langt unna bunnen av petriskålen. Legg om nødvendig til mer medium til kalibreringsskålen. Vent 5 min slik at likevektsforholdene oppnås i væsken.
  5. I programvarens Initialize-meny klikker du på Scan Wavelength. Interferometerets skjerm vil vise en fremdriftslinje, og Live Signal-vinduet på datamaskinens programvare vil vise mønsteret vist i figur S1A, til venstre. For å sjekke om den optiske skanningen var vellykket, naviger til bølgelengdeskanningspanelet på interferometerboksen. Hvis vellykket, bør en sinusbølge være synlig (figur 1A, til høyre). Se Diskusjon (feilsøking av metoden) hvis det vises en feil.
  6. I Initialiser-menyen klikker du på Finn overflate, som gradvis senker sonden til en angitt terskel i utkragerens bøyning er nådd. Sonden slutter å bevege seg når kontakt med petriskålen i glass er laget.
  7. Kontroller om sonden er i kontakt med overflaten. Flytt sonden ned med 1 μm ved hjelp av pilknappen y nedover i programvarens hovedvindu. Observer det grønne signalet (utkragens avbøyning) i programvarens livevindu for endringer i grunnlinjen med hvert trinn, når utkrageren er i kontakt med substratet (figur S1B). Hvis det ikke er noen endring, er utkrageren ikke i kontakt (se neste trinn).
  8. Øk terskelverdien på Alternativer-menyen under kategorien Finn Surface fra standardverdien 0,01 med et trinn på 0,01 om gangen, og gjenta Finn overflate-trinnet til det er i kontakt. Alternativt kan du få ned sonden for å komme i kontakt i små 1 μm trinn til den grønne grunnlinjen begynner å skifte ved hvert trinn nedover.
    MERK: For de mykeste utkragerne (k = 0,025 Nm-1) øker du terskelverdien i Alternativer-menyen under Finn overflate-fanen a priori for å utføre trinn 6. Start fra en terskelverdi på 0,06 eller 0,07 og øk den opp til 0,1 om nødvendig. Dette er fordi miljøstøy sannsynligvis vil føre til at utkrageren bøyer seg over terskelen før kontakt. For myke sonder forbedres også prosedyren ved å redusere innflygingshastigheten (μm/s) i samme meny.
  9. I Initialiser-menyen klikker du på Kalibrer.
  10. Sjekk Live Signal-vinduet til programvaren og sørg for at både piezos forskyvning og utkragers avbøyningssignaler beveger seg opp samtidig (figur S1C).
    1. Hvis det er en mismatch i tide, er sonden ikke helt i kontakt med glasset. Flytt ned sonden i trinn på 1 μm til grunnlinjen for utkragesignalet endres (se trinn 7) og gjenta trinn 9.
    2. Hvis utkragesignalet ikke endres i det hele tatt under kalibreringstrinnet , er sonden langt fra overflaten. Øk kontaktterskelen iterativt (se trinn 8) til overflaten er riktig funnet, og gjenta kalibreringen fra begynnelsen fra bølgelengdeskanningen.
  11. Når kalibreringen er fullført, kontrollerer du de gamle og nye kalibreringsfaktorene i popup-vinduet som vises. Hvis den nye kalibreringsfaktoren er i riktig område, klikker du på Bruk ny faktor. Hvis kalibreringen mislykkes, og den nye faktoren enten er NaN eller ikke er i det forventede området, kan du se Diskusjon (feilsøking av metoden) for oppløsning.
    MERK: Den nye faktoren skal være ~ n ganger lavere enn den som er gitt på sondens boks hvis kalibreringen ble utført i et flytende medium med brytningsindeks n (n = 1,33 for vann). Hvis kalibrering ble utført i luft, bør de nye og gamle kalibreringsfaktorene være omtrent like.
  12. Kontroller om demodulasjonssirkelen er riktig kalibrert som følger. Naviger til kategorien Demodulering på interferometer-skrivebordet. Trykk forsiktig på det optiske bordet eller på nanoindenter for å indusere nok støy. En hvit sirkel bestående av diskrete datapunkter skal omtrent dekke den røde sirkelen (figur S1D).
  13. Hvis den hvite sirkelen ikke overlapper med den røde sirkelen, eller det vises en advarsel på interferometerets display, må demoduleringssirkelen kalibreres på nytt. Dette kan gjøres på to måter som beskrevet nedenfor.
    1. Trykk kontinuerlig på nanoindenterens kropp for å indusere en full sirkel av støy og trykk på Kalibrer-knappen på interferometeret.
    2. Gå inn i kontakt med glassunderlaget og trykk Kalibrer fra Initialiser-menyen i programvarens hovedvindu. Ikke lagre kalibreringsfaktoren. På dette tidspunktet, sjekk igjen og sørg for at den hvite sirkelen overlapper med den røde sirkelen.
      MERK: Hvis signalet ikke bare er litt forskjøvet fra demodulasjonssirkelen, men heller ble veldig lite eller ikke er synlig i det hele tatt, betyr det at utkragingen sitter fast på den optiske fiberen. Følg feilsøkingsrådene for dette problemet (se Diskusjon, feilsøking av metoden) og gjenta trinnene 13.1 eller 13.2. Når utkrageren kommer tilbake til sin horisontale posisjon (figur 3A), vil signalet komme tilbake til demodulasjonssirkelen.
  14. Bekreft kalibreringen ved å utføre et innrykk på glassunderlaget rett etter kalibreringen som beskrevet nedenfor.
    1. Last inn eller lag en eksperimentfil ved å klikke på Konfigurer eksperiment og legg til et Finn overflate-trinn og innrykkstrinn . For innrykkstrinnet bruker du standardinnstillingene for forskyvningsmodus og endrer maksimal forskyvning til kalibreringsavstanden (3 000 nm) for å forskyve sonden mot det stive underlaget.
    2. Klikk på Kjør eksperiment og sjekk demoduleringssirkelen i interferometervinduet. Kontroller det hvite signalet og sørg for at det er på toppen av den røde sirkelen under innrykk.
    3. Kontroller resultatene i programvarens hovedvindu i Time Data-grafen , og sørg for at piezoens forskyvning (blå linje) er lik utkragerens avbøyning (grønn linje) når innrykket starter i kontakt og ingen materialdeformasjon forventes. Hvis signalene ikke er parallelle, se Diskusjon (feilsøking av metoden).
  15. Endre den lokale banen i kalibreringsmenyen ved å sette Kalibreringslagringsbane til en passende katalog.
  16. Når sonden er kalibrert, flytter du piezoen opp med 500 μm.

4. Måling av Youngs modul av myke materialer

  1. Nanoindentasjon av hydrogeler
    1. Legg petriskålen som inneholder prøven (e) på mikroskopets trinn og flytt nanoindenterens sonde manuelt til en ønsket x-y-posisjon over prøven.
    2. Skyv sonden manuelt i oppløsning, og pass på å la 1-2 mm være mellom sonden og prøvens overflate på dette stadiet. Vent 5 min til sonden balanserer i mediet.
    3. Fokuser z-planet til det optiske mikroskopet slik at sonden er tydelig synlig.
    4. Utfør et enkelt innrykk for å justere de eksperimentelle parametrene som beskrevet nedenfor.
      1. Konfigurer et nytt eksperiment i programvarens hovedvindu. Klikk på Konfigurer eksperiment, som åpner et nytt vindu. Legg til et Finn overflate-trinn . Alle parametere i Finn overflate-trinnet kan endres i Alternativer-menyen i programvaren om nødvendig.
        MERK: Find Surface vil senke sonden til overflaten er funnet, og deretter vil den trekke sonden til en avstand definert av Z Above Surface (μm), over prøvens overflate. Hvis den valgte utkrageren er for stiv for prøven eller prøven er klebrig, vil sonden etter trinnet sannsynligvis fortsatt være i kontakt med prøven, noe som vil resultere i en kurve uten baseline (figur 4C). For å løse dette problemet, øk Z over overflaten (μm).
      2. Legg til et innrykkstrinn . Velg Profil-fanen og klikk på Fortrengningskontroll. La standard innrykksprofil være.
      3. Klikk på Kjør eksperiment i hovedprogramvarevinduet. Dette vil finne overflaten og utføre en enkelt innrykk. Hvis enkeltinnrykket ikke ser ut som forventet, justerer du de eksperimentelle parametrene som beskrevet i figur 4 og diskusjon (feilsøking av metoden).
    5. Når innrykket ser ut som ønsket, konfigurerer du matriseskanningen slik at et tilstrekkelig område av prøven blir rykket inn. Klikk på Konfigurer eksperiment, legg til et Finn overflate-trinn med de tidligere bestemte eksperimentelle parametrene og legg til et Matrix Scan-trinn .
    6. For flate hydrogeler, konfigurer en matriseskanning som inneholder 50-100 punkter (dvs. 5 x 10 eller 10 x 10 i x og y) fordelt på 10-100 μm (dvs. dx = dy = 10-100 μm). Klikk på Bruk faseposisjon for å starte matriseskanningen fra gjeldende faseposisjon . Kontroller at det er merket av for Finn overflate automatisk for å finne overflaten ved hvert innrykk ved hjelp av de angitte eksperimentelle parameterne.
      1. For å unngå oversampling, sett trinnstørrelsen til minst to ganger kontaktradiusen (Equation 1der δ er innrykksdybden).
      2. Definer matriseskanningsprofilen i forskyvningskontroll. Sikre at profilen ikke bryter med forutsetningene i Hertz-modellen (se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen).
      3. La antall segmenter være 5, som er standardverdien, og bruk standard forskyvningsprofil. Endre om nødvendig forskyvningsprofilen når det gjelder maksimal forskyvning og tid for hvert skrånende segment, noe som vil påvirke henholdsvis maksimal innrykksdybde og belastningshastighet. Ikke overskrid belastningshastigheter > 10 μm/s (se Diskusjon, begrensninger i metoden).
      4. Angi en verdi for innflygingshastigheten, som bestemmer hvor raskt sonden forskyves mot prøven før kontakt. Tilpass tilbaketrekningshastigheten til innflygingshastigheten (se merknad nedenfor).
        MERK: For myke utkrager og støyende omgivelser anbefales en innflygingshastighet på 1,000-2,000 nm/s. For stivere utkrager og kontrollerte miljøer kan dette økes.
      5. Lagre det konfigurerte eksperimentet i ønsket eksperimentbane, og velg en katalog der dataene skal lagres i Lagre bane, i kategorien Generelt i vinduet Konfigurer eksperiment. Klikk på Kjør eksperiment.
    7. Når matriksskanningen er fullført, løft sonden med 200-500 μm og flytt sonden til et annet område av prøven tilstrekkelig langt unna det første området.
    8. Gjenta eksperimentet minst to ganger slik at tilstrekkelige data blir oppnådd på hver prøve (dvs. minst to matriseskanninger per prøve, som inneholder 50-100 kurver hver).
  2. Nanoindentasjon av celler
    1. Legg prøven på mikroskopet som beskrevet ovenfor.
    2. For enkeltcelleinnrykk fokuserer du z-planet slik at både celler og sonde er synlige ved 20x eller 40x forstørrelse, avhengig av cellestørrelse og spredning.
    3. Flytt sonden over cellen som skal rykkes inn.
    4. Konfigurer et nytt eksperiment i programvarens hovedvindu. Klikk på Konfigurer eksperiment, som åpner et nytt vindu. Legg til trinnet Finn overflate og innrykk med standardparametere i forskyvningsmodus.
    5. Klikk på Kjør eksperiment, som finner overflaten og utfører en enkelt innrykk. Kontroller om innrykket var vellykket. Hvis kurven ikke ser ut som forventet, justerer du de eksperimentelle parametrene (se figur 4 og Diskusjon, feilsøking av metoden).
    6. Hvis innrykket var vellykket, legger du til en matriseskanning i eksperimentet. Følg trinnene som er gitt for hydrogels nanoindentasjonseksperimenter; konfigurere matriseskanningen slik at trinnstørrelsen gjør det mulig å rykke inn et lite område av cellen; 25 poeng fordelt på 0,5-5 μm for HEK293T-celler.
      1. Avhengig av cellestørrelsen, tilpass matriseskanningen for å sikre at spissen ikke rykker inn utenfor cellegrensen, det vil si å gjøre en annen kartgeometri eller undersøke færre punkter.
    7. Klikk på Kjør eksperiment og vent til det er fullført.
    8. Når matriseskanningen er fullført, løft sonden ut av kontakt (50 μm i z-planet ).
    9. Flytt sonden over en ny celle og gjenta prosessen (se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen).
  3. Rengjøring av sonden og slå av instrumentet
    1. Følg trinnene som er gitt i tilleggsprotokollen for å rengjøre sonden og slå av nanoindentasjonsenheten.

5. Analyse av data

  1. Laste ned og installere programvaren
    1. Følg trinnene i tilleggsprotokollen for å laste ned og installere programvaren for dataanalyse28,29.
  2. Screening av F-z-kurver og produksjon av renset datasett i JSON-format
    1. Start prepare.py fra kommandolinjen på laboratoriedatamaskinen som beskrevet i trinn 2 til 3.
    2. Hvis du bruker en Windows-datamaskin, holder du nede shift-tasten mens du høyreklikker på NanoPrepare-mappen og klikker på Åpne PowerShell-vinduet her. Skriv inn python prepare.py-kommandoen og trykk Enter-tasten . En GUI vil dukke opp på skjermen din (figur S2).
    3. Hvis du bruker en MacOS-datamaskin, høyreklikker du på NanoPrepare-mappen og klikker på Ny terminal på Mappe. Skriv inn python3 prepare.py-kommandoen og trykk Enter-tasten , som starter GUI (figur S2).
    4. Velg O11NEW-dataformatet fra rullegardinlisten. Hvis data ikke er lastet inn riktig, starter du GUI-en på nytt og velger O11OLD.
      MERK: O11NEW-formatet fungerer for data oppnådd ved hjelp av ferrule-top optisk fiberfølende nanoindentasjonsenheter med programvareversjon 3.4.1. Dette formatet vil også fungere for tidligere programvareversjoner, i hvert fall de som tilhører nanoindenters installert i 2019-2020.
    5. Klikk på Last inn mappe. Velg en mappe som inneholder dataene som skal analyseres - enkelt matriseskanning eller flere matriseskanninger. Den øverste grafen (Raw Curves) fylles ut med det opplastede datasettet. For å visualisere en bestemt kurve, klikk på den. Dette vil markere det i grønt og vise det på den nederste grafen (Current Curve).
    6. Rengjør datasettet ved hjelp av fanene til høyre i GUI-en som beskrevet nedenfor.
      1. Bruk Segment-knappen til å velge riktig segment som skal analyseres, som er fremoversegmentet for F-z-kurver . Det spesifikke tallet avhenger av antall segmenter som er valgt i nanoindentasjonsprogramvaren når du utfører eksperimenter.
      2. Bruk Beskjær 50 nm-knappen for å beskjære kurvene med 50 nm helt til venstre (hvis L er krysset av), høyre (hvis R er krysset av) eller begge sider (hvis både R og L er krysset av). Klikk på denne knappen flere ganger for å beskjære så mye som nødvendig. Bruk dette til å fjerne artefakter som er tilstede ved starten/slutten av F-z-kurver.
      3. Inspiser Cantilever-fanen for fjærkonstanten, spissgeometrien og spissradiusen. Undersøk fanen for å sikre at metadataene er lest riktig.
      4. Bruk kategorien Screening til å angi en styrketerskel som vil forkaste alle kurvene som ikke nådde den gitte kraften. Kasserte kurver vil bli uthevet i rødt.
      5. Bruk knappen for manuell veksleknapp til å fjerne kurver som ikke er anskaffet på riktig måte, manuelt. Fjern eventuelle kurver ved å klikke på den spesifikke kurven og velge UT, som vil markere kurven i rødt.
    7. Klikk på Lagre JSON. Skriv inn et passende navn for det rensede datasettet, som er en enkelt JSON-fil. Send JSON-filen til datamaskinen der NanoAnalysis-programvaren ble installert.

6. Formell dataanalyse

  1. Start nano.py-filen fra kommandolinjen ved å navigere til NanoAnalysis-mappen og starte en terminal som tidligere forklart. Skriv inn python nano.py eller python3 nano.py-kommandoen (avhengig av operativsystemet) og trykk Enter-tasten . En GUI vil dukke opp på skjermen din (figur S3).
  2. Øverst til venstre i GUI klikker du på Last inn eksperiment og velger JSON-filen. Dette vil fylle fillisten og Raw Curves-grafen som viser datasettet når det gjelder F-z-kurver. Både F- og z-aksene vises i forhold til CP-koordinatene, som beregnes i bakgrunnen når datasettet lastes inn (se følgende merknad). I Statistikk-boksen merker du av for verdiene for de tre parameterne: Naktivert, N mislyktes og Nekskludert.
    MERK: Naktivert representerer antall kurver som vil bli analysert i den påfølgende Hertz / elastisitetsspektraanalysen og vises i svart i Raw Curves-grafen . Nmislyktes representerer antall kurver som en pålitelig CP ikke kunne bli funnet på og vises i blått i grafen. Disse kurvene vil automatisk bli forkastet i den påfølgende analysen. Når du åpner programvaren, kan noen kurver automatisk flyttes til det mislykkede settet. Dette er fordi CP beregnes ved åpning av programvaren med standard terskelalgoritme (se nedenfor). N ekskludert representerer kurvene som er manuelt valgt for å bliekskludert fra analysen, og vil vises i rødt i grafen (se nedenfor).
  3. Kontroller om antall mislykkede, ekskluderte og aktiverte kurver er rimelig. Sjekk Raw Curves-grafen for å visualisere kurvene.
  4. For å visualisere en bestemt kurve mer detaljert, klikk på den. Dette vil markere den i grønt og vise den på Current Curve-grafen. Når en enkelt kurve er valgt, fylles R- og k-parametrene (som må være de samme for alle kurver) ut i Statistikk-boksen i GUI-en.
  5. Endre statusen for en gitt kurve ved hjelp av veksleboksen . Klikk på den spesifikke kurven du vil endre statusen for, og klikk deretter på enten Aktivert, Mislyktes eller Ekskludert. Tellingen i Statistikk-boksen oppdateres automatisk.
    Hvis du vil endre visningen av datasettet i råkurvediagrammet , bruker du Vis-boksen . Klikk på Alle for å vise alle kurver (dvs. aktivert, mislyktes og ekskludert i de respektive fargene). Klikk på Kunne ikke vise de aktiverte og mislykkede kurvene og klikk på Aktivert for å bare vise de aktiverte kurvene. For å tilbakestille statusen til alle kurver mellom aktivert og ekskludert, klikk på Aktivert eller Ekskludert i Tilbakestill-boksen .
  6. Når datasettet er ytterligere renset, følger du dataanalysepipelinen som er beskrevet nedenfor.
    1. Filtrer eventuell støy som er tilstede i kurvene ved hjelp av filtrene som er implementert i GUI (Filtering Box), nemlig et tilpasset filter kalt Prominency filter, Savitzky Golay30,31 (SAVGOL) filter, og et utjevningsfilter basert på beregning av medianen av dataene i et gitt vindu (medianfilter). Se Diskusjon (kritiske trinn i protokollen) for detaljer om filtre.
    2. Inspiser de filtrerte kurvene i Gjeldende kurve-grafen . Den filtrerte kurven vises i svart, mens den ikke-filtrerte versjonen av kurven vises i grønt.
      MERK: Det anbefales å filtrere dataene så lite som mulig for å bevare funksjonene til det opprinnelige signalet. Overfiltrering kan jevne ut eventuelle forskjeller i dataene. Arbeid med prominensfilteret aktivert er nok for Hertz-analysen av nanoindentasjonsdata. Hvis dataene er spesielt støyende, kan en SAVGOL eller median filtre brukes i tillegg.
    3. Velg en algoritme for å finne CP. I Kontaktpunkt-boksen velger du en av en rekke numeriske prosedyrer som er implementert i programvaren, nemlig Goodness of Fit (GoF)32, Ratio of Variances (RoV)32, Second derivative 33 eller Threshold 33. Se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen for detaljer om algoritmene.
      MERK: CP er punktet der sonden kommer i kontakt med materialet og må identifiseres for å konvertere F-z-data til F-δ-data (for myke materialer er δ endelig og må beregnes). Den valgte algoritmen vil bli brukt på alle aktive kurver i datasettet, og kurver der algoritmen ikke klarer å finne CP robust, vil bli flyttet til det mislykkede settet.
    4. Juster algoritmens parametere slik at de passer til datasettet ditt, slik at CP er riktig plassert som beskrevet i diskusjonen, kritiske trinn i protokollen. For å se hvor CP er funnet på en enkelt kurve, velg kurven ved å klikke på den og klikk på Inspiser. Kontroller popup-vinduet som vises, for å identifisere hvor CP-en har blitt plassert.
    5. Kontroller om den røde linjen som vises, som er parameteren algoritmen beregnet i det valgte interesseområdet, har en maksimums- eller minimumsverdi som tilsvarer plasseringen av CP (f.eks. For GoF er parameteren R2). Gjenta denne prosessen for alle kurver om nødvendig.
      MERK: Aksene i popup-vinduet er i absolutte koordinater, slik at plasseringen av CP kan vises. Omvendt vises aksene til Raw Curves og Current Curve-grafen i forhold til CP, dvs. plasseringen av CP er (0,0).
    6. Klikk på Hertz Analyse. Dette vil generere tre grafer beskrevet nedenfor.
      1. Kontroller individuelle F-δ kurver i datasettet sammen med gjennomsnittlig Hertz-tilpasning (rød stiplet linje). Juster innrykket i nm opp til Hertz-modellen i Resultater-boksen under Maks innrykk (nm). Sett den til maksimalt ~ 10% av R for at Hertz-modellen skal være gyldig (se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen).
      2. Kontroller den gjennomsnittlige F-δ-kurven med feilbånd som viser ett standardavvik (SD) sammen med gjennomsnittlig Hertz-tilpasning (rød stiplet linje). Visualiser den gjennomsnittlige Hertz-tilpasningen på Raw Curves-grafen for referanse og Hertz-tilpasningen for hver kurve på Current Curve.
      3. Kontroller spredningsplottet til E som stammer fra å tilpasse Hertz-modellen til hver enkelt kurve.
    7. Klikk enten på filnavnet, F-z-kurven, F-δ-kurven eller et punkt på punktdiagrammet for å utheve kurven i hvert plott. Hvis et datapunkt i punktdiagrammet ser ut til å ligge utenfor fordelingen av dataene, klikker du på det og inspiserer kurven det tilhører. Kontroller at CP er riktig plassert ved å klikke på Inspiser-knappen. Ekskluder kurven fra analysen om nødvendig.
    8. Inspiser Resultater-boksen for den beregnede gjennomsnittlige E og dens SD (Eγ ± σ) og sørg for at de er rimelige for det gitte eksperimentet.
    9. I Lagre-boksen klikker du på Hertz. I popup-vinduet skriver du inn filnavn og katalog. Når du er ferdig, klikker du på Lagre. En .tsv-fil vil bli opprettet. Åpne .tsv-filen i hvilken som helst ekstra programvare du foretrekker, og bruk verdiene for statistisk analyse og videre plotting.
      MERK: Filen inneholder E hentet fra hver kurve og gjennomsnittlig E og dens SD. I tillegg inneholder filen metadata knyttet til analysen, inkludert antall analyserte kurver, R, k og maksimal innrykk som brukes for Hertz-modellen.
    10. Dette trinnet er valgfritt. Klikk på Gjennomsnittlig F-Ind for å eksportere gjennomsnittlig kraft og gjennomsnittlig innrykk, sammen med en SD i kraften.
    11. For celle nanoindentation data, klikk på Elasticity Spectra Analysis (se Representative resultater og diskusjon). Inspiser de to plottene som produseres, nemlig E som en funksjon av innrykksdybden (E (δ)) for hver kurve, og gjennomsnittlig E (δ) med feilbånd som viser en SD (solid rød linje og skyggelagt område) montert av en modell (svart stiplet linje), som gjør det mulig å estimere cellens aktinbarkens Youngs modul, cellens bulk Youngs modul, og aktinbarkens tykkelse. I tillegg sjekker du gjennomsnittlig E (δ) i toppgrafen i rødt.
    12. Forsikre deg om at interpolatboksen er merket av, noe som sikrer at derivatet som trengs for å utføre elastisitetsspektraanalysen, beregnes på det interpolerte signalet (se Representative resultater).
    13. Inspiser Resultater-boksen, rapporter cortexens Youngs modul (E 0 ± σ), cellens bulk Youngs modul (Eb ± σ) og cortextykkelsen (d0 ± σ).
      MERK: De gjennomsnittlige elastisitetsspektrene kan virke støyende i begynnelsen, med fremtredende sinusformede svingninger. Som et resultat kan det hende at ligningen (3) ikke passer riktig. Hvis dette er tilfelle, løser dette problemet iterativt å øke vinduslengden på det utjevnende SAVGOL-filteret34 .
    14. Når analysen er ferdig, klikker du på ES i Lagre-boksen . Dette vil eksportere en .tsv-fil i den angitte katalogen, som inneholder den gjennomsnittlige elastisiteten som en funksjon av gjennomsnittlig innrykksdybde og kontaktradius, metadataene knyttet til eksperimentet (se ovenfor) og de estimerte modellparametrene forklart ovenfor. Til slutt rapporteres også den gjennomsnittlige elastisiteten som ser bort fra avhengigheten av δ og dens SD.
    15. Lukk programvaren og skriv inn de lagrede resultatene i annen programvare du foretrekker for å plotte dataene ytterligere og utføre statistisk analyse.
    16. Dette trinnet er valgfritt: Eksporter grafer fra GUI ved å høyreklikke på grafen og velge Eksporter. Eksporter grafen i .svg, slik at parametere som skrift, skriftstørrelse, linjestil osv. kan redigeres i en annen programvare etter eget valg.
      MERK: Egendefinerte CP-algoritmer og filtre kan programmeres og legges til de allerede eksisterende. Se utfyllende merknad 1 for detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokollen oppnås et sett med F-z-kurver. Datasettet vil mest sannsynlig inneholde gode kurver, og kurver som skal forkastes før man fortsetter med analysen. Generelt bør kurver kastes hvis formen er forskjellig fra den som er vist i figur 4A. Figur 5AI viser et datasett på ~ 100 kurver oppnådd på en myk PAAm-hydrogel av forventet E 0,8 KPa35 lastet opp i NanoPrepare GUI. De fleste kurver presenterer en klar, flat grunnlinje, et overgangsområde og et skrånende område som er proporsjonalt med materialets tilsynelatende stivhet13. Et mindretall av kurvene viser imidlertid endringer fra figuren vist i figur 4A, for eksempel fravær av grunnlinje, manglende kontakt eller skråstilt grunnlinje. Disse kurvene kan enkelt fjernes fra datasettet ved hjelp av NanoPrepare (Figur 5AII, røde kurver), og et rent datasett lagret i standard JSON-format (figur 5AIII). Det rene datasettet lastes opp i NanoAnalysis (figur 5BIV), som er designet slik at det batchbehandler alle kurver. Dette betyr at hvert trinn i arbeidsflyten brukes på hele datasettet. Etter å ha blitt lastet opp, kan kurver filtreres for å fjerne tilfeldig støy ved hjelp av ett eller flere filtre beskrevet i diskusjonen, kritiske trinn i protokollen (figur 5BV). CP blir deretter lokalisert ved hjelp av en av algoritmene implementert i programvaren og detaljert i diskusjonen, kritiske trinn i protokollen (figur 5BVI). Når CP er identifisert, konverteres F-z-data til F-δ-data. Fordi programvaren er designet for primært å analysere data fra ferrule-top nanoindentation-enheter basert på optisk fibersensor, som bruker sonder som har en sfærisk spiss, er Hertz-analysen basert på Hertz-modellen som tilnærmer kontakten mellom en sfære med radius R og en uendelig utvidet lineær elastisk homogen isotropisk (LEHI) halvplass13:

Equation 2

hvor F er kraften, δ er innrykket, E er Youngs modul, og ν er Poissons forhold, tatt som 0,5 forutsatt inkompressibilitet. Ved å tilpasse F-δ-kurver med ligning (1) kan E derfor estimeres (se Diskusjonskritiske trinn i protokollen-for antagelser i Hertz-modellen) (figur 5BVII).

I tillegg til Hertz-analysen kan programvaren utføre en mer avansert analyse, nemlig elastisitetsspektra, som er spesielt nyttig for cellenanoindentasjonsdata; og kan også brukes som et verktøy for å estimere påvirkningen av det underliggende substratet på de mekaniske egenskapene oppnådd via Hertz-modellen. Nedenfor er tilnærmingen kort oppsummert. Alle detaljer finnes i den opprinnelige publikasjonen24.

Med utgangspunkt i Oliver-Pharr modell36, som beskriver innrykk av en aksisymmetrisk stans av vilkårlig geometri og et elastisk halvrom, kan man utlede E (δ) for det spesifikke tilfellet av en sfærisk indenter. Tar ν som 0,5, E (δ) har skjemaet24:

Equation 3

Beregning av E (δ) for hver F-δ-kurve ved hjelp av ligning (2) gir et sett med kurver, nemlig elastisitetsspektra (ES). Ved å ta gjennomsnittet av alle kurvene i datasettet, oppnås gjennomsnittlig ES (figur 5BVIII, rød solid linje). Gjennomsnittlig ES er et nyttig verktøy fordi det gir informasjon om hvordan E varierer med δ i datasettet. I det spesifikke tilfellet av cellenanoindentasjonseksperimenter er tykkelsen på cellen ikke kjent a priori, noe som betyr at valg av passende tilpasningsområde for Hertz-analysen er noe vilkårlig. Ved å bruke gjennomsnittlig ES, blir substrateffekter på den tilsynelatende E (δ) tydelig, noe som betyr at verktøyet kan brukes til å velge et passende tilpasningsområde, tilsvarende det punktet hvor E (δ) begynner å øke etter forfallet. Videre har det tidligere blitt demonstrert og beregningsmessig og eksperimentelt validert at en enkel dobbeltlagsmodell er effektiv i estimeringen av aktinbarkens tykkelse (d 0), aktinbarkens Youngs modul (E 0) og cellens bulk Youngs modul (Eb)24. Modellen beskriver cellen som et dobbeltlag, med et ytterste lag av tykkelse d 0 og modul E 0, og et indre lag med uendelig tykkelse med elastisk modul E b 0:

Equation 4

hvor R er spissens radius og Λ er en fenomenologisk parameter, som ble bestemt til å være 1,74 fra endelige elementanalysesimuleringer24. Denne prosedyren er implementert i NanoAnalysis-programvaren, som gjør det mulig å passe gjennomsnittlig ES med ligning (3) for å oppnå et estimat på E 0, E b og d0 (figur 5BVIII, svart stiplet linje). For fullstendige metodologiske detaljer, se den opprinnelige publikasjonen24.

For å demonstrere protokollens levedyktighet ble elastisiteten til PAAm-hydrogeler av kjent E (målt ved AFM)35 fremstilt og testet ved hjelp av prosedyren foreslått i del 1 av protokollen. For hver gel ble to stivhetskart i to forskjellige områder av prøven oppnådd ved hjelp av en kommersiell ferrule-top nanoindenter utstyrt med en spiss som har R = 52 μm og k = 0, 46 N / m. Hvert kart besto av 50 innrykk utført i forskyvningskontroll, og trinnstørrelsen i x og y ble satt til 20 μm for å unngå oversampling. Figur 6A viser gjennomsnittlig F-δ-kurve sammen med gjennomsnittlig Hertz-modell for en myk PAAm-hydrogel (forventet E 0,8 kPa) og en stiv PAAm-hydrogel (forventet E 8 kPa)35. Ved å utføre Hertz-analysen gjennom programvaren NanoAnalysis og plotte individuelle verdier av E, ble forventet E hentet for begge hydrogelene (figur 6B).

Videre ble nanoindentasjonseksperimenter på HEK293T-celler utført. Seks individuelle celler ble rykket inn ved å utføre en matriseskanning med x- og y-trinnstørrelse satt til 0,5 μm på hver celle og anskaffe minst 25 kurver på hver celle. Dette resulterte i det analyserte datasettet som inneholdt ~ 200 kurver. Den valgte sonden hadde R = 3,5 μm og k =0,02 N/m.

Figur 7A viser den gjennomsnittlige Hertz-kurven og den tilsvarende gjennomsnittlige Hertz-modellen, plottet ved hjelp av gjennomsnittlig E oppnådd fra tilpasningsligning (1) til hver enkelt kurve i NanoAnalysis opp til en innrykk på 200 nm. E ble funnet å være 915 ± 633 Pa (gjennomsnitt ± SD), som er i samsvar med verdier rapportert i litteraturen24. Til tross for sin brede bruk, fanger Hertz-modellen ikke fullt ut utviklingen av kraften med økende innrykksdybde for cellenanoindentasjonseksperimenter (figur 7A). På grunn av dette er ES et spesielt egnet verktøy for å studere de mekaniske egenskapene til enkeltceller.

Figur 7B viser gjennomsnittlig ES, sammen med ligning (3) montert opp til et innrykk på 200 nm. Den gjennomsnittlige ES begynner å øke ved en innrykksdybde på ~ 200 nm, noe som indikerer substratets bidrag til den undersøkte tilsynelatende E (figur S4). På grunn av dette ble 200 nm valgt som monteringsområde for både Hertz-modellen (figur 7A) og dobbeltlagsmodellen (figur 7B). Monteringsligning (3) til gjennomsnittlig ES tillot å trekke ut viktig informasjon, som ellers ville forbli utilgjengelig fra enkle nanoindentasjonseksperimenter analysert ved hjelp av Hertz-modellen. Spesielt ble aktinbarkens modul E 0 estimert til å være 5,794 ± 0,095 kPa, aktinbarkens tykkelse d0 ble funnet å være 311 ± 3 nm og bulkmodulen Eb ble funnet å være 0,539 ± 0,002 kPa (gjennomsnittlig ± SD). Alle verdier er i samsvar med tidligere forsøk utført med AFM på samme celletype24, og med verdier som er rapportert i litteraturen37,38. Spesielt forventes aktinbarken å være mellom 300-400 nm for adherenteceller37, og opptil 10 ganger stivere enn hoveddelen av cellen38.

Uavhengig av tolagsmodellen er en direkte sammenligning mellom resultater oppnådd med standard Hertz-modellen og ES-tilnærmingen gitt i figur 7C, som avslører overlappende fordelinger med sammenlignbare midler.

Figure 1
Figur 1: Protokolloversikt. Protokollen består av følgende deler: (A) Del 1: Forberedelse av prøven (enten hydrogeler eller celler) for nanoindentasjonseksperimenter. (B) Del 2: Velge riktig sonde og kalibrere sonden. (C) Del 3: Utføre nanoindentasjonseksperimenter ved å skaffe stivhetskart på prøven. (D) Del 4: Analysere dataene, som består av i) å rense det oppkjøpte datasettet gjennom den første GUI (NanoPrepare) og lagre det rensede datasettet og tilhørende metadata som en standard JSON-fil; og ii) analysere det rensede datasettet i den andre GUI (NanoAnalysis), som består av datafiltrering, CP-identifikasjon og modelltilpasning for å estimere Youngs modul E av prøven. Resultatene lagres for videre plotting og statistisk analyse, som kan utføres i hvilken som helst programvare du velger. Laget med Biorender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Prøvepreparering . (A) Trinn foreslått for å forberede flate PAAm-hydrogeler for nanoindentasjonseksperimenter. Disse er: I) helle hydrogelløsningen på et hydrofobt glassglass og dekke det med et silanisert deksel; II) venter i 20 minutter på polymerisering og skreller av deksel-gelkompositten fra glassglasset; og III) feste dekkgelkompositten til en petriskål og tilsette passende løsning (renset vann i sammenheng med denne protokollen) for nanoindentasjonseksperimenter. Den samme begrunnelsen kan tilpasses og brukes på alle andre typer hydrogel. (B) Trinn foreslått for å forberede celler for nanoindentation eksperimenter. Disse er: I) såing celler og venter på celleadhesjon; II) serum sulter cellene for å synkronisere cellepopulasjonen når det gjelder cellesyklusen (valgfritt); og III) venter på at cellene skal være i en overholdt tilstand ved ønsket sammenløp før du starter nanoindentasjonseksperimenter. Laget med Biorender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Oversikt og valg av nanoindentasjonssonde. (A) Skjematisk av ferrule-top sonde (venstre) og bilde av en ferrule-top sonde med den sfæriske spissen av radius 250 μm (høyre). Alle komponenter er merket på bildet. (B) Forstørret skjematisk av cantilever og sfærisk spiss. Utkragingen behandles som en krokfjær med elastisk konstant k (vist i vinkel for representasjonsformål). Spissen er definert av radiusen, R. Når prøven er rykket inn, forskyves sonden med en mengde z fra referanseposisjonen z 0, noe som resulterer i at utkrageren bøyer d fra referansebøyningen d 0. En kraft på F = k (d - d 0) påføres prøven, noe som resulterer i et innrykk δ = (z - z 0) - (d - d0). (C) Cantilevers stivhet k bør velges i henhold til substratets forventede elastisitet. Plottet ble oppnådd med tanke på Hertzian kontakt med en innrykk på 1 μm, forutsatt at energien er likt fordelt mellom cantileverens bøyning og substratets innrykk (dvs. d = δ). Jo større spissradiusen er, desto stivere bør utkrageren være for å nå samme innrykk for et substrat med en gitt E. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Morfologiske egenskaper ved F-z-kurver. (A) Et vellykket eksperiment resulterer i at tilnærmingssegmentet til en F-z-kurve har en klar grunnlinje (spiss som nærmer seg prøven, men ikke i kontakt); et overgangsområde der spissen først kontakter prøven; og et område der kraften øker med forskyvningen, hvor spissen gradvis rykker inn prøven. Hellingen til denne regionen er proporsjonal med den tilsynelatende stivheten til materialet13, noe som betyr at kurver som tilhører stive biomaterialer (f.eks. Svært tverrbundne geler) vil være brattere enn de som tilhører mykere biomaterialer (f.eks. Svakt tverrbundne geler og celler). (B) En innflygingskurve der spissen aldri kom i kontakt med prøven. Se feilsøking av metoden i diskusjonen for løsning. (C) En innflygingskurve der spissen startet i kontakt med prøven. Se feilsøking av metoden i diskusjonen for løsning. Dataene som vises er fra et eksperiment utført på en myk PAAm-hydrogel med forventet E 0,8 kPa35. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Dataanalysearbeidsflyt ved hjelp av Python GUIer . (A) Et eksempeldatasett av F-z-kurver anskaffet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ferrule-top nanoindenter på en myk PAAm-hydrogel (forventet E 0,8 kPa35) ble lastet opp i NanoPrepare. Kurver som ikke følger figuren som er beskrevet i figur 4A , utelates fra datasettet, og det rene datasettet og tilknyttede metadata lagres som en standard JSON-fil. (B) Det rene datasettet lastes opp i den andre GUI (NanoAnalysis) der kurver kan filtreres ved å bruke ett eller flere filtre for å fjerne støy (se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen). Videre velges en CP-algoritme for automatisk å finne CP for alle kurver (se Diskusjon, kritiske trinn i protokollen). Hertz-analysen utføres deretter, noe som gir en F-δ-kurve for hver innrykk, som er utstyrt med Hertz-modellen for å gi et spredningsplott av E. De oppnådde resultatene kan lagres for videre plotting. For celler kan en ytterligere analyse kalt elastisitetsspektra24 utføres. Alle grafer som ble vist ble direkte eksportert fra både NanoPrepare og NanoAnalysis GUIer. Detaljer for hvert trinn i arbeidsflyten er gitt i hovedteksten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Elastisitet av PAAm hydrogeler. (A) Gjennomsnittlig F-δ kurve fra et sett med ~100 kurver ervervet på en myk PAAm-hydrogel (forventet E 0,8 kPa 35) og en stiv PAAm-hydrogel (forventet E 8 kPa35). Heltrukne linjer viser gjennomsnittlig og skyggelagt bånd viser en SD. Den stiplede linjen viser Hertz-modellen plottet ved hjelp av gjennomsnittlig E fra NanoAnalysis-programvaren, oppnådd ved å tilpasse Hertz-modellen til hver kurve opp til en maksimal innrykk på 2000 nm (~ 4% av R, R = 52 μm, k = 0,46 N / m). Kurvene ble jevnet ut ved hjelp av prominecy-filteret med standardparametere, og CP ble identifisert ved hjelp av RoV-algoritmen32. (B) Individuelle verdier av E hentet fra analysen utført i NanoAnalysis plottet for statistisk sammenligning. Regnskyplottet ble oppnådd ved hjelp av Python-modulen beskrevet i referanse39. p < 0,0001, tosidig uparret t-test, α=0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Elastisitet av HEK293T-celler. (A) Gjennomsnittlig F-δ-kurve fra et sett med ~ 200 kurver oppnådd på seks individuelle HEK293T-celler. Den heltrukne blå linjen viser gjennomsnittet, og det skyggelagte båndet viser en SD. Den stiplede linjen viser Hertz-modellen plottet ved hjelp av gjennomsnittlig E beregnet ved hjelp av NanoAnalysis-programvaren, oppnådd ved å tilpasse Hertz-modellen til hver kurve opp til en maksimal innrykk på 200 nm (~ 6% av R, R = 3,5 μm, k = 0,02 N / m). Kurvene ble jevnet ut ved hjelp av prominecy-filteret med standardparametere og et SAVGOL-filter34 med ordre 3 og vinduslengde 80 nm, og CP ble identifisert ved hjelp av terskelalgoritmen33. Ved hjelp av Hertz-modellen behandles cellen som en homogen sfære med Youngs modul E, som skjematisk vist i innfellingen (kjernen er avbildet for billedlige formål). (B) Gjennomsnittlige elastisitetsspektra beregnet på samme datasett som beskrevet i (A). Den heltrukne røde linjen viser gjennomsnittet, og det skyggelagte båndet viser én SD. Ved å tilpasse en tolagsmodell til de gjennomsnittlige elastisitetsspektrene, beregnes estimater på E 0, Eb og d0. For datasettet som vises: E 0= 5,79 ± 0,09 kPa, Eb= 0,539 ± 0,002 kPa og d0 = 311 ± 3 nm (gjennomsnitt ± SD). (C) Sammenligning mellom Hertz-modellen og elastisitetsspektratilnærmingen når det gjelder E-fordeling. For elastisitetsspektrene representerer fordelingen verdiene av E fra de gjennomsnittlige elastisitetsspektrene, uavhengig av innrykksdybde (opp til en maksimal innrykk på 200 nm). De kontinuerlige linjene lagt på histogrammene er Gaussiske kjernetetthetsestimater av de underliggende fordelingene. E = 915 ± 633 Pa (Hertz) og E = 890 ± 297 Pa (elastisitetsspektra) (gjennomsnitt ± SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.  

Figur S1: Prosedyre for kalibrering. (A) Vellykket bølgelengdeskanning. Utkragerens avbøyning og piezos forskyvningssignaler under bølgelengdeskanningen (til venstre). Sinusbølgen på interferometerets skjerm på slutten av bølgelengdeskanningen (høyre). (B) Finn overflateprosedyre. Cantilevers avbøyning og Piezos forskyvning signaliserer når sonden senkes i 1 μm trinn etter kontakt med et stivt substrat. (C) Geometrisk faktorkalibrering. Under innrykk av et stivt substrat følger utkragerens avbøyning utkragerens forskyvning (henholdsvis grønne og blå linjer). Innrykket skal være omtrent null (rød linje). Hvis avbøyningen forsinker forskyvningen i tide (grønn stiplet linje), er sonden ikke helt i kontakt med det stive underlaget. (D) Demoduleringssignal. Demoduleringssignalet på interferometerets skjerm på slutten av kalibreringsprosedyren (venstre) og når du banker på nanoindenter (høyre). Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S2: NanoPrepare GUI. Skjermbilder av NanoPrepare GUI. Detaljer om funksjonaliteten til hver widget er gitt i hovedprotokollen og diskusjonen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S3: NanoAnalysis GUI. Skjermbilder av NanoAnalysis GUI. Detaljer om funksjonaliteten til hver widget er gitt i hovedprotokollen og diskusjonen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsmerknad 1: Legge til tilpassede filtre og CP-algoritmer i NanoAnalysis-programvaren. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsprotokoll. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S4: Dybdeavhengighet av gjennomsnittlige elastisitetsspektra. Plottet viser gjennomsnittlig elastisitetsspektra δ)> (heltrukket rød linje) sammen med en SD (σ(E(δ)). Etter et innledende forfall begynner de gjennomsnittlige elastisitetsspektrene å øke, noe som hovedsakelig er forbundet med effekten av det stive underliggende substratet på den undersøkte tilsynelatende elastiske modulen. Den maksimale innrykksdybden som brukes til å tilpasse Hertz-modellen til F-δ kurver, og forfallsmodellen til gjennomsnittlige elastisitetsspektra bør velges slik at det underliggende substratet ikke påvirker resultatene (Fit range). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen viser hvordan man robust kan skaffe kraftspektroskopi nanoindentasjonsdata ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ferrule-top nanoindenter på både hydrogeler og enkeltceller. I tillegg er instruksjoner for bruk av en åpen kildekode-programvare programmert i Python som omfatter en presis arbeidsflyt for analyse av nanoindentasjonsdata, gitt.

Kritiske trinn i protokollen
Følgende trinn er identifisert som spesielt viktige når du følger denne protokollen.

Forberedelse av prøver

Det er avgjørende at prøven utarbeides med tanke på målingens begrensninger før målingen igangsettes. Det vil si at prøven må festes til en overflate og være så flat som mulig. Dette er spesielt viktig når du forbereder prøver som ikke naturlig fester seg til overflater som celler gjør, for eksempel hydrogeler. For det første må prøven ikke flyte i løsning, da dette vil forstyrre målinger og potensielt skade sonden. For dette anbefales kjemisk funksjonalisering av et deksel, slik at hydrogelen kan polymeriseres festet til en overflate, som senere kan limes til en petriskål mens den er nedsenket. Videre må prøvens overflate være så flat som mulig for å sikre sammenhengende overflatedeteksjon av sonden og unngå å skade sonden mens den beveger seg i x og y under en matriseskanning. Hydrogeloppløsningen kan polymeriseres på et hydrofobt glassglass, noe som gjør den resulterende hydrogelen flat uten å feste seg til den. Dersom disse hensynene ikke følges, vil det være vanskelig å få rene F-z-data .

Når det gjelder cellepreparasjon, er det best å rykke inn celler med lignende morfologi for å forbedre datahomogeniteten. I tilfelle celler vokser i en heterogen populasjon, kan et serum sultetrinn innføres forhåndsmåling, for å hjelpe cellesyklussynkronisering og derfor fjerne potensielle eksperimentelle forstyrrelser40,41. Når det gjelder ikke-adherente celler eller organoide kulturer, må man utføre ekstra trinn for å sikre stabilitet og etterlevelse av den biologiske prøven mens målinger utføres. Ekstra trinn kan omfatte kjemisk binding av celler til kulturplater eller bruk av vevslim som nå er allment kommersielt tilgjengelige.

Nanoindentation eksperimenter

Det er viktig at en utkrager med riktig k velges avhengig av prøvens forventede E15. Dette skyldes at hvis utkrageren er for stiv, vil prøven bli rykket inn, men ingen signifikant utkragebøyning vil oppstå. Omvendt, hvis utkrageren er for myk med hensyn til prøven, vil utkrageren bøye seg for mye med minimal innrykk. Begge tilfeller vil resultere i feilberegning av E i den påfølgende analysen.

For sondekalibrering må sonden være våt før den settes inn i kalibreringsskålen for å minimere overflatespenningen når den møter væsken i kalibreringsskålen. Hvis du ikke gjør det, kan det føre til fangst av luftbobler eller presse utkragingen mot den optiske fiberen. Dette kan også føre til at sonden blir skadet.

Bruk av en tykk petriskål i glass anbefales for kalibrering. Glass er uendelig stivt sammenlignet med utkrageren, noe som muliggjør nøyaktig kalibrering av utkragerens k mens glasset rykkes inn. Videre sikrer glassets vekt et stabilt underlag som er mer robust mot støy (f.eks. luftstrøm og akustiske vibrasjoner) sammenlignet med en lettere petriskål i plast. Kalibreringen utfører en lineariseringsprosedyre av det interferometriske signalet målt ved detektoren (V / t), noe som betyr at signalet vil bli konvertert til lineær utkragebøyning (μm / t) ved hjelp av enhetssirkelen (demodulasjonssirkelen) som et lineariseringsverktøy18. Avbøyningsfølsomheten (μm/V) angis som standard i interferometeret og brukes til å konvertere V til μm. Under denne prosedyren bestemmes også kalibreringsfaktoren, som stammer fra misforholdet i posisjon mellom den sfæriske spissen og fiberposisjonen der signalavlesningen oppstår (figur 3A). Ved å rykke inn på et stivt substratlignende glass, er avbøyningen målt av fiberen omtrent den samme som avstanden forskjøvet av piezoen, noe som betyr at innrykksdybden er omtrent null. Å ta forholdet gir kalibreringsfaktoren. Det er viktig at kalibreringen av instrumentet utføres korrekt, og at alle kontroller er oppfylt før man fortsetter å innhente F-z-data .

Når du konfigurerer en innrykksprofil, er det nyttig å huske på forutsetningene til Hertz-modellen, som senere vil bli brukt til å analysere dataene. Hertz-modellen er avledet under forutsetning av at prøven er en LEHI uendelig utvidet halvrom, noe som resulterer i følgende praktiske konsekvenser: i) påførte stammer bør ikke overstige 20% (som en tommelfingerregel bør δ ikke overstige 10% av spissens R) og ii) δ skal være mindre enn 10% av prøvetykkelsen, og liten sammenlignet med den andre prøvens dimensjoner13.

Maksimal forskyvning (eller innrykksdybde / kraft avhengig av driftsmodus) kan justeres avhengig av den resulterende δ, og om overflate- eller bulkmekaniske egenskaper er ønsket. Hvis prøven er rykket inn til en litt større δ, kan Hertz-modellen fortsatt monteres opp til en maksimal δ som ligger innenfor forutsetningene i NanoAnalysis-programvaren, og gjennomsnittlig ES brukes til å estimere dette området (se Representative resultater).

For cellenanoindentasjonseksperimenter er det utfordrende å utføre flere matriseskanninger på samme celle. Men hvis cellen er stor nok, kan det være mulig å finne et annet passende område og gjenta prosedyren på samme celle, for eksempel et eksperiment der brukeren ønsker å oppdage forskjeller i de mekaniske egenskapene til en bestemt region av cellen sammenlignet med en annen. Vanligvis utføres et kart per celle, og minst fem celler rykkes inn per biologisk tilstand. Det anbefales å gjenta eksperimentet minst tre ganger slik at tilstrekkelige data blir oppnådd på hver prøve (dvs. tre replikasjoner for hver biologisk tilstand).

Kritisk bør oppkjøpte kurver presentere en flat grunnlinje, et overgangsområde og et skrått område. Kurver som ikke presenterer en basislinje, kan ikke senere analyseres på grunn av usikkerhet om plasseringen av CP. Hvis kurvene avviker fra figuren vist i figur 4A, bør kontaktterskelen optimaliseres før du fortsetter med eksperimentet (se feilsøking av metoden nedenfor).

Det bør innhentes tilstrekkelige data for å sikre statistisk robuste resultater, gitt teknikkens art, som undersøker mekaniske egenskaper lokalt.

Data analyse

Programvaren beskrevet i denne protokollen er rutinemessig vedtatt for å analysere nanoindentation data, og det har blitt brukt til å oppnå resultater publisert i flere peer-reviewed tidsskrifter (f.eks nanoindentation av hydrogeler8,21, nanoindentation av celler24,42). Analyse av nanoindentasjonsdata er ikke-triviell. Det anbefales å være spesielt oppmerksom på følgende deler:

Screening av datasettet: Datasettet bør screenes grundig i NanoPrepare-programvaren, og alle mislykkede kurver bør fjernes før du lagrer det rensede datasettet som en JSON-fil. Kurver kan fortsatt utelates fra analysen i NanoAnalysis-programvaren, men JSON-filen kan ikke endres. Som sådan, for å sikre konsistens mellom det rensede og analyserte datasettet, foreslås det å nøye utføre screeningsprosessen i NanoPrepare-programvaren.

Filtrering av data: Bruk av filtre er nyttig når dataene bråker og anbefales når du utfører ES-analysen. Tre hovedfiltre brukes som beskrevet nedenfor.

Prominency: Dette filteret fjerner fremtredende topper i Fourier-rommet, for å eliminere instrumentelle svingninger som er typiske for kommersielt tilgjengelige ferrule-top nanoindenters. Filteret er basert på tre parametere: Prominency (a.u.): peak prominency i Fourier-rommet; Minimum frekvens (kanaler): minimumsfrekvensen som skal filtreres; Bånd (% av toppposisjon): bredden rundt den filtrerte frekvensen i prosent av toppposisjonen. Aktiver dette filteret for data som stammer fra kommersielt tilgjengelige ferrule-top nanoindenters ved å klikke på avmerkingsboksen og forlate standardparametere.

Savitzky Golay (SAVGOL), algoritme fra SciPy-biblioteket34 (scipy.signal.savgol_filter): Dette filteret jevner ut dataene basert på en lokal minste kvadraters polynomtilnærming. Aktiver dette filteret hvis dataene er spesielt støyende. Endre rekkefølgen på polynomet og filtervindulengden i GUI-en avhengig av hvor støyende dataene er. For flere detaljer, se referanse30,31. Aktiver dette filteret for ES-analysen.

Medianfilter, algoritme fra SciPy-biblioteket34 (scipy.signal.medfilt): Dette filteret jevner ut dataene basert på å erstatte hvert punkt med medianen beregnet rundt det punktet i et gitt vindu. Endre vinduslengden i GUI-en avhengig av hvor støyende dataene er. Dette filteret brukes som et alternativ til SAVGOL-filteret.

Aktivering av prominensfilteret bidrar til å fjerne instrumentell støy (lavfrekvente svingninger) som er typiske for kommersielle ferrule-top nanoindenters. Generelt er det ikke nødvendig å aktivere andre filtre som SAVGOL34 når du utfører den enkle Hertz-analysen. Ved beregning av ES, anbefales det å aktivere både prominensfilteret og SAVGOL-filteret34, med et utjevningsvindu avhengig av støynivået i dataene. Dette skyldes at ES inneholder et derivatbegrep (ligning 2), som er svært følsomt for støy. For eksempel ble resultatene i figur 7 oppnådd ved bruk av prominensfilteret sammen med et SAVGOL-filter34 med vindu 80 nm og polynomrekkefølge 3. Det er imidlertid viktig å ikke jevne ut dataene for mye, fordi dette kan skjule eventuelle forskjeller som er til stede mellom datasett.

CP-identifikasjon: Den viktigste delen av analysen er identifiseringen av CP, som sterkt påvirker både absoluttverdien av E og dens fordeling32,33. Fire algoritmer basert på automatiske søkeprosedyrer som lokaliserer CP for å fjerne menneskelig skjevhet, er implementert i NanoAnalysis-programvaren. Alle algoritmer er dokumentert i litteraturen32,33. Generelt testes hvert punkt i en region av interesse som en prøve-CP mens en algoritmespesifikk parameter beregnes. Punktet som returnerer den optimaliserte parameteren, som kan være maksimums- eller minimumsverdien avhengig av algoritmen, tas som CP32. Disse prosedyrene er implementert for å fjerne menneskelig skjevhet og ta en statistisk tilnærming til problemet. Fordi hver algoritme beregner CP basert på optimalisering av en gitt parameter, vil den identifiserte CP være litt forskjellig for hver algoritme. Som sådan er det viktig å opprettholde den samme CP-algoritmen og spesifikke parametere (f.eks. Vinduslengde for RoV-algoritmen) mellom datasett som man ønsker å sammenligne, da relative forskjeller i E vil bli bevart. De forskjellige CP-algoritmene og deres parametere er oppsummert nedenfor.

Goodness of Fit (GoF): En tilnærming basert på å montere en kontaktmekanikkmodell (Hertz) fra hvert (z, F) par i et interesseområde og velge passformen med høyest R2-verdi . Det fungerer bra der overgangen mellom ikke-kontakt og kontakt er tydelig, noe som skjer med stive materialer som høyt tverrbundne hydrogeler. Algoritmen er beregningsmessig dyr, og generelt den tregeste. Her er det implementert slik at Hertz-modellen bare er montert opp til maksimalt δ på ca. 10% av R, da dette har vist seg å gi mer nøyaktige resultater32.

Forholdet mellom varians (RoV): En tilnærming basert på beregning av forholdet mellom variansen til avbøyningssignalet (kraftsignalet) i ikke-kontakt- og kontaktområdet32.

Andre derivat: En tilnærming basert på det andre derivatet av avbøyningssignalet (kraftsignalet)33. Det fungerer bra når signalet er rent. Hvis signalet er for støyende, anbefales ikke denne tilnærmingen.

Terskel: En tilnærming basert på gjennomsnittlig avbøyning (kraft) i ikke-kontaktområdet33. Kort sagt, fra en kraftverdi valgt av brukeren nær kontaktområdet, itererer algoritmen gjennom hvert punkt mot grunnlinjen, til den finner det første punktet hvis kraftverdi er større enn gjennomsnittet av grunnlinjen. Dette punktet er valgt som CP. Denne algoritmen er veldig robust og anbefales å bruke.

Detaljer om hvordan du bruker hver algoritme er gitt nedenfor. CP-algoritmene involverer numeriske konstanter som må endres i GUI for å passe til det spesifikke datasettet. Spesielt er følgende parametere felles for GoF, RoV og Second Derivative metoden, slik at du kan velge en underregion av kurvene (interesseområde eller avkastning) der CP vil bli søkt etter:

Sikker terskel (nN): Den definerer den maksimale kraften i nN (og det tilsvarende z-punktet ) som CP skal søkes fra. Dette er den høyre grensen for avkastningen, hvis standardverdi er 10 nN. Alle kurver hvis maksimale kraft er under denne terskelen, flyttes automatisk til det mislykkede settet. Endre denne verdien til en kraftverdi litt over overgangen fra ikke-kontakt til kontakt.

X-område (nm): Den definerer området i nm fra z-punktet som tilsvarer den sikre terskelen. Dette er den venstre grensen for avkastningen. Standardverdien på 1000 nm er et godt utgangspunkt, men hvis CP blir funnet for sent i kurven (dvs. i det skrånende området), øker du denne verdien. Omvendt, hvis CP blir funnet for tidlig (dvs. i grunnlinjen), reduser du denne verdien.

Parametere som er spesifikke for hver algoritme er oppsummert her. For GoF representerer Window Fit (nm) vinduet i nm fra CP-prøven som Hertz-modellen er montert på. Dette er begrenset til en verdi av 10% av R. For RoV representerer Window RoV (nm) vinduet i nm til venstre og høyre for rettssaken CP som variansen av avbøyningssignalet (kraftsignalet) beregnes over. For det andre derivatet representerer vinduet P (nm) vinduet som sendes til SAVGOL-filteret34 som brukes til å beregne det andre derivatet av avbøyningssignalet (kraft). Standardverdier er satt fra testing av de forskjellige algoritmene, og det er vanligvis ikke nødvendig å endre dem.

For terskelalgoritmen kan følgende parametere endres:

Juster terskel (nN): Kraften (F0) som CP vil bli sett etter fra dette punktet og beveger seg mot grunnlinjen. Alle kurver hvis maksimale kraft er under denne terskelen, blir automatisk flyttet til det mislykkede settet. Standardverdien er 10 nN. Du kan imidlertid endre denne verdien til en kraftverdi litt over overgangen fra ikke-kontakt til kontakt. Det tilsvarende z-punktet (z0) lagres for senere bruk i algoritmen (se nedenfor).

Juster venstre trinn (nm): Denne parameteren definerer skiftet for å legge til venstre for z 0 (standardverdien 2 000 nm), noe som resulterer i beregningen av et punkt definert av (z 0 - juster venstre trinn). Dette punktet er punktet rundt hvilket gjennomsnittet av grunnlinjen vil bli beregnet (se nedenfor).

Gjennomsnittlig areal (nm): Denne parameteren definerer det gjennomsnittlige området til venstre og høyre for (z0 - juster venstre trinn), som gjennomsnittet av grunnlinjen beregnes over. Standardverdien er 100 nm, og det er ikke nødvendig å endre den.

Iter ned fra F0, blir CP tatt som det første punktet hvis verdi er over kraften definert av gjennomsnittet av grunnlinjen.

Merknad om ES og støy: Den gjennomsnittlige ES kan virke støyende i begynnelsen med fremtredende sinusformede svingninger, og som et resultat kan det hende at ligningen (3) ikke passer riktig. Hvis dette er tilfelle, løser du vanligvis dette problemet ved å øke vinduet til det utjevnende SAVGOL-filteret34 .

Modifikasjoner og feilsøking av metoden

Feilsøking av metoden

Feilsøking av bølgelengdeskanning
Hvis det vises en feilmelding på interferometerets display etter at bølgelengdeskanningen er utført, kan følgende problemer være årsaken: i) Miljøet kan være forurenset av støy. Bli kvitt støykilder, inkludert luftstrøm, høye lyder og mekaniske vibrasjoner; ii) Sonden er kanskje ikke riktig tilkoblet. Koble fra og koble til den grønne optiske fiberkontakten på nytt; iii) Utkragingen kan være skitten. Rengjør den ved å senke sonden i en petriskål som inneholder isopropanol i noen minutter, og deretter vann; iv) En luftboble kan være tilstede på cantilever. Senk sonden i en petriskål som inneholder isopropanol og skap litt flyt ved å pipettere væsken opp og ned; v) Utkragingen kan bøyes/festes til fiberen, som kan ses under mikroskopet. Slipp den ved å berøre cantilever forsiktig med en vevsserviett. Vær ekstra forsiktig når du berører utkrageren, da bruk av overdreven kraft kan bryte den; vi) Utkrageren mangler i sonden, som kan ses under mikroskopet. Den eneste løsningen er å bruke en ny sonde. Prøv bølgelengdeskanningen på nytt, som nå skal lykkes.

Feilsøking for kalibrering
Hvis kalibreringen mislykkes og den nye faktoren enten er NaN eller ikke er i det forventede området, kan følgende problemer være årsaken: i) Spissen er ikke helt i kontakt med underlaget. Forsikre deg om at spissen er i kontakt med underlaget ved å følge trinnene gitt i protokollen; ii) Attraktive krefter mellom spissen og glassoverflaten (snap-on-oppførsel) resulterer i kalibrering av den overbøyde utkrageren. Rengjør sonden ved å senke den i isopropanol i 5 minutter, og deretter vann. Rengjør parabolen med isopropanol; iii) Spissen / parabolen kan være forurenset: Rengjør sonden ved å senke den i isopropanol i 5 minutter, og deretter vann. Rengjør parabolen med isopropanol; iv) Utkragingen kan bøyes/festes til fiberen. Slipp den ved å berøre den forsiktig med en vevsserviett. Gjenta både bølgelengdeskanning og kalibrering etter feilsøking.

Kontakt feilsøking
Hvis kurvene avviker fra formen vist i figur 4A, må eksperimentelle parametere justeres før eksperimentet fortsetter. To av de vanligste problemene er:

En innflygingskurve der spissen aldri kommer i kontakt med utvalget (figur 4B). Dette skjer når kontaktterskelen er satt til en for lav verdi, og støy får utkrageren til å bøye seg med en mengde som tilsvarer den gitte terskelen. For å løse dette problemet, naviger til Alternativer-menyen og øk terskelen sakte i trinn på 0,01 og utfør et innrykk til kurven ligner den som er vist i figur 4A. Å redusere hastigheten i samme meny kan også bidra til å løse dette problemet.

En innflygingskurve der spissen startet i kontakt med utvalget (figur 4C). Dette skjer når kontaktterskelen er satt til en verdi som er for høy, og utkrageren ikke bøyer seg med mengden som tilsvarer den gitte terskelen når den først berører prøven. For å løse dette problemet, senk terskelen sakte i Alternativer-menyen i trinn på 0,01 og utfør et innrykk til kurven ligner den som vises i figur 4A. Dette problemet er spesielt problematisk fordi fraværet av en grunnlinje forhindrer riktig beregning av CP, noe som til slutt fører til en feilberegning av E.

Modifikasjoner av metoden
Protokollen kan utvides til å kvantifisere E av forskjellige typer hydrogeler. PAAm-hydrogeler ble valgt for denne protokollen, da de er de vanligste hydrogelene som brukes innen mekanobiologi. Protokollen er imidlertid like anvendelig for alle typer elastisk hydrogel25, både syntetisk, for eksempel polyetylenglykol (PEG)43 og gelatinmetakryl (GelMA)44,45; og naturlig, for eksempel kollagen46. Videre er det ingen begrensninger på dimensjonene til prøven som skal testes, innenfor rimelige grenser. For eksempel har denne protokollen blitt brukt til å kvantifisere E av syntetiske PEG-hydrogeler som senere ble testet ved hjelp av et bulkreometer og måtte være ~ 15 mm i diameter og ~ 2 mm i tykkelse8. Protokollen er også implementert for å karakterisere E av PDMS-membraner som ble polymerisert i en petriskål (resultater ikke publisert).

Foruten standard innrykk av enkeltceller utført ved hjelp av et konvensjonelt invertert fasekontrastmikroskop, er ferrule-top nanoindenters kompatible med komplekse bildesystemer og har blitt brukt til å undersøke de lokale elastisitets subcellulære strukturer, som cellens kjerne og cytoplasma47. Mens trinnene må justeres avhengig av det spesifikke optiske systemet, er denne protokollen av generell anvendelighet med hensyn til å utføre nanoindentasjonseksperimenter og analysere de resulterende dataene.

Videre er protokollen ikke begrenset til å måle de mekaniske egenskapene til celler og hydrogeler og kan tilpasses for å måle de lokale elastiske egenskapene til mer komplekse systemer, inkludert organoider48, sfæroider49 og hele vev som nyrer, lever, milt og livmor23. Leseren henvises til referanser 23,48,49 for spesifisiteter ved utførelse av nanoindentasjonseksperimenter på slike prøver. Et aspekt å vurdere er at forskyvningskontroll fungerer i åpen sløyfe-modus og ikke mottar tilbakemelding fra prøven. Dermed sikres ikke konstant belastning/belastning og hastighet, og mykere deler av prøven vil rykkes inn mer og raskere sammenlignet med stivere områder. Dette er relevant for mekanisk heterogene prøver som vev, hvor det er mer hensiktsmessig å velge enten innrykkskontroll (I-modus) eller lastkontroll (P-modus), noe som sikrer en konsistent belastning / belastning og hastighet over mekanisk heterogene områder av prøven.

Begrensninger av metoden
Det er en økende mengde bevis på at viskoelastisitet, i tillegg til elastisitet, spiller en viktig rolle i regulering av fysiologisk og patologisk relevante prosesser. Dette skyldes at celler, ECM og vev er viskoelastiske, og elastisitet representerer bare en komponent av deres mekaniske oppførsel50,51,52,53. Mens ferrule-top nanoindenters gir funksjonalitet for å karakterisere viskoelastisitet, inkludert stressavslapping, krypoverensstemmelse og dynamisk mekanisk analyse for å trekke ut både lagrings- og tapsmodulen over forskjellige frekvensregimer, fokuserer denne protokollen bare på elastisitet, som fortsatt er den mest studerte mekaniske variabelen i sammenheng med mekanobiologi og vevsteknikk (for eksempel, se referanse3).

Den underliggende antagelsen med konsekvenser for både eksperimenter og dataanalyse er at det innrykkede substratet oppfører seg som et LEHI-fast stoff. Dette betyr at spenningsbelastningsresponsen er lineær, det er ingen tidsavhengig oppførsel, og prøven er mekanisk homogen og isotropisk. Basert på disse antagelsene kvantifiseres substratets mekaniske egenskaper gjennom Youngs modul etter en spesifikk kontaktmekanikkmodell, i dette tilfellet Hertz-modellen (ligning 1). For små kvasistatiske krefter/deformasjoner oppfører kjemisk tverrbundne hydrogeler som PAAm-geler brukt i denne protokollen35 seg nesten som elastiske faste stoffer og viskoelastiske effekter er minimale og ubetydelige53. På den annen side er celler ikke LEHI faste stoffer og viser kompleks mekanisk oppførsel9. Youngs modul av celler er svært avhengig av belastningshastigheten (dvs. hastigheten) av innrykksprosedyren, men ingen klar trend er etablert, og tilleggsvariabler som spissstørrelse og maksimal innrykksdybde påvirker dette forholdet9. Likevel, for kvasi-statiske deformasjoner, som de som brukes i denne protokollen (v = 5 μm / s), viser celler en markert elastisk respons og dissipative effekter er minimale9. Stammefrekvensavhengighet kan fanges opp av mer komplekse modeller som tar hensyn til tidsavhengige variabler, som leseren henvises til54.

Videre, etter den samme underliggende antagelsen, er Poissons forhold (ν) tatt som 0,5 både i Hertz- og ES-analysen. Når man sammenligner mellom prøver, påvirker dette bare resultatene som en koeffisient; Imidlertid har ν vist seg å være en frekvensavhengig mengde for celler55 og å avvike fra 0,5 for hydrogeler56.

En annen begrensning av protokollen ligger i det faktum at programvaren ikke gir kvantifisering av E gjennom mer sofistikerte kontaktmekanikkmodeller. Hertz-modellen er den mest brukte kontaktmekanikkmodellen i AFM-eksperimenter, og den er ekstremt effektiv13,15; Det tar imidlertid ikke hensyn til mer komplekse hendelser som kort- eller langdistanse attraktive krefter mellom spissen og prøven. Mer komplekse modeller som Johnson-Kendall-Roberts-modellen kan fange opp disse atferdene13, men er ikke implementert i programvaren. For en oversikt over ulike kontaktmekanikkmodeller som varierer i kompleksitet, henvises leseren til referanse13.

Metodens betydning i forhold til eksisterende/alternative metoder
Den vanligste tilnærmingen for å kvantifisere de lokale elastiske egenskapene til biomaterialer og enkeltceller i mikroskala er AFM13,14,15,16. Til tross for at det er et kraftig og allsidig instrument, krever AFM omfattende opplæring på grunn av det komplekse oppsettet før brukerne kan utføre eksperimenter robust. Ferrule-top nanoindenters tilbyr en plug-and-play-løsning, samtidig som den tillater å bruke nN-krefter med μm-oppløsning for å undersøke de lokale mekaniske egenskapene til biomaterialer (f.eks. Referanser 8,19,20,21). Mens standardiserte protokoller eksisterer for bruk av AFM i sammenheng med mekanobiologi16 og vevsteknikk14, er det ingen protokoller som beskriver driften av ferrule-top nanoindenter-enheter. Denne protokollen tillater en uerfaren bruker å utføre nanoindentasjonseksperimenter på både hydrogeler og celler, ved å følge retningslinjer som er ment å standardisere den eksperimentelle arbeidsflyten i samfunnet. Videre er dataanalyse av nanoindentasjonseksperimenter ikke-trivielle og vil forbli stort sett utilgjengelige for brukere uten erfaring med programmering. Det gis instruksjoner for bruk av intuitiv programvare som gjør det mulig å rengjøre og lagre det oppkjøpte datasettet i lys- og standardformat og utføre både standard Hertz-analyse og ES-analyse24 med noen få klikk og på en reproduserbar måte.

Ved å følge denne protokollen oppnås resultater som er sammenlignbare med de som er oppnådd ved bruk av AFM, både for hydrogelers E (resultater i figur 6 sammenlignet med de i referanse35) og cellenes mekaniske egenskaper (resultater i figur 7 sammenlignet med de i referanse24) ved en brøkdel av kompleksiteten. Metoden er av generell anvendbarhet og kan tilpasses ulike typer nanoindenters gitt noen trinn er endret basert på den spesifikke enheten.

Metodens betydning og mulige anvendelser innenfor spesifikke forskningsområder
Karakterisering av de elastiske egenskapene til celler, hydrogeler og vev er standard praksis i mange forskningslaboratorier med fokus på mekanobiologi, vevsteknikk / regenerativ medisin og utover3. Denne protokollen kan brukes til å kvantifisere de elastiske egenskapene til enkeltceller, hydrogeler og tilpasset vev og mer komplekse biomaterialer i sammenheng med fysiologisk relevante prosesser preget av endring i mekaniske egenskaper. For eksempel, for å etterligne dynamikken til den opprinnelige ECM, har det vist seg at nedbrytbare 3D PEG-lamininhydrogeler tillater celler å omforme omgivelsene, noe som fører til en reduksjon i gelenes E på ~ 50% over en periode på 9 dager sammenlignet med de samme gelene uten celler21. Protokollen er av generell anvendbarhet og er ikke begrenset til prøvene og det optiske oppsettet som er beskrevet her. Det er tenkt at denne protokollen vil lette bruken av nanoindenters i forskningslaboratorier med fokus på studier av mekaniske egenskaper i fysiologi og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

GC og MAGO anerkjenner alle medlemmer av CeMi. MSS anerkjenner støtte via et EPSRC-programstipend (EP/P001114/1).

GC: programvare (bidrag til programvareutvikling og algoritmer), formell analyse (analyse av nanoindentasjonsdata), validering, undersøkelse (nanoindentasjonseksperimenter på polyakrylamidgeler), datakurering, skriving (originalutkast, gjennomgang og redigering), visualisering (figurer og grafer). MAGO: undersøkelse (fremstilling av geler og celleprøver, nanoindentasjonseksperimenter på celler), skriving (originalutkast, gjennomgang og redigering), visualisering (figurer og grafer). NA: validering, skriving (gjennomgang og redigering). IL: programvare (bidrag til programvareutvikling og algoritmer), validering, skriving (gjennomgang og redigering); MV: konseptualisering, programvare (design og utvikling av original programvare og algoritmer), validering, ressurser, skriving (originalt utkast, gjennomgang og redigering), tilsyn, prosjektadministrasjon, finansieringsanskaffelse MSS: ressurser, skriving (gjennomgang og redigering), tilsyn, prosjektadministrasjon, finansieringsoppkjøp. Alle forfatterne leste og godkjente det endelige manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm coverslips VWR 631-1577P
35 mm cell treated culture dishes Greiner CELLSTAR 627160
Acrylamide Sigma-Aldrich A4058
Acrylsilane Alfa Aesar L16400
Ammonium Persulfate Merk 7727-54-0
Bisacrylamide Merk 110-26-9
Chiaro nanoindenter Optics 11 Life  no catologue number
Ethanol general
Fetal bovine serum Gibco 16140071
High glucose DMEM Gibco 11995065
Isopropanol general
Kimwipe Kimberly Clark 21905-026
Microscope glass slides VWR 631-1550P
MilliQ system Merk Millipore ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer Optics11 Life no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um) Optics 11 Life no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um) Optics 11 Life no catologue number
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
RainX rain repellent RainX 26012
Standard petri dishes (90 mm) Thermo Scientific 101RTIRR
Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich 110-18-9
Vaccum dessicator Thermo Scientific 531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1) Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional) Microsoft
Python 3 Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional) Microsoft

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P. Y. W. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), New York, N.Y. 1139-1143 (2005).
  2. Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying forces in cell biology. Nature Cell Biology. 19 (7), 742-751 (2017).
  3. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature. Reviews. Materials. 5, 351-370 (2020).
  4. Moeendarbary, E., Harris, A. R. Cell mechanics: Principles, practices, and prospects. Wiley Interdisciplinary. Reviews. Systems. Biology and Medicine. 6 (5), 371-388 (2014).
  5. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: Forcing tumour progression. Nature Reviews Cancer. 9 (2), 108-122 (2009).
  6. Kubánková, M., et al. Physical phenotype of blood cells is altered in COVID-19. Biophysical Journal. 120 (14), 2838-2847 (2021).
  7. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  8. Ciccone, G., et al. What caging force cells feel in 3D hydrogels: A rheological perspective. Advanced Healthcare Materials. 9 (17), 2000517 (2020).
  9. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  10. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation versus tensile measurements of young's modulus for soft biological tissues. Tissue Engineering B Reviews. 17 (3), 155-164 (2011).
  11. Humphrey, J. D., Delange, S. L. An Introduction to Biomechanics Solids and Fluids, Analysis and Design. , Springer-Verlag. New York. 271-371 (2004).
  12. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nature Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  13. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1, 41-57 (2019).
  14. Norman, M. D. A., Ferreira, S. A., Jowett, G. M., Bozec, L., Gentleman, E. Measuring the elastic modulus of soft culture surfaces and three-dimensional hydrogels using atomic force microscopy. Nature Protocols. 16 (5), 2418-2449 (2021).
  15. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  16. Whitehead, A. J., Kirkland, N. J., Engler, A. J. Atomic force microscopy for live-cell and hydrogel measurement. Methods in Molecular Biology. 2299, Clifton, N.J. 217-226 (2021).
  17. Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: An optomechanical fiber sensor for nanoindentation. The Review of Scientific Instruments. 83 (11), 115110 (2012).
  18. Van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink Ac, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12 (12), 3066-3073 (2016).
  19. Baldini, F., et al. Biomechanics of cultured hepatic cells during different steatogenic hits. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 97, 296-305 (2019).
  20. Emig, R., et al. Piezo1 channels contribute to the regulation of human atrial fibroblast mechanical properties and matrix stiffness sensing. Cells. 10 (3), 663 (2021).
  21. Dobre, O., et al. A hydrogel platform that incorporates laminin isoforms for efficient presentation of growth factors - Neural growth and osteogenesis. Advanced Functional Materials. 31 (21), 2010225 (2021).
  22. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Scientific Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  23. Wu, G., Gotthardt, M., Gollasch, M. Assessment of nanoindentation in stiffness measurement of soft biomaterials: kidney, liver, spleen and uterus. Scientific Reports. 10 (1), 18784 (2020).
  24. Lüchtefeld, I., et al. Elasticity spectra as a tool to investigate actin cortex mechanics. Journal of Nanobiotechnology. 18 (1), 147 (2020).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Blumlein, A., Williams, N., McManus, J. J. The mechanical properties of individual cell spheroids. Scientific Reports. 7 (1), 7346 (2017).
  27. Mirsandi, H., et al. Influence of wetting conditions on bubble formation from a submerged orifice. Experiments in Fluids. 61, 83 (2020).
  28. Vassalli, M., Ciccone, G. CellMechLab/NanoPrepare: v0.1.1. Zendo. , (2021).
  29. Vassalli, M., Ciccone, G., Lüchtefeld, I. CellMechLab/nanoindentation: v1.0.0. Zendo. , (2021).
  30. Savitzky, A., Golay, M. J. E. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Analytical Chemistry. 36 (8), 1627-1639 (1964).
  31. Schafer, R. W. What is a savitzky-golay filter. IEEE Signal Processing Magazine. 28 (4), 111-117 (2011).
  32. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267 (2016).
  33. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis-I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  34. Virtanen, P., et al. SciPy 1.0: fundamental algorithms for scientific computing in Python. Nature Methods. 17 (3), 261-272 (2020).
  35. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10 (2010).
  36. Pharr, G. M., Oliver, W. C., Brotzen, F. R. On the generality of the relationship among contact stiffness, contact area, and elastic modulus during indentation. Journal of Materials Research. 7 (3), 613-617 (1992).
  37. Kumar, R., Saha, S., Sinha, B. Cell spread area and traction forces determine myosin-II-based cortex thickness regulation. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866 (12), 118516 (2019).
  38. Kunda, P., Pelling, A. E., Liu, T., Baum, B. Moesin controls cortical rigidity, cell rounding, and spindle morphogenesis during mitosis. Current Biology: CB. 18 (2), 91-101 (2008).
  39. Allen, M., Poggiali, D., Whitaker, K., Marshall, T. R., Kievit, R. A. Raincloud plots: a multi-platform tool for robust data visualization. Wellcome Open Research. 4, 63 (2019).
  40. Clark, A. G., Paluch, E. Mechanics and regulation of cell shape during the cell cycle. Results and Problems in Cell Differentiation. 53, 31-73 (2011).
  41. Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. Synchronization of mammalian cell cultures by serum deprivation. Methods in Molecular Biology. 1524, Clifton, N.J. 97-105 (2017).
  42. Hodgkinson, T., et al. The use of nanovibration to discover specific and potent bioactive metabolites that stimulate osteogenic differentiation in mesenchymal stem cells. Science Advances. 7 (9), 7921 (2021).
  43. Kloxin, A. M., Kloxin, C. J., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 22 (31), 3484-3494 (2010).
  44. Loessner, D., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
  45. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  46. Sarrigiannidis, S. O., et al. A tough act to follow: collagen hydrogel modifications to improve mechanical and growth factor loading capabilities. Materials Today. Bio. 10, 100098 (2021).
  47. Karoutas, A., et al. The NSL complex maintains nuclear architecture stability via lamin A/C acetylation. Nature Cell Biology. 21 (10), 1248-1260 (2019).
  48. Ryu, H., et al. Transparent, compliant 3D mesostructures for precise evaluation of mechanical characteristics of organoids. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla). 33 (25), 2100026 (2021).
  49. Carvalho, D. T. O., Feijão, T., Neves, M. I., Da Silva, R. M. P., Barrias, C. C. Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs Biofabrication Directed self-assembly of spheroids into modular vascular beds for engineering large tissue constructs. Biofabrication. 13 (3), 035008 (2021).
  50. Chaudhuri, O., Cooper-White, J., Janmey, P. A., Mooney, D. J., Shenoy, V. B. Effects of extracellular matrix viscoelasticity on cellular behaviour. Nature. 584 (7822), 535-546 (2020).
  51. Cantini, M., Donnelly, H., Dalby, M. J., Salmeron-Sanchez, M. The plot thickens: The emerging role of matrix viscosity in cell mechanotransduction. Advanced Healthcare Materials. 9 (8), 1901259 (2020).
  52. Elosegui-Artola, A. The extracellular matrix viscoelasticity as a regulator of cell and tissue dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 72, 10-18 (2021).
  53. Chaudhuri, O. Viscoelastic hydrogels for 3D cell culture. Biomaterials Science. 5 (8), 1480-1490 (2017).
  54. Nguyen, T. D., Gu, Y. Determination of strain-rate-dependent mechanical behavior of living and fixed osteocytes and chondrocytes using atomic force microscopy and inverse finite element analysis. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (10), 101004 (2014).
  55. Mokbel, M., Hosseini, K., Aland, S., Fischer-Friedrich, E. The Poisson Ratio of the Cellular Actin Cortex Is Frequency Dependent. Biophysical Journal. 118 (8), 1968-1976 (2020).
  56. Javanmardi, Y., Colin-York, H., Szita, N., Fritzsche, M., Moeendarbary, E. Quantifying cell-generated forces: Poisson's ratio matters. Communications Physics. 4, 237 (2021).

Tags

Bioteknologi utgave 179 nanoindentasjon mekaniske egenskaper mekanobiologi cellemekanikk elastisitet hydrogeler myk materie dataanalyse
Eksperimentell og dataanalyse Arbeidsflyt for Soft Matter Nanoindentation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciccone, G., Azevedo Gonzalez Oliva, … More

Ciccone, G., Azevedo Gonzalez Oliva, M., Antonovaite, N., Lüchtefeld, I., Salmeron-Sanchez, M., Vassalli, M. Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation. J. Vis. Exp. (179), e63401, doi:10.3791/63401 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter