सॉफ्ट मैटर नैनोइंडेंटेशन के लिए प्रायोगिक और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो

Summary

प्रोटोकॉल हाइड्रोगेल और कोशिकाओं सहित नरम सामग्री नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए एक पूर्ण वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, बल स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक कदम विस्तृत हैं; फिर, इस तरह के डेटा का विश्लेषण एक नए विकसित ओपन-सोर्स पायथन सॉफ्टवेयर के माध्यम से विस्तृत है, जो गिटहब से डाउनलोड करने के लिए स्वतंत्र है।

Abstract

नैनोइंडेंटेशन प्रयोगात्मक तकनीकों के एक वर्ग को संदर्भित करता है जहां नरम बायोमैटेरियल्स और कोशिकाओं के स्थानीय यांत्रिक गुणों को निर्धारित करने के लिए एक माइक्रोमेट्रिक बल जांच का उपयोग किया जाता है। इस दृष्टिकोण ने मेकेनोबायोलॉजी, बायोमैटेरियल्स डिजाइन और ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में एक केंद्रीय भूमिका प्राप्त की है, ताकि एकल कोशिकाओं के आकार के बराबर संकल्प के साथ नरम सामग्री का उचित यांत्रिक लक्षण वर्णन प्राप्त किया जा सके। इस तरह के प्रयोगात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे लोकप्रिय रणनीति एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप (एएफएम) को नियोजित करना है; जबकि यह उपकरण बल (पीएन से नीचे) और अंतरिक्ष (उप-एनएम) में एक अभूतपूर्व संकल्प प्रदान करता है, इसकी प्रयोज्यता अक्सर इसकी जटिलता से सीमित होती है जो यांत्रिक गुणों के अभिन्न संकेतकों के नियमित माप को रोकती है, जैसे कि यंग का मापांक (ई)। नैनोइंडेंटर्स की एक नई पीढ़ी, जैसे ऑप्टिकल फाइबर सेंसिंग तकनीक पर आधारित, ने हाल ही में एकीकरण में आसानी के लिए लोकप्रियता हासिल की है, जबकि एसएम स्थानिक संकल्प के साथ उप-एनएन बलों को लागू करने की अनुमति दी है, इसलिए हाइड्रोगेल और कोशिकाओं के स्थानीय यांत्रिक गुणों की जांच के लिए उपयुक्त है।

इस प्रोटोकॉल में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फेरूल-टॉप ऑप्टिकल फाइबर सेंसिंग नैनोइंडेंटर का उपयोग करके हाइड्रोगेल और कोशिकाओं पर नैनोइंडेंटेशन डेटा प्राप्त करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विवरण देने वाली एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रस्तुत की गई है। जबकि कुछ कदम यहां उपयोग किए जाने वाले उपकरण के लिए विशिष्ट हैं, प्रस्तावित प्रोटोकॉल को अन्य नैनोइंडेंटेशन उपकरणों के लिए एक गाइड के रूप में लिया जा सकता है, कुछ चरणों को निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार अनुकूलित किया जाता है। इसके अलावा, नैनोइंडेंटेशन डेटा के विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल यूजर इंटरफेस से लैस एक नया ओपन-सोर्स पायथन सॉफ्टवेयर प्रस्तुत किया गया है, जो गलत तरीके से अधिग्रहित वक्रों की स्क्रीनिंग, डेटा फ़िल्टरिंग, विभिन्न संख्यात्मक प्रक्रियाओं के माध्यम से संपर्क बिंदु की गणना, ई की पारंपरिक गणना, साथ ही एकल-सेल नैनोइंडेंटेशन डेटा के लिए विशेष रूप से अनुकूल अधिक उन्नत विश्लेषण की अनुमति देता है।

Introduction

जीव विज्ञान में यांत्रिकी की मौलिक भूमिका आजकल ^1,2 स्थापित है। पूरे ऊतकों से एकल कोशिकाओं तक, यांत्रिक गुण जांच ^3,4 के तहत बायोमटेरियल की पैथोफिजियोलॉजिकल स्थिति के बारे में सूचित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, कैंसर से प्रभावित स्तन ऊतक स्वस्थ ऊतक की तुलना में कठोर होता है, एक अवधारणा जो लोकप्रिय धड़कन परीक्षण⁵ का आधार है। विशेष रूप से, हाल ही में यह दिखाया गया है कि गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) के कारण होने वाली कोरोनावायरस बीमारी 2019 (सीओवी-19) को रक्त कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन द्वारा रेखांकित किया गया है, जिसमें सार्स-सीओवी-2-भोले व्यक्तियों से रक्त कोशिकाओं की तुलना में एरिथ्रोसाइट विकृति में कमी और लिम्फोसाइट और न्यूट्रोफिल कठोरता में कमी^{शामिल} है।

सामान्य तौर पर, कोशिकाओं और ऊतकों के यांत्रिकी स्वाभाविक रूप से परस्पर जुड़े होते हैं: प्रत्येक ऊतक में विशिष्ट यांत्रिक गुण होते हैं जो एक साथ घटक कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ⁵ को प्रभावित करते हैं और उन पर निर्भर करते हैं। इस वजह से, जीव विज्ञान में यांत्रिकी का अध्ययन करने की रणनीतियों में अक्सर उन उत्तेजनाओं के जवाब में सेल व्यवहार को स्पष्ट करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक यांत्रिक उत्तेजनाओं के साथ इंजीनियरिंग सब्सट्रेट शामिल होते हैं। उदाहरण के लिए, एंगलर और सहयोगियों द्वारा मौलिक कार्य ने प्रदर्शित किया कि मेसेनकाइमल स्टेम सेल लिनेज प्रतिबद्धता मैट्रिक्स लोच द्वारा नियंत्रित होती है, जैसा कि नरम और कठोर दो-आयामी पॉलीक्रिलामाइड (पीएएएम) हाइड्रोगेल 7 पर अध्ययन किया^गया है।

जांच के तहत बायोमटेरियल को यांत्रिक रूप से चिह्नित करने के लिए कई रणनीतियां मौजूद हैं, स्थानिक पैमाने (यानी, स्थानीय से थोक) और विरूपण के मोड (जैसे, अक्षीय बनाम कतरनी) में भिन्न होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अलग-अलग जानकारी मिलती है, जिसके लिए सावधानीपूर्वक व्याख्या की आवश्यकता होती है 3,8,9,10। नरम बायोमैटेरियल्स के यांत्रिकी को आमतौर पर कठोरता के संदर्भ में व्यक्त किया जाता है। हालांकि, कठोरता भौतिक गुणों और ज्यामिति दोनों पर निर्भर करती है, जबकि लोचदार मोडुलिन एक सामग्री के मौलिक गुण हैं और सामग्री की ज्यामिति¹¹ से स्वतंत्र हैं। जैसे, विभिन्न लोचदार मोडुलिन किसी दिए गए नमूने की कठोरता से संबंधित हैं, और प्रत्येक लोचदार मापांक में विभिन्न सीमा स्थितियों (जैसे, मुक्त विस्तार बनाम कारावास) के तहत विरूपण के एक विशिष्ट मोड (जैसे, अक्षीय बनाम कतरनी) के लिए सामग्री के प्रतिरोध को शामिल किया ^गया है। नैनोइंडेंटेशन प्रयोग ई के माध्यम से यांत्रिक गुणों की मात्रा का परिमाणीकरण करने की अनुमति देते हैं जो एकअक्षीय विरूपण (इंडेंटेशन) से जुड़ा होता है जब बायोमटेरियल पार्श्व रूप से ^10,11,12 तक सीमित नहीं होता है।

माइक्रोस्केल पर जैविक प्रणालियों के ई को मापने का सबसे लोकप्रिय तरीका एएफएम 13,14,15,16 है। एएफएम एक अत्यंत शक्तिशाली उपकरण है जिसमें पीएन स्तर तक बल संकल्प और उप-एनएम पैमाने तक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन होता है। इसके अलावा, एएफएम पूरक ऑप्टिकल और यांत्रिक उपकरणों के साथ युग्मन के मामले में अत्यधिक लचीलापन प्रदान करता है, जांच के तहत बायोमटेरियल से जानकारी का खजाना निकालने के लिए अपनी क्षमताओं का विस्तार करता^है। हालांकि, उन आकर्षक विशेषताओं को प्रयोगात्मक सेट-अप की जटिलता द्वारा प्रतिनिधित्व किए गए एक बाधा-से-प्रवेश के साथ आते हैं। एएफएम को उपयोगकर्ताओं को मजबूत डेटा प्राप्त करने से पहले व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, और जैविक सामग्री के रोजमर्रा के यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए इसका उपयोग अक्सर अनुचित होता है, खासकर जब इसके अद्वितीय बल और स्थानिक संकल्पों की आवश्यकता नहीं होती है।

इस वजह से, नैनोइंडेंटर्स के एक नए वर्ग ने हाल ही में उपयोग में आसानी के कारण लोकप्रियता हासिल की है, जबकि अभी भी उप-एनएन बल संकल्प और एसएम स्थानिक संकल्प के साथ एएफएम-तुलनीय डेटा की पेशकश की है, जो प्रासंगिक लंबाई पैमाने² पर कोशिकाओं द्वारा लगाए गए बलों को दर्शाता है। विशेष रूप से, ऑप्टिकल फाइबर सेंसिंग तकनीक^17,18 पर आधारित फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटेशन उपकरणों ने मेकेनोबायोलॉजी और उससे परे के क्षेत्र में सक्रिय शोधकर्ताओं के बीच लोकप्रियता हासिल की है; और इन उपकरणों का उपयोग करके बायोमैटेरियल्स के यांत्रिक गुणों की रिपोर्ट करने वाले कार्यों का खजाना, जिसमें कोशिकाएं^19,20, हाइड्रोगेल ^8,21 और ऊतक^22,23 शामिल हैं, प्रकाशित किए गए हैं। स्थानीय गतिशील यांत्रिक गुणों (यानी, भंडारण और हानि मापांक) की जांच करने के लिए इन प्रणालियों की क्षमताओं के बावजूद, ई उत्पन्न करने वाले अर्ध-स्थैतिक प्रयोग सबसे लोकप्रिय विकल्प 8,19,20,21 बने हुए हैं। संक्षेप में, अर्ध-स्थैतिक नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों में नमूने को अधिकतम विस्थापन, बल या इंडेंटेशन गहराई द्वारा परिभाषित सेट-बिंदु तक निरंतर गति के साथ इंडेंट करना और तथाकथित बल-दूरी (एफ-जेड) वक्रों में कैंटिलीवर के बल और ऊर्ध्वाधर स्थिति दोनों को रिकॉर्ड करना शामिल है। एफ-जेड कर्व्स को तब संपर्क बिंदु (सीपी) की पहचान के माध्यम से बल-इंडेंटेशन (एफ-δ) वक्रों में परिवर्तित किया जाता है, और ई की गणना करने के लिए एक उपयुक्त संपर्क यांत्रिकी मॉडल (आमतौर पर हर्ट्ज मॉडल¹³) के साथ फिट किया जाता है।

जबकि फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर्स का संचालन एएफएम माप जैसा दिखता है, विचार करने योग्य विशिष्टताएं हैं। इस काम में, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर का उपयोग करके कोशिकाओं और ऊतक-नकल हाइड्रोगेल से एफ-जेड वक्रों को मजबूत रूप से प्राप्त करने के लिए एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान की जाती है, ताकि इस और अन्य समान उपकरणों का उपयोग करने वाले अनुसंधान समूहों के बीच प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के मानकीकरण को प्रोत्साहित किया जा सके। इसके अलावा, नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों को करने के लिए हाइड्रोगेल नमूने और कोशिकाओं को सर्वोत्तम रूप से तैयार करने के तरीके के बारे में सलाह दी गई है, साथ ही प्रयोगात्मक मार्ग के साथ समस्या निवारण युक्तियां भी दी गई हैं।

इसके अलावा, नैनोइंडेंटेशन परिणामों (यानी, ई और इसके वितरण) में अधिकांश परिवर्तनशीलता डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग की जाने वाली विशिष्ट प्रक्रिया पर निर्भर करती है, जो गैर-तुच्छ है। इस समस्या को हल करने के लिए, पायथन में प्रोग्राम किए गए एक नए विकसित ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर के उपयोग के लिए निर्देश और एफ-जेड कर्व्स के बैच विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) से लैस हैं। सॉफ्टवेयर तेजी से डेटा स्क्रीनिंग, डेटा की फ़िल्टरिंग, विभिन्न संख्यात्मक प्रक्रियाओं के माध्यम से सीपी की गणना, ई की पारंपरिक गणना, साथ ही लोच स्पेक्ट्रा²⁴ नामक एक अधिक उन्नत विश्लेषण की अनुमति देता है, जिससे सेल के थोक यंग के मापांक, एक्टिन कॉर्टेक्स के यंग के मापांक और एक्टिन कॉर्टेक्स की मोटाई का अनुमान लगाने की अनुमति मिलती है। सॉफ्टवेयर को GitHub से स्वतंत्र रूप से डाउनलोड किया जा सकता है और एक उपयुक्त डेटा पार्सर जोड़कर अन्य प्रणालियों से उत्पन्न डेटा का विश्लेषण करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इस बात पर जोर दिया जाता है कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटेशन उपकरणों के लिए किया जा सकता है, और सामान्य रूप से अन्य नैनोइंडेंटेशन उपकरणों को विशिष्ट उपकरण के दिशानिर्देशों के अनुसार अनुकूलित किया जाता है। प्रोटोकॉल को योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1 में संक्षेप ति किया गया है।

Protocol

1. नैनोइंडेंटेशन माप के लिए सब्सट्रेट्स / कोशिकाओं की तैयारी

1. नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए पीएएएम हाइड्रोगेल/कोशिकाओं की तैयारी के लिए पूरक प्रोटोकॉल में दिए गए चरणों का पालन करें। प्रक्रिया को चित्र 2 में संक्षेप ति किया गया है।
   नोट: पीएएएम हाइड्रोगेल को चुना गया है क्योंकि वे मेकेनोबायोलॉजी के क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले सबसे आम हाइड्रोगेल हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल किसी भी प्रकार के हाइड्रोगेल²⁵ पर समान रूप से लागू होता है ( देखें चर्चा, विधि के संशोधन)।

2. डिवाइस शुरू करना, जांच विकल्प, और जांच अंशांकन

1. डिवाइस को शुरू करने के लिए पूरक प्रोटोकॉल में दिए गए चरणों का पालन करें। ऑप्टिकल फाइबर फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर के संचालन पर तकनीकी विवरण के लिए, इन संदर्भों^{को देखें 17,18}.
2. नीचे वर्णित नैनोइंडेंटेशन जांच का चयन करें।
   नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांच एक गोलाकार टिप (चित्रा 3 ए) से लैस हैं। इसलिए, विकल्प दो चर तक सीमित हो जाता है: कैंटिलीवर की कठोरता और टिप त्रिज्या (चित्रा 3 बी)।
   1. एक कैंटिलीवर की कठोरता (एन / एम में के ) चुनें जो सर्वोत्तम^{परिणामों के} लिए अपेक्षित नमूना कठोरता से मेल खाती है 15 ( देखें चित्रा 3 सी और चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)। कक्षों के लिए, 0.01-0.09 N/m की सीमा में k के साथ एक प्रोब का चयन करें. हाइड्रोगेल के लिए, 0.1-0.9 एन / एम की सीमा में के के साथ एक जांच का चयन करें, जो कुछ केपीए और 100 केपीए के बीच अपेक्षित ई के साथ जैल के लिए इष्टतम परिणाम देता है ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
   2. इंडेंटेशन प्रक्रिया के वांछित स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के अनुसार टिप त्रिज्या (μm में R ) चुनें। मानव भ्रूण किडनी 293टी (एचईके293टी) कोशिकाओं (~ 10-15 μm²⁶ का औसत व्यास) जैसी छोटी कोशिकाओं के लिए R = 3 μm के साथ एक गोले का चयन करें। हाइड्रोजेल के लिए, एक बड़े संपर्क क्षेत्र पर बायोमटेरियल के यांत्रिक गुणों की जांच करने और स्थानीय विषमताओं से बचने के लिए आर = 10-250 μm के साथ एक गोले का चयन करें।
   3. उपयुक्त जांच का चयन करने के लिए चित्रा 3 सी और किसी भी अतिरिक्त निर्माता के दिशानिर्देशों से परामर्श करें।
3. एक बार जांच का चयन हो जाने के बाद, इसे नैनोइंडेंटर पर माउंट करने के लिए पूरक प्रोटोकॉल में दिए गए चरणों का पालन करें।

3. जांच अंशांकन

नोट: निम्नलिखित चरण ऑप्टिकल फाइबर सेंसिंग तकनीक के आधार पर फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटेशन उपकरणों के लिए विशिष्ट हैं, और वे सॉफ्टवेयर संस्करण 3.4.1 के लिए विस्तृत हैं। अन्य नैनोइंडेंटेशन डिवाइस के लिए, डिवाइस निर्माता द्वारा अनुशंसित चरणों का पालन करें।

1. सॉफ्टवेयर की मुख्य विंडो पर, प्रारंभिक पर क्लिक करें। एक अंशांकन मेनू दिखाई देगा। जांच विवरण दर्ज करें (जांच के बॉक्स के किनारे पाया जा सकता है; इनपुट बॉक्स में k , n/m में R , और हवा में अंशांकन कारक)
2. अंशांकन पकवान तैयार करें: एक सपाट तल के साथ एक मोटी ग्लास पेट्री डिश ( देखें चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)। नमूना पकवान के समान माध्यम से पकवान भरें (यह हवा भी हो सकती है)। नमूने के साथ माध्यम के तापमान का मिलान करें।
3. जांच के तहत अंशांकन डिश रखें। यदि आवश्यक हो, तो नैनोइंडेंटर के आर्म होल्डर से जांच को बाहर निकालें और अंशांकन डिश के प्लेसमेंट के लिए जगह बनाने के लिए इसे एक हाथ में पकड़ें। जांच को वापस जगह पर स्लाइड करें।
4. तरल में अंशांकन के लिए अगले दो चरणों का प्रदर्शन करें। यदि हवा में मापते हैं, तो अंशांकन के लिए प्रदान किए गए पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन सब्सट्रेट का उपयोग करें और चरण 5 पर जाएं।
   1. ग्लास फर्रूल के साथ हल्के संपर्क में पिपेट के अंत के साथ पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 70% इथेनॉल की एक बूंद के साथ जांच को प्रीवेट करें, ताकि बूंद कैंटिलीवर और गोलाकार टिप²⁷ पर स्लाइड हो सके ( देखें चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)।
   2. मैन्युअल रूप से नैनोइंडेंटर की बांह को नीचे की ओर स्लाइड करें जब तक कि जांच पूरी तरह से जलमग्न न हो जाए, लेकिन फिर भी पेट्री डिश के तल से बहुत दूर। यदि आवश्यक हो, तो अंशांकन डिश में अधिक माध्यम जोड़ें। 5 मिनट प्रतीक्षा करें ताकि तरल में संतुलन की स्थिति तक पहुंच जाए।
5. सॉफ्टवेयर के आरंभ मेनू में, स्कैन तरंगदैर्ध्य पर क्लिक करें। इंटरफेरोमीटर की स्क्रीन एक प्रगति पट्टी दिखाएगी और कंप्यूटर के सॉफ्टवेयर पर लाइव सिग्नल विंडो चित्रा एस 1 ए में दिखाए गए पैटर्न को प्रदर्शित करेगी। यह जांचने के लिए कि ऑप्टिकल स्कैन सफल रहा है या नहीं, इंटरफेरोमीटर बॉक्स पर तरंगदैर्ध्य स्कैन पैनल पर नेविगेट करें। यदि सफल होता है, तो एक साइन तरंग दिखाई देनी चाहिए (चित्रा 1 ए, दाएं)। यदि कोई त्रुटि प्रकट होती है तो चर्चा (विधि का समस्या निवारण) देखें.
6. आरंभिक मेनू में, Find Surface पर क्लिक करें, जो कैंटिलीवर के झुकने में एक निर्धारित सीमा तक पहुंचने तक जांच को उत्तरोत्तर कम कर देगा। ग्लास पेट्री डिश के साथ संपर्क बनने पर जांच चलना बंद हो जाती है।
7. जांचें कि जांच सतह के संपर्क में है या नहीं। सॉफ्टवेयर की मुख्य विंडो पर वाई डाउनवर्ड एरो बटन का उपयोग करके जांच को 1 μm से नीचे ले जाएं। प्रत्येक चरण के साथ बेसलाइन में परिवर्तन के लिए सॉफ्टवेयर की लाइव विंडो में ग्रीन सिग्नल (कैंटिलीवर का विक्षेपण) का निरीक्षण करें, जब कैंटिलीवर सब्सट्रेट (चित्रा एस 1 बी) के संपर्क में होता है। यदि कोई परिवर्तन नहीं है, तो कैंटिलीवर संपर्क में नहीं है (अगला चरण देखें)।
8. 0.01 के डिफ़ॉल्ट मान से 0.01 के डिफ़ॉल्ट मान से एक बार में 0.01 के चरण से सतह खोजें टैब के तहत विकल्प मेनू में थ्रेशोल्ड मान बढ़ाएं और संपर्क में आने तक सतह खोजें चरण को दोहराएँ। वैकल्पिक रूप से, जांच को छोटे 1 μm चरणों में संपर्क करने के लिए नीचे लाएं जब तक कि हरी आधार रेखा प्रत्येक नीचे की ओर स्थानांतरित नहीं होने लगती।
   नोट: सबसे नरम कैंटिलीवर (k = 0.025 ^Nm-1) के लिए, चरण 6 प्रदर्शन करने की प्राथमिकता के रूप में खोज सतह टैब के तहत विकल्प मेनू में थ्रेशोल्ड मान बढ़ाएं। 0.06 या 0.07 के थ्रेशोल्ड मान से शुरू करें और यदि आवश्यक हो तो इसे 0.1 तक बढ़ाएं। ऐसा इसलिए है क्योंकि पर्यावरणीय शोर संभवतः संपर्क से पहले कैंटिलीवर को दहलीज से ऊपर झुकने का कारण बनेगा। सॉफ्ट प्रोब्स के लिए, एक ही मेनू में एप्रोच स्पीड (μm /s) को कम करने से प्रक्रिया में भी सुधार होता है।
9. प्रारंभिक मेनू में, कैलिब्रेट पर क्लिक करें।
10. सॉफ्टवेयर की लाइव सिग्नल विंडो की जांच करें और सुनिश्चित करें कि पीजो के विस्थापन और कैंटिलीवर के विक्षेपण संकेत दोनों एक ही समय में ऊपर जाते हैं (चित्रा एस 1 सी)।
    1. यदि समय में कोई विसंगति है, तो जांच पूरी तरह से ग्लास के संपर्क में नहीं है। जांच को 1 μm के चरणों पर तब तक नीचे ले जाएं जब तक कि कैंटिलीवर सिग्नल की आधार रेखा में परिवर्तन न हो (चरण 7 देखें) और चरण 9 को दोहराएं।
    2. यदि कैलिब्रेट चरण के दौरान कैंटिलीवर सिग्नल बिल्कुल नहीं बदलता है, तो जांच सतह से बहुत दूर है। संपर्क सीमा को पुनरावृत्ति से बढ़ाएं (चरण 8 देखें) जब तक कि सतह सही ढंग से नहीं मिल जाती है और तरंग दैर्ध्य स्कैन से शुरू होने वाली शुरुआत से अंशांकन दोहराएं।
11. जब अंशांकन पूरा हो जाता है, तो प्रदर्शित पॉप-अप विंडो पर पुराने और नए अंशांकन कारकों की जांच करें। यदि नया अंशांकन कारक सही सीमा में है, तो नए कारक का उपयोग करें पर क्लिक करें। यदि अंशांकन विफल रहता है, और नया कारक या तो NaN है या अपेक्षित सीमा में नहीं है, तो समाधान के लिए चर्चा (विधि का समस्या निवारण) देखें।
    नोट: नया कारक जांच के बॉक्स पर प्रदान किए गए से ~ एन गुना कम होना चाहिए यदि अंशांकन अपवर्तक सूचकांक एन (पानी के लिए एन = 1.33) के साथ तरल माध्यम में किया गया था। यदि अंशांकन हवा में किया गया था, तो नए और पुराने अंशांकन कारक लगभग बराबर होने चाहिए।
12. जांचें कि क्या डिमॉड्यूलेशन सर्कल को सही ढंग से कैलिब्रेट किया गया है। इंटरफेरोमीटर डेस्कटॉप पर डिमॉड्यूलेशन टैब पर नेविगेट करें। पर्याप्त शोर को प्रेरित करने के लिए धीरे से ऑप्टिकल टेबल पर या नैनोइंडेंटर पर टैप करें। असतत डेटा बिंदुओं से बना एक सफेद सर्कल लगभग लाल सर्कल (चित्रा एस 1 डी) को कवर करना चाहिए।
13. यदि सफेद सर्कल लाल सर्कल के साथ ओवरलैप नहीं होता है, या इंटरफेरोमीटर के डिस्प्ले पर एक चेतावनी दिखाई देती है, तो डिमॉड्यूलेशन सर्कल को रीकैलिब्रेशन की आवश्यकता होती है। यह दो तरीकों से किया जा सकता है जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. शोर के एक पूर्ण चक्र को प्रेरित करने के लिए नैनोइंडेंटर के शरीर पर लगातार टैप करें और इंटरफेरोमीटर पर कैलिब्रेट बटन दबाएं।
    2. ग्लास सब्सट्रेट के संपर्क में प्रवेश करें और सॉफ़्टवेयर की मुख्य विंडो के प्रारंभिक मेनू से कैलिब्रेट दबाएं। अंशांकन कारक को न सहेजें। इस बिंदु पर, फिर से जांचें और सुनिश्चित करें कि सफेद सर्कल लाल सर्कल के साथ ओवरलैप होता है।
       नोट: यदि सिग्नल केवल डिमॉड्यूलेशन सर्कल से थोड़ा विस्थापित नहीं है, बल्कि बहुत छोटा हो गया है या बिल्कुल भी दिखाई नहीं दे रहा है, तो इसका मतलब है कि कैंटिलीवर ऑप्टिकल फाइबर से चिपक गया है। इस समस्या के लिए समस्या निवारण सलाह का पालन करें ( चर्चा, विधि का समस्या निवारण देखें) और या तो चरण 13.1 या 13.2 दोहराएँ। एक बार कैंटिलीवर अपनी क्षैतिज स्थिति (चित्रा 3 ए) में वापस आ जाता है, तो सिग्नल डिमॉड्यूलेशन सर्कल में ठीक हो जाएगा।
14. नीचे वर्णित अंशांकन के बाद सीधे ग्लास सब्सट्रेट पर इंडेंटेशन करके अंशांकन को सत्यापित करें।
    1. कॉन्फ़िगर प्रयोग पर क्लिक करके कोई प्रयोग फ़ाइल लोड करें या बनाएँ और एक खोज सतह चरण और इंडेंटेशन चरण जोड़ें. इंडेंटेशन चरण के लिए, डिफ़ॉल्ट विस्थापन मोड सेटिंग्स का उपयोग करें और कठोर सब्सट्रेट के खिलाफ जांच को विस्थापित करने के लिए अधिकतम विस्थापन को अंशांकन दूरी (3,000 एनएम) में बदलें।
    2. रन एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करें और इंटरफेरोमीटर विंडो में डिमॉड्यूलेशन सर्कल की जांच करें। सफेद सिग्नल की जांच करें और सुनिश्चित करें कि यह इंडेंटेशन के दौरान लाल सर्कल के शीर्ष पर है।
    3. टाइम डेटा ग्राफ में सॉफ्टवेयर की मुख्य विंडो पर परिणामों की जांच करें, और सुनिश्चित करें कि पीजो का विस्थापन (नीली रेखा) कैंटिलीवर के विक्षेपण (हरी रेखा) के बराबर है क्योंकि इंडेंटेशन संपर्क में शुरू होता है और कोई भौतिक विरूपण अपेक्षित नहीं है। यदि संकेत समानांतर नहीं हैं, तो चर्चा (विधि का समस्या निवारण) देखें।
15. अंशांकन सहेजें पथ को उपयुक्त निर्देशिका में सेट करके अंशांकन मेनू में स्थानीय पथ परिवर्तित करें.
16. जब प्रोब को सफलतापूर्वक कैलिब्रेट किया गया है, तो पीज़ो को 500 μm तक ले जाएं।

4. नरम सामग्री के युवा मापांक को मापना

1. हाइड्रोजेल का नैनोइंडेंटेशन
   1. माइक्रोस्कोप के चरण पर नमूना (ओं) वाले पेट्री डिश को लोड करें और मैन्युअल रूप से नैनोइंडेंटर की जांच को नमूने के ऊपर वांछित एक्स-वाई स्थिति में ले जाएं।
   2. मैन्युअल रूप से जांच को समाधान में स्लाइड करें, इस स्तर पर जांच और नमूने की सतह के बीच 1-2 मिमी छोड़ने का ध्यान रखें। जांच को माध्यम में बराबर करने के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
   3. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के जेड विमान पर ध्यान केंद्रित करें ताकि जांच स्पष्ट रूप से दिखाई दे।
   4. नीचे वर्णित प्रयोगात्मक मापदंडों को ट्यून करने के लिए एक एकल इंडेंटेशन करें।
      1. सॉफ़्टवेयर की मुख्य विंडो में एक नया प्रयोग कॉन्फ़िगर करें। कॉन्फ़िगर प्रयोग पर क्लिक करें, जो एक नई विंडो खोलेगा। कोई सतह खोजें चरण जोड़ें. यदि आवश्यक हो तो खोज सतह चरण के सभी मापदंडों को सॉफ़्टवेयर के विकल्प मेनू में बदला जा सकता है।
         नोट: फाइंड सरफेस सतह पाए जाने तक जांच को कम कर देगा, और फिर यह नमूने की सतह के ऊपर जेड अबव सरफेस (μm) द्वारा परिभाषित दूरी पर जांच को वापस ले लेगा। यदि चयनित कैंटिलीवर नमूने के लिए बहुत कठोर है या नमूना चिपचिपा है, तो चरण के बाद जांच अभी भी नमूने के संपर्क में होने की संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप बेसलाइन के बिना वक्र होगा (चित्रा 4 सी)। इस समस्या को हल करने के लिए, Z अबव सरफेस (μm) बढ़ाएं।
      2. एक इंडेंटेशन चरण जोड़ें। प्रोफ़ाइल टैब का चयन करें और विस्थापन नियंत्रण पर क्लिक करें. डिफ़ॉल्ट इंडेंटेशन प्रोफ़ाइल छोड़ दें।
      3. मुख्य सॉफ्टवेयर विंडो पर प्रयोग चलाएँ पर क्लिक करें। यह सतह को ढूंढेगा और एक एकल इंडेंटेशन करेगा। यदि एकल इंडेंटेशन अपेक्षित रूप से नहीं दिखता है, तो चित्रा 4 और चर्चा (विधि की समस्या निवारण) में उल्लिखित प्रयोगात्मक मापदंडों को समायोजित करें।
   5. एक बार इंडेंटेशन वांछित दिखता है, तो मैट्रिक्स स्कैन को कॉन्फ़िगर करें ताकि नमूने का पर्याप्त क्षेत्र इंडेंटेड हो। कॉन्फ़िगर प्रयोग पर क्लिक करें, पहले से निर्धारित प्रयोगात्मक मापदंडों के साथ एक खोज सतह चरण जोड़ें और मैट्रिक्स स्कैन चरण जोड़ें।
   6. फ्लैट हाइड्रोगेल के लिए, 50-100 अंक (यानी, x और y में 5 x 10 या 10 x 10) वाले मैट्रिक्स स्कैन को कॉन्फ़िगर करें, जिसे 10-100 μm (यानी, dx = dy = 10-100 μm) पर रखा गया है। वर्तमान चरण की स्थिति से मैट्रिक्स स्कैन शुरू करने के लिए स्टेज पोजीशन का उपयोग करें पर क्लिक करें। सुनिश्चित करें कि ऑटो फाइंड सरफेस बॉक्स सेट प्रयोगात्मक मापदंडों का उपयोग करके प्रत्येक इंडेंटेशन पर सतह खोजने के लिए टिक किया गया है।
      1. ओवरसैंपलिंग से बचने के लिए, चरण आकार को संपर्क त्रिज्या से कम से कम दोगुना सेट करें (, जहां δ इंडेंटेशन गहराई है)।
      2. विस्थापन नियंत्रण में मैट्रिक्स स्कैन प्रोफ़ाइल सेट करें। सुनिश्चित करें कि प्रोफ़ाइल हर्ट्ज मॉडल की मान्यताओं का उल्लंघन नहीं करती है ( देखें चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)।
      3. खंडों की संख्या को 5 पर छोड़ दें, जो डिफ़ॉल्ट मान है, और डिफ़ॉल्ट विस्थापन प्रोफ़ाइल का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक ढलान वाले खंड के लिए अधिकतम विस्थापन और समय के संदर्भ में विस्थापन प्रोफ़ाइल को बदलें, जो क्रमशः अधिकतम इंडेंटेशन गहराई और तनाव दर को प्रभावित करेगा। तनाव दर > 10 `m / s से अधिक न करें ( देखें चर्चा, विधि की सीमाएं)।
      4. दृष्टिकोण गति के लिए एक मान दर्ज करें, जो यह निर्धारित करता है कि संपर्क से पहले जांच कितनी तेजी से नमूने की ओर विस्थापित होती है। वापसी की गति को दृष्टिकोण गति से मिलान करें (नीचे नोट देखें)।
         नोट: नरम कैंटिलीवर और शोर वातावरण के लिए, 1,000-2,000 एनएम / एस की दृष्टिकोण गति की सिफारिश की जाती है। कठोर कैंटिलीवर और नियंत्रित वातावरण के लिए, इसे बढ़ाया जा सकता है।
      5. कॉन्फ़िगर किए गए प्रयोग को वांछित प्रयोग पथ में सहेजें और एक निर्देशिका का चयन करें जहाँ डेटा सहेजें पथ में, कॉन्फ़िगर प्रयोग विंडो के सामान्य टैब में सहेजा जाएगा. रन एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करें।
   7. एक बार मैट्रिक्स स्कैन पूरा हो जाने के बाद, जांच को 200-500 μm तक बढ़ाएं और जांच को नमूने के एक अलग क्षेत्र में ले जाएं जो पहले क्षेत्र से पर्याप्त रूप से दूर है।
   8. प्रयोग को कम से कम दो बार दोहराएं ताकि प्रत्येक नमूने पर पर्याप्त डेटा प्राप्त किया जा सके (यानी, प्रति नमूना कम से कम दो मैट्रिक्स स्कैन, जिसमें प्रत्येक में 50-100 वक्र हों)।
2. कोशिकाओं का नैनोइंडेंटेशन
   1. ऊपर वर्णित माइक्रोस्कोप पर नमूना लोड करें।
   2. एकल-सेल इंडेंटेशन के लिए, जेड प्लेन पर ध्यान केंद्रित करें ताकि सेल आकार और प्रसार के आधार पर कोशिकाएं और जांच दोनों 20x या 40x आवर्धन पर दिखाई दें।
   3. जांच को सेल के ऊपर ले जाएं ताकि इंडेंट किया जा सके।
   4. सॉफ़्टवेयर की मुख्य विंडो में एक नया प्रयोग कॉन्फ़िगर करें। कॉन्फ़िगर प्रयोग पर क्लिक करें, जो एक नई विंडो खोलेगा। विस्थापन मोड में डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के साथ एक खोज सतह और इंडेंटेशन चरण जोड़ें।
   5. रन एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करें, जो सतह को ढूंढेगा और एक इंडेंटेशन करेगा। जांचें कि क्या इंडेंटेशन सफल रहा था। यदि वक्र अपेक्षा के अनुसार नहीं दिखता है, तो प्रयोगात्मक मापदंडों को समायोजित करें (चित्र 4 और चर्चा, विधि का समस्या निवारण देखें)।
   6. यदि इंडेंटेशन सफल रहा, तो प्रयोग में एक मैट्रिक्स स्कैन जोड़ें। हाइड्रोगेल के नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए दिए गए चरणों का पालन करें; मैट्रिक्स स्कैन को कॉन्फ़िगर करें ताकि चरण आकार सेल के एक छोटे से क्षेत्र को इंडेंट करने की अनुमति दे; HEK293T कोशिकाओं के लिए 0.5-5 μm पर 25 अंक स्थान दिया गया है।
      1. सेल आकार के आधार पर, मैट्रिक्स स्कैन को यह सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित करें कि टिप सेल सीमा के बाहर नहीं है, यानी, एक अलग मानचित्र ज्यामिति करना या कम बिंदुओं की जांच करना।
   7. रन एक्सपेरिमेंट पर क्लिक करें और इसके पूरा होने की प्रतीक्षा करें।
   8. एक बार मैट्रिक्स स्कैन पूरा हो जाने के बाद, जांच को संपर्क से बाहर उठाएं ( जेड विमान में 50 μm)।
   9. जांच को एक नए सेल के ऊपर ले जाएं और प्रक्रिया को दोहराएं ( देखें चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)।
3. जांच को साफ करना और उपकरण को बंद करना
   1. जांच को साफ करने और नैनोइंडेंटेशन डिवाइस को बंद करने के लिए पूरक प्रोटोकॉल में दिए गए चरणों का पालन करें।

5. डेटा विश्लेषण

1. सॉफ़्टवेयर डाउनलोड और स्थापित करना
   1. डेटा विश्लेषण^28,29 के लिए सॉफ़्टवेयर डाउनलोड और इंस्टॉल करने के लिए पूरक प्रोटोकॉल में दिए गए ^{चरणों का} पालन करें।
2. F-z वक्रों की स्क्रीनिंग और JSON प्रारूप में साफ किए गए डेटा सेट का उत्पादन
   1. चरण 2 से 3 में उल्लिखित प्रयोगशाला कंप्यूटर पर कमांड लाइन से prepare.py लॉन्च करें।
   2. यदि विंडोज कंप्यूटर का उपयोग कर रहे हैं, तो नैनोप्रीपर फ़ोल्डर पर राइट-क्लिक करते समय शिफ्ट कुंजी रखें और ओपन पावरशेल विंडो पर क्लिक करें। पायथन prepare.py आदेश टाइप करें और Enter कुंजी दबाएँ । एक जीयूआई आपकी स्क्रीन पर पॉप अप होगा (चित्रा एस 2)।
   3. यदि मैकओएस कंप्यूटर का उपयोग कर रहे हैं, तो नैनोप्रीपर फ़ोल्डर पर राइट-क्लिक करें और फ़ोल्डर में नया टर्मिनल पर क्लिक करें। पायथन 3 prepare.py कमांड टाइप करें और एंटर कुंजी दबाएं , जो जीयूआई (चित्रा एस 2) लॉन्च करेगा।
   4. ड्रॉप-डाउन सूची से O11नए डेटा स्वरूप का चयन करें. यदि डेटा सही ढंग से लोड नहीं किया गया है, तो जीयूआई को फिर से लॉन्च करें और ओ 11ओल्ड का चयन करें।
      नोट: ओ 11नया प्रारूप सॉफ्टवेयर संस्करण 3.4.1 के साथ फेरूल-टॉप ऑप्टिकल फाइबर सेंसिंग नैनोइंडेंटेशन उपकरणों का उपयोग करके प्राप्त डेटा के लिए काम करता है। यह प्रारूप पिछले सॉफ्टवेयर संस्करणों के लिए भी काम करेगा, कम से कम 2019-2020 में स्थापित नैनोइंडेंटर से संबंधित।
   5. लोड फ़ोल्डर पर क्लिक करें। विश्लेषण किए जाने वाले डेटा वाले फ़ोल्डर का चयन करें- एकल मैट्रिक्स स्कैन या एकाधिक मैट्रिक्स स्कैन। शीर्ष ग्राफ (रॉ कर्व्स) अपलोड किए गए डेटा सेट के साथ पॉप्युलेट किया जाएगा। एक विशिष्ट वक्र की कल्पना करने के लिए, उस पर क्लिक करें। यह इसे हरे रंग में हाइलाइट करेगा और इसे नीचे ग्राफ (वर्तमान वक्र) पर दिखाएगा।
   6. नीचे उल्लिखित जीयूआई के दाहिने भाग पर मौजूद टैब का उपयोग करके डेटा सेट को साफ करें।
      1. विश्लेषण किए जाने वाले सही सेगमेंट का चयन करने के लिए सेगमेंट बटन का उपयोग करें, जो एफ-जेड कर्व्स का फॉरवर्ड सेगमेंट है। विशिष्ट संख्या प्रयोगों को करते समय नैनोइंडेंटेशन सॉफ्टवेयर में चुने गए खंडों की संख्या पर निर्भर करती है।
      2. क्रॉप 50 एनएम बटन का उपयोग करके वक्रों को चरम बाईं ओर 50 एनएम तक क्रॉप किया जाए (यदि एल टिका हुआ है), दाएं (यदि आर टिका हुआ है), या दोनों तरफ (यदि आर और एल दोनों टिक हैं)। जितना आवश्यक हो उतना क्रॉप करने के लिए इस बटन को कई बार क्लिक करें। एफ-जेड वक्रों के प्रारंभ/अंत में मौजूद कलाकृतियों को हटाने के लिए इसका उपयोग करें।
      3. स्प्रिंग स्थिरांक, टिप ज्यामिति और टिप त्रिज्या के लिए कैंटिलीवर टैब का निरीक्षण करें। यह सुनिश्चित करने के लिए टैब का निरीक्षण करें कि मेटाडेटा सही ढंग से पढ़ा गया है।
      4. एक बल सीमा सेट करने के लिए स्क्रीनिंग टैब का उपयोग करें जो उन सभी वक्रों को त्याग देगा जो दिए गए बल तक नहीं पहुंचे थे। छोड़े गए वक्रों को लाल रंग में हाइलाइट किया जाएगा।
      5. मैन्युअल रूप से उन वक्रों को हटाने के लिए मैन्युअल टॉगल बटन का उपयोग करें जिन्हें सही ढंग से प्राप्त नहीं किया गया है। विशिष्ट वक्र पर क्लिक करके और आउट का चयन करके किसी भी वक्र को हटा दें, जो लाल रंग में वक्र को उजागर करेगा।
   7. Save JSON पर क्लिक करें। साफ़ किए गए डेटा सेट के लिए एक उपयुक्त नाम दर्ज करें, जो एक एकल JSON फ़ाइल है. JSON फ़ाइल को उस कंप्यूटर पर भेजें जहाँ नैनोविश्लेषण सॉफ़्टवेयर स्थापित किया गया था।

6. औपचारिक डेटा विश्लेषण

1. नैनोएनालिसिस फ़ोल्डर में नेविगेट करके और पहले बताए गए अनुसार एक टर्मिनल लॉन्च करके कमांड लाइन से nano.py फ़ाइल लॉन्च करें। पायथन nano.py या python3 nano.py कमांड (ऑपरेटिंग सिस्टम के आधार पर) टाइप करें और Enter कुंजी दबाएँ. एक जीयूआई आपकी स्क्रीन पर पॉप अप होगा (चित्रा एस 3)।
2. GUI के शीर्ष बाईं ओर, लोड प्रयोग पर क्लिक करें और JSON फ़ाइल का चयन करें। यह फ़ाइल सूची और रॉ कर्व्स ग्राफ को एफ-जेड कर्व्स के संदर्भ में डेटा सेट को दिखाएगा। एफ और जेड अक्ष दोनों को सीपी निर्देशांक के सापेक्ष दिखाया गया है, जो डेटासेट लोड करते समय पृष्ठभूमि में गणना की जाती है (निम्नलिखित नोट देखें)। आँकड़े बॉक्स में, तीन मापदंडों के मानों की जाँच करें: N_{सक्रिय}, N _{विफल,} और N_{बाहर रखा गया}.
   नोट: एन_{सक्रिय} उन वक्रों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है जिनका विश्लेषण बाद के हर्ट्ज़ / लोच स्पेक्ट्रा विश्लेषण में किया जाएगा और कच्चे कर्व्स ग्राफ में काले रंग में दिखाई देंगे। N_विफल उन वक्रों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है जिन पर एक विश्वसनीय CP नहीं मिल सका और ग्राफ में नीले रंग में दिखाई देता है। इन वक्रों को बाद के विश्लेषण में स्वचालित रूप से त्याग दिया जाएगा। सॉफ़्टवेयर खोलने पर, कुछ वक्र स्वचालित रूप से विफल सेट पर ले जाया जा सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि सीपी की गणना डिफ़ॉल्ट थ्रेशोल्ड एल्गोरिदम (नीचे देखें) के साथ सॉफ़्टवेयर खोलने पर की जाती है। _{एन बाहर किए} गए वक्रों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें विश्लेषण से बाहर रखने के लिए मैन्युअल रूप से चुना जाता है और ग्राफ में लाल रंग में दिखाई देगा (नीचे देखें)।
3. जांचें कि क्या विफल, बहिष्कृत और सक्रिय वक्रों की संख्या उचित है। वक्रों की कल्पना करने के लिए रॉ कर्व्स ग्राफ की जांच करें।
4. अधिक विस्तार से एक विशिष्ट वक्र की कल्पना करने के लिए, उस पर क्लिक करें। यह इसे हरे रंग में हाइलाइट करेगा और इसे वर्तमान वक्र ग्राफ पर दिखाएगा । एक बार एकल वक्र का चयन हो जाने के बाद, आर और के पैरामीटर (जो सभी वक्रों के लिए समान होना चाहिए) जीयूआई के स्टैट्स बॉक्स में पॉप्युलेट किए जाएंगे।
5. टॉगल बॉक्स का उपयोग करके किसी दिए गए वक्र की स्थिति बदलें । उस विशिष्ट वक्र पर क्लिक करें जिसकी आप स्थिति बदलना चाहते हैं, और फिर सक्रिय, असफल या बहिष्कृत पर क्लिक करें। आँकड़े बॉक्स में गिनती स्वचालित रूप से अद्यतन हो जाती है।
   नोट: रॉ कर्व्स ग्राफ़ में सेट किए गए डेटा के दृश्य को बदलने के लिए दृश्य बॉक्स का उपयोग करें। सभी वक्रों को दिखाने के लिए सभी पर क्लिक करें (यानी, संबंधित रंगों में सक्रिय, विफल और बहिष्कृत)। सक्रिय और विफल वक्रों को दिखाने के लिए विफल पर क्लिक करें और केवल सक्रिय वक्र दिखाने के लिए सक्रिय पर क्लिक करें। सक्रिय और बहिष्कृत के बीच सभी वक्रों की स्थिति रीसेट करने के लिए, रीसेट बॉक्स में सक्रिय या बहिष्कृत पर क्लिक करें.
6. एक बार डेटासेट को और साफ करने के बाद, नीचे उल्लिखित डेटा विश्लेषण पाइपलाइन का पालन करें।
   1. जीयूआई (फ़िल्टरिंग बॉक्स) में कार्यान्वित फ़िल्टर का उपयोग करके वक्रों में मौजूद किसी भी शोर को फ़िल्टर करें, अर्थात्, प्रोमिनेंसी फ़िल्टर नामक एक कस्टम फ़िल्टर, Savitzky Golay^30,31 (SAVGOL) फ़िल्टर, और किसी दिए गए विंडो (माध्य फ़िल्टर) में डेटा के औसत की गणना के आधार पर एक स्मूथिंग फ़िल्टर। फ़िल्टर पर विवरण के लिए चर्चा (प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण) देखें.
   2. वर्तमान वक्र ग्राफ में फ़िल्टर किए गए वक्रों का निरीक्षण करें। फ़िल्टर किए गए वक्र को काले रंग में दिखाया गया है जबकि वक्र के गैर-फ़िल्टर किए गए संस्करण को हरे रंग में दिखाया गया है।
      नोट: यह सलाह दी जाती है कि मूल सिग्नल की विशेषताओं को संरक्षित करने के लिए डेटा को जितना संभव हो उतना कम फ़िल्टर करें। ओवर फ़िल्टरिंग डेटा में मौजूद किसी भी अंतर को दूर कर सकती है। सक्रिय प्रोमिनेंसी फिल्टर के साथ काम करना नैनोइंडेंटेशन डेटा के हर्ट्ज विश्लेषण के लिए पर्याप्त है। यदि डेटा विशेष रूप से शोर है, तो एक SAVGOL या माध्य फ़िल्टर अतिरिक्त रूप से लागू किया जा सकता है।
   3. CP खोजने के लिए एक एल्गोरिथ्म का चयन करें। संपर्क बिंदु बॉक्स में, सॉफ्टवेयर में लागू की गई संख्यात्मक प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला में से एक चुनें, अर्थात्, फिट की अच्छाई (जीओएफ) ³², विचरण का अनुपात (आरओवी) ³², दूसरा व्युत्पन्न³³, या थ्रेशोल्ड³³। एल्गोरिदम पर विवरण के लिए प्रोटोकॉल में चर्चा, महत्वपूर्ण कदम देखें।
      नोट: सीपी वह बिंदु है जिस पर जांच सामग्री के संपर्क में आती है और एफ-जेड डेटा को एफ-δ डेटा में बदलने के लिए पहचानने की आवश्यकता होती है (नरम सामग्री के लिए, δ परिमित है और गणना करने की आवश्यकता है)। चयनित एल्गोरिथ्म को डेटा सेट के सभी सक्रिय वक्रों पर लागू किया जाएगा, और जिन वक्रों में एल्गोरिदम सीपी को मजबूती से खोजने में विफल रहता है, उन्हें विफल सेट पर ले जाया जाएगा।
   4. अपने डेटासेट के अनुरूप एल्गोरिदम के मापदंडों को समायोजित करें ताकि सीपी चर्चा में विस्तृत, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों के रूप में सही ढंग से स्थित हो। यह देखने के लिए कि सीपी एकल वक्र पर कहां पाया गया है, उस पर क्लिक करके वक्र का चयन करें और निरीक्षण पर क्लिक करें। पॉप-अप विंडो की जाँच करें जो यह पहचानने के लिए प्रकट होती है कि CP कहाँ स्थित है।
   5. जांचें कि क्या दिखाई देने वाली लाल रेखा, जो कि रुचि के चयनित क्षेत्र में गणना की गई एल्गोरिदम का पैरामीटर है, का अधिकतम या न्यूनतम मान है जो सीपी के स्थान से मेल खाता है (उदाहरण के लिए, जीओएफ के लिए, पैरामीटर आर² है)। यदि आवश्यक हो तो सभी वक्रों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
      नोट: पॉप-अप के अक्ष पूर्ण निर्देशांक में हैं ताकि सीपी का स्थान दिखाया जा सके। इसके विपरीत, कच्चे वक्र और वर्तमान वक्र ग्राफ के अक्षों को सीपी के सापेक्ष दिखाया गया है, यानी, सीपी का स्थान (0,0) है।
   6. हर्ट्ज विश्लेषण पर क्लिक करें। यह नीचे वर्णित तीन ग्राफ उत्पन्न करेगा।
      1. औसत हर्ट्ज फिट (लाल डैश्ड लाइन) के साथ डेटासेट में अलग-अलग एफ-δ वक्रों की जांच करें। मैक्स इंडेंटेशन (एनएम) के तहत परिणाम बॉक्स में हर्ट्ज मॉडल को फिट करने वाले एनएम में इंडेंटेशन समायोजित करें। हर्ट्ज मॉडल के मान्य होने के लिए इसे आर के अधिकतम ~ 10% पर सेट करें ( देखें चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)।
      2. औसत हर्ट्ज फिट (लाल डैश्ड लाइन) के साथ एक मानक विचलन (एसडी) दिखाने वाले त्रुटि बैंड के साथ औसत एफ -δ वक्र की जांच करें। संदर्भ के लिए रॉ कर्व्स ग्राफ पर फिट औसत हर्ट्ज की कल्पना करें और वर्तमान वक्र पर प्रत्येक वक्र के लिए हर्ट्ज फिट।
      3. प्रत्येक व्यक्तिगत वक्र में हर्ट्ज मॉडल फिट करने से उत्पन्न ई के स्कैटर प्लॉट की जांच करें।
   7. प्रत्येक प्लॉट में वक्र को हाइलाइट करने के लिए फ़ाइल नाम, एफ-जेड वक्र, एफ-δ वक्र, या स्कैटर प्लॉट पर एक बिंदु पर क्लिक करें। यदि स्कैटर प्लॉट में एक डेटा बिंदु डेटा के वितरण के बाहर स्थित प्रतीत होता है, तो उस पर क्लिक करें और उस वक्र का निरीक्षण करें जिससे वह संबंधित है। निरीक्षण बटन पर क्लिक करके सत्यापित करें कि CP ठीक से स्थित किया गया है। यदि आवश्यक हो तो विश्लेषण से वक्र को बाहर रखें।
   8. गणना किए गए माध्य ई और इसके एसडी (ई_{γ ± σ}) के लिए परिणाम बॉक्स का निरीक्षण करें और सुनिश्चित करें कि वे दिए गए प्रयोग के लिए उचित हैं।
   9. सहेजें बॉक्स में, हर्ट्ज पर क्लिक करें। पॉप-अप विंडो में, फ़ाइल नाम और निर्देशिका दर्ज करें। एक बार पूरा हो जाने के बाद, सहेजें पर क्लिक करें। एक .tsv फ़ाइल बनाई जाएगी। वरीयता के किसी भी अतिरिक्त सॉफ़्टवेयर में .tsv फ़ाइल खोलें और सांख्यिकीय विश्लेषण और आगे प्लॉटिंग के लिए मानों का उपयोग करें।
      नोट: फ़ाइल में प्रत्येक वक्र से प्राप्त E और माध्य E और उसके SD शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, फ़ाइल में विश्लेषण से जुड़े मेटाडेटा होते हैं, जिसमें विश्लेषण किए गए वक्रों की संख्या, R, k और हर्ट्ज मॉडल के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकतम इंडेंटेशन शामिल हैं।
   10. यह चरण वैकल्पिक है. बल में एक एसडी के साथ औसत बल और औसत इंडेंटेशन निर्यात करने के लिए औसत एफ-इंड पर क्लिक करें।
   11. सेल नैनोइंडेंटेशन डेटा के लिए, लोच स्पेक्ट्रा विश्लेषण पर क्लिक करें ( प्रतिनिधि परिणाम और चर्चा देखें)। उत्पादित दो भूखंडों का निरीक्षण करें, अर्थात् , प्रत्येक वक्र के लिए इंडेंटेशन गहराई (ई (δ)) के एक फ़ंक्शन के रूप में ई, और त्रुटि बैंड के साथ औसत ई (δ) एक मॉडल (ब्लैक डैश्ड लाइन) द्वारा फिट किए गए एक एसडी (ठोस लाल रेखा और छायांकित क्षेत्र) को दर्शाता है, जो सेल के एक्टिन कॉर्टेक्स के यंग के मापांक, सेल के थोक यंग के मापांक का अनुमान लगाने की अनुमति देता है। और एक्टिन कॉर्टेक्स की मोटाई। इसके अतिरिक्त, लाल रंग में शीर्ष ग्राफ में औसत ई (δ) की जांच करें।
   12. सुनिश्चित करें कि इंटरपोलेट बॉक्स चेक किया गया है, जो यह सुनिश्चित करता है कि लोच स्पेक्ट्रा विश्लेषण करने के लिए आवश्यक व्युत्पन्न की गणना इंटरपोलेटेड सिग्नल पर की जाती है ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
   13. परिणाम बॉक्स का निरीक्षण करें, कॉर्टेक्स के यंग के मापांक (ई₀ ± σ), सेल के थोक यंग के मापांक (ई_बी ± σ), और कॉर्टेक्स मोटाई (डी₀ ± σ) की रिपोर्ट करें।
       नोट: औसत लोच स्पेक्ट्रा पहले शोर दिखाई दे सकता है, जिसमें प्रमुख साइनसॉइडल दोलन होते हैं। नतीजतन, समीकरण (3) सही ढंग से फिट नहीं किया जा सकता है। यदि यह मामला है, तो स्मूथिंग SAVGOL फ़िल्टर³⁴ की विंडो लंबाई को पुनरावर्ती रूप से बढ़ाने से यह समस्या हल हो जाती है।
   14. एक बार विश्लेषण समाप्त हो जाने के बाद, सहेजें बॉक्स में ईएस पर क्लिक करें। यह निर्दिष्ट निर्देशिका में एक .tsv फ़ाइल निर्यात करेगा, जिसमें औसत इंडेंटेशन गहराई और संपर्क त्रिज्या, प्रयोग से जुड़े मेटाडेटा (ऊपर देखें), और ऊपर बताए गए अनुमानित मॉडल पैरामीटर के फ़ंक्शन के रूप में औसत लोच होगी। अंत में, δ और इसके एसडी पर निर्भरता की अवहेलना करते हुए औसत लोच भी रिपोर्ट की जाती है।
   15. सॉफ़्टवेयर को बंद करें और सहेजे गए परिणामों को पसंद के किसी अन्य सॉफ़्टवेयर में इनपुट करें ताकि डेटा को आगे प्लॉट किया जा सके और सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सके।
   16. यह चरण वैकल्पिक है: ग्राफ़ पर राइट-क्लिक करके और निर्यात का चयन करके GUI से ग्राफ़ निर्यात करें। ग्राफ को .svg में निर्यात करें, ताकि फ़ॉन्ट, फ़ॉन्ट आकार, लाइन शैली आदि जैसे पैरामीटर हों। पसंद के किसी अन्य सॉफ्टवेयर में संपादित किया जा सकता है।
       नोट: कस्टम सीपी एल्गोरिदम और फिल्टर को प्रोग्राम किया जा सकता है और पहले से मौजूद लोगों में जोड़ा जा सकता है। विवरण के लिए अनुपूरक नोट 1 देखें।

Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, एफ-जेड कर्व्स का एक सेट प्राप्त किया जाता है। डेटासेट में सबसे अधिक संभावना है कि अच्छे वक्र होंगे, और विश्लेषण जारी रखने से पहले वक्रों को त्याग दिया जाएगा। सामान्य तौर पर, वक्रों को त्याग दिया जाना चाहिए यदि उनका आकार चित्रा 4 ए में दिखाए गए से अलग है। चित्रा 5 एआई नैनोप्रेपर जीयूआई में अपलोड किए गए अपेक्षित ई 0.8 केपीए³⁵ के नरम पीएएएम हाइड्रोगेल पर प्राप्त ~ 100 वक्रों का डेटासेट दिखाता है। अधिकांश वक्र एक स्पष्ट, सपाट आधार रेखा, एक संक्रमण क्षेत्र और एक ढलान वाले क्षेत्र को प्रस्तुत करते हैं जो सामग्री¹³ की स्पष्ट कठोरता के आनुपातिक है। हालांकि, वक्रों का एक अल्पसंख्यक चित्रा 4 ए में दिखाए गए आकार से परिवर्तन दिखाता है, जैसे कि बेसलाइन की अनुपस्थिति, मिस्ड संपर्क, या ढलान वाली बेसलाइन। इन वक्रों को नैनोप्रेयर (चित्रा 5 एआईआई, लाल वक्र) का उपयोग करके डेटासेट से आसानी से हटाया जा सकता है, और मानक जेएसओएन प्रारूप (चित्रा 5 ए III) में सहेजा गया एक साफ डेटासेट। स्वच्छ डेटासेट नैनोएनालिसिस (चित्रा 5बीआईवी) में अपलोड किया गया है, जिसे डिज़ाइन किया गया है ताकि यह बैच सभी वक्रों को संसाधित करे। इसका मतलब है कि वर्कफ़्लो का प्रत्येक चरण पूरे डेटासेट पर लागू होता है। अपलोड किए जाने के बाद, चर्चा में वर्णित एक या अधिक फ़िल्टर, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों (चित्रा 5बीवी) का उपयोग करके यादृच्छिक शोर को हटाने के लिए वक्रों को फ़िल्टर किया जा सकता है। सीपी तब सॉफ्टवेयर में लागू एल्गोरिदम में से एक का उपयोग करके स्थित है और चर्चा में विस्तृत है, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम (चित्रा 5 बीवीआई)। एक बार सीपी की पहचान हो जाने के बाद, एफ-जेड डेटा को एफ-δ डेटा में परिवर्तित किया जाता है। चूंकि सॉफ्टवेयर को मुख्य रूप से ऑप्टिकल फाइबर सेंसिंग के आधार पर फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटेशन उपकरणों से डेटा का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जो गोलाकार टिप वाले प्रोब का उपयोग करते हैं, हर्ट्ज विश्लेषण हर्ट्ज मॉडल पर आधारित है जो त्रिज्या आर के एक गोले और असीम रूप से विस्तारित रैखिक लोचदार सजातीय आइसोट्रोपिक (एलईएचआई) आधा स्थान¹³ के बीच संपर्क को दर्शाता है:

जहां F बल है, δ इंडेंटेशन है, E यंग का मापांक है, और a पॉइसन का अनुपात है, जिसे असंगतता मानते हुए 0.5 के रूप में लिया जाता है। समीकरण (1) के साथ एफ-δ वक्रों को फिट करके, ई का अनुमान लगाया जा सकता है (हर्ट्ज मॉडल की मान्यताओं के लिए प्रोटोकॉल में चर्चा-महत्वपूर्ण कदम देखें) (चित्रा 5बीवीआईआई)।

हर्ट्ज विश्लेषण के अलावा, सॉफ्टवेयर एक अधिक उन्नत विश्लेषण कर सकता है, अर्थात्, लोच स्पेक्ट्रा, जो सेल नैनोइंडेंटेशन डेटा के लिए विशेष रूप से उपयोगी है; और हर्ट्ज मॉडल के माध्यम से प्राप्त यांत्रिक गुणों पर अंतर्निहित सब्सट्रेट के प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है। नीचे, दृष्टिकोण संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। पूर्ण विवरण मूल प्रकाशन²⁴ में पाया जा सकता है।

ओलिवर-फार मॉडल³⁶ से शुरू होकर, जो मनमाने ढंग से ज्यामिति और एक लोचदार आधे स्थान के एक एक्सिसिमेट्रिक पंच के इंडेंटेशन का वर्णन करता है, कोई गोलाकार इंडेंटर के विशिष्ट मामले के लिए ई (δ) प्राप्त कर सकता है। 0.5 के रूप में लेते हुए, E(δ) का रूप²⁴ है:

समीकरण (2) का उपयोग करके प्रत्येक एफ-δ वक्र के लिए कंप्यूटिंग ई (δ) वक्रों का एक सेट उत्पन्न करता है, अर्थात्, लोच स्पेक्ट्रा (ईएस)। डेटा सेट में सभी वक्रों का औसत लेने से, औसत ईएस प्राप्त किया जाता है (चित्रा 5BVIII, लाल ठोस रेखा)। औसत ईएस एक उपयोगी उपकरण है क्योंकि यह जानकारी प्रदान करता है कि ई डेटासेट में δ के साथ कैसे भिन्न होता है। सेल नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के विशिष्ट मामले में, सेल की मोटाई को प्राथमिकता नहीं दी जाती है, जिसका अर्थ है कि हर्ट्ज विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त फिटिंग रेंज चुनना कुछ हद तक मनमाना है। औसत ईएस का उपयोग करके, स्पष्ट ई (δ) पर सब्सट्रेट प्रभाव स्पष्ट हो जाते हैं, जिसका अर्थ है कि उपकरण का उपयोग एक उपयुक्त फिटिंग रेंज का चयन करने के लिए किया जा सकता है, जो उस बिंदु के अनुरूप है जहां ई (δ) इसके क्षय के बाद बढ़ना शुरू होता है। इसके अलावा, यह पहले प्रदर्शित किया गया है और कम्प्यूटेशनल और प्रयोगात्मक रूप से मान्य किया गया है कि एक साधारण बाइलेयर मॉडल एक्टिन कॉर्टेक्स की मोटाई (डी₀), एक्टिन कॉर्टेक्स के यंग के मापांक (ई₀), और सेल के थोक यंग के मापांक (ई_बी) ²⁴ के आकलन में प्रभावी है। मॉडल सेल को एक बाईलेयर के रूप में वर्णित करता है, जिसमें मोटाई डी₀ और मापांक ई₀ की सबसे बाहरी परत होती है, और लोचदार मापांक ई_बी<ई₀ के साथ अनंत मोटाई की एक आंतरिक परत होती है:

जहां आर टिप की त्रिज्या है और ए एक घटनात्मक पैरामीटर है, जिसे परिमित तत्व विश्लेषण सिमुलेशन²⁴ से 1.74 निर्धारित किया गया था। इस प्रक्रिया को नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर में लागू किया गया है, जो ई₀, ई_बी और डी 0 (चित्रा 5 बीVIII, ब्लैक डैश्ड लाइन) का अनुमान प्राप्त करने के लिए समीकरण (3) के साथ औसत ईएस फिट करने की अनुमति देता है। पूर्ण पद्धतिसंबंधी विवरण के लिए, मूल प्रकाशन²⁴ देखें।

प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए, ज्ञात ई (एएफएम द्वारा मापा ^{गया) 35} के पीएएएम हाइड्रोगेल की लोच प्रोटोकॉल के भाग 1 में सुझाई गई प्रक्रिया का उपयोग करके तैयार और परीक्षण की गई थी। प्रत्येक जेल के लिए, नमूने के दो अलग-अलग क्षेत्रों में दो कठोरता मानचित्रों को एक वाणिज्यिक फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर का उपयोग करके प्राप्त किया गया था, जिसमें आर = 52 μm और k = 0.46 N / m युक्त एक टिप थी। प्रत्येक मानचित्र में विस्थापन नियंत्रण में किए गए 50 इंडेंटेशन शामिल थे, और ओवरसैंपलिंग से बचने के लिए एक्स और वाई में चरण आकार 20 μm पर सेट किया गया था। चित्रा 6 ए एक नरम पीएएएम हाइड्रोगेल (अपेक्षित ई 0.8 केपीए) और एक कठोर पीएएएम हाइड्रोगेल (अपेक्षित ई 8 केपीए) ³⁵ के लिए औसत हर्ट्ज मॉडल के साथ औसत एफ-δ वक्र को दर्शाता है। नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर के माध्यम से हर्ट्ज विश्लेषण करके और ई के व्यक्तिगत मूल्यों को प्लॉट करके, अपेक्षित ई को दोनों हाइड्रोगेल (चित्रा 6 बी) के लिए पुनः प्राप्त किया गया था।

इसके अलावा, एचईके 293 टी कोशिकाओं पर नैनोइंडेंटेशन प्रयोग किए गए थे। प्रत्येक सेल पर एक्स और वाई स्टेप साइज 0.5 μm पर सेट किए गए मैट्रिक्स स्कैन के साथ छह अलग-अलग कोशिकाओं को इंडेंट किया गया था और प्रत्येक सेल पर न्यूनतम 25 वक्र प्राप्त किए गए थे। इसके परिणामस्वरूप विश्लेषण किए गए डेटासेट में ~ 200 वक्र शामिल थे। चयनित जांच में R = 3.5 μm और k = 0.02 N/m था।

चित्रा 7 ए औसत हर्ट्ज वक्र और संबंधित औसत हर्ट्ज मॉडल को दर्शाता है, जिसे 200 एनएम के इंडेंटेशन तक नैनोएनालिसिस में प्रत्येक व्यक्तिगत वक्र में फिटिंग समीकरण (1) से प्राप्त औसत ई का उपयोग करके प्लॉट किया गया है। ई को 915 ± 633 पीए (एसडी ± माध्य) पाया गया, जो साहित्य²⁴ में बताए गए मूल्यों के अनुसार है। इसके व्यापक उपयोग के बावजूद, हर्ट्ज मॉडल सेल नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों (चित्रा 7 ए) के लिए बढ़ती इंडेंटेशन गहराई के साथ बल के विकास को पूरी तरह से कैप्चर नहीं करता है। इस वजह से, ईएस एकल कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से उपयुक्त उपकरण है।

चित्र 7बी औसत ईएस को दर्शाता है, साथ में समीकरण (3) 200 एनएम के इंडेंटेशन तक फिट होता है। औसत ईएस ~ 200 एनएम की इंडेंटेशन गहराई पर बढ़ना शुरू होता है, जो जांच किए गए स्पष्ट ई (चित्रा एस 4) में सब्सट्रेट के योगदान को इंगित करता है। इस वजह से, 200 एनएम को हर्ट्ज मॉडल (चित्रा 7 ए) और बाइलेयर मॉडल (चित्रा 7 बी) दोनों के लिए फिटिंग रेंज के रूप में चुना गया था। औसत ईएस के लिए फिटिंग समीकरण (3) ने महत्वपूर्ण जानकारी निकालने की अनुमति दी, जो अन्यथा हर्ट्ज मॉडल का उपयोग करके विश्लेषण किए गए सरल नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों से दुर्गम रहेगा। विशेष रूप से, एक्टिन कॉर्टेक्स का मापांक ई₀ 5.794 ± 0.095 केपीए होने का अनुमान लगाया गया था, एक्टिन कॉर्टेक्स की मोटाई डी₀ 311 ± 3 एनएम और थोक मापांक ई_बी 0.539 ± 0.002 केपीए (एसडी ±) पाया गया था। सभी मान एक ही सेल प्रकार²⁴ पर एएफएम का उपयोग करके किए गए पिछले प्रयोगों के अनुसार हैं, और साहित्य^37,38 में रिपोर्ट किए गए मूल्यों के साथ हैं। विशेष रूप से, एक्टिन कॉर्टेक्स³⁷ अनुयायी कोशिकाओं के लिए 300-400 एनएम के बीच होने की उम्मीद है, और सेल³⁸ के थोक की तुलना में 10 गुना तक कठोर है।

बाइलेयर मॉडल के बावजूद, मानक हर्ट्ज मॉडल और ईएस दृष्टिकोण के साथ प्राप्त परिणामों के बीच एक सीधी तुलना चित्रा 7 सी में दी गई है, जो तुलनीय साधनों के साथ अतिव्यापी वितरण का खुलासा करती है।

चित्रा 1: प्रोटोकॉल अवलोकन। प्रोटोकॉल में निम्नलिखित भाग होते हैं: (ए) भाग 1: नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए नमूना (या तो हाइड्रोगेल या कोशिकाएं) तैयार करना। (बी) भाग 2: सही जांच चुनना और जांच को कैलिब्रेट करना। (सी) भाग 3: नमूने पर कठोरता मानचित्र प्राप्त करके नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों का प्रदर्शन करना। (डी) भाग 4: डेटा का विश्लेषण करना, जिसमें शामिल हैं i) पहले जीयूआई (नैनोप्रीपर) के माध्यम से अधिग्रहित डेटासेट को साफ करना और साफ किए गए डेटासेट और संबंधित मेटाडेटा को मानक जेएसओएन फ़ाइल के रूप में सहेजना; और ii) दूसरे जीयूआई (नैनोएनालिसिस) में साफ किए गए डेटासेट का विश्लेषण करना, जिसमें नमूने के यंग के मापांक ई का अनुमान लगाने के लिए डेटा फ़िल्टरिंग, सीपी पहचान और मॉडल फिटिंग शामिल है। परिणाम आगे प्लॉटिंग और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सहेजे जाते हैं, जिसे पसंद के किसी भी सॉफ्टवेयर में किया जा सकता है। Biorender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2: नमूना तैयार करना। (ए) नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए फ्लैट पीएएएम हाइड्रोगेल तैयार करने के लिए सुझाए गए कदम। ये हैं: I) हाइड्रोजेल समाधान को हाइड्रोफोबिक ग्लास स्लाइड पर डालना और इसे सिलनाइज्ड कवरस्लिप के साथ कवर करना; II) पोलीमराइजेशन होने के लिए 20 मिनट तक प्रतीक्षा करना और ग्लास स्लाइड से कवरस्लिप-जेल कम्पोजिट को छीलना; और III) एक पेट्री डिश में कवरस्लिप-जेल कम्पोजिट को संलग्न करना और नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए उचित समाधान (इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में शुद्ध पानी) जोड़ना। एक ही तर्क को किसी अन्य प्रकार के हाइड्रोगेल के लिए अनुकूलित और लागू किया जा सकता है। (बी) नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए सुझाए गए कदम। ये हैं: I) बीज कोशिकाएं और सेल आसंजन की प्रतीक्षा करना; II) कोशिका चक्र (वैकल्पिक) के संदर्भ में कोशिका आबादी को सिंक्रनाइज़ करने के लिए कोशिकाओं को भूखा करना; और III) नैनोइंडेंटेशन प्रयोगशुरू करने से पहले कोशिकाओं के वांछित संयोजन पर एक पालन अवस्था में होने की प्रतीक्षा करना। Biorender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3: नैनोइंडेंटेशन जांच अवलोकन और चयन। (ए) फेरूल-टॉप प्रोब (बाएं) की योजनाबद्ध और 250 μm (दाएं) त्रिज्या के गोलाकार सिरे के साथ एक फेरूल-टॉप जांच की तस्वीर। सभी घटकों को फोटो में लेबल किया गया है। (बी) कैंटिलीवर और गोलाकार नोक का बढ़ा हुआ योजनाबद्ध। कैंटिलीवर को लोचदार स्थिरांक के हुकियन स्प्रिंग के रूप में माना जाता है (प्रतिनिधित्व उद्देश्यों के लिए एक कोण पर दिखाया गया है)। टिप को इसकी त्रिज्या, R द्वारा परिभाषित किया गया है। जब नमूना इंडेंट किया जाता है, तो जांच को इसकी संदर्भ स्थिति z ₀ से एक राशि z द्वारा विस्थापित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कैंटिलीवर अपने संदर्भ झुकाव d ₀ से झुकता है। नमूने पर F = k (d - d₀) का बल लागू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक इंडेंटेशन δ = (z - z₀) - (d - d₀) होता है। (सी) कैंटिलीवर की कठोरता के को सब्सट्रेट की अपेक्षित लोच के अनुसार चुना जाना चाहिए। प्लॉट को 1 μm के इंडेंटेशन के साथ हर्टज़ियन संपर्क पर विचार करते हुए प्राप्त किया गया था, यह मानते हुए कि ऊर्जा कैंटिलीवर के झुकने और सब्सट्रेट के इंडेंटेशन (यानी, डी = δ) के बीच समान रूप से साझा की जाती है। टिप त्रिज्या जितनी बड़ी होगी, कैंटिलीवर को दिए गए ई के साथ सब्सट्रेट के लिए समान इंडेंटेशन तक पहुंचने के लिए उतना ही कठोर होना चाहिए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 4: F-z वक्रों की रूपात्मक विशेषताएं। (A) एक सफल प्रयोग के परिणामस्वरूप F-z वक्र के दृष्टिकोण खंड में एक स्पष्ट आधार रेखा होती है (टिप नमूने के करीब आती है लेकिन संपर्क में नहीं होती है); एक संक्रमण क्षेत्र जहां टिप पहले नमूने से संपर्क करता है; और एक क्षेत्र जहां विस्थापन के साथ बल बढ़ता है, जहां नोक उत्तरोत्तर नमूने को प्रभावित कर रही है। इस क्षेत्र की ढलान सामग्री¹³ की स्पष्ट कठोरता के समानुपाती है, जिसका अर्थ है कि कठोर बायोमैटेरियल्स (जैसे, अत्यधिक क्रॉसलिंक्ड जैल) से संबंधित वक्र नरम बायोमैटेरियल्स (जैसे, कमजोर क्रॉसलिंक्ड जैल और कोशिकाओं) से संबंधित लोगों की तुलना में तेज होंगे। (बी) एक दृष्टिकोण वक्र जहां टिप ने कभी भी नमूने के संपर्क में प्रवेश नहीं किया। समाधान के लिए चर्चा में विधि का समस्या निवारण देखें. (सी) एक दृष्टिकोण वक्र जहां टिप नमूने के संपर्क में शुरू हुई। समाधान के लिए चर्चा में विधि का समस्या निवारण देखें. दिखाया गया डेटा अपेक्षित ई 0.8 केपीए³⁵ के नरम पीएएएम हाइड्रोगेल पर किए गए एक प्रयोग से है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(ए) सॉफ्ट पीएएएम हाइड्रोगेल (अपेक्षित ई 0.8 केपीए³⁵) पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर का उपयोग करके प्राप्त एफ-जेड कर्व्स का एक उदाहरण डेटासेट नैनोप्रेयर में अपलोड किया गया था। जो कर्व्स चित्रा 4 ए में वर्णित आकृति का पालन नहीं करते हैं, उन्हें डेटासेट से बाहर रखा जाता है, और स्वच्छ डेटासेट और संबंधित मेटाडेटा को मानक जेएसओएन फ़ाइल के रूप में सहेजा जाता है। (बी) स्वच्छ डेटासेट को दूसरे जीयूआई (नैनोएनालिसिस) में अपलोड किया जाता है जहां शोर को हटाने के लिए एक या अधिक फिल्टर लागू करके वक्रों को फ़िल्टर किया जा सकता है (देखें चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)। इसके अलावा, सभी वक्रों के लिए सीपी का स्वचालित रूप से पता लगाने के लिए एक सीपी एल्गोरिदम का चयन किया जाता है (देखें चर्चा, प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम)। हर्ट्ज विश्लेषण तब किया जाता है, जिससे प्रत्येक इंडेंटेशन के लिए एक एफ-δ वक्र मिलता है, जिसे ई के स्कैटर प्लॉट को प्राप्त करने के लिए हर्ट्ज मॉडल के साथ फिट किया जाता है। प्राप्त परिणामों को आगे की साजिश के लिए सहेजा जा सकता है। कोशिकाओं के लिए, लोच स्पेक्ट्रा²⁴ नामक एक अतिरिक्त विश्लेषण किया जा सकता है। दिखाए गए सभी ग्राफ़ सीधे नैनोप्रेयर और नैनोएनालिसिस जीयूआई दोनों से निर्यात किए गए थे। वर्कफ़्लो के प्रत्येक चरण का विवरण मुख्य पाठ में दिया गया है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(ए) एक नरम पीएएएम हाइड्रोगेल (अपेक्षित ई 0.8 केपीए 35) और एक कठोर पीएएएम हाइड्रोगेल (अपेक्षित ई 8 केपीए 35) पर प्राप्त ~ 100^{वक्रों} के एक सेट से औसत एफ-δ ^{वक्र।} ठोस रेखाएं माध्य दिखाती हैं और छायांकित बैंड एक एसडी दिखाता है। डैश्ड लाइन नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर से औसत ई का उपयोग करके प्लॉट किए गए हर्ट्ज मॉडल को दर्शाती है, जिसे हर्ट्ज मॉडल को प्रत्येक वक्र में 2,000 एनएम (~ 4% आर, आर = 52 μm, k = 0.46 N / m) तक फिट करके प्राप्त किया जाता है। डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ प्रोमिनेसी फिल्टर का उपयोग करके कर्व्स को चिकना किया गया था, और सीपी को आरओवी एल्गोरिदम³² का उपयोग करके पहचाना गया था। (बी) सांख्यिकीय तुलना के लिए नैनोएनालिसिस में किए गए विश्लेषण से प्राप्त ई के व्यक्तिगत मूल्य। रेनक्लाउड प्लॉट संदर्भ³⁹ में वर्णित पायथन मॉड्यूल का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। पी < 0.0001, दो पूंछ वाला अप्रकाशित टी-टेस्ट, α = 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 7: HEK293T कोशिकाओं की लोच। (A) छह अलग-अलग HEK293T कोशिकाओं पर प्राप्त ~ 200 वक्रों के एक सेट से औसत F-δ वक्र। ठोस नीली रेखा माध्य दिखाती है और छायांकित बैंड एक एसडी दिखाता है। डैश्ड लाइन नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके गणना किए गए औसत ई का उपयोग करके हर्ट्ज मॉडल को प्लॉट करती है, जिसे हर्ट्ज मॉडल को 200 एनएम (~ 6% आर, आर = 3.5 μm, k = 0.02 N / m) के अधिकतम इंडेंटेशन तक प्रत्येक वक्र में फिट करके प्राप्त किया जाता है। वक्रों को डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ प्रोमिनेसी फिल्टर और ऑर्डर 3 और विंडो लंबाई 80 एनएम के साथ एसएवीजीओएल फ़िल्टर³⁴ का उपयोग करके चिकना किया गया था, और सीपी को थ्रेशोल्ड एल्गोरिदम³³ का उपयोग करके पहचाना गया था। हर्ट्ज मॉडल का उपयोग करते हुए, सेल को यंग के मापांक ई के साथ एक सजातीय क्षेत्र के रूप में माना जाता है, जैसा कि इनसेट में योजनाबद्ध रूप से दिखाया गया है (नाभिक को चित्रात्मक उद्देश्यों के लिए चित्रित किया गया है)। (बी) औसत लोच स्पेक्ट्रा (ए) में वर्णित एक ही डेटा सेट पर गणना की गई। ठोस लाल रेखा माध्य दिखाती है और छायांकित बैंड एक एसडी दिखाता है। औसत लोच स्पेक्ट्रा के लिए एक बाईलेयर मॉडल फिट करके, ई₀, ई_बी और डी₀ के अनुमानों की गणना की जाती है। दिखाए गए डेटासेट के लिए: E₀ = 5.79 ± 0.09 kPa, E_b = 0.539 ± 0.002 kPa और d₀ = 311 ± 3 nm (एसडी ± माध्य)। (सी) ई वितरण के संदर्भ में हर्ट्ज मॉडल और लोच स्पेक्ट्रा दृष्टिकोण के बीच तुलना। लोच स्पेक्ट्रा के लिए, वितरण औसत लोच स्पेक्ट्रा से ई के मूल्यों का प्रतिनिधित्व करता है, इंडेंटेशन गहराई (200 एनएम के अधिकतम इंडेंटेशन तक) की परवाह किए बिना। हिस्टोग्राम पर सुपरइम्पोज की गई निरंतर लाइनें अंतर्निहित वितरण के गॉसियन कर्नेल घनत्व अनुमान हैं। E = 915 ± 633 Pa (Hertz) और E = 890 ± 297 Pa (लोच स्पेक्ट्रा) (एसडी ± माध्य)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।  

चित्रा एस 1: अंशांकन प्रक्रिया। (ए) सफल तरंग दैर्ध्य स्कैन। तरंगदैर्ध्य स्कैन (बाएं) के दौरान कैंटिलीवर का विक्षेपण और पीजो का विस्थापन संकेत। तरंगदैर्ध्य स्कैन (दाएं) के अंत में इंटरफेरोमीटर की स्क्रीन पर साइनसोइडल तरंग। (बी) सतह प्रक्रिया का पता लगाएं। कैंटिलीवर का विक्षेपण और पीजो का विस्थापन संकेत देता है क्योंकि एक कठोर सब्सट्रेट के संपर्क के बाद जांच को 1 μm चरणों में कम किया जाता है। (ग) ज्यामितीय कारक अंशांकन। एक कठोर सब्सट्रेट के इंडेंटेशन के दौरान, कैंटिलीवर का विक्षेपण कैंटिलीवर के विस्थापन (क्रमशः हरी और नीली रेखाओं) का अनुसरण करता है। इंडेंटेशन लगभग शून्य (लाल रेखा) होना चाहिए। यदि विक्षेपण समय में विस्थापन (हरी डैश्ड लाइन) को पीछे छोड़ देता है, तो जांच पूरी तरह से कठोर सब्सट्रेट के संपर्क में नहीं होती है। (डी) डिमॉड्यूलेशन सिग्नल। अंशांकन प्रक्रिया (बाएं) के अंत में इंटरफेरोमीटर की स्क्रीन पर और नैनोइंडर (दाएं) पर टैप करते समय डीमॉड्यूलेशन सिग्नल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा एस 2: नैनोप्रीपर जीयूआई। नैनोप्रीपर जीयूआई के स्क्रीनशॉट। प्रत्येक विजेट की कार्यक्षमता पर विवरण मुख्य प्रोटोकॉल और चर्चा में दिए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा एस 3: नैनोएनालिसिस जीयूआई। नैनोएनालिसिस जीयूआई के स्क्रीनशॉट। प्रत्येक विजेट की कार्यक्षमता पर विवरण मुख्य प्रोटोकॉल और चर्चा में दिए गए हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक नोट 1: नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर में कस्टम फिल्टर और सीपी एल्गोरिदम जोड़ना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक प्रोटोकॉल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा एस 4: औसत लोच स्पेक्ट्रा की गहराई निर्भरता। प्लॉट एक एसडी (σ (ई (δ)) के साथ औसत लोच स्पेक्ट्रा <ई (δ) > (ठोस लाल रेखा) दिखाता है। प्रारंभिक क्षय के बाद, औसत लोच स्पेक्ट्रा बढ़ने लगता है, जो मुख्य रूप से जांच किए गए स्पष्ट लोचदार मापांक पर कठोर अंतर्निहित सब्सट्रेट के प्रभाव से जुड़ा होता है। हर्ट्ज मॉडल को एफ-δ वक्रों में फिट करने के लिए उपयोग की जाने वाली अधिकतम इंडेंटेशन गहराई, और औसत लोच स्पेक्ट्रा के लिए क्षय मॉडल चुना जाना चाहिए ताकि अंतर्निहित सब्सट्रेट परिणामों (फिट रेंज) को प्रभावित न करे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि हाइड्रोगेल और एकल कोशिकाओं दोनों पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर का उपयोग करके बल स्पेक्ट्रोस्कोपी नैनोइंडेंटेशन डेटा को मजबूत रूप से कैसे प्राप्त किया जाए। इसके अलावा, पायथन में प्रोग्राम किए गए ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर के उपयोग के लिए निर्देश प्रदान किए जाते हैं जिसमें नैनोइंडेंटेशन डेटा के विश्लेषण के लिए एक सटीक वर्कफ़्लो शामिल होता है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय निम्नलिखित चरणों को विशेष महत्व के रूप में पहचाना गया है।

नमूना तैयार करना

यह महत्वपूर्ण है कि माप शुरू करने से पहले, नमूना माप के अवरोधों को ध्यान में रखते हुए तैयार किया जाता है। यही है, नमूना एक सतह का पालन किया जाना चाहिए और जितना संभव हो उतना सपाट होना चाहिए। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब नमूने तैयार किए जाते हैं जो स्वाभाविक रूप से सतहों का पालन नहीं करते हैं जैसा कि कोशिकाएं करती हैं, जैसे कि हाइड्रोगेल। सबसे पहले, नमूना समाधान में तैरना नहीं चाहिए क्योंकि यह माप में हस्तक्षेप करेगा और संभावित रूप से जांच को नुकसान पहुंचाएगा। इसके लिए, एक कवरस्लिप के रासायनिक कार्यात्मककरण की सिफारिश की जाती है, ताकि हाइड्रोगेल को एक सतह का पालन करके पोलीमराइज्ड किया जा सके, जिसे बाद में जलमग्न होने पर पेट्री डिश से चिपकाया जा सकता है। इसके अलावा, नमूने की सतह जांच द्वारा सुसंगत सतह का पता लगाने और मैट्रिक्स स्कैन के दौरान एक्स और वाई में चलते समय जांच को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए यथासंभव सपाट होनी चाहिए। हाइड्रोजेल समाधान को हाइड्रोफोबिक ग्लास स्लाइड पर पॉलीमराइज्ड किया जा सकता है, जो परिणामी हाइड्रोगेल को इसका पालन किए बिना सपाट बनाता है। यदि इन विचारों का पालन नहीं किया जाता है, तो स्वच्छ एफ-जेड डेटा प्राप्त करना मुश्किल होगा।

सेल तैयारी के मामले में, डेटा समरूपता में सुधार के लिए समान आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं की पहचान करना सबसे अच्छा है। यदि कोशिकाएं विषम आबादी में बढ़ती हैं, तो सेल चक्र सिंक्रनाइज़ेशन में सहायता के लिए एक सीरम भुखमरी चरण को पूर्व-माप पेश किया जा सकता है और इसलिए, संभावित प्रयोगात्मक^{तत्वों} को हटा दिया जा सकता ^है। गैर-अनुयायी कोशिकाओं या ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के मामले में, माप करते समय जैविक नमूने की स्थिरता और पालन सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त कदम उठाने चाहिए। अतिरिक्त चरणों में रासायनिक रूप से कोशिकाओं को कल्चर प्लेटों में बांधना या ऊतक चिपकने वाले पदार्थों का उपयोग करना शामिल हो सकता है जो अब व्यापक रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

नैनोइंडेंटेशन प्रयोग

यह महत्वपूर्ण है कि नमूने के अपेक्षित ई¹⁵ के आधार पर सही के साथ एक कैंटिलीवर चुना जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि यदि कैंटिलीवर बहुत कठोर है, तो नमूना इंडेंटेड होगा लेकिन कोई महत्वपूर्ण कैंटिलीवर झुकने वाला नहीं होगा। इसके विपरीत, यदि कैंटिलीवर नमूने के संबंध में बहुत नरम है, तो कैंटिलीवर न्यूनतम इंडेंटेशन के साथ अत्यधिक झुक जाएगा। दोनों उदाहरणों के परिणामस्वरूप बाद के विश्लेषण में ई की गलत गणना होगी।

जांच अंशांकन के लिए, अंशांकन डिश के तरल का सामना करते समय सतह के तनाव को कम करने के लिए अंशांकन डिश में सम्मिलन से पहले जांच को गीला किया जाना चाहिए। ऐसा नहीं करने से हवा के बुलबुले फंस सकते हैं या ऑप्टिकल फाइबर के खिलाफ कैंटिलीवर को धक्का दे सकते हैं। इससे जांच को नुकसान भी हो सकता है।

अंशांकन के लिए एक मोटी ग्लास पेट्री डिश के उपयोग की सिफारिश की जाती है। कांच कैंटिलीवर की तुलना में असीम रूप से कठोर है, जो कांच को इंडेंट करते समय कैंटिलीवर के के सटीक अंशांकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, ग्लास का वजन एक स्थिर सब्सट्रेट सुनिश्चित करता है जो हल्के प्लास्टिक पेट्री डिश की तुलना में शोर (जैसे, वायु प्रवाह और ध्वनिक कंपन) के खिलाफ अधिक मजबूत है। अंशांकन डिटेक्टर (वी / टी) पर मापा गया इंटरफेरोमेट्रिक सिग्नल की एक रैखिककरण प्रक्रिया करता है, जिसका अर्थ है कि सिग्नल को रैखिककरण उपकरण¹⁸ के रूप में यूनिट सर्कल (डीमॉड्यूलेशन सर्कल) का उपयोग करके रैखिक कैंटिलीवर झुकने (μm / t) में परिवर्तित किया जाएगा। विक्षेपण संवेदनशीलता (μm/V) इंटरफेरोमीटर में डिफ़ॉल्ट रूप से सेट की जाती है और V को μm में परिवर्तित करने के लिए उपयोग की जाती है। इस प्रक्रिया के दौरान, अंशांकन कारक भी निर्धारित किया जाता है, जो गोलाकार टिप और फाइबर स्थिति के बीच की स्थिति में बेमेल से उत्पन्न होता है जहां सिग्नल रीड-आउट होता है (चित्रा 3 ए)। एक कठोर सब्सट्रेट जैसे कांच पर इंडेंटिंग करके, फाइबर द्वारा मापा गया विक्षेपण लगभग पीजो द्वारा विस्थापित दूरी के समान होता है, जिसका अर्थ है कि इंडेंटेशन गहराई लगभग शून्य है। उनके अनुपात को लेने से अंशांकन कारक उत्पन्न होता है। यह महत्वपूर्ण है कि उपकरण का अंशांकन सही ढंग से किया जाता है, और यह कि एफ-जेड डेटा प्राप्त करना जारी रखने से पहले सभी जांच संतुष्ट हैं।

इंडेंटेशन प्रोफ़ाइल को कॉन्फ़िगर करते समय, हर्ट्ज मॉडल की मान्यताओं को ध्यान में रखना उपयोगी होता है, जिसका उपयोग बाद में डेटा का विश्लेषण करने के लिए किया जाएगा। हर्ट्ज मॉडल यह मानते हुए लिया गया है कि नमूना एक लेही असीम रूप से विस्तारित आधा स्थान है, जिसके परिणामस्वरूप निम्नलिखित व्यावहारिक परिणाम होते हैं: i) लागू उपभेदों को 20% से अधिक नहीं होना चाहिए (अंगूठे के नियम के रूप में, δ टिप के आर के 10% से अधिक नहीं होना चाहिए) और ii) δ नमूना मोटाई के 10% से कम होना चाहिए, और अन्य नमूने के आयाम¹³ की तुलना में छोटा होना चाहिए।

अधिकतम विस्थापन (या ऑपरेशन मोड के आधार पर इंडेंटेशन गहराई / बल) को परिणामी δ के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, और क्या सतह या थोक यांत्रिक गुण वांछित हैं। यदि नमूना थोड़ा बड़ा δ में लगाया गया है, तो हर्ट्ज मॉडल को अभी भी अधिकतम δ तक फिट किया जा सकता है जो नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर में इसकी मान्यताओं के भीतर निहित है, और इस सीमा का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाने वाला औसत ईएस ( प्रतिनिधि परिणाम देखें)।

सेल नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के लिए, एक ही सेल पर कई मैट्रिक्स स्कैन करना चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, यदि सेल काफी बड़ा है, तो एक और उपयुक्त क्षेत्र ढूंढना और उसी सेल पर प्रक्रिया को दोहराना संभव हो सकता है, उदाहरण के लिए, एक प्रयोग जहां उपयोगकर्ता दूसरे की तुलना में सेल के एक निश्चित क्षेत्र के यांत्रिक गुणों में अंतर का पता लगाना चाहता है। आमतौर पर, प्रति सेल एक नक्शा किया जाता है, और प्रति जैविक स्थिति में न्यूनतम पांच कोशिकाओं को इंडेंट किया जाता है। प्रयोग को कम से कम तीन बार दोहराने की सलाह दी जाती है ताकि प्रत्येक नमूने पर पर्याप्त डेटा प्राप्त किया जा सके (यानी, प्रत्येक जैविक स्थिति के लिए तीन प्रतिकृतियां)।

गंभीर रूप से, अधिग्रहित वक्रों को एक सपाट आधार रेखा, एक संक्रमण क्षेत्र और एक ढलान क्षेत्र प्रस्तुत करना चाहिए। सीपी के स्थान पर अनिश्चितता के कारण जो वक्र बेसलाइन प्रस्तुत नहीं करते हैं, उनका बाद में विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। यदि वक्र चित्र 4 ए में दिखाए गए आकार से विचलित होते हैं, तो प्रयोग जारी रखने से पहले संपर्क सीमा को अनुकूलित किया जाना चाहिए (नीचे दी गई विधि का समस्या निवारण देखें)।

तकनीक की प्रकृति को देखते हुए सांख्यिकीय रूप से मजबूत परिणाम सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त डेटा प्राप्त किया जाना चाहिए, जो स्थानीय रूप से यांत्रिक गुणों की जांच करता है।

डेटा विश्लेषण

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सॉफ्टवेयर को नियमित रूप से नैनोइंडेंटेशन डेटा का विश्लेषण करने के लिए अपनाया जाता है और इसका उपयोग कई सहकर्मी-समीक्षा पत्रिकाओं में प्रकाशित परिणाम प्राप्त करने के लिए किया गया है (उदाहरण के लिए, हाइड्रोगेल ^8,21 का नैनोइंडेंटेशन, कोशिकाओं का नैनोइंडेंटेशन^24,42)। नैनोइंडेंटेशन डेटा का विश्लेषण गैर-तुच्छ है। निम्नलिखित भागों पर विशेष ध्यान देने का सुझाव दिया जाता है:

डेटासेट की स्क्रीनिंग: डेटासेट को नैनोप्रीपर सॉफ्टवेयर में पूरी तरह से जांचा जाना चाहिए, और साफ किए गए डेटासेट को जेएसओएन फ़ाइल के रूप में सहेजने से पहले सभी असफल वक्रों को हटा दिया जाना चाहिए। कर्व्स को अभी भी नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर में विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है, लेकिन JSON फ़ाइल को बदला नहीं जा सकता है। जैसे, साफ और विश्लेषण किए गए डेटासेट के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, नैनोप्रीपर सॉफ्टवेयर में स्क्रीनिंग प्रक्रिया को सावधानीपूर्वक करने का सुझाव दिया जाता है।

डेटा फ़िल्टर करना: फ़िल्टर का उपयोग करना तब उपयोगी होता है जब डेटा शोर होता है और ईएस विश्लेषण करते समय अनुशंसित होता है। नीचे वर्णित के रूप में तीन प्रमुख फिल्टर का उपयोग किया जाता है।

प्रोमिनेंसी: यह फिल्टर फूरियर स्पेस में प्रमुख चोटियों को हटा देता है, ताकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर्स के विशिष्ट वाद्य दोलनों को खत्म किया जा सके। फ़िल्टर तीन मापदंडों पर आधारित है: प्रोमिनेंसी (ए.यू.): फूरियर स्पेस में पीक प्रोमिनेंसी; न्यूनतम आवृत्ति (चैनल): फ़िल्टर की जाने वाली न्यूनतम आवृत्ति; बैंड (शिखर स्थिति का%) : चोटी की स्थिति के प्रतिशत में फ़िल्टर की गई आवृत्ति के चारों ओर की चौड़ाई। चेकबॉक्स पर क्लिक करके और डिफ़ॉल्ट पैरामीटर छोड़कर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर से उत्पन्न डेटा के लिए इस फ़िल्टर को सक्रिय करें।

Savitzky Golay (SAVGOL), SciPy लाइब्रेरी³⁴ (scipy.signal.savgol_filter) से एल्गोरिथ्म: यह फ़िल्टर स्थानीय न्यूनतम-वर्ग बहुपद अनुमान के आधार पर डेटा को सुचारू बनाता है। यदि डेटा विशेष रूप से शोर है तो इस फ़िल्टर को सक्रिय करें। डेटा कितना शोर है, इसके आधार पर जीयूआई में बहुपद और फ़िल्टर विंडो की लंबाई का क्रम बदलें। अधिक जानकारी के लिए, संदर्भ ^30,31 देखें। ES विश्लेषण के लिए इस फ़िल्टर को सक्रिय करें।

Median फ़िल्टर, SciPy लाइब्रेरी³⁴ से एल्गोरिथ्म (scipy.signal.medfilt): यह फ़िल्टर किसी दिए गए विंडो में उस बिंदु के आसपास गणना किए गए माध्य के साथ प्रत्येक बिंदु को बदलने के आधार पर डेटा को सुचारू करता है। डेटा कितना शोर है, इसके आधार पर जीयूआई में विंडो की लंबाई बदलें। इस फ़िल्टर का उपयोग SAVGOL फ़िल्टर के विकल्प के रूप में किया जाता है।

प्रोमिनेंसी फिल्टर को सक्रिय करने से वाद्य शोर (कम आवृत्ति दोलनों) को हटाने में मदद मिलती है जो वाणिज्यिक फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर के विशिष्ट होते हैं। सामान्य तौर पर, सरल हर्ट्ज विश्लेषण करते समय एसएवीजीओएल³⁴ जैसे अन्य फिल्टर को सक्रिय करना आवश्यक नहीं है। ईएस की गणना करते समय, डेटा में मौजूद शोर के स्तर के आधार पर एक स्मूथिंग विंडो के साथ प्रोमिनेंसी फिल्टर और एसएवीजीओएल फिल्टर³⁴ दोनों को सक्रिय करने की सिफारिश की जाती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि ईएस में एक व्युत्पन्न शब्द (समीकरण 2) होता है, जो शोर के प्रति बहुत संवेदनशील होता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 7 में परिणाम विंडो 80 एनएम और बहुपद क्रम 3 के साथ एसएवीजीओएल फिल्टर³⁴ के साथ प्रोमिनेंसी फिल्टर का उपयोग करके प्राप्त किए गए थे। हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि डेटा को अधिक चिकना न किया जाए, क्योंकि यह डेटासेट के बीच मौजूद किसी भी अंतर को छिपा सकता है।

सीपी पहचान: विश्लेषण का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा सीपी की पहचान है, जो ई के पूर्ण मूल्य और इसके वितरण^32,33 दोनों को दृढ़ता से प्रभावित करता ^है। मानव पूर्वाग्रह को दूर करने के लिए सीपी का पता लगाने वाली स्वचालित खोज प्रक्रियाओं पर आधारित चार एल्गोरिदम नैनोएनालिसिस सॉफ्टवेयर में लागू किए गए हैं। सभी एल्गोरिदम को साहित्य^32,33 में प्रलेखित किया गया है। सामान्य तौर पर, रुचि के क्षेत्र में प्रत्येक बिंदु को परीक्षण सीपी के रूप में परीक्षण किया जाता है जबकि एक एल्गोरिथ्म-विशिष्ट पैरामीटर की गणना की जा रही है। वह बिंदु जो अनुकूलित पैरामीटर लौटाता है, जो एल्गोरिथ्म के आधार पर इसका अधिकतम या न्यूनतम मान हो सकता है, को सीपी³² के रूप में लिया जाता है। उन प्रक्रियाओं को मानव पूर्वाग्रह को दूर करने और समस्या के लिए एक सांख्यिकीय दृष्टिकोण लेने के लिए लागू किया गया है। क्योंकि प्रत्येक एल्गोरिथ्म किसी दिए गए पैरामीटर के अनुकूलन के आधार पर सीपी की गणना करता है, पहचाने गए सीपी प्रत्येक एल्गोरिदम के लिए थोड़ा अलग होगा। इस प्रकार, डेटासेट के बीच एक ही सीपी एल्गोरिदम और विशिष्ट मापदंडों (जैसे, आरओवी एल्गोरिदम के लिए विंडो लंबाई) को बनाए रखना सर्वोपरि है, जिसकी तुलना कोई करना चाहता है, क्योंकि ई में सापेक्ष अंतर संरक्षित किया जाएगा। विभिन्न सीपी एल्गोरिदम और उनके मापदंडों को नीचे संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है।

फिट (जीओएफ) की अच्छाई: रुचि के क्षेत्र में प्रत्येक (जेड, एफ) जोड़ी से संपर्क यांत्रिकी मॉडल (हर्ट्ज) फिट करने और उच्चतम आर² मूल्य वाले फिट का चयन करने पर आधारित एक दृष्टिकोण। यह अच्छी तरह से काम करता है जहां गैर-संपर्क और संपर्क के बीच संक्रमण स्पष्ट है, जो अत्यधिक क्रॉसलिंक्ड हाइड्रोगेल जैसी कठोर सामग्री के साथ होता है। एल्गोरिथ्म कम्प्यूटेशनल रूप से महंगा है, और आम तौर पर सबसे धीमा है। यहां, इसे लागू किया गया है ताकि हर्ट्ज मॉडल केवल आर के लगभग 10% की अधिकतम δ तक फिट हो, क्योंकि यह अधिक^{सटीक परिणाम देने} के लिए दिखाया गया है।

विचरण का अनुपात (आरओवी): गैर-संपर्क और संपर्क क्षेत्र³² में विक्षेपण (बल) संकेत के विचरण के अनुपात की गणना पर आधारित एक दृष्टिकोण।

दूसरा व्युत्पन्न: विक्षेपण (बल) संकेत³³ के दूसरे व्युत्पन्न पर आधारित एक दृष्टिकोण। सिग्नल साफ होने पर यह अच्छी तरह से काम करता है। यदि संकेत बहुत शोर है, तो इस दृष्टिकोण की सिफारिश नहीं की जाती है।

सीमा: गैर-संपर्क क्षेत्र^में औसत विक्षेपण (बल) पर आधारित एक दृष्टिकोण। संक्षेप में, संपर्क क्षेत्र के पास उपयोगकर्ता द्वारा चुने गए बल मान से शुरू होकर, एल्गोरिथ्म प्रत्येक बिंदु के माध्यम से बेसलाइन की ओर बढ़ता है, जब तक कि यह पहला बिंदु नहीं ढूंढता है जिसका बल मूल्य बेसलाइन के औसत से बड़ा है। इस बिंदु को CP के रूप में चुना गया है। यह एल्गोरिथ्म बहुत मजबूत है और उपयोग करने के लिए अनुशंसित है।

प्रत्येक एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के तरीके के बारे में विवरण नीचे दिया गया है। सीपी एल्गोरिदम में संख्यात्मक स्थिरांक शामिल होते हैं जिन्हें विशिष्ट डेटासेट के अनुरूप जीयूआई में बदलने की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, निम्नलिखित पैरामीटर जीओएफ, आरओवी और सेकंड डेरिवेटिव विधि के लिए सामान्य हैं, जिससे वक्रों (रुचि का क्षेत्र या आरओआई) के उप-क्षेत्र का चयन करने की अनुमति मिलती है जहां सीपी की खोज की जाएगी:

सुरक्षित सीमा (nN): यह nN (और संबंधित z बिंदु) में अधिकतम बल को परिभाषित करता है जिसमें से CP को खोजा जाएगा। यह ROI की सही सीमा है, जिसका डिफ़ॉल्ट मान 10 nN है। सभी वक्र जिनका अधिकतम बल इस सीमा से नीचे है, स्वचालित रूप से विफल सेट पर ले जाया जाएगा। इस मान को गैर-संपर्क से संपर्क में संक्रमण से थोड़ा ऊपर बल मान में बदलें.

एक्स रेंज (एनएम): यह सुरक्षित सीमा के अनुरूप जेड बिंदु से एनएम में सीमा को परिभाषित करता है। यह ROI की बाईं सीमा है। 1,000 एनएम का डिफ़ॉल्ट एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन यदि सीपी वक्र में बहुत देर से पाया जाता है (यानी, ढलान वाले क्षेत्र में), तो इस मान को बढ़ाएं। इसके विपरीत, यदि सीपी बहुत जल्दी पाया जाता है (यानी, बेसलाइन में), तो इस मान को कम करें।

प्रत्येक एल्गोरिथ्म के लिए विशिष्ट पैरामीटर यहां संक्षेप में दिए गए हैं। जीओएफ के लिए, विंडो फिट (एनएम) परीक्षण सीपी से एनएम में खिड़की का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें हर्ट्ज मॉडल फिट किया गया है। यह R के 10% के मान पर सीमित है। आरओवी के लिए, विंडो आरओवी (एनएम) परीक्षण सीपी के बाईं और दाईं ओर एनएम में खिड़की का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर विक्षेपण (बल) संकेत के विचरण की गणना की जाती है। दूसरे व्युत्पन्न के लिए, विंडो पी (एनएम) एसएवीजीओएल फिल्टर³⁴ को पारित खिड़की का प्रतिनिधित्व करता है जिसका उपयोग विक्षेपण (बल) संकेत के दूसरे व्युत्पन्न की गणना करने के लिए किया जाता है। डिफ़ॉल्ट मान विभिन्न एल्गोरिदम के परीक्षण से सेट किए गए हैं और आमतौर पर उन्हें बदलने की आवश्यकता नहीं होती है।

थ्रेशोल्ड एल्गोरिथ्म के लिए, निम्न पैरामीटर परिवर्तित किया जा सकता है:

संरेखित सीमा (nN): वह बल (F₀) जिसमें से CP को इस बिंदु से शुरू करने और आधार रेखा की ओर बढ़ने के लिए देखा जाएगा। सभी वक्र जिनका अधिकतम बल इस सीमा से नीचे है, स्वचालित रूप से विफल सेट पर ले जाया जाएगा। इसका डिफ़ॉल्ट मान 10 nN है; हालांकि, इस मान को गैर-संपर्क से संपर्क में संक्रमण से थोड़ा ऊपर बल मान में बदलें। संबंधित z बिंदु (z₀) एल्गोरिथ्म में बाद में उपयोग के लिए संग्रहीत किया जाता है (नीचे देखें)।

बाएं चरण (एनएम) संरेखित करें: यह पैरामीटर जेड 0 (डिफ़ॉल्ट मान _2,000 एनएम) के बाईं ओर जोड़ने के लिए शिफ्ट को परिभाषित करता है, जिसके परिणामस्वरूप (जेड₀ - संरेखित बाएं चरण) द्वारा परिभाषित बिंदु की गणना होती है। यह बिंदु वह बिंदु है जिसके चारों ओर बेसलाइन के औसत की गणना की जाएगी (नीचे देखें)।

औसत क्षेत्र (एनएम): यह पैरामीटर (जेड 0 - संरेखित बाएं चरण) के बाईं और _दाईं ओर औसत क्षेत्र को परिभाषित करता है, जिस पर बेसलाइन के औसत की गणना की जाएगी। इसका डिफ़ॉल्ट मान 100 एनएम है, और इसे बदलने की आवश्यकता नहीं है।

एफ₀ से नीचे, सीपी को पहले बिंदु के रूप में लिया जाता है जिसका मूल्य बेसलाइन के औसत द्वारा परिभाषित बल से ऊपर है।

ईएस और शोर पर ध्यान दें: औसत ईएस प्रमुख साइनसोइडल दोलनों के साथ पहली बार शोर दिखाई दे सकता है, और परिणामस्वरूप समीकरण (3) सही ढंग से फिट नहीं हो सकता है। यदि यह मामला है, तो स्मूथिंग SAVGOL फ़िल्टर³⁴ की विंडो बढ़ाने से आमतौर पर इस समस्या का समाधान होता है।

विधि के संशोधन और समस्या निवारण

विधि का समस्या निवारण

तरंगदैर्ध्य स्कैन समस्या निवारण
यदि तरंगदैर्ध्य स्कैन करने के बाद इंटरफेरोमीटर के डिस्प्ले पर एक त्रुटि संदेश दिखाई देता है, तो निम्नलिखित समस्याएं कारण हो सकती हैं: i) पर्यावरण शोर से दूषित हो सकता है। एयरफ्लो, तेज शोर और यांत्रिक कंपन सहित किसी भी शोर स्रोतों से छुटकारा पाएं; ii) जांच ठीक से जुड़ी नहीं हो सकती है। ग्रीन ऑप्टिकल फाइबर कनेक्टर को अनप्लग और री-प्लग करें; iii) कैंटिलीवर गंदा हो सकता है। कुछ मिनटों के लिए आइसोप्रोपेनॉल युक्त पेट्री डिश में जांच को डुबोकर इसे साफ करें, और फिर पानी; iv) कैंटिलीवर पर एक हवा का बुलबुला मौजूद हो सकता है। जांच को एक पेट्री डिश में डुबोएं जिसमें आइसोप्रोपेनोल होता है और तरल को ऊपर और नीचे पाइप करके कुछ प्रवाह बनाते हैं; v) कैंटिलीवर को फाइबर से मोड़ा / चिपकाया जा सकता है, जिसे माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है। टिशू वाइप के साथ कैंटिलीवर को धीरे से स्पर्श करके इसे छोड़ दें। कैंटिलीवर को छूते समय अतिरिक्त सावधानी बरतें क्योंकि अत्यधिक बल का उपयोग इसे तोड़ सकता है; vi) जांच से कैंटिलीवर गायब है, जिसे माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जा सकता है। एकमात्र समाधान एक नई जांच का उपयोग करना है। तरंगदैर्ध्य स्कैन को फिर से आज़माएं, जो अब सफल होना चाहिए।

अंशांकन समस्या निवारण
यदि अंशांकन विफल हो जाता है और नया कारक या तो एनएएन है या अपेक्षित सीमा में नहीं है, तो निम्नलिखित समस्याएं कारण हो सकती हैं: i) टिप पूरी तरह से सब्सट्रेट के संपर्क में नहीं है। प्रोटोकॉल में दिए गए चरणों का पालन करके सुनिश्चित करें कि टिप सब्सट्रेट के संपर्क में है; ii) टिप और ग्लास सतह (स्नैप-ऑन व्यवहार) के बीच आकर्षक बलों के परिणामस्वरूप ओवर-बेंड कैंटिलीवर का अंशांकन होता है। जांच को 5 मिनट के लिए आइसोप्रोपेनोल में डुबोकर साफ करें, और फिर पानी। आइसोप्रोपेनोल के साथ पकवान साफ करें; पकवान दूषित हो सकता है: जांच को 5 मिनट के लिए आइसोप्रोपेनोल में डुबोकर साफ करें, और फिर पानी। आइसोप्रोपेनोल के साथ पकवान साफ करें; iv) कैंटिलीवर को फाइबर से मोड़ा/चिपकाया जा सकता है। इसे धीरे से एक ऊतक पोंछे के साथ स्पर्श करके छोड़ दें। समस्या निवारण के बाद तरंगदैर्ध्य स्कैन और अंशांकन दोनों को दोहराएं।

समस्या निवारण से संपर्क करें
यदि वक्र चित्रा 4 ए में दिखाए गए आकार से विचलित होते हैं, तो प्रयोग को जारी रखने से पहले प्रयोगात्मक मापदंडों को समायोजित करने की आवश्यकता होती है। सबसे आम समस्याओं में से दो हैं:

एक दृष्टिकोण वक्र जहां टिप कभी भी नमूने के संपर्क में प्रवेश नहीं करती है (चित्रा 4 बी)। यह तब होता है जब संपर्क सीमा को बहुत कम मान पर सेट किया जाता है, और शोर कैंटिलीवर को दी गई सीमा के अनुरूप राशि से झुकने का कारण बनता है। इस समस्या को हल करने के लिए, विकल्प मेनू पर नेविगेट करें और धीरे-धीरे 0.01 के चरणों पर दहलीज बढ़ाएं और तब तक इंडेंटेशन करें जब तक कि वक्र चित्रा 4 ए में दिखाए गए जैसा दिखता है। एक ही मेनू में गति कम करने से भी इस समस्या को हल करने में मदद मिल सकती है।

एक दृष्टिकोण वक्र जहां टिप नमूने के संपर्क में शुरू हुई (चित्रा 4 सी)। यह तब होता है जब संपर्क सीमा को बहुत अधिक मान पर सेट किया जाता है, और कैंटिलीवर पहली बार नमूने को छूते समय दी गई सीमा के अनुरूप राशि से नहीं झुकता है। इस समस्या को हल करने के लिए, धीरे-धीरे 0.01 के चरणों पर विकल्प मेनू में दहलीज कम करें और तब तक इंडेंटेशन करें जब तक कि वक्र चित्रा 4 ए में दिखाए गए जैसा न हो। यह मुद्दा विशेष रूप से समस्याग्रस्त है क्योंकि बेसलाइन की अनुपस्थिति सीपी की सही गणना को रोकती है, जिससे अंततः ई की गलत गणना होती है ।

विधि के संशोधन
प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के हाइड्रोगेल के ई को निर्धारित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। पीएएएम हाइड्रोगेल को इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया था क्योंकि वे मेकेनोबायोलॉजी के क्षेत्र में उपयोग किए जाने वाले सबसे आम हाइड्रोगेल हैं। हालांकि, प्रोटोकॉल किसी भी प्रकार के लोचदार हाइड्रोगेल²⁵ पर समान रूप से लागू होता है, दोनों सिंथेटिक, उदाहरण के लिए, पॉलीथीन-ग्लाइकोल (पीईजी) ⁴³ और जिलेटिन मेथैक्रिलोयल (गेलएमए) ^44,45; और प्राकृतिक, जैसे कोलेजन⁴⁶। इसके अलावा, उचित सीमा के भीतर परीक्षण करने के लिए नमूने के आयामों पर कोई बाधा नहीं है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग सिंथेटिक पीईजी हाइड्रोगेल के ई को निर्धारित करने के लिए किया गया है, जिन्हें बाद में थोक रिओमीटर का उपयोग करके परीक्षण किया गया था और व्यास में ~ 15 मिमी और मोटाई⁸ में ~ 2 मिमी होना आवश्यक था। प्रोटोकॉल को पीडीएमएस झिल्ली के ई को चिह्नित करने के लिए भी लागू किया गया है जो पेट्री डिश (परिणाम प्रकाशित नहीं) में बहुलक थे।

पारंपरिक उल्टे चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किए गए एकल कोशिकाओं के मानक इंडेंटेशन के अलावा, फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर जटिल इमेजिंग सिस्टम के साथ संगत हैं और इसका उपयोग स्थानीय लोच उपकोशिकीय संरचनाओं की जांच के लिए किया गया है, जैसे कि सेल का नाभिक और साइटोप्लाज्म⁴⁷। जबकि चरणों को विशिष्ट ऑप्टिकल सिस्टम के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता होगी, यह प्रोटोकॉल नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों को करने और परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण करने के संबंध में सामान्य प्रयोज्यता का है।

इसके अलावा, प्रोटोकॉल कोशिकाओं और हाइड्रोगेल के यांत्रिक गुणों को मापने तक सीमित नहीं है और इसे ऑर्गेनोइड⁴⁸, स्फेरॉइड⁴⁹ और गुर्दे, यकृत, प्लीहा और गर्भाशय²³ जैसे पूरे ऊतकों सहित अधिक जटिल प्रणालियों के स्थानीय लोचदार गुणों को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। पाठक को ऐसे नमूनों पर नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों के प्रदर्शन पर विशिष्टताओं के लिए ^23,48,49 संदर्भों के लिए निर्देशित किया जाता है। विचार करने के लिए एक पहलू यह है कि विस्थापन नियंत्रण ओपन-लूप मोड में काम करता है और नमूने से प्रतिक्रिया प्राप्त नहीं करता है। इस प्रकार, निरंतर तनाव / तनाव और गति सुनिश्चित नहीं की जाती है, और नमूने के नरम हिस्सों को कठोर क्षेत्रों की तुलना में अधिक और तेजी से इंडेंट किया जाएगा। यह यांत्रिक रूप से विषम नमूनों जैसे ऊतकों के लिए प्रासंगिक है, जहां इंडेंटेशन कंट्रोल (आई मोड) या लोड कंट्रोल (पी मोड) चुनना अधिक उपयुक्त है, जो नमूने के यांत्रिक रूप से विषम क्षेत्रों में लगातार तनाव / तनाव और गति सुनिश्चित करता है।

विधि की सीमाएँ
सबूतों का एक बढ़ता हुआ शरीर है कि लोच के अलावा विस्कोस्टिकिटी, शारीरिक और पैथोलॉजिकल रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि कोशिकाएं, ईसीएम और ऊतक विस्कोस्टिक हैं, और लोच उनके यांत्रिक व्यवहार ^50,51,52,53 के केवल एक घटक का प्रतिनिधित्व करती ^है। जबकि फेरूल-टॉप नैनोइंडर विस्कोस्टिकिटी को चिह्नित करने के लिए कार्यक्षमता प्रदान करते हैं, जिसमें तनाव छूट, रेंगने वाला अनुपालन और गतिशील यांत्रिक विश्लेषण शामिल हैं, जो विभिन्न आवृत्ति (समय) व्यवस्थाओं पर भंडारण और हानि मापांक दोनों को निकालने के लिए है, यह प्रोटोकॉल केवल लोच पर केंद्रित है, जो मेकेनोबायोलॉजी और ऊतक इंजीनियरिंग के संदर्भ में सबसे अधिक अध्ययन किया गया यांत्रिक चर बना हुआ है (उदाहरण के लिए, संदर्भ³ देखें)।

प्रयोगों और डेटा विश्लेषण दोनों पर परिणामों के साथ अंतर्निहित धारणा यह है कि इंडेंटेड सब्सट्रेट एक लेही ठोस के रूप में व्यवहार करता है। इसका मतलब है कि तनाव-तनाव प्रतिक्रिया रैखिक है, कोई समय-निर्भर व्यवहार नहीं हैं, और नमूना यांत्रिक रूप से सजातीय और आइसोट्रोपिक है। इन मान्यताओं के आधार पर, सब्सट्रेट के यांत्रिक गुणों को एक विशिष्ट संपर्क यांत्रिकी मॉडल के बाद यंग के मापांक के माध्यम से निर्धारित किया जाता है, इस मामले में, हर्ट्ज मॉडल (समीकरण 1)। विरूपण के लिए, रासायनिक रूप से क्रॉसलिंक हाइड्रोजेल जैसे कि इस प्रोटोकॉल³⁵ में उपयोग किए जाने वाले पीएएएम जैल लगभग लोचदार ठोस पदार्थों के रूप में व्यवहार करते हैं और विस्कोस्टिक प्रभाव न्यूनतम और नगण्य^होते हैं। दूसरी ओर, कोशिकाएं लेही ठोस नहीं हैं और जटिल यांत्रिक व्यवहार दिखाती हैं^। यंग का कोशिकाओं का मापांक इंडेंटेशन प्रक्रिया की तनाव दर (यानी, गति) पर अत्यधिक निर्भर है, हालांकि, कोई स्पष्ट प्रवृत्ति स्थापित नहीं हुई है और अतिरिक्त चर जैसे टिप आकार और अधिकतम इंडेंटेशन गहराई इस संबंध को प्रभावित करते^हैं। बहरहाल, अर्ध-स्थैतिक विकृतियों के लिए, जैसे कि इस प्रोटोकॉल (v = 5 μm / s) में उपयोग किए जाने वाले, कोशिकाएं एक चिह्नित लोचदार प्रतिक्रिया दिखाती हैं और क्षयकारी प्रभाव न्यूनतम⁹ होते हैं। तनाव दर निर्भरता को समय-निर्भर चर को ध्यान में रखते हुए अधिक जटिल मॉडल द्वारा कैप्चर किया जा सकता है, जिसके लिए पाठक को⁵⁴ के लिए संदर्भित किया जाता है।

इसके अलावा, एक ही अंतर्निहित धारणा के बाद, हर्ट्ज और ईएस विश्लेषण दोनों में पोइसन का अनुपात (3) 0.5 के रूप में लिया जाता है। नमूनों के बीच तुलना करते समय, यह केवल एक गुणांक के रूप में परिणामों को प्रभावित करता है; हालांकि, 55 कोशिकाओं के लिए आवृत्ति-निर्भर मात्रा के रूप में दिखाया गया है और हाइड्रोगेल⁵⁶ के लिए 0.5 से विचलित होने के लिए दिखाया गया है।

प्रोटोकॉल की एक और सीमा इस तथ्य में निहित है कि सॉफ्टवेयर अधिक परिष्कृत संपर्क यांत्रिकी मॉडल के माध्यम से ई की मात्रा का निर्धारण प्रदान नहीं करता है। हर्ट्ज मॉडल एएफएम प्रयोगों में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला संपर्क यांत्रिकी मॉडल है और यह बेहद प्रभावी^{है 13,15}; हालांकि, यह टिप और नमूने के बीच छोटी या लंबी दूरी के आकर्षक बलों जैसे अधिक जटिल घटनाओं को ध्यान में नहीं रखता है। जॉनसन-केंडल-रॉबर्ट्स मॉडल जैसे अधिक जटिल मॉडल इन व्यवहारों को पकड़ सकते हैं¹³, लेकिन सॉफ्टवेयर में लागू नहीं किए जाते हैं। जटिलता में विभिन्न संपर्क यांत्रिकी मॉडल के अवलोकन के लिए, पाठक को^{संदर्भ 13} के लिए निर्देशित किया जाता है।

मौजूदा/वैकल्पिक विधियों के संबंध में विधि का महत्व
माइक्रोस्केल पर बायोमैटेरियल्स और एकल कोशिकाओं के स्थानीय लोचदार गुणों को निर्धारित करने के लिए सबसे आम दृष्टिकोण एएफएम 13,14,15,16 है। एक शक्तिशाली और बहुमुखी उपकरण होने के बावजूद, एएफएम को अपने जटिल सेटअप के कारण व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, इससे पहले कि उपयोगकर्ता मजबूत रूप से प्रयोग कर सकें। फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर्स एक प्लग-एंड-प्ले समाधान प्रदान करते हैं, जबकि अभी भी बायोमैटेरियल्स के स्थानीय यांत्रिक गुणों की जांच के लिए μm रिज़ॉल्यूशन के साथ एनएन बलों को लागू करने की अनुमति देते हैं (उदाहरण के लिए, संदर्भ 8,19,20,21)। जबकि मेकेनोबायोलॉजी¹⁶ और ऊतक इंजीनियरिंग¹⁴ के संदर्भ में एएफएम के उपयोग के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल मौजूद हैं, फेरूल-टॉप नैनोइंडेंटर उपकरणों के संचालन का विवरण देने वाले कोई प्रोटोकॉल नहीं हैं। यह प्रोटोकॉल एक अनुभवहीन उपयोगकर्ता को हाइड्रोगेल और कोशिकाओं दोनों पर नैनोइंडेंटेशन प्रयोग करने की अनुमति देता है, दिशानिर्देशों का पालन करके जो समुदाय के भीतर प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो को मानकीकृत करने का इरादा रखते हैं। इसके अलावा, नैनोइंडेंटेशन प्रयोगों का डेटा विश्लेषण गैर-तुच्छ है और प्रोग्रामिंग में अनुभव के बिना उपयोगकर्ताओं के लिए काफी हद तक दुर्गम रहेगा। सहज ज्ञान युक्त सॉफ़्टवेयर के उपयोग के लिए निर्देश प्रदान किए जाते हैं जो अधिग्रहित डेटासेट को प्रकाश और मानक प्रारूप में साफ करने और सहेजने की अनुमति देता है और मानक हर्ट्ज विश्लेषण के साथ-साथ ईएस विश्लेषण²⁴ को कुछ क्लिक के साथ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से करता है।

इस प्रोटोकॉल का पालन करके, एएफएम का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के साथ तुलनीय परिणाम प्राप्त किए जाते हैं, दोनों हाइड्रोगेल के ई (संदर्भ³⁵ की तुलना में चित्रा 6 में परिणाम) और कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों (संदर्भ²⁴ की तुलना में चित्रा 7 में परिणाम) जटिलता के एक अंश पर। विधि सामान्य प्रयोज्यता की है और इसे विभिन्न प्रकार के नैनोइंडेंटर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, कुछ चरणों को विशिष्ट डिवाइस के आधार पर संशोधित किया जाता है।

विशिष्ट अनुसंधान क्षेत्रों में विधि का महत्व और संभावित अनुप्रयोग
कोशिकाओं, हाइड्रोगेल और ऊतकों के लोचदार गुणों को चिह्नित करना कई शोध प्रयोगशालाओं में मानक अभ्यास है जो मेकेनोबायोलॉजी, ऊतक इंजीनियरिंग / पुनर्योजी चिकित्सा और³ से परे पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एकल कोशिकाओं, हाइड्रोगेल के लोचदार गुणों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, और यांत्रिक गुणों में परिवर्तन द्वारा चिह्नित शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाओं के संदर्भ में ऊतकों और अधिक जटिल बायोमैटेरियल्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, देशी ईसीएम की गतिशीलता की नकल करने के लिए, यह दिखाया गया है कि डिग्रेडेबल 3 डी पीईजी-लैमिनिन हाइड्रोगेल कोशिकाओं को अपने आसपास के वातावरण को फिर से तैयार करने की अनुमति देते हैं,^{जिससे कोशिकाओं} के बिना समान जैल की तुलना में 9 दिनों की अवधि में ~ 50% की जैल ई में कमी आती है। प्रोटोकॉल सामान्य प्रयोज्यता का है और यहां वर्णित नमूने और ऑप्टिकल सेटअप तक सीमित नहीं है। यह परिकल्पना की गई है कि यह प्रोटोकॉल शरीर विज्ञान और रोग में यांत्रिक गुणों के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित करने वाली अनुसंधान प्रयोगशालाओं में नैनोइंडेंटर के उपयोग की सुविधा प्रदान करेगा।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm coverslips	VWR	631-1577P
35 mm cell treated culture dishes	Greiner CELLSTAR	627160
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A4058
Acrylsilane	Alfa Aesar	L16400
Ammonium Persulfate	Merk	7727-54-0
Bisacrylamide	Merk	110-26-9
Chiaro nanoindenter	Optics 11 Life		no catologue number
Ethanol			general
Fetal bovine serum	Gibco	16140071
High glucose DMEM	Gibco	11995065
Isopropanol			general
Kimwipe	Kimberly Clark	21905-026
Microscope glass slides	VWR	631-1550P
MilliQ system	Merk Millipore	ZR0Q008WW
OP1550 Interferometer	Optics11 Life		no catalogue number
Optics 11 Life probe (k = 0.02-0.005 N/m, R = 3-3.5 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Optics 11 Life probe (k = 0.46-0.5 N/m, R = 50-55 um)	Optics 11 Life		no catologue number
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
RainX rain repellent	RainX	26012
Standard petri dishes (90 mm)	Thermo Scientific	101RTIRR
Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	110-18-9
Vaccum dessicator	Thermo Scientific	531-0250
Software
Data acquisition software (v 3.4.1)	Optics 11 Life
GitHub Desktop (Optional)	Microsoft
Python 3	Python Software Foundation
Visual Studio Code (Optional)	Microsoft