Здесь описан способ сделать растительные ткани прозрачными при сохранении стабильности флуоресцентных белков. Этот метод облегчает глубокую визуализацию очищенных растительных тканей без физического сечения.
Трудно непосредственно наблюдать внутреннюю структуру многослойных и непрозрачных образцов растений без рассечения под микроскопом. Кроме того, автофлуоресценция, приписываемая хлорофиллу, затрудняет наблюдение флуоресцентных белков в растениях. Долгое время для того, чтобы сделать растения прозрачными, использовались различные очищающие реагенты. Однако обычные клиринговые реагенты уменьшают флуоресцентные сигналы; поэтому не удалось наблюдать клеточные и внутриклеточные структуры с флуоресцентными белками. Были разработаны реагенты, которые могут очищать растительные ткани, удаляя хлорофилл при сохранении стабильности флуоресцентного белка. Здесь представлен подробный протокол оптической очистки растительных тканей с использованием очищающих реагентов ClearSee (CS) или ClearSeeAlpha (CSA). Подготовка очищенных растительных тканей включает в себя три этапа: фиксацию, промывку и очистку. Фиксация является решающим шагом в поддержании клеточных структур и внутриклеточной стабильности флуоресцентных белков. Время инкубации для очистки зависит от типа ткани и вида. У Arabidopsis thaliana время, необходимое для очистки КС, составляло 4 дня для листьев и корней, 7 дней для рассады и 1 месяц для пестиков. CS также потребовалось относительно короткое время в 4 дня, чтобы сделать гаметофитные листья Physcomitrium patens прозрачными. Напротив, пестики в табаке и торении продуцируют коричневый пигмент из-за окисления во время лечения CS. CSA уменьшал коричневый пигмент, предотвращая окисление, и мог сделать табак и пестики торении прозрачными, хотя это заняло относительно много времени (1 или 2 месяца). CS и CSA также были совместимы с окрашиванием с использованием химических красителей, таких как DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол) и Hoechst 33342 для ДНК и Calcofluor White, SR2200 и Direct Red 23 для клеточной стенки. Этот метод может быть полезен для визуализации всего растения, чтобы выявить интактную морфологию, процессы развития, взаимодействия растений и микробов и инфекции нематод.
Визуализация клеточных структур и локализация белков в живых организмах важна для уточнения их функций in vivo. Однако, поскольку живое тело не является прозрачным, трудно наблюдать внутреннюю структуру живых организмов без рассечения. Особенно, в случае растительных тканей, которые многослойны с клетками разной формы, несоответствие индексов, вызванное их структурой и наличием светопоглощающих пигментов, проблематично. Например, листья растений имеют сложную структуру, которая позволяет им эффективно использовать свет, поступающий в их тела, для фотосинтеза1, тогда как структура также вызывает несоответствие показателя преломления, что затрудняет их наблюдение. Однако листья имеют много светопоглощающих пигментов, таких как хлорофилл, которые выделяют сильную красную флуоресценцию, а коричневатые пигменты образуются при окислении2,3. Эти пигменты также препятствуют наблюдениям флуоресцентной микроскопии у растений. Поэтому для наблюдения за внутренним строением растений, обесцвечивания и фиксации спиртом и очистки с помощью хлоралгидрата долгое время использовались для устранения несоответствия показателя преломления и автофлуоресценции4,5. Эти традиционные методы были приняты в течение многих лет, но у них есть недостаток в устранении флуоресценции флуоресцентных белков одновременно6,7. Это проблематично, поскольку флуоресцентные белки стали незаменимыми в современной флуоресцентной визуализации.
Поэтому ClearSee (CS) и ClearSeeAlpha (CSA) были разработаны в качестве оптических очищающих реагентов для растительных тканей. Оба реагента снижают автофлуоресценцию хлорофилла при сохранении стабильности флуоресцентных белков7,8. CSA особенно полезен, когда коричневые пигменты образуются вследствие окисления тканей. Используя эти очищающие реагенты, можно наблюдать клеточную структуру и локализацию белка внутри растительного тела без физического сечения.
Этот метод состоит из фиксации, стирки и очистки. Фиксация является критическим шагом в этом протоколе. Если флуоресцентный белок не наблюдается после фиксации ПФА, он не будет наблюдаться после обработки очищающим раствором. Проникновение раствора PFA в ткани имеет решающее значение, но лечение высоким вакуумом не рекомендуется, поскольку оно может разрушить клеточную структуру. Условия вакуума и периоды фиксации должны быть оптимизированы для каждого типа тканей и видов. Рекомендуется проверять флуоресцентные белки даже после фиксации. Хотя образцы обычно фиксировали в течение 30-60 мин при комнатной температуре, они могут фиксироваться при 4 °C в течение более длительного времени (ночью или более).
Как показано на рисунке 6А, некоторые дезоксихолаты натрия имели бледно-желтый цвет при растворении. Такие растворы дезоксихолата натрия показали сильную автофлуоресценцию в области 400-600 нм после возбуждения при 380 нм (рис. 6В). Эта автофлуоресценция предотвращает оптическую очистку и флуоресцентную визуализацию. Пользователи должны проверить цвет раствора дезоксихолата натрия, так как качество реагента может отличаться из-за чистоты, вариаций от партии к партии или по другим причинам.
Используемые здесь очищающие растворы имеют высокие концентрации дезоксихолата натрия, который может разрушить мембранную структуру. Маркер плазматической мембраны (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) наблюдался даже после лечения CS7. Тем не менее, может быть лучше уменьшить концентрацию дезоксихолата натрия, в зависимости от структуры и ткани, представляющей интерес. Действительно, изображения с улучшенной четкостью были получены для Arabidopsis pistils с модифицированным CS, в котором концентрация дезоксихолата натрия снижена вдвое; однако снижение концентрации дезоксихолата натрия требовало длительного времени лечения (например, 1 месяц для Arabidopsis pistils).
CS может уменьшить красную автофлуоресценцию (>610 нм) для удаления хлорофилла в обработанных образцах. Однако автофлуоресценция в диапазоне 500-600 нм (от желтого до оранжевого) осталась даже в образцах, обработанных CS7. Считается, что эта автофлуоресценция получена из клеточной стенки и других клеточных компонентов, таких как лигнин12,13. Поэтому трудно сделать ткани, такие как стебли с развитыми вторичными стенками, полностью прозрачными при лечении CS.
Несколько очищающих реагентов, помимо тех, которые используются здесь, были разработаны для наблюдения флуоресцентных белков в растениях с помощью флуоресцентной микроскопии14,15,16,17. По сравнению с этими методами, CS и CSA удаляют хлорофилл и уменьшают автофлуоресценцию, делая ткани растений более прозрачными. Недавно Sakamoto et al. разработали улучшенный метод iTOMEI для фиксации, очистки моющих средств и монтажа для регулировки несоответствия показателя преломления18. У саженцев Arabidopsis iTOMEI очищает ткани в течение 26 ч.
CS применим к широкому спектру видов растений, таких как Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, barley22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Эвкалипт25, кукуруза26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soybean33, strawberry34, wheat35 и Wolffiella hyalina36. Для более толстых тканей CS также может сделать секции вибратома прозрачными37,38. Этот метод позволил изучить клеточную структуру и паттерны экспрессии генов у растений37,38. Кроме того, нематодные инфекции20,39, грибковые инфекции и симбиоз19,40,41 также наблюдались глубоко внутри тканей, обработанных CS. Таким образом, этот метод полезен для визуализации целых тканей от микро- до макромасштабов и может помочь обнаружить новые взаимодействия между различными клетками, тканями, органами и организмами.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Японским обществом содействия развитию науки (Грант в помощи для научных исследований в инновационных областях (JP16H06464, JP16H06280 для T.H.), Грант в помощи для научных исследований (B, JP17H03697 для D.K.), Грант в помощи для сложных поисковых исследований (JP18K19331 в D.K.), Грант в помощи для научных исследований в инновационных областях (JP20H05358 для D.K.)) и Японское агентство по науке и технике (программа PRESTO (JPMJPR15QC to Y.M., JPMJPR18K4 к D.K.)). Авторы благодарны Центру живой визуализации при Институте трансформационных биомолекул (WPI-ITbM) Университета Нагои за поддержку микроскопических исследований и editage (www.editage.com) для редактирования английского языка.
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |