Summary
Здесь описан способ сделать растительные ткани прозрачными при сохранении стабильности флуоресцентных белков. Этот метод облегчает глубокую визуализацию очищенных растительных тканей без физического сечения.
Abstract
Трудно непосредственно наблюдать внутреннюю структуру многослойных и непрозрачных образцов растений без рассечения под микроскопом. Кроме того, автофлуоресценция, приписываемая хлорофиллу, затрудняет наблюдение флуоресцентных белков в растениях. Долгое время для того, чтобы сделать растения прозрачными, использовались различные очищающие реагенты. Однако обычные клиринговые реагенты уменьшают флуоресцентные сигналы; поэтому не удалось наблюдать клеточные и внутриклеточные структуры с флуоресцентными белками. Были разработаны реагенты, которые могут очищать растительные ткани, удаляя хлорофилл при сохранении стабильности флуоресцентного белка. Здесь представлен подробный протокол оптической очистки растительных тканей с использованием очищающих реагентов ClearSee (CS) или ClearSeeAlpha (CSA). Подготовка очищенных растительных тканей включает в себя три этапа: фиксацию, промывку и очистку. Фиксация является решающим шагом в поддержании клеточных структур и внутриклеточной стабильности флуоресцентных белков. Время инкубации для очистки зависит от типа ткани и вида. У Arabidopsis thaliana время, необходимое для очистки КС, составляло 4 дня для листьев и корней, 7 дней для рассады и 1 месяц для пестиков. CS также потребовалось относительно короткое время в 4 дня, чтобы сделать гаметофитные листья Physcomitrium patens прозрачными. Напротив, пестики в табаке и торении продуцируют коричневый пигмент из-за окисления во время лечения CS. CSA уменьшал коричневый пигмент, предотвращая окисление, и мог сделать табак и пестики торении прозрачными, хотя это заняло относительно много времени (1 или 2 месяца). CS и CSA также были совместимы с окрашиванием с использованием химических красителей, таких как DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) и Hoechst 33342 для ДНК и Calcofluor White, SR2200 и Direct Red 23 для клеточной стенки. Этот метод может быть полезен для визуализации всего растения, чтобы выявить интактную морфологию, процессы развития, взаимодействия растений и микробов и инфекции нематод.
Introduction
Визуализация клеточных структур и локализация белков в живых организмах важна для уточнения их функций in vivo. Однако, поскольку живое тело не является прозрачным, трудно наблюдать внутреннюю структуру живых организмов без рассечения. Особенно, в случае растительных тканей, которые многослойны с клетками разной формы, несоответствие индексов, вызванное их структурой и наличием светопоглощающих пигментов, проблематично. Например, листья растений имеют сложную структуру, которая позволяет им эффективно использовать свет, поступающий в их тела, для фотосинтеза1, тогда как структура также вызывает несоответствие показателя преломления, что затрудняет их наблюдение. Однако листья имеют много светопоглощающих пигментов, таких как хлорофилл, которые выделяют сильную красную флуоресценцию, а коричневатые пигменты образуются при окислении2,3. Эти пигменты также препятствуют наблюдениям флуоресцентной микроскопии у растений. Поэтому для наблюдения за внутренним строением растений, обесцвечивания и фиксации спиртом и очистки с помощью хлоралгидрата долгое время использовались для устранения несоответствия показателя преломления и автофлуоресценции4,5. Эти традиционные методы были приняты в течение многих лет, но у них есть недостаток в устранении флуоресценции флуоресцентных белков одновременно6,7. Это проблематично, поскольку флуоресцентные белки стали незаменимыми в современной флуоресцентной визуализации.
Поэтому ClearSee (CS) и ClearSeeAlpha (CSA) были разработаны в качестве оптических очищающих реагентов для растительных тканей. Оба реагента снижают автофлуоресценцию хлорофилла при сохранении стабильности флуоресцентных белков7,8. CSA особенно полезен, когда коричневые пигменты образуются вследствие окисления тканей. Используя эти очищающие реагенты, можно наблюдать клеточную структуру и локализацию белка внутри растительного тела без физического сечения.
Protocol
1. Подготовка клиринговых решений
- Для приготовления раствора CS растворяют 10% (мас./об.) ксилита, 15% (мас./об.) дезоксихолата натрия и 25% (мас./об.) мочевины в дистиллированной воде на магнитной мешалке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок дезоксихолата натрия следует взвешивать в тягловой камере, так как он легко плавает в воздухе. CS можно хранить при комнатной температуре в темноте более 1 года. - Для приготовления раствора CSA добавляют сульфит натрия (конечная концентрация 50 мМ) к полученному выше раствору CS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте сульфит натрия в раствор CS непосредственно перед использованием, так как восстановитель легко деактивируется.
2. Приготовление фиксирующего раствора
- Переложить 40 мл стерилизованной воды в коническую трубку и добавить 2 г параформальдегида. Добавьте 200 мкл 2 N NaOH для повышения рН раствора. После закрытия и герметизации трубки парапленкой инкубируют при 60 °C с редкими инверсиями, пока все не растворится.
- После охлаждения раствора до комнатной температуры добавьте 5 мл 10x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), чтобы отрегулировать рН до 7,4. Добавьте стерилизованную воду, чтобы объем составил до 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно свежеприготовленный фиксирующий раствор. Раствор также можно хранить при -30 °C в течение нескольких месяцев.
3. Фиксация образцов
- Погружайте образцы растений в фиксирующий раствор в микропробирку (рисунок 1А), гарантируя, что объем фиксирующего раствора более чем в пять раз превышает объем образца.
- Запечатайте микротрубку парапленкой и сделайте отверстия с помощью иглы. Не оставляйте трубку открытой из-за риска разлива пробы во время вакуумной декомпрессии.
- Поместите микротрубку в осушитель и медленно отрегулируйте степень вакуума (~690 мм рт.ст.) так, чтобы из образцов постепенно появлялись пузырьки (рисунок 1B-C). Выключите вакуумный насос после эвакуации осушителя. Оставьте микротрубку ненарушенной в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Осторожно выветривайте осушитель, чтобы не повредить образцы. Снова включите вакуумный насос и выключите его после эвакуации осушителя. Оставьте микротрубку ненарушенной в течение 30 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить повреждение образцов во время выпуска осушителя. Проникновение фиксирующего раствора в образцы усиливается двумя вакуумными обработками. Дальнейшая вакуумная обработка способствует проникновению фиксирующего раствора в более толстые образцы. - Осторожно откройте осушитель, не натыкаясь на фиксирующий раствор в микропробирке. Используя микропипетку, удалите фиксирующий раствор и добавьте 1x PBS. После хранения в течение 1 мин замените старый PBS на новый 1x PBS (рисунок 1D).
4. Клиринг
- После удаления PBS добавьте в пять раз больший объем пробы очищающего раствора.
- Запечатайте микротрубку парапленкой и сделайте отверстия с помощью иглы. Поместите образцы в осушитель, откачивайте, как на шаге 3.3, и выключите вакуумный насос. Оставьте микротрубку ненарушенной в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Осторожно откройте осушитель. Закройте микропробирку парапленкой и храните ее при комнатной температуре в темноте, чтобы избежать фотоотбеливания флуоресцентных белков. Инвертировать микропробирку каждые 1-2 дня, чтобы ускорить процесс очистки.
- Когда очищающий раствор станет зеленым, замените его новыми очищающими растворами до тех пор, пока раствор не останется бесцветным (рисунок 1E-H).
Рисунок 1: Порядок обработки КС. (А) Саженец арабидопсиса в 4% растворе ПФА (параформальдегида). (B) Образец помещается в осушитель. (C) Рассада закрепляется под вакуумом. (D) Рассада вымачивается в растворе PFA после вакуумной обработки. (E) Полученная 3-дневная очистка рассады, обработанная раствором. Обратите внимание на зеленый цвет очищающего раствора. (F) Очищающий раствор заменяют через 3 дня после лечения. (G) В результате 5-дневной очистки раствором обработанный рассадой. (H) Очищающий раствор заменяют через 5 дней после лечения. Шкала стержней: 1 см (A,C-H) и 5 см (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5. Химическое окрашивание красителем
- К микротрубке добавляют Hoechst 33342 (конечная концентрация 10 мкг/мл) для ядерного окрашивания или Calcofluor White (конечная концентрация 1 мг/мл) для окрашивания клеточной стенки и ждут 1 ч. После удаления раствора красителя промыть образец свежим очищающим раствором в течение 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ночное окрашивание и стирка могут улучшить проникновение флуоресцентного красителя в ткани и уменьшить фоновую флуоресценцию. Различные флуоресцентные красители совместимы с раствором CS, такие как Basic Fuchsin9 (лигнин), Auramine O9 (лигнин, суберин и кутин), Nile Red9 (суберин), Direct Yellow 969, Direct Red 239 и SR220010,11 (клеточные стенки).
6. Наблюдение
- Вырежьте силиконовый резиновый лист лезвием бритвы, чтобы подготовить раму для распорки (рисунок 2А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте толщину листа резинового кремния в соответствии с толщиной образца. Поскольку образцы, обработанные очищающим раствором, мягкие, они будут повреждены, если их покрыть непосредственно покровным стеклом. - Поместите силиконовую раму на покровное стекло (например, 25 x 60 мм) (рисунок 2B). Поместите обработанные образцы в рамку и добавьте ~100 мкл очищающего раствора, чтобы удалить любые пузырьки в раме. Накройте другим покровным стеклом (18 x 18 мм или 24 x 24 мм) для предотвращения испарения очищающего раствора (рисунок 2C).
- Наблюдайте за образцами под флуоресцентным микроскопом. После наблюдения возвращают образцы в очищающий раствор, взятый в микропробирке, и хранят при комнатной температуре в темноте.
Рисунок 2: Подготовка образца для микроскопического наблюдения. (А) Вырежьте силиконовый лист толщиной 0,2 мм в рамку. (B) Поместите рамку из силиконового листа на защитное стекло. (C) Поместите образец, обработанный очищающим раствором (помеченным пунктирной границей), в рамку и накройте его покровным стеклом. Шкала: 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Representative Results
CS может очищать листья различных видов (рисунок 3A-H). Раствору CS трудно проникнуть в рисовый лист, потому что поверхность листа покрыта кутикулярным воском у этого растения. Однако после извлечения кутикулярного воска путем погружения в хлороформ на 10 с, CS может очистить листья риса (рисунок 3H). Однако CS не смог проникнуть в листья Chamaecyparis obtusa, которые менее проницаемы для CS (рисунок 3I, J). В листьях хризантемы коричневая пигментация, вызванная полифенольным окислением, наблюдалась в листьях, обработанных CS (рисунок 3K, L). Аналогичным образом, табак и пестики торении показали коричневую пигментацию во время лечения CS (рисунок 3M, O). Поскольку компонент сульфита натрия в CSA предотвращает окисление полифенолов благодаря восстановительному эффекту, CSA может очищать пестики табака и торении без какой-либо коричневой пигментации (рисунок 3N, P).
На рисунках 4B показано, что обработка CS уменьшала бледно-зеленый цвет листа Arabidopsis H2B-mClover (яркое поле) и усиливала интенсивность флуоресценции H2B-mClover по сравнению с инкубацией PBS (рисунок 4A). Помимо цветковых растений, CS также применим к моховым растениям (рисунок 4C); после 4 дней лечения КС была четко обнаружена флуоресценция H2B-mRFP для всего гаметофора с пониженной автофлуоресценцией хлорофилла. Рисунки 4D, E показывают 3D-реконструкционные изображения пестика H2B-mClover в Nicotiana benthamiana , очищенные с использованием CSA. Глубина образца составляла 440 мкм. Как показывает проекционное изображение максимальной интенсивности с глубиной, CSA позволяет глубоко визуализировать сложные ткани, такие как табачные пестики.
CS и CSA также были совместимы с флуоресцентным окрашиванием красителем. Рисунок 5 показывает, что CS может одновременно использоваться для наблюдения флуоресцентного белка (H2B-mClover) и органического флуоресцентного окрашивания красителем (Calcofluor White). После 3D-реконструкции из изображений z-stack можно было наблюдать любой участок.
Рисунок 3: Оптическая очистка листьев и пестиков с использованием очищающих растворов. (A-L) Фиксированные листья различных видов инкубировали в PBS (A,C,E,G,I,K) или CS (B,D,F,H,J,L) в течение 8 дней и CS (M,O) или CSA (N,P) в течение 2 дней. (А,Б,О,П) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Шкала: 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Флуоресцентная визуализация тканей, обработанных очищающими растворами. (A,B) UBQ10pro::H2B-mClover листья Arabidopsis thaliana обрабатывали PBS (A) или CS (B) в течение 3 дней. (C) H2B-mRFP листовые гаметофоры Physcomitrium patens обрабатывали КС в течение 4 дней. Ядра были помечены H2B-mRFP (зеленым). Обработка CS снижает аутофлуоресценцию хлорофилла (пурпурный). Сигнал H2B-mRFP в апикальной области четко наблюдался как для объединенных изображений H2B-mRFP, так и для автофлуоресценции или яркого поля. (Д,Д) Стигма UBQ10pro::H2B-mClover Nicotiana benthamiana лечилась в CSA в течение 1 месяца. Проекция максимальной интенсивности (D) и проекция максимальной интенсивности (E) с кодированием глубины были получены из 88 изображений z-стека с интервалами 5 мкм. Шкала стержней: 100 мкм. Снимки были сделаны с использованием широкоугольной (A,B), конфокальной (C) и двухфотонной микроскопии возбуждения (D,E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Флуоресцентное окрашивание красителем совместимо с CS. (A) Обработанные CS листья, наблюдаемые двухфотонной микроскопией возбуждения с возбуждением 950 нм. Клеточная стенка окрашена calcofluor White (голубой). Ядра помечены UBQ10pro::H2B-mClover (желтый). Изображения yz (B) и xz (C) представляют собой поперечные сечения в положении, обозначенном белыми пунктирными линиями в (A). Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Прозрачность дезоксихолата натрия. (А) Цвета различных 15% дезоксихолатов натрия ( перечислены в Таблице материалов). (B) Спектр флуоресценции каждого 15% дезоксихолата натрия с возбуждением 380 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Этот метод состоит из фиксации, стирки и очистки. Фиксация является критическим шагом в этом протоколе. Если флуоресцентный белок не наблюдается после фиксации ПФА, он не будет наблюдаться после обработки очищающим раствором. Проникновение раствора PFA в ткани имеет решающее значение, но лечение высоким вакуумом не рекомендуется, поскольку оно может разрушить клеточную структуру. Условия вакуума и периоды фиксации должны быть оптимизированы для каждого типа тканей и видов. Рекомендуется проверять флуоресцентные белки даже после фиксации. Хотя образцы обычно фиксировали в течение 30-60 мин при комнатной температуре, они могут фиксироваться при 4 °C в течение более длительного времени (ночью или более).
Как показано на рисунке 6А, некоторые дезоксихолаты натрия имели бледно-желтый цвет при растворении. Такие растворы дезоксихолата натрия показали сильную автофлуоресценцию в области 400-600 нм после возбуждения при 380 нм (рис. 6В). Эта автофлуоресценция предотвращает оптическую очистку и флуоресцентную визуализацию. Пользователи должны проверить цвет раствора дезоксихолата натрия, так как качество реагента может отличаться из-за чистоты, вариаций от партии к партии или по другим причинам.
Используемые здесь очищающие растворы имеют высокие концентрации дезоксихолата натрия, который может разрушить мембранную структуру. Маркер плазматической мембраны (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) наблюдался даже после лечения CS7. Тем не менее, может быть лучше уменьшить концентрацию дезоксихолата натрия, в зависимости от структуры и ткани, представляющей интерес. Действительно, изображения с улучшенной четкостью были получены для Arabidopsis pistils с модифицированным CS, в котором концентрация дезоксихолата натрия снижена вдвое; однако снижение концентрации дезоксихолата натрия требовало длительного времени лечения (например, 1 месяц для Arabidopsis pistils).
CS может уменьшить красную автофлуоресценцию (>610 нм) для удаления хлорофилла в обработанных образцах. Однако автофлуоресценция в диапазоне 500-600 нм (от желтого до оранжевого) осталась даже в образцах, обработанных CS7. Считается, что эта автофлуоресценция получена из клеточной стенки и других клеточных компонентов, таких как лигнин12,13. Поэтому трудно сделать ткани, такие как стебли с развитыми вторичными стенками, полностью прозрачными при лечении CS.
Несколько очищающих реагентов, помимо тех, которые используются здесь, были разработаны для наблюдения флуоресцентных белков в растениях с помощью флуоресцентной микроскопии14,15,16,17. По сравнению с этими методами, CS и CSA удаляют хлорофилл и уменьшают автофлуоресценцию, делая ткани растений более прозрачными. Недавно Sakamoto et al. разработали улучшенный метод iTOMEI для фиксации, очистки моющих средств и монтажа для регулировки несоответствия показателя преломления18. У саженцев Arabidopsis iTOMEI очищает ткани в течение 26 ч.
CS применим к широкому спектру видов растений, таких как Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, barley22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Эвкалипт25, кукуруза26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soybean33, strawberry34, wheat35 и Wolffiella hyalina36. Для более толстых тканей CS также может сделать секции вибратома прозрачными37,38. Этот метод позволил изучить клеточную структуру и паттерны экспрессии генов у растений37,38. Кроме того, нематодные инфекции20,39, грибковые инфекции и симбиоз19,40,41 также наблюдались глубоко внутри тканей, обработанных CS. Таким образом, этот метод полезен для визуализации целых тканей от микро- до макромасштабов и может помочь обнаружить новые взаимодействия между различными клетками, тканями, органами и организмами.
Disclosures
ClearSee коммерциализируется (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Япония). Университет Нагои имеет патент (JP6601842) на клиринговый реагент ClearSee. Д. Курихара является патентным изобретателем. Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Японским обществом содействия развитию науки (Грант в помощи для научных исследований в инновационных областях (JP16H06464, JP16H06280 для T.H.), Грант в помощи для научных исследований (B, JP17H03697 для D.K.), Грант в помощи для сложных поисковых исследований (JP18K19331 в D.K.), Грант в помощи для научных исследований в инновационных областях (JP20H05358 для D.K.)) и Японское агентство по науке и технике (программа PRESTO (JPMJPR15QC to Y.M., JPMJPR18K4 к D.K.)). Авторы благодарны Центру живой визуализации при Институте трансформационных биомолекул (WPI-ITbM) Университета Нагои за поддержку микроскопических исследований и editage (www.editage.com) для редактирования английского языка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
| ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
| Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
| Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
| Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
| Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
| Needle | TERUMO | NN-2238S | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
| Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
| Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
| Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
| Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
| Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Vogelmann, T. C.
- Krause, G. H., Weis, E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).
- Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions. Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).
- Lersten, N. R. An annotated bibliography of botanical clearing methods. Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).
- Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications. Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy. Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).
- Vijayan, A., et al. A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule. eLife. 10, 1-38 (2021).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Research Square. , (2021).
- Tanaka, E., Ono, Y. Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation. Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).
- Ohtsu, M., et al. Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines. Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).
- Duman, Z., et al. Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock. Plants. 9 (11), 1481 (2020).
- Ho, W. W. H., et al. Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms. Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).
- Arsovski, A. A., et al. BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves. bioRxiv. , (2020).
- Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).
- Eliyahu, A., et al. Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation. Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).
- Kelliher, T., et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature. 542, 105-109 (2017).
- Aki, S. S., et al. Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha. Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).
- Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization. Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).
- Okazawa, A., et al. Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor. bioRxiv. , 448768 (2021).
- Chen, M., et al. VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida. New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11, 23 (2018).
- Alaguero-Cordovilla, A., et al. An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants. Plant, Cell & Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).
- Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein. The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).
- Kim, D. -R., et al. A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees. Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).
- Wu, J., Mock, H. -P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., Mühling, K. H. Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants. Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).
- Isoda, M., Oyama, T. Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level. Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).
- Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis. Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).
- Shwartz, I., et al. The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing. bioRxiv. , (2021).
- Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat. Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).
- Nouri, E., et al. Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling. Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).
- Evangelisti, E., et al. Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots. bioRxiv. , 434067 (2021).
