Her beskrives en metode til at gøre plantevæv gennemsigtigt og samtidig opretholde stabiliteten af fluorescerende proteiner. Denne teknik letter dyb billeddannelse af ryddet plantevæv uden fysisk sektionering.
Det er udfordrende at observere den indre struktur af flerlagede og uigennemsigtige planteprøver direkte uden dissektion under et mikroskop. Derudover hæmmer autofluorescens, der tilskrives klorofyl, observationen af fluorescerende proteiner i planter. I lang tid er forskellige clearingreagenser blevet brugt til at gøre planter gennemsigtige. Konventionelle clearingreagenser mindsker imidlertid fluorescerende signaler; derfor har det ikke været muligt at observere de cellulære og intracellulære strukturer med fluorescerende proteiner. Reagenser blev udviklet, der kan rydde plantevæv ved at fjerne klorofyl og samtidig opretholde fluorescerende proteinstabilitet. Her findes en detaljeret protokol til optisk clearing af plantevæv ved hjælp af clearingreagenser, ClearSee (CS) eller ClearSeeAlpha (CSA). Forberedelsen af ryddet plantevæv involverer tre trin: fiksering, vask og rydning. Fiksering er et afgørende skridt i opretholdelsen af de cellulære strukturer og intracellulær stabilitet af fluorescerende proteiner. Inkubationstiden for rydning afhænger af vævstype og art. I Arabidopsis thaliana var den tid, der kræves til rydning med CS, 4 dage for blade og rødder, 7 dage for frøplanter og 1 måned for pistiller. CS krævede også en relativt kort tid på 4 dage for at gøre de gametofytiske blade af Physcomitrium patens gennemsigtige . I modsætning hertil producerede pistiller i tobak og toreni brunt pigment på grund af oxidation under CS-behandling. CSA reducerede det brune pigment ved at forhindre oxidation og kunne gøre tobak og torenia pistiller gennemsigtige, selvom det tog relativt lang tid (1 eller 2 måneder). CS og CSA var også kompatible med farvning ved hjælp af kemiske farvestoffer, såsom DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindol) og Hoechst 33342 til DNA og Calcofluor White, SR2200 og Direct Red 23 til cellevæggen. Denne metode kan være nyttig til helplantebilleddannelse for at afsløre intakt morfologi, udviklingsprocesser, plante-mikrobe-interaktioner og nematodeinfektioner.
Visualisering af cellulære strukturer og lokalisering af proteiner i levende organismer er vigtig for at afklare deres funktioner in vivo. Men da den levende krop ikke er gennemsigtig, er det udfordrende at observere levende organismers indre struktur uden dissektion. Især i tilfælde af plantevæv, der er flerlags med celler af forskellig form, er indeksmismatchet forårsaget af deres struktur og tilstedeværelsen af lysabsorberende pigmenter problematisk. For eksempel har planteblade en kompleks struktur, der giver dem mulighed for effektivt at udnytte det lys, der kommer ind i deres kroppe til fotosyntese1, mens strukturen også forårsager brydningsindeksmismatch, hvilket gør dem vanskelige at observere. Bladene har imidlertid mange lysabsorberende pigmenter, såsom klorofyl, der udsender stærk rød fluorescens, og brunlige pigmenter produceres ved oxidation2,3. Disse pigmenter hindrer også hele montering fluorescensmikroskopi observationer i planter. Til observation af planternes indre struktur er affarvning og fiksering ved alkohol og rydning ved hjælp af chlorhydrat derfor blevet brugt i lang tid for at eliminere brydningsindeksmismatch og autofluorescens4,5. Disse konventionelle metoder er blevet vedtaget i mange år, men de har den ulempe, at de eliminerer fluorescensen af fluorescerende proteiner på samme tid6,7. Dette er problematisk, da fluorescerende proteiner er blevet uundværlige i den nuværende fluorescerende billeddannelse.
Derfor er ClearSee (CS) og ClearSeeAlpha (CSA) blevet udviklet som optiske clearingreagenser til plantevæv. Begge reagenser reducerer klorofylautfluorescens, samtidig med at stabiliteten af fluorescerende proteiner7,8 opretholdes. CSA er især nyttigt, når brune pigmenter produceres på grund af vævsoxidation. Ved hjælp af disse clearingreagenser er det muligt at observere den cellulære struktur og proteinlokalisering inde i plantekroppen uden fysisk sektionering.
Denne metode består af fiksering, vask og rengøring. Fiksering er et kritisk trin i denne protokol. Hvis det fluorescerende protein ikke observeres efter PFA-fiksering, vil det ikke blive observeret efter behandling med clearingopløsning. Pfa-opløsningens indtrængning i væv er kritisk, men højvakuumbehandling anbefales ikke, fordi det kan ødelægge cellestrukturen. Vakuumbetingelser og fikseringsperioder bør optimeres for hver type væv og art. Det anbefales at kontrollere fluorescerende proteiner selv efter fiksering. Selvom prøver normalt blev fastgjort i 30-60 minutter ved stuetemperatur, kan de fastsættes til 4 ° C i længere tid (natten over eller mere).
Som vist i figur 6A havde nogle natriumdeoxycholater en lysegul farve, når de blev opløst. Sådanne natriumdeoxycholatopløsninger viste stærk autofluorescens i 400-600 nm-regionen efter excitation ved 380 nm (figur 6B). Denne autofluorescens forhindrer optisk clearing og fluorescensbilleddannelse. Brugere bør kontrollere farven på natriumdeoxycholatopløsning, da reagensets kvalitet kan variere på grund af renhed, parti-til-parti-variation eller andre årsager.
De clearingopløsninger, der anvendes her, har høje koncentrationer af natriumdeoxycholat, som kan ødelægge membranstrukturen. Plasmamembranmarkøren (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) blev observeret selv efter CS-behandling7. Det kan dog være bedre at reducere koncentrationen af natriumdeoxycholat, afhængigt af strukturen og vævet af interesse. Faktisk blev der opnået billeder med forbedret klarhed for Arabidopsis-pistiller med modificeret CS, hvor koncentrationen af natriumdeoxycholat reduceres med halvdelen; Reducerede koncentrationer af natriumdeoxycholat krævede imidlertid forlængede behandlingstider (f.eks. 1 måned for Arabidopsis-pistiller).
CS kan reducere rød autofluorescens (>610 nm) for at fjerne klorofyl i behandlede prøver. Imidlertid forblev 500-600 nm autofluorescens (gul til orange) selv i CS-behandlede prøver7. Denne autofluorescens menes at være afledt af cellevæggen og andre cellulære komponenter, såsom lignin12,13. Derfor er det svært at lave væv, såsom stængler med udviklede sekundære vægge, helt gennemsigtige ved CS-behandling.
Flere rensereagenser ud over dem, der anvendes her, er blevet udviklet til at observere fluorescerende proteiner i planter ved hjælp af fluorescerende mikroskopi14,15,16,17. Sammenlignet med disse metoder fjerner CS og CSA klorofyl og reducerer autofluorescens, hvilket gør plantevævene mere gennemsigtige. For nylig udviklede Sakamoto et al. en forbedret metode, iTOMEI, til fiksering, rensning af vaskemiddel og montering for at justere brydningsindeksets uoverensstemmelse18. I Arabidopsis-frøplanter ryddede iTOMEI vævet inden for 26 timer.
CS gælder for en bred vifte af plantearter, såsom Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, byg22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, majs26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, sojabønne33, jordbær34, hvede35 og Wolffiella hyalina36. For tykkere væv kan CS også gøre vibratomsektionerne gennemsigtige37,38. Denne metode tillod undersøgelser af den cellulære struktur og genekspressionsmønstre i planter37,38. Desuden blev nematodeinfektioner20,39, svampeinfektioner og symbiose19,40,41 også observeret dybt inde i det CS-behandlede væv. Således er denne metode nyttig til billeddannelse af hele væv fra mikro- til makroskalaer og kan hjælpe med at opdage nye interaktioner mellem forskellige celler, væv, organer og organismer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 til T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 til D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 til D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) og Japan Science and Technology Agency (PRESTO-programmet (JPMJPR15QC til Y.M., JPMJPR18K4 til D.K.)). Forfatterne er taknemmelige for Live Imaging Center ved Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) ved Nagoya University for at støtte de mikroskopiske undersøgelser og Editage (www.editage.com) til engelsksproget redigering.
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |