Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल स्फेरॉइड का बड़े पैमाने पर, स्वचालित उत्पादन

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63430
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,4, 1,2,4, 1,2, 2,3,4,5, 1,2,3,4
1Nucleus of Multidisciplinary Research in Biology (Numpex-Bio), Federal University of Rio de Janeiro, 2Laboratory of Tissue Bioengineering, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 3Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), Unigranrio, 4Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 5Dental School, Fluminense Federal Fluminense

Summary

स्टेम सेल (एएससी) स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन का वर्णन करते हैं, जो सेल निलंबन को बीज करने के लिए एक स्वचालित पाइपिंग सिस्टम का उपयोग करते हैं, इस प्रकार गोलाकार आकार और आकार की एकरूपता सुनिश्चित करते हैं। इन एएससी स्फेरॉइड का उपयोग 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में किया जा सकता है।

Abstract

स्टेम कोशिकाएं (एएससी) मानव चमड़े के नीचे के वसा ऊतक के स्ट्रोमल संवहनी अंश में पाई जाने वाली कोशिकाओं की एक उप-जनसंख्या है जिसे मेसेनकाइमल स्ट्रोमल / स्टेम कोशिकाओं के शास्त्रीय स्रोत के रूप में मान्यता प्राप्त है। पाड़-आधारित ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोणों के लिए एएससी के साथ कई अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं, जिन्होंने मुख्य रूप से बायोएक्टिव मचानों पर उनके बोने के बाद इन कोशिकाओं के व्यवहार का पता लगाया। हालांकि, मचान-मुक्त दृष्टिकोण इन विट्रो और विवो में ऊतकों को इंजीनियर करने के लिए उभर रहे हैं, मुख्य रूप से स्फेरॉइड का उपयोग करके, मचान-आधारित दृष्टिकोणों की सीमाओं को दूर करने के लिए।

स्फेरॉइड स्व-असेंबली प्रक्रिया द्वारा गठित 3 डी माइक्रोटिस्यू हैं। वे देशी ऊतकों की वास्तुकला और सूक्ष्म वातावरण की बेहतर नकल कर सकते हैं, मुख्य रूप से सेल-टू-सेल और सेल-टू-एक्सट्रासेल्युलर मैट्रिक्स इंटरैक्शन के आवर्धन के कारण। हाल ही में, स्फेरॉइड को मुख्य रूप से रोग मॉडल, ड्रग स्क्रीनिंग अध्ययन और 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में खोजा जा रहा है। हालांकि, 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए, कई स्फेरॉइड, आकार और आकार में सजातीय, जटिल ऊतक और अंग मॉडल को बायोफैब्रिकेट करने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, जब स्फेरॉइड स्वचालित रूप से उत्पादित होते हैं, तो सूक्ष्मजीवविज्ञानी संदूषण के लिए बहुत कम मौका होता है, जिससे विधि की प्रजनन क्षमता बढ़ जाती है।

स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन को बायोफैब्रिकेशन लाइन विकसित करने के लिए पहला अनिवार्य कदम माना जाता है, जो 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में जारी रहता है और बायोरिएक्टरों में ऊतक निर्माण की पूर्ण परिपक्वता में समाप्त होता है। हालांकि, बड़े पैमाने पर एएससी गोलाकार उत्पादन का पता लगाने वाले अध्ययनों की संख्या अभी भी दुर्लभ है, साथ ही उन अध्ययनों की संख्या के साथ जो 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए बिल्डिंग ब्लॉक्स के रूप में एएससी स्फेरॉइड का उपयोग करते थे। इसलिए, इस लेख का उद्देश्य 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में एएससी स्फेरॉइड फैलाने वाली गैर-चिपकने वाली माइक्रोमोल्ड हाइड्रोगेल तकनीक का उपयोग करके एएससी स्फेरॉइड के बड़े पैमाने पर उत्पादन को दिखाना है।

Introduction

स्फेरॉइड को ऊतक इंजीनियरिंग में एक मचान मुक्त दृष्टिकोण माना जाता है। एएससी स्व-असेंबली प्रक्रिया द्वारा स्फेरॉइड बनाने में सक्षम हैं। स्फेरॉइड का 3 डी माइक्रोआर्किटेक्चर एएससी की पुनर्योजी क्षमता को बढ़ाता है, जिसमें कई वंशों 1,2,3 में भेदभाव क्षमता शामिल है। यह शोध समूह उपास्थि और हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग 4,5,6 के लिए एएससी स्फेरॉइड के साथ काम कर रहा है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि स्फेरॉइड को ऊतकों और अंगों के बायोफैब्रिकेशन में बिल्डिंग-ब्लॉक माना जाता है, मुख्य रूप से उनकी संलयन क्षमता के कारण।

ऊतक गठन के लिए स्फेरॉइड का उपयोग तीन मुख्य बिंदुओं पर निर्भर करता है: (1) उनके बायोफैब्रिकेशन के लिए मानकीकृत और स्केलेबल रोबोट विधियों का विकास7, (2) ऊतक स्फेरॉइड के व्यवस्थित फेनोटाइपिंग8, (3) 3 डी ऊतकों की विधानसभा के तरीकों का विकास9. इन स्फेरॉइड्स को विभिन्न सेल प्रकारों के साथ बनाया जा सकता है और विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें हैंगिंग ड्रॉप, रीएग्रीगेशन, माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रोमोल्ड्स 8,9,10 शामिल हैं। इन विधियों में से प्रत्येक में स्फेरॉइड के आकार और आकार की एकरूपता, गठन के बाद स्फेरॉइड की वसूली, उत्पादित स्फेरॉइड की संख्या, प्रक्रिया स्वचालन, श्रम तीव्रता और लागत11 से संबंधित फायदे और नुकसान हैं।

माइक्रोमोल्ड विधि में, कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण के कारण माइक्रोमोल्ड के तल पर वितरित और जमा किया जाता है। गैर-चिपकने वाला हाइड्रोगेल कोशिकाओं को नीचे का पालन करने की अनुमति नहीं देता है, और सेल-टू-सेल इंटरैक्शन प्रति मंदी 8,12 में एक एकल गोलाकार के गठन की ओर जाता है। यह बायोफैब्रिकेशन विधि सजातीय और नियंत्रित आकार के स्फेरॉइड उत्पन्न करती है, न्यूनतम प्रयास के साथ समय-कुशल तरीके से बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए रोबोट किया जा सकता है, और ऊतक स्फेरॉइड 7,8 के बायोफैब्रिकेशन के डिजाइन में अच्छी लागत-प्रभावशीलता-महत्वपूर्ण कारक हैं। इस विधि को अनुमानित, इष्टतम और नियंत्रणीय विशेषताओं के साथ एक नया ऊतक प्रकार तैयार करने के लिए किसी भी सेल वंश के स्फेरॉइड बनाने के लिए लागू किया जा सकता है8.

बायोफैब्रिकेशन को "संरचनात्मक संगठन के साथ जैविक रूप से कार्यात्मक उत्पादों की स्वचालित पीढ़ी के रूप में परिभाषित किया गया है ..." 13. इसलिए, स्फेरॉइड के स्वचालित उत्पादन को बायोफैब्रिकेशन लाइन विकसित करने के लिए पहला अनिवार्य कदम माना जाता है, जो 3 डी बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया में जारी रहता है और स्फेरॉइड संलयन द्वारा बायोप्रिंटेड ऊतक की पूर्ण परिपक्वता में समाप्त होता है। इस अध्ययन में, एएससी गोलाकार बायोफैब्रिकेशन की मापनीयता में सुधार करने के लिए, हम सेल निलंबन को बीज करने के लिए एक स्वचालित पाइपिंग प्रणाली का उपयोग करते हैं, इस प्रकार गोलाकार आकार और आकार की एकरूपता सुनिश्चित करते हैं। इस पेपर से पता चलता है कि बायोफैब्रिकेट अधिक जटिल ऊतक मॉडल के लिए 3 डी बायोप्रिंटिंग दृष्टिकोण के लिए आवश्यक बड़ी संख्या (हजारों) स्फेरॉइड का उत्पादन करना संभव था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एएससी को पहले स्वस्थ मानव दाताओं से अलग किया गया था और क्लेमेंटिनो फ्रागा फिल्हो विश्वविद्यालय अस्पताल, रियो डी जनेरियो, ब्राजील के संघीय विश्वविद्यालय (25818719.4.0000.5257) की अनुसंधान नैतिकता समिति के अनुसार 14 वर्णित क्रायोप्रेज़र्व किया गया था। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. मार्ग तीन पर एएससी मोनोलेयर का ट्रिप्सिनाइजेशन

  1. 80% संगम पर एएससी के मोनोलेयर युक्त टिशू कल्चर 175 सेमी2 फ्लास्क खोलें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  2. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस, 0.01 एम) के 7 मिलीलीटर जोड़ें और मोनोलेयर को दो बार धो लें। अगला, तरल को त्याग दें।
  3. 0.78 एमएम एथिलीनेडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के साथ 0.125% ट्रिप्सिन के 5 एमएल जोड़ें। अगला, 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  4. टिशू कल्चर 175 सेमी2 फ्लास्क में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ कम ग्लूकोज डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम लो) के 10 मिलीलीटर जोड़ें और सेल निलंबन को 10 एमएल सोरोलॉजिकल पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. एक 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल विंदुक के साथ सेल निलंबन हार्वेस्ट और यह एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए हस्तांतरण। अगला, एएससी की गोली प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए 400 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। 10% एफबीएस युक्त डीएमईएम कम का उपयोग करके सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. ट्रिपैन बहिष्करण द्वारा एक कक्ष गणना करें।
  7. गिनती के बाद, गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल (यहां वरीयता प्राप्त कुल 10,000 कोशिकाओं / एमएल वरीयता प्राप्त) के साथ 81 मंदी को बीज देने के लिए एक अलग 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में कुल 1 × 106 एएससी लें। माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल की 256 मंदी को बीज करने के लिए, एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में कुल5 × 10 5 एएससी लें (यहां वरीयता प्राप्त कुल 2,500 कोशिकाएं /

2. माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी एगरोज़ हाइड्रोगेल निर्माण

  1. अल्ट्राप्योर पानी में 0.9% एनएसीएल में 2% अल्ट्राप्योर एगारोज के बाँझ समाधान के 50 एमएल तैयार करें। 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए समाधान आटोक्लेव।
  2. 81 या 256 परिपत्र अवकाश युक्त सिलिकॉन मोल्ड के केंद्र में बाँझ 2% अल्ट्राप्योर एगरोज समाधान के 500 μL जोड़ें।
  3. 40 मिनट के बाद, सिलिकॉन मोल्ड से अल्ट्राप्योर एगरोज़ को अनमोल्ड करें और इसे 12-अच्छी तरह से प्लास्टिक प्लेट के कुएं में रखें।
  4. माइक्रोमोल्ड एगरोज के साथ कुएं में डीएमईएम कम के 2 एमएल जोड़ें और एएससी को बोने से पहले कम से कम12 घंटे के लिए 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सेते हैं।

3. स्वचालित पाइपिंग सिस्टम का उपयोग करके एएससी स्फेरॉइड का बायोफैब्रिकेशन

  1. निम्न की जाँच करें:
    1. जांचें कि लामिना का प्रवाह चालू है, और कैबिनेट का एयरफ्लो ठीक से काम कर रहा है या नहीं।
    2. जांचें कि उपकरण सही वोल्टेज से जुड़ा हुआ है या नहीं।
    3. जांचें कि टैबलेट उपकरण से जुड़ा हुआ है या नहीं।
    4. जांचें कि कैबिनेट प्रोटेक्शन ग्लास की ऊंचाई उपकरण के सेंसर अंकन के समान ऊंचाई पर है या नहीं।
  2. उपकरण के बाईं ओर ऑन / ऑफ बटन दबाएं और टैबलेट और उपकरण शुरू होने की प्रतीक्षा करें।
  3. टिप बक्से, अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए रैक, और उपकरण के कार्यक्षेत्र में माइक्रोमोल्ड एगरोज हाइड्रोगेल युक्त प्लेट की स्थिति।
  4. सॉफ्टवेयर ओपन होने के साथ टैबलेट पर, पहले लैबवेयर एडिटर पर क्लिक करें।
  5. एक आभासी वर्कटेबल सेट करें और पिपेट, टिप बॉक्स, प्लास्टिक ट्यूबों के लिए रैक और प्लेटों की स्थिति चुनें।
    नोट: वर्चुअल वर्कटेबल को उपकरण में सहायक उपकरण की भौतिक स्थिति का प्रतिनिधित्व करना चाहिए।
  6. पैरामीटर (चरण 3.10 देखें) और आदेशों को शामिल करने के लिए उत्पादन करने के लिए स्विच करें बटन पर क्लिक करें जो उपकरण पूरे प्रयोग में करेंगे। सॉफ़्टवेयर में खोलने के लिए उपकरण पट्टी और उत्पादन सूची की प्रतीक्षा करें.
  7. प्रारंभ में, कमांड को इंगित करने के लिए, पाइप किए जाने वाले नमूनों की संख्या शामिल करें और इसे उत्पादन सूची में खींचें।
    नोट: नमूनों की संख्या प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों की संख्या है जिसमें माइक्रोमोल्ड्स के केंद्र में वरीयता प्राप्त करने के लिए एएससी निलंबन होता है।
  8. नमूनों की संख्या दर्ज करने के बाद, एएससी निलंबन को 12-अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में स्थानांतरित करने के लिए सॉफ़्टवेयर पर नमूना स्थानांतरण कमांड बटन पर क्लिक करें, जिसमें माइक्रोमोल्ड्स होते हैं, और इसे उत्पादन सूची में खींचें।
  9. नमूना स्थानांतरित करने के लिए उपकरण के लिए प्रारंभ और अंत पदों को स्थापित करने के लिए गुणों पर क्लिक करें।
  10. सॉफ़्टवेयर के कार्य तालिका पृष्ठ पर लौटने की प्रतीक्षा करें. एएससी के स्वचालित बोने के लिए पैरामीटर स्थापित करने के लिए विकल्प बटन पर क्लिक करें: i) 15.4 एस -1 की आकांक्षा गति; ii) 1 एस -1 की गति का वितरण; iii) 0 एमएस की झटका देरी; iv) 15.4 एस -1 की ब्लो स्पीड; v) 100% का प्रारंभिक स्ट्रोक। मानक तरल प्रकार के रूप में पानी का चयन करें।
  11. एक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए एएससी को मिलाने के लिए पैरामीटर सेट करें: i) 5 के चक्रों की संख्या; ii) 6.5 एस -1 की गति; iii) 300 μL का आयतन।
  12. पैरामीटर स्थापित करने के बाद, उत्पादन सूची में 40 मिनट का समय जोड़ें।
    नोट: माइक्रोमोल्ड के तल पर एएससी निलंबन की प्रतीक्षा करने के लिए इस समय की आवश्यकता होती है।
  13. उत्पादन सूची में, प्लेट के संबंधित कुओं में गोलाकार संस्कृति माध्यम को स्थानांतरित करने के लिए अभिकर्मक स्थानांतरण विकल्प शामिल करें।
  14. स्फेरॉइड संस्कृति माध्यम को स्थानांतरित करने के लिए स्थिति और पैरामीटर कॉन्फ़िगरेशन सेट करने के लिए चरण 3.9-3.11 दोहराएँ।
  15. सॉफ़्टवेयर के शीर्ष बार पर एक चेक प्रतीक के साथ बटन पर क्लिक करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई प्रोग्रामिंग त्रुटि नहीं है।
  16. प्रोग्राम शुरू करने के लिए सॉफ़्टवेयर के शीर्ष बार पर प्ले बटन (त्रिकोण प्रतीक के साथ) पर क्लिक करें।
  17. उपकरण शुरू होने दें, जैसा कि प्रोग्राम किया गया है, और ध्वनि बनाने के लिए प्रतीक्षा करें, यह दर्शाता है कि यह समाप्त हो गया है।
  18. 12 अच्छी तरह से प्लेट लीजिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में सेते हैं, 5% सीओ2 स्फेरॉइड के लिए कम से कम 18 घंटे के लिए पूरी तरह से गठित और कॉम्पैक्ट किया जा सकता है।
  19. विश्लेषण के लिए संस्कृति के 1, 3 और 7 दिनों के बाद मैन्युअल रूप से स्फेरॉइड की कटाई करें। माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी एगरोज़ हाइड्रोगेल से स्फेरॉइड को मुक्त करने के लिए मैन्युअल रूप से एक माइक्रोपिपेट के साथ माध्यम को फ्लश करें।
  20. 5 मिनट के बाद, यह निर्धारित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे जांचें कि क्या स्फेरॉइड पूरी तरह से माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी एगरोज़ हाइड्रोगेल से जारी किए जाते हैं।
  21. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके मैन्युअल रूप से स्फेरॉइड इकट्ठा करें और उन्हें 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  22. 0.01 एम पीबीएस के साथ कम से कम दो बार स्फेरॉइड को धोएं। व्यवहार्यता का आकलन करें और ताजा गोलाकार नमूनों पर बायोमैकेनिकल विश्लेषण करें। आकृति विज्ञान विश्लेषण (ऊतक विज्ञान) के लिए, 2-8 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 18 घंटे के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में गोलाकार नमूनों सेते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

स्वचालित पिपेट प्रणाली 15 मिनट में एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के 12 कुओं में एएससी सेल निलंबन बीज कर सकते हैं। 81 माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल का उपयोग प्रोटोकॉल के अंत में 972 स्फेरॉइड का उत्पादन करेगा। 256 माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल का उपयोग प्रोटोकॉल के अंत में 3,072 स्फेरॉइड का उत्पादन करेगा। एएससी स्फेरॉइड का विश्लेषण उनके आकार और आकार की एकरूपता के लिए किया गया था। 81 मंदी के साथ माइक्रोमोल्ड्स से एएससी स्फेरॉइड ने 256 मंदी (चित्रा 1 सी, डी) के साथ माइक्रोमोल्ड्स से एएससी स्फेरॉइड के विपरीत संस्कृति अवधि के दौरान सजातीय व्यास दिखाया। सबसे छोटे और सबसे बड़े व्यास (गोलाकारता) का अनुपात 81 और 256 मंदी (चित्रा 1 ई, एफ) के साथ माइक्रोमोल्ड्स से एएससी स्फेरॉइड में 1 के करीब था। व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान और बल (चित्रा 2) विश्लेषण के परिणाम एएससी स्फेरॉइड के सफल, बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए सबूत प्रदान करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एएससी स्फेरॉइड ने उच्च व्यास प्रजनन क्षमता दिखाई। (ए) 81 परिपत्र मंदी और (बी) 256 परिपत्र मंदी के साथ माइक्रोमोल्ड गैर-चिपकने वाले हाइड्रोगेल से एएससी स्फेरॉइड के प्रतिनिधि ऑप्टिकल माइक्रोग्राफ। (सी, डी) क्रमशः 81 और 256 परिपत्र मंदी के साथ पांच माइक्रोमोल्ड गैर-चिपकने वाला हाइड्रोगेल से 1, 3 और 7 दिनों में गोलाकार व्यास। (ई, एफ) क्रमशः 81 और 256 परिपत्र मंदी के साथ माइक्रोमोल्ड गैर-चिपकने वाले हाइड्रोगेल से सबसे छोटे और सबसे बड़े व्यास का अनुपात। स्फेरॉइड के सबसे छोटे और सबसे बड़े व्यास को मापने के लिए, डिजिटल कैमरे से लैस ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवियों को साप्ताहिक रूप से अधिग्रहित किया गया था। चौड़ाई और लंबाई इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मापा गया था। चौड़ाई को लंबाई (गोलाकार गोलाकारता) से विभाजित करके प्रत्येक गोलाकार का व्यास अनुपात प्राप्त किया गया था। 81 परिपत्र मंदी के साथ माइक्रोमोल्डेड, गैर-चिपकने वाले हाइड्रोगेल से कुल 85 स्फेरॉइड को मापा गया था, और कुल 160 स्फेरॉइड को 256 परिपत्र मंदी के साथ माइक्रोमोल्ड, गैर-चिपकने वाले हाइड्रोगेल से मापा गया था। डेटा को माध्य ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त किया जाता है। तारांकन एनोवा नॉनपैरामेट्रिक द्वारा प्राप्त पी के मूल्यों को इंगित करते हैं और कई तुलनाओं के बाद अप्रकाशित होते हैं (** पी < 0.001; **** पी < 0.0001)। स्केल सलाखों = 100 μm. संक्षिप्त नाम: एएससी = वसा ऊतक स्टेम / कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एएससी स्फेरॉइड ने उच्च सेल व्यवहार्यता दिखाई ( ए ) 256 परिपत्र मंदी के साथ माइक्रोमोल्डेड, गैर-चिपकने वाला हाइड्रोगेल से दिन 7 पर एएससी स्फेरॉइड की व्यवहार्यता परख के प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ। जीवित और मृत कोशिकाओं को क्रमशः हरे और लाल रंग में देखा जाता है। इनसेट में मृत्यु नियंत्रण दिखाया गया है। (बी) 81 परिपत्र मंदी के साथ माइक्रोमोल्ड, गैर-चिपकने वाला हाइड्रोगेल से हेमटोक्सिलिन और ईओसिन द्वारा दाग वाले एएससी स्फेरॉइड का खंड। निश्चित स्फेरॉइड नमूने पैराफिन में एम्बेडेड थे, और नमूनों को माइक्रोटोम का उपयोग करके 5 μm मोटाई वर्गों में काट दिया गया था। (सी) 7 दिन में एएससी स्फेरॉइड के μN में मापा गया संपीड़न प्रतिरोध बल। डेटा को पांच स्फेरॉइड से एकत्र किया गया था और पहले वर्णित पद्धति5 के अनुसार मानक विचलन ± माध्य के रूप में व्यक्त किया गया था। तारांकन दो-तरफ़ा एनोवा, नॉनपैरामेट्रिक और अप्रकाशित द्वारा प्राप्त पी के मूल्य को इंगित करते हैं, इसके बाद कई तुलनाएं होती हैं। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षिप्त नाम: एएससी = वसा ऊतक स्टेम / कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह पेपर एक स्वचालित पिपेट सिस्टम का उपयोग करके एएससी स्फेरॉइड की बड़े पैमाने पर पीढ़ी प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम पाइपिंग के लिए सेल निलंबन, गति और दूरी की सही मात्रा सुनिश्चित करने के लिए सॉफ़्टवेयर को ठीक से सेट करना है। प्रोटोकॉल में वर्णित मापदंडों माइक्रोमोल्ड, गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल युक्त 12-अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं में एएससी सेल निलंबन के वितरण को अनुकूलित करने के लिए कई परीक्षणों के बाद निर्धारित किए गए थे। स्फेरॉइड के व्यास और गोलाकारता को मापकर अनुकूलन का मूल्यांकन किया गया था। माइक्रोमोल्ड गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल के क्षेत्र और ऊंचाई का उपयोग सेल निलंबन को वितरित करने के लिए आदर्श गति की गणना करने के लिए किया गया था। यदि सेल निलंबन को एक अलग वितरण गति पर उपकरण द्वारा वरीयता दी जाती है, तो यह सीधे स्फेरॉइड के गठन को प्रभावित करेगा। इसलिए, ये उपकरणों के साथ परीक्षण के बाद अनुकूलित किए जाने वाले महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं। इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। माइक्रोमोल्ड में गैर-अनुयायी हाइड्रोगेल में केवल एएससी के बीजारोपण को स्वचालित किया जा सकता है, इसके बाद सेल संस्कृति माध्यम को जोड़ा जा सकता है। सिस्टम की विशेषताएं उपकरण और सॉफ़्टवेयर के संस्करण द्वारा सीमित हैं। हालांकि, इस प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण का मुख्य लाभ 3,072 एएससी स्फेरॉइड-आकार और आकार में सजातीय और व्यवहार्य-मानव त्रुटियों या संदूषण के मामूली जोखिमों के साथ उत्पादन करना है। अधिक जटिल ऊतक मॉडल का उत्पादन करने के लिए बड़ी संख्या में बायोफैब्रिकेटेड एएससी स्फेरॉइड को सीधे 3 डी बायोप्रिंटर में लोड किया जा सकता है।

सामान्य तौर पर, यह व्यापक रूप से ज्ञात है कि सटीक और स्वचालित पाइपिंग सेल संस्कृति के स्वचालन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। स्वचालित सेल संस्कृति प्रणाली बड़े पैमाने पर उत्पादन को सक्षम करती है और तकनीकी सटीकता, प्रजनन क्षमता और प्रक्रिया दक्षतामें वृद्धि करती है 15. इसलिए, स्वचालित सिस्टम बड़े पैमाने पर उत्पादन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं, जो औद्योगिक वातावरण16,17 के लिए आम और फायदेमंद है। हालांकि, 3 डी सेल संस्कृति प्रणालियों 7,18,19,20,21 को स्वचालित करने के लिए प्रोटोकॉल के विकास का वर्णन करने वाले कुछ अध्ययन हैं।

मेहस्ज़ और सहयोगी7 और मेसेगुएर-रिपोल्स और सहकर्मियों21 ने एएससी स्फेरॉइड को बायोफैब्रिकेट करने के लिए एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग किया। मेहस्ज़ एट अल 7 द्वारा किए गए अध्ययन में, लेखकों ने एक ही स्वचालित पाइपिंग प्रणाली का उपयोग किया। हालांकि, उनके प्रोटोकॉल ने केवल 96 स्फेरॉइड का उत्पादन किया, जबकि वर्तमान कार्य में विकसित प्रोटोकॉल एक बार में 3,072 एएससी स्फेरॉइड का उत्पादन करने में सक्षम था, आकार और आकार में सजातीय था। 21 ने 73 यकृत स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए एक स्वचालित पाइपिंग प्रणाली का भी उपयोग किया। आजकल बड़े पैमाने पर स्फेरॉइड बनाने के लिए चर्चा की जा रही एक और दृष्टिकोण माइक्रोफ्लुइडिक्स उपकरणों के माध्यम से है। हालांकि, अब तक प्रकाशित लेखों ने बेहतर उपकरणों को विकसित करने के लिए प्रौद्योगिकी का पता लगाया है जो स्फेरॉइड फैब्रिकेशन 7,20 के पैमाने को बढ़ाने के बजाय स्फेरॉइड का उत्पादन कर सकते हैं।

एक और तरीका जिसका उपयोग उच्च संख्या में स्फेरॉइड बनाने के लिए किया जा सकता है, स्पिनर फ्लास्क का उपयोग करके है। हालांकि, इस तकनीक के बारे में एक मुख्य मुद्दा स्फेरॉइड22,23 के आकार और आकार को नियंत्रित करने में कठिनाई है। इसके अलावा, 3 डी बायोप्रिंटिंग पहले से ही बड़े पैमाने पर बायोफैब्रिकेट स्फेरॉइड पर लागू किया गया था। डेली और केली19 के अध्ययन में, लेखकों ने पॉलीकैप्रोलैक्टोन माइक्रोचैंबर्स में बड़ी संख्या में स्फेरॉइड का उत्पादन करने के लिए एक इंकजेट तकनीक का उपयोग किया। स्फेरॉइड आकार और आकार में व्यवहार्य और सजातीय थे।

इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल का मुख्य अनुप्रयोग 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए आवश्यक बड़े पैमाने पर एएससी स्फेरॉइड को बायोफैब्रिकेट करना है। जैसा कि मिरोनोव और सहयोगियों24 द्वारा चर्चा की गई है, जटिल ऊतकों और अंग मॉडल को बायोफैब्रिकेट करने के लिए हजारों स्फेरॉइड आवश्यक होंगे। इस प्रोटोकॉल में वर्णित स्वचालित विधि बड़ी संख्या में एएससी स्फेरॉइड के निर्माण की अनुमति देगी जिसे सीधे 3 डी बायोप्रिंटर में लोड किया जा सकता है। मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों को इंजीनियर करने के लिए इन स्फेरॉइड को वांछित मेसोडर्मल मार्ग में अलग करना भी संभव है। डी मूर और सहयोगियों25 ने भविष्य के 3 डी बायोप्रिंटिंग अनुप्रयोगों के लिए बड़ी संख्या में संवहनी स्फेरॉइड बनाने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि विकसित की।

प्रोटोकॉल में सुधार के लिए उपकरण को संशोधित किया जा सकता है। उपकरण के अधिक हालिया संस्करण बड़ी संख्या में प्लेटों के उपयोग की अनुमति देते हैं, जो उत्पादित एएससी स्फेरॉइड की संख्या को बढ़ा सकते हैं। यह वही हालिया संस्करण प्लेटों के सटीक स्टैकिंग की अनुमति देता है, और यह प्रोटोकॉल की बेहतर दक्षता भी प्रदान करेगा। अंत में, हमने सफलतापूर्वक 15 मिनट में आकार और आकार में सजातीय 3,072 एएससी स्फेरॉइड तक बायोफैब्रिकेशन की अनुमति देने वाला एक प्रोटोकॉल दिखाया, और यह ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए बायोफैब्रिकेशन लाइन बनाने के लिए पहला कदम माना जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ मेट्रोलॉजी, क्वालिटी एंड टेक्नोलॉजी (इनमेट्रो, आरजे, ब्राजील) को उनकी सुविधाओं के उपयोग के लिए धन्यवाद देते हैं। यह अध्ययन आंशिक रूप से रियो डी जनेरियो राज्य (फेपरज) के अनुसंधान समर्थन के लिए कार्लोस चगास फिल्हो फाउंडेशन द्वारा समर्थित था (वित्त संहिता: ई 26 / 202.682/2018 और ई -26 / 010.001771/2019, वैज्ञानिक और तकनीकी विकास के लिए राष्ट्रीय परिषद (सीएनपीक्यू) (वित्त कोड: 307460/2019-3), और नौसेना अनुसंधान कार्यालय यह काम आंशिक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा-आईएनसीटी रेजेनेरा (http://www.inctregenera.org.br/) पर विज्ञान और प्रौद्योगिकी के राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plastic plate Corning 3512
50 mL centrifuge tube Corning CLS430828
EpMotion 5070 Eppendorf 5070000282
epT.I.P.S. Motion Eppendorf 30015231
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Invitrogen 15576028
fetal bovine serum (FBS) Gibco 10082147
Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) Gibco 31600034
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array Sigma Z764000
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array Sigma Z764019
phosphate saline buffer (PBS) Sigma 806552
sodium chloride (NaCl) Sigma S8776
tissue culture flask Corning 430720U
trypan Lonza 17-942E
trypsin Gibco 27250018
ultrapure agarose Invitrogen 16500100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
  2. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  3. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
  4. Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
  5. Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
  6. Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  7. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
  8. Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
  9. Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
  10. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  11. Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
  12. Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
  13. Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
  14. Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
  15. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
  16. Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  17. Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
  18. Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
  19. Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
  20. Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
  21. Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
  22. Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
  23. Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
  24. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
  25. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 181
3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल स्फेरॉइड का बड़े पैमाने पर, स्वचालित उत्पादन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kronemberger, G. S., Miranda, G. A.… More

Kronemberger, G. S., Miranda, G. A. S. C., Silva, T. I. G., Gonçalves, R. M., Granjeiro, J. M., Baptista, L. S. Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (181), e63430, doi:10.3791/63430 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter