Summary
Aquí, describimos la producción a gran escala de esferoides estromales /células madre (ASC) derivados de tejido adiposo utilizando un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Estos esferoides ASC se pueden utilizar como bloques de construcción para enfoques de bioimpresión 3D.
Abstract
Las células estromales/madre derivadas de tejido adiposo (ASC) son una subpoblación de células que se encuentran en la fracción vascular estromal del tejido adiposo subcutáneo humano reconocido como una fuente clásica de células estromales/madre mesenquimales. Se han publicado muchos estudios con ASC para enfoques de ingeniería de tejidos basados en andamios, que exploraron principalmente el comportamiento de estas células después de su siembra en andamios bioactivos. Sin embargo, están surgiendo enfoques libres de andamios para diseñar tejidos in vitro e in vivo, principalmente mediante el uso de esferoides, para superar las limitaciones de los enfoques basados en andamios.
Los esferoides son microtejidos 3D formados por el proceso de autoensamblaje. Pueden imitar mejor la arquitectura y el microambiente de los tejidos nativos, principalmente debido a la ampliación de las interacciones de célula a célula y de célula a matriz extracelular. Recientemente, los esferoides se están explorando principalmente como modelos de enfermedades, estudios de detección de drogas y bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Sin embargo, para los enfoques de bioimpresión 3D, numerosos esferoides, homogéneos en tamaño y forma, son necesarios para biofabricar modelos complejos de tejidos y órganos. Además, cuando los esferoides se producen automáticamente, hay pocas posibilidades de contaminación microbiológica, lo que aumenta la reproducibilidad del método.
La producción a gran escala de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa de la construcción de tejidos en biorreactores. Sin embargo, el número de estudios que exploraron la producción de esferoides ASC a gran escala aún es escaso, junto con el número de estudios que utilizaron esferoides ASC como bloques de construcción para la bioimpresión 3D. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo mostrar la producción a gran escala de esferoides ASC utilizando una técnica de hidrogel micromoldeado no adhesivo que difunde los esferoides ASC como bloques de construcción para los enfoques de bioimpresión 3D.
Introduction
Los esferoides se consideran un enfoque libre de andamios en la ingeniería de tejidos. Los ASC son capaces de formar esferoides mediante el proceso de autoensamblaje. La microarquitectura 3D del esferoide aumenta el potencial regenerativo de los ASC, incluida la capacidad de diferenciación en múltiples linajes 1,2,3. Este grupo de investigación ha estado trabajando con esferoides ASC para la ingeniería de cartílago y tejido óseo 4,5,6. Más importante aún, los esferoides se consideran bloques de construcción en la biofabricación de tejidos y órganos, principalmente debido a su capacidad de fusión.
El uso de esferoides para la formación de tejidos depende de tres puntos principales: (1) el desarrollo de métodos robóticos estandarizados y escalables para su biofabricación7, (2) el fenotipado sistemático de esferoides tisulares8, (3) el desarrollo de métodos para el ensamblaje de tejidos 3D9. Estos esferoides se pueden formar con diferentes tipos de células y obtenerse a través de diversos métodos, incluyendo gota colgante, reagregación, microfluídica y micromoldes 8,9,10. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas relacionadas con la homogeneidad del tamaño y la forma de los esferoides, la recuperación de los esferoides después de la formación, el número de esferoides producidos, la automatización del proceso, la intensidad de la mano de obra y los costos11.
En el método del micromoldo, las células se dispensan y se depositan en la parte inferior del micromoldo debido a la gravedad. El hidrogel no adhesivo no permite que las células se adhieran al fondo, y las interacciones de célula a célula conducen a la formación de un solo esferoide por recesión 8,12. Este método de biofabricación genera esferoides de tamaño homogéneo y controlado, puede ser robotizado para la producción a gran escala de una manera eficiente en el tiempo con el mínimo esfuerzo, y tiene buenos factores críticos de costo-efectividad en el diseño de una biofabricación de esferoide tisular 7,8. Este método se puede aplicar para formar esferoides de cualquier linaje celular para preparar un nuevo tipo de tejido con características predecibles, óptimas y controlables8.
La biofabricación se define como "la generación automatizada de productos biológicamente funcionales con organización estructural..."13. Por lo tanto, la producción automatizada de esferoides se considera el primer paso obligatorio para desarrollar una línea de biofabricación, que continúa en el proceso de bioimpresión 3D y termina en la maduración completa del tejido bioimpreso por fusión esferoide. En este estudio, para mejorar la escalabilidad de la biofabricación de esferoides ASC, utilizamos un sistema de pipeteo automatizado para sembrar la suspensión celular, asegurando así la homogeneidad del tamaño y la forma del esferoide. Este artículo muestra que fue posible producir un gran número (miles) de esferoides necesarios para los enfoques de bioimpresión 3D para biofabricar modelos de tejidos más complejos.
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Protocol
Los ASC utilizados en este estudio fueron previamente aislados de donantes humanos sanos y criopreservados como se describe14 según el Comité de Ética en Investigación del Hospital Universitario Clementino Fraga Filho, Universidad Federal de Río de Janeiro, Brasil (25818719.4.0000.5257). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este estudio.
1. Tripsinización de la monocapa ASC en el paso tres
- Abrir el matraz de cultivo tisularde 175 cm 2 que contiene la monocapa de ASCs al 80% de confluencia y desechar el sobrenadante.
- Agregue 7 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0.01 M) y lave la monocapa dos veces. A continuación, deseche el líquido.
- Añadir 5 ml de tripsina al 0,125% con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a 0,78 ml de ácido etilendiaminotetraacético. A continuación, incubar durante 5 min a 37 °C.
- Añadir 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) bajo en glucosa con suero fetal bovino (FBS) al cultivo tisular de 175 cm2 matraz y mezclar bien la suspensión celular con una pipeta sorológica de 10 mL.
- Cosechar la suspensión celular con una pipeta serológica de 10 ml y transferirla a un tubo centrífugo de 50 ml. A continuación, centrifugar a 400 × g durante 5 min para obtener el pellet de ASCs. Resuspend el pellet celular usando DMEM LOW que contiene 10% fbs.
- Realice un recuento de celdas por exclusión de tripano.
- Después de contar, tome un total de 1 × 106 ASC en un tubo de centrífuga separado de 15 ml para sembrar las 81 recesiones micromoldeadas con hidrogel no adherente (un total de 10,000 células / ml sembradas aquí). Para sembrar 256 recesiones de hidrogel micromoldeado no adherente, tome un total de 5 × 105 ASC en un tubo de centrífuga (un total de 2,500 células / ml sembrados aquí).
2. Fabricación de hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado
- Preparar 50 ml de una solución estéril de agarosa ultrapura al 2% en NaCl al 0,9% en agua ultrapura. Autoclave la solución durante 30 min a 121 °C.
- Agregue 500 μL de solución estéril de agarosa ultrapura al 2% en el centro de un molde de silicona que contenga 81 o 256 huecos circulares.
- Después de 40 minutos, desmolde la agarosa ultrapura del molde de silicona y colócala en un pozo de una placa de plástico de 12 pocillos.
- Añadir 2 mL de DMEM LOW en el pozo con la agarosa micromoldeada e incubar en una incubadora a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2 durante al menos 12 h antes de sembrar los ASC.
3. Biofabricación de esferoides ASC utilizando el sistema de pipeteo automatizado
- Compruebe lo siguiente:
- Compruebe si el flujo laminar está activado y si el flujo de aire del gabinete funciona correctamente.
- Compruebe si el equipo está conectado a la tensión correcta.
- Compruebe si la tableta está conectada al equipo.
- Compruebe si la altura del vidrio de protección del gabinete está a la misma altura que el marcado del sensor del equipo.
- Presione el botón de encendido / apagado en el lado izquierdo del equipo y espere a que la tableta y el equipo se inicien.
- Coloque las cajas de punta, el bastidor para tubos de centrífuga y la placa que contiene el hidrogel de agarosa micromoldeado en el espacio de trabajo del equipo.
- En la tableta con el software abierto, primero haga clic en Labware Editor.
- Configure una mesa de trabajo virtual y elija las posiciones de las pipetas, las cajas de puntas, el bastidor para los tubos de plástico y las placas.
NOTA: La mesa de trabajo virtual debe representar las posiciones físicas de los accesorios en el equipo. - Haga clic en el botón Cambiar a producir para incluir los parámetros (consulte el paso 3.10) y los comandos que el equipo llevará a cabo a lo largo del experimento. Espere a que se abra una barra de herramientas y una lista de productos en el software.
- Inicialmente, para indicar los comandos, incluya el número de muestras que se van a pipetear y arrástrelo a la Lista de productos.
NOTA: El número de muestras es el número de tubos de centrífuga de plástico que contienen la suspensión ASC que se sembrará en el centro de los micromoldes. - Después de ingresar el número de muestras, haga clic en el botón de comando Transferencia de muestras en el software para transferir la suspensión ASC a los pocillos de la placa de 12 pocillos, que contiene los micromoldes, y arrástrela a la Lista de productos.
- Haga clic en Propiedades para configurar las posiciones de inicio y fin del equipo para transferir la muestra.
- Espere a que el software vuelva a la página Tabla de trabajo . Haga clic en el botón Opciones para configurar los parámetros para la siembra automatizada de los ASC: i) Velocidad de aspiración de 15.4 s-1; ii) Velocidad de dispensación de 1 s-1; iii) Retardo de soplado de 0 ms; iv) Velocidad de soplado de 15.4 s-1; v) Accidente cerebrovascular inicial del 100%. Seleccione Agua como el tipo de líquido estándar.
- Configurar los parámetros para mezclar los ASCs para obtener una suspensión homogénea: i) Número de Ciclos de 5; ii) Velocidad de 6.5 s-1; iii) Volumen de 300 μL.
- Después de configurar los parámetros, agregue el tiempo de 40 minutos a la lista de productos.
NOTA: Este tiempo es necesario esperar a que la suspensión ASC se decante en la parte inferior del micromold. - En la Lista de productos, incluya la opción Transferencia de reactivos para transferir el medio de cultivo de esferoides a los pozos correspondientes de la placa.
- Repita los pasos 3.9 a 3.11 para configurar las configuraciones de posición y parámetros para transferir el medio de cultivo de esferoides.
- Haga clic en el botón con un símbolo de verificación en la barra superior del software para asegurarse de que no haya ningún error de programación.
- Haga clic en el botón Reproducir (con un símbolo de triángulo) en la barra superior del software para iniciar el programa.
- Deje que el equipo arranque, según lo programado, y espere a que emita un sonido, indicando que ha terminado.
- Recoge la placa de 12 pocillos e inculícala en una incubadora a 37 °C, 5% CO2 durante al menos 18 h para que los esferoides estén completamente formados y compactos.
- Cosechar manualmente los esferoides después de 1, 3 y 7 días de cultivo para su análisis. Enjuague manualmente el medio con una micropipeta para liberar los esferoides del hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado.
- Después de 5 min, verifique bajo el microscopio para determinar si los esferoides se liberan completamente del hidrogel de agarosa no adherente micromoldeado.
- Recoja los esferoides manualmente usando una micropipeta y transfiéralos a un tubo centrífugo de 15 ml.
- Lave los esferoides al menos dos veces con 0,01 M PBS. Evaluar la viabilidad y realizar análisis biomecánicos en las muestras de esferoides frescos. Para el análisis morfológico (histología), incubar las muestras de esferoides en paraformaldehído al 4% en PBS durante al menos 18 h a 2-8 °C.
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Representative Results
El sistema automático de pipetas puede sembrar la suspensión de células ASC en 12 pocillos de una placa de 12 pocillos en 15 minutos. El uso del hidrogel no adherente micromoldeado de 81 producirá 972 esferoides al final del protocolo. Utilizando el hidrogel no adherente micromoldeado 256 producirá 3.072 esferoides al final del protocolo. Los esferoides ASC fueron analizados por la homogeneidad de su tamaño y forma. Los esferoides ASC de micromoldes con 81 recesiones mostraron un diámetro homogéneo durante el período de cultivo en contraste con los esferoides ASC de micromoldes con 256 recesiones (Figura 1C, D). La relación entre los diámetros más pequeños y más grandes (esfericidad) fue cercana a 1 en los esferoides ASC de micromoldes con 81 y 256 recesiones (Figura 1E, F). Los resultados de los análisis de viabilidad, morfología y fuerza (Figura 2) proporcionan evidencia de la producción exitosa y a gran escala de esferoides ASC.
Figura 1: Los esferoides ASC mostraron una reproducibilidad de alto diámetro. Micrografías ópticas representativas de esferoides ASC a partir de hidrogeles no adhesivos micromoldeados con (A) 81 recesiones circulares y (B) 256 recesiones circulares. (C,D) Diámetro esferoide a 1, 3 y 7 días de cinco hidrogeles no adhesivos micromoldeados con 81 y 256 recesiones circulares, respectivamente. (E,F) Relación de los diámetros más pequeños y más grandes de hidrogeles no adhesivos micromoldeados con 81 y 256 recesiones circulares, respectivamente. Para medir los diámetros más pequeños y más grandes de los esferoides, las imágenes se adquirieron semanalmente utilizando un microscopio óptico equipado con una cámara digital. El ancho y la longitud se midieron utilizando el software ImageJ. Se obtuvo una relación de diámetro de cada esferoide dividiendo el ancho por la longitud (esfericidad esferoide). Se midieron un total de 85 esferoides a partir de hidrogeles micromoldeados y no adhesivos con 81 recesiones circulares, y se midieron un total de 160 esferoides a partir de hidrogeles micromoldeados y no adhesivos con 256 recesiones circulares. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Los asteriscos indican valores de P obtenidos por ANOVA no paramétrico y no emparejado seguidos de comparaciones múltiples (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: ASC = células madre/estromales del tejido adiposo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los esferoides ASC mostraron una alta viabilidad celular. (A) Micrografías de fluorescencia del ensayo de viabilidad de esferoides ASC en el día 7 a partir de hidrogeles micromoldeados y no adhesivos con 256 recesiones circulares. Las células vivas y muertas se observan en verde y rojo, respectivamente. El control de la muerte se muestra en el recuadro. (B) Sección de un esferoide ASC teñido por hematoxilina y eosina de hidrogeles micromoldeados y no adhesivos con 81 recesiones circulares. Las muestras de esferoides fijos se incrustaron en parafina, y las muestras se cortaron en secciones de espesor de 5 μm utilizando un microtomo. (C) Fuerza de resistencia a la compresión medida en μN de esferoides ASC en el día 7. Los datos fueron recolectados a partir de cinco esferoides y expresados como media ± desviación estándar, de acuerdo con la metodología previamente descrita5. Los asteriscos indican el valor de P obtenido por ANOVA bidireccional, no paramétrico y no emparejado, seguido de comparaciones múltiples. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: ASC = células madre/estromales del tejido adiposo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este artículo presenta la generación a gran escala de esferoides ASC utilizando un sistema automatizado de pipetas. El paso crítico del protocolo es configurar con precisión el software para garantizar el volumen correcto de suspensión de celdas, velocidad y distancia para el pipeteo. Los parámetros descritos en el protocolo se determinaron después de una serie de ensayos para optimizar la dispensación de la suspensión celular ASC en los pocillos de placas de 12 pocillos que contienen los hidrogeles micromoldeados y no adherentes. La optimización se evaluó midiendo el diámetro y la esfericidad de los esferoides. Se utilizó el área y la altura de los hidrogeles no adherentes micromoldeados para calcular la velocidad ideal para dispensar la suspensión celular. Si la suspensión celular es sembrada por el equipo a una velocidad de dispensación diferente, esto afectará directamente la formación de los esferoides. Por lo tanto, estos son parámetros cruciales para ser optimizados después de las pruebas con el equipo. Este protocolo tiene algunas limitaciones. Solo se puede automatizar la siembra de los ASC en el hidrogel no adherente en el micromoldo, seguida de la adición de medio de cultivo celular. Las características del sistema están limitadas por la versión del equipo y el software. Sin embargo, la principal ventaja de este enfoque reproducible es producir hasta 3.072 esferoides ASC -homogéneos en tamaño y forma y viables- con riesgos menores de errores humanos o contaminación. La gran cantidad de esferoides ASC biofabricados se puede cargar directamente en una bioimpresora 3D para producir modelos de tejidos más complejos.
En general, es ampliamente conocido que el pipeteo preciso y automatizado juega un papel central en la automatización del cultivo celular. Los sistemas automatizados de cultivo celular permiten la producción a gran escala y aumentan la precisión técnica, la reproducibilidad y la eficiencia del proceso15. Por lo tanto, los sistemas automatizados pueden facilitar la producción a gran escala, lo cual es común y beneficioso para los entornos industriales16,17. Sin embargo, hay pocos estudios que describan el desarrollo de protocolos para automatizar sistemas de cultivo celular 3D 7,18,19,20,21.
Mehesz y colaboradores7 y Meseguer-Ripolles y colegas21 utilizaron un protocolo similar al biofabricado de esferoides ASC. En el estudio de Mehesz et al.7, los autores utilizaron el mismo sistema de pipeteo automatizado. Sin embargo, su protocolo produjo solo 96 esferoides, mientras que el protocolo desarrollado en el presente trabajo fue capaz de producir hasta 3.072 esferoides ASC a la vez, homogéneos en tamaño y forma. Meseguer-Ripolles et al.21 también utilizaron un sistema de pipeteo automatizado para producir hasta 73 esferoides hepáticos. Otro enfoque que se está discutiendo para fabricar esferoides a gran escala hoy en día es a través de dispositivos de microfluídica. Sin embargo, los artículos publicados hasta ahora han explorado la tecnología para desarrollar mejores dispositivos que puedan producir los esferoides en lugar de aumentar la escala para la fabricación de esferoides 7,20.
Otro método que se puede utilizar para fabricar un gran número de esferoides es mediante el uso de matraces giratorios. Sin embargo, un problema principal con respecto a esta técnica es la dificultad para controlar el tamaño y la forma de los esferoides22,23. Además, la bioimpresión 3D también se aplicó ya a los esferoides biofabricados a gran escala. En el estudio de Daly y Kelly19, los autores utilizaron una técnica de inyección de tinta para producir un gran número de esferoides en microcámaras de policaprolactona. Los esferoides eran viables y homogéneos en tamaño y forma.
La principal aplicación del protocolo descrito en este trabajo es biofabricar los esferoides ASC a gran escala necesarios para la bioimpresión 3D. Como discutieron Mironov y colaboradores24, miles de esferoides serán necesarios para biofabricar tejidos complejos y modelos de órganos. El método automatizado descrito en este protocolo permitirá la fabricación de una gran cantidad de esferoides ASC que se pueden cargar directamente en la bioimpresora 3D. También es posible diferenciar estos esferoides a una vía mesodérmica deseada para diseñar tejidos musculoesqueléticos. De Moor y colaboradores25 desarrollaron un método de alto rendimiento para fabricar una gran cantidad de esferoides vascularizados para futuras aplicaciones de bioimpresión 3D.
El equipo puede ser modificado para mejorar el protocolo. Las versiones más recientes del equipo permiten el uso de un mayor número de placas, lo que podría mejorar el número de esferoides ASC producidos. Esta misma versión reciente permite el apilamiento preciso de las placas, y esto también proporcionaría una mejor eficiencia del protocolo. En conclusión, mostramos con éxito un protocolo que permite la biofabricación de hasta 3.072 esferoides ASC homogéneos en tamaño y forma en 15 min, y que este se considera el primer paso para construir una línea de biofabricación para aplicaciones de Ingeniería de Tejidos.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos al Instituto Nacional de Metrología, Calidad y Tecnología (INMETRO, RJ, Brasil) por el uso de sus instalaciones. Este estudio fue parcialmente apoyado por la Fundación Carlos Chagas Filho para el Apoyo a la Investigación del Estado de Río de Janeiro (Faperj) (Código financiero: E26/202.682/2018 y E-26/010.001771/2019), el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) (código financiero: 307460/2019-3) y la Oficina de Investigaciones Navales (ONR) (código financiero: N62909-21-1-2091). Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Centro Nacional de Ciencia y Tecnología en Medicina Regenerativa-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
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