Summary
Ici, nous décrivons la production à grande échelle de sphéroïdes stromaux / cellules souches (ASC) dérivés des adipeux à l’aide d’un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Ces sphéroïdes ASC peuvent être utilisés comme blocs de construction pour les approches de bio-impression 3D.
Abstract
Les cellules stromales/souches (ASC) dérivées des adiposes sont une sous-population de cellules présentes dans la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux sous-cutané humain reconnu comme une source classique de cellules stromales/souches mésenchymateuses. De nombreuses études ont été publiées avec des ASC pour des approches d’ingénierie tissulaire basées sur des échafaudages, qui ont principalement exploré le comportement de ces cellules après leur ensemencement sur des échafaudages bioactifs. Cependant, des approches sans échafaudage émergent pour concevoir des tissus in vitro et in vivo, principalement en utilisant des sphéroïdes, afin de surmonter les limites des approches basées sur des échafaudages.
Les sphéroïdes sont des microtissus 3D formés par le processus d’auto-assemblage. Ils peuvent mieux imiter l’architecture et le microenvironnement des tissus natifs, principalement en raison du grossissement des interactions de cellule à cellule et de matrice de cellule à extracellulaire. Récemment, les sphéroïdes sont principalement explorés en tant que modèles de maladies, études de dépistage de médicaments et éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Cependant, pour les approches de bio-impression 3D, de nombreux sphéroïdes, de taille et de forme homogènes, sont nécessaires pour biofabriquer des modèles complexes de tissus et d’organes. De plus, lorsque les sphéroïdes sont produits automatiquement, il y a peu de risques de contamination microbiologique, ce qui augmente la reproductibilité de la méthode.
La production à grande échelle de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bioimpression 3D et se termine par la maturation complète de la construction tissulaire dans les bioréacteurs. Cependant, le nombre d’études qui ont exploré la production de sphéroïdes ASC à grande échelle est encore rare, ainsi que le nombre d’études qui ont utilisé des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs de la bioimpression 3D. Par conséquent, cet article vise à montrer la production à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’une technique d’hydrogel micromoulé non adhésif répandant des sphéroïdes ASC comme éléments constitutifs pour les approches de bioimpression 3D.
Introduction
Les sphéroïdes sont considérés comme une approche sans échafaudage dans l’ingénierie tissulaire. Les ASC sont capables de former des sphéroïdes par le processus d’auto-assemblage. La microarchitecture 3D du sphéroïde augmente le potentiel de régénération des ASC, y compris la capacité de différenciation en plusieurs lignées 1,2,3. Ce groupe de recherche a travaillé avec des sphéroïdes ASC pour l’ingénierie du cartilage et des tissus osseux 4,5,6. Plus important encore, les sphéroïdes sont considérés comme des éléments constitutifs de la biofabrication des tissus et des organes, principalement en raison de leur capacité de fusion.
L’utilisation des sphéroïdes pour la formation des tissus dépend de trois points principaux: (1) le développement de méthodes robotiques standardisées et évolutives pour leur biofabrication7, (2) le phénotypage systématique des sphéroïdes tissulaires8, (3) le développement de méthodes pour l’assemblage de tissus 3D9. Ces sphéroïdes peuvent être formés avec différents types de cellules et obtenus par diverses méthodes, y compris la goutte suspendue, la réagrégation, la microfluidique et les micromoules 8,9,10. Chacune de ces méthodes présente des avantages et des inconvénients liés à l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes, à la récupération des sphéroïdes après leur formation, au nombre de sphéroïdes produits, à l’automatisation des processus, à l’intensité de la main-d’œuvre et aux coûts11.
Dans la méthode du micromoulage, les cellules sont distribuées et déposées au fond du micromoulage en raison de la gravité. L’hydrogel non adhésif ne permet pas aux cellules d’adhérer au fond, et les interactions cellule-à-cellule conduisent à la formation d’un seul sphéroïde par récession 8,12. Cette méthode de biofabrication génère des sphéroïdes de taille homogène et contrôlée, peut être robotisée pour une production à grande échelle de manière rapide avec un minimum d’effort, et présente de bons facteurs critiques de rentabilité dans la conception d’une biofabrication de sphéroïde tissulaire 7,8. Cette méthode peut être appliquée pour former des sphéroïdes de n’importe quelle lignée cellulaire afin de préparer un nouveau type de tissu avec des caractéristiques prévisibles, optimales et contrôlables8.
La biofabrication est définie comme « la génération automatisée de produits biologiquement fonctionnels avec une organisation structurelle... »13. Par conséquent, la production automatisée de sphéroïdes est considérée comme la première étape obligatoire pour le développement d’une ligne de biofabrication, qui se poursuit dans le processus de bio-impression 3D et se termine par la maturation complète du tissu bioimprimé par fusion sphéroïde. Dans cette étude, pour améliorer l’évolutivité de la biofabrication des sphéroïdes ASC, nous utilisons un système de pipetage automatisé pour ensemencer la suspension cellulaire, assurant ainsi l’homogénéité de la taille et de la forme des sphéroïdes. Cet article montre qu’il était possible de produire un grand nombre (des milliers) de sphéroïdes nécessaires aux approches de bio-impression 3D pour biofabriquer des modèles tissulaires plus complexes.
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Protocol
Les ASC utilisés dans cette étude ont déjà été isolés à partir de donneurs humains en bonne santé et cryoconservés comme décrit14 selon le Comité d’éthique de la recherche de l’hôpital universitaire Clementino Fraga Filho, Université fédérale de Rio de Janeiro, Brésil (25818719.4.0000.5257). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails concernant tous les matériaux et équipements utilisés dans cette étude.
1. Trypsinisation de la monocouche ASC au passage trois
- Ouvrir la culture tissulaire 175 cm2 flacon contenant la monocouche d’ASC à 80% de confluence et jeter le surnageant.
- Ajouter 7 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 0,01 M) et laver la monocouche deux fois. Ensuite, jetez le liquide.
- Ajouter 5 mL de trypsine à 0,125 % avec 0,78 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Ensuite, incuber pendant 5 min à 37 °C.
- Ajouter 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM LOW) à faible teneur en glucose de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) à la fiole de culture tissulaire de 175 cm2 et bien mélanger la suspension cellulaire avec une pipette sorologique de 10 mL.
- Récoltez la suspension cellulaire avec une pipette sérologique de 10 mL et transférez-la dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Ensuite, centrifuger à 400 × g pendant 5 min pour obtenir la pastille d’ASC. Remettez en suspension la pastille de la cellule en utilisant DMEM LOW contenant 10% de FBS.
- Effectuez un comptage de cellules par exclusion de trypan.
- Après avoir compté, prenez un total de 1 × 106 ASC dans un tube centrifuge de 15 mL séparé pour ensemencer les 81 récessions micromoulées avec de l’hydrogel non adhérent (un total de 10 000 cellules / mL ensemencées ici). Pour ensemencer 256 récessions d’hydrogel micromoulé non adhérent, prenez un total de 5 × 105 ASC dans un tube centrifuge (un total de 2 500 cellules / mL ensemencées ici).
2. Fabrication d’hydrogel d’agarose non adhérent micromoulé
- Préparer 50 mL d’une solution stérile d’agarose ultrapure à 2 % dans du NaCl à 0,9 % dans de l’eau ultrapure. Autoclaver la solution pendant 30 min à 121 °C.
- Ajouter 500 μL de solution stérile d’agarose ultrapure à 2% au centre d’un moule en silicone contenant 81 ou 256 renfoncements circulaires.
- Après 40 min, démoulez l’agarose ultrapure du moule en silicone et placez-la dans un puits d’une plaque en plastique à 12 puits.
- Ajouter 2 mL de DMEM LOW dans le puits avec l’agarose micromoulée et incuber dans un incubateur à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5 % pendant au moins 12 h avant d’ensemencer les ASC.
3. Biofabrication des sphéroïdes ASC à l’aide du système de pipetage automatisé
- Vérifiez les points suivants :
- Vérifiez si le flux laminaire est activé et si le flux d’air de l’armoire fonctionne correctement.
- Vérifiez si l’équipement est connecté à la bonne tension.
- Vérifiez si la tablette est connectée à l’équipement.
- Vérifiez si la hauteur du verre de protection de l’armoire est à la même hauteur que le marquage du capteur de l’équipement.
- Appuyez sur le bouton Marche/Arrêt sur le côté gauche de l’équipement et attendez que la tablette et l’équipement démarrent.
- Placez les boîtes de pointe, le rack pour les tubes centrifuges et la plaque contenant l’hydrogel d’agarose micromoulé dans l’espace de travail de l’équipement.
- Sur la tablette avec le logiciel ouvert, cliquez d’abord sur Labware Editor.
- Installez une table de travail virtuelle et choisissez les positions des pipettes, des boîtes à embouts, du rack pour les tubes en plastique et des plaques.
REMARQUE : La table de travail virtuelle doit représenter les positions physiques des accessoires dans l’équipement. - Cliquez sur le bouton Passer à la production pour inclure les paramètres (voir étape 3.10) et les commandes que l’équipement exécutera tout au long de l’expérience. Attendez qu’une barre d’outils et une liste de produits s’ouvrent dans le logiciel.
- Initialement, pour indiquer les commandes, incluez le nombre d’échantillons à pipeter et faites-le glisser vers la liste de production.
REMARQUE: Le nombre d’échantillons est le nombre de tubes centrifuges en plastique contenant la suspension ASC à ensemencer au centre des micromoules. - Après avoir entré le nombre d’échantillons, cliquez sur le bouton de commande Transfert d’échantillons du logiciel pour transférer la suspension ASC vers les puits de la plaque de 12 puits, contenant les micromoules, et faites-la glisser vers la liste des produits.
- Cliquez sur Propriétés pour définir les positions de début et de fin de l’équipement pour transférer l’échantillon.
- Attendez que le logiciel revienne à la page Table de travail . Cliquez sur le bouton Options pour configurer les paramètres d’ensemencement automatisé des ASC: i) Vitesse d’aspiration de 15,4 s-1; ii) Vitesse de distribution de 1 s-1; iii) Délai de soufflage de 0 ms; iv) Vitesse de soufflage de 15,4 s-1; v) Avc initial de 100%. Sélectionnez Eau comme type de liquide standard.
- Configurer les paramètres pour mélanger les ASC afin d’obtenir une suspension homogène : i) Nombre de cycles de 5 ; ii) Vitesse de 6,5 s-1; iii) Volume de 300 μL.
- Après avoir configuré les paramètres, ajoutez le temps de 40 min à la liste des produits.
REMARQUE: Ce temps est nécessaire pour attendre que la suspension ASC décante au bas du micromoulage. - Dans la liste des produits, incluez l’option Transfert de réactif pour transférer le milieu de culture sphéroïde vers les puits correspondants de la plaque.
- Répétez les étapes 3.9 à 3.11 pour configurer les configurations de position et de paramètres pour transférer le milieu de culture sphéroïde.
- Cliquez sur le bouton avec un symbole de contrôle sur la barre supérieure du logiciel pour vous assurer qu’il n’y a pas d’erreur de programmation.
- Cliquez sur le bouton Lecture (avec un symbole triangulaire) dans la barre supérieure du logiciel pour démarrer le programme.
- Laissez l’équipement démarrer, comme programmé, et attendez qu’il émette un son, indiquant qu’il est terminé.
- Recueillir la plaque de 12 puits et l’incuber dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 18 h pour que les sphéroïdes soient complètement formés et compacts.
- Récoltez manuellement les sphéroïdes après 1, 3 et 7 jours de culture pour analyse. Rincer manuellement le milieu avec une micropipette pour libérer les sphéroïdes de l’hydrogel d’agarose micromoulé non adhérent.
- Après 5 min, vérifiez au microscope si les sphéroïdes sont complètement libérés de l’hydrogel d’agarose non adhérent micromoulé.
- Collectez les sphéroïdes manuellement à l’aide d’une micropipette et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
- Lavez les sphéroïdes au moins deux fois avec 0,01 M PBS. Évaluer la viabilité et effectuer des analyses biomécaniques sur les échantillons de sphéroïdes frais. Pour l’analyse morphologique (histologie), incuber les échantillons de sphéroïdes dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant au moins 18 h à 2-8 °C.
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Representative Results
Le système de pipette automatique peut ensemencer la suspension de la cellule ASC dans 12 puits d’une plaque de 12 puits en 15 min. L’utilisation des 81 hydrogels micromoulés non adhérents produira 972 sphéroïdes à la fin du protocole. L’utilisation des 256 hydrogels micromoulés non adhérents produira 3 072 sphéroïdes à la fin du protocole. Les sphéroïdes ASC ont été analysés pour l’homogénéité de leur taille et de leur forme. Les sphéroïdes ASC des micromoules avec 81 récessions ont montré un diamètre homogène pendant la période de culture, contrairement aux sphéroïdes ASC des micromolds avec 256 récessions (Figure 1C, D). Le rapport entre les diamètres les plus petits et les plus grands (sphéricité) était proche de 1 dans les sphéroïdes ASC provenant de micromoules avec 81 et 256 récessions (Figure 1E, F). Les résultats des analyses de viabilité, de morphologie et de force (figure 2) fournissent des preuves de la production réussie à grande échelle de sphéroïdes ASC.
Figure 1 : Les sphéroïdes ASC ont montré une reproductibilité de haut diamètre. Micrographies optiques représentatives des sphéroïdes ASC à partir d’hydrogels non adhésifs micromoulés avec (A) 81 récessions circulaires et (B) 256 récessions circulaires. (C,D) Diamètre sphéroïde à 1, 3 et 7 jours de cinq hydrogels micromoulés non adhésifs avec 81 et 256 récessions circulaires, respectivement. (E,F) Rapport des diamètres les plus petits et les plus grands des hydrogels non adhésifs micromoulés avec respectivement 81 et 256 récessions circulaires. Pour mesurer les diamètres les plus petits et les plus grands des sphéroïdes, des images ont été acquises chaque semaine à l’aide d’un microscope optique équipé d’un appareil photo numérique. La largeur et la longueur ont été mesurées à l’aide du logiciel ImageJ. Un rapport de diamètre de chaque sphéroïde a été obtenu en divisant la largeur par la longueur (sphéricité sphéroïde). Au total, 85 sphéroïdes ont été mesurés à partir d’hydrogels micromoulés non adhésifs avec 81 récessions circulaires, et un total de 160 sphéroïdes ont été mesurés à partir d’hydrogels micromoulés non adhésifs avec 256 récessions circulaires. Les données sont exprimées sous forme d’écart-type moyen ±. Les astérisques indiquent des valeurs de P obtenues par ANOVA non paramétrique et non appariée suivies de comparaisons multiples (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Barres d’échelle = 100 μm. Abréviation : ASC = cellules souches/stromales du tissu adipeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les sphéroïdes ASC ont montré une viabilité cellulaire élevée. (A) Micrographies de fluorescence du test de viabilité des sphéroïdes ASC au jour 7 à partir d’hydrogels micromoulés non adhésifs avec 256 récessions circulaires. Les cellules vivantes et mortes sont observées en vert et en rouge, respectivement. Le contrôle de la mort est indiqué dans l’encart. (B) Section d’un sphéroïde ASC coloré par l’hématoxyline et l’éosine à partir d’hydrogels micromoulés non adhésifs avec 81 récessions circulaires. Les échantillons de sphéroïdes fixes ont été incorporés dans de la paraffine et les échantillons ont été découpés en sections de 5 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome. (C) Force de résistance à la compression mesurée en μN des sphéroïdes ASC au jour 7. Les données ont été recueillies à partir de cinq sphéroïdes et exprimées en moyenne ± écart-type, selon la méthodologie décrite précédemment5. Les astérisques indiquent la valeur de P obtenue par ANOVA bidirectionnelle, non paramétrique et non appariée, suivie de comparaisons multiples. Barres d’échelle = 50 μm. Abréviation : ASC = cellules souches/stromales du tissu adipeux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cet article présente la génération à grande échelle de sphéroïdes ASC à l’aide d’un système de pipette automatisé. L’étape critique du protocole consiste à configurer avec précision le logiciel pour assurer le volume correct de suspension de cellule, la vitesse et la distance pour le pipetage. Les paramètres décrits dans le protocole ont été déterminés après un certain nombre d’essais afin d’optimiser la distribution de la suspension de cellules ASC dans les puits de plaques de 12 puits contenant les hydrogels micromoulés non adhérents. L’optimisation a été évaluée en mesurant le diamètre et la sphéricité des sphéroïdes. La surface et la hauteur des hydrogels micromoulés non adhérents ont été utilisées pour calculer la vitesse idéale pour distribuer la suspension cellulaire. Si la suspension cellulaire est ensemencée par l’équipement à une vitesse de distribution différente, cela affectera directement la formation des sphéroïdes. Par conséquent, ce sont des paramètres cruciaux à optimiser après les essais avec l’équipement. Ce protocole présente certaines limites. Seul l’ensemencement des ASC dans l’hydrogel non adhérent dans le micromoulage peut être automatisé, suivi de l’ajout d’un milieu de culture cellulaire. Les caractéristiques du système sont limitées par la version de l’équipement et du logiciel. Cependant, le principal avantage de cette approche reproductible est de produire jusqu’à 3 072 sphéroïdes ASC - homogènes en taille et en forme et viables - avec des risques mineurs d’erreurs humaines ou de contamination. Le grand nombre de sphéroïdes ASC biofabriqués peut être directement chargé dans une bioimprimante 3D pour produire des modèles tissulaires plus complexes.
En général, il est bien connu que le pipetage précis et automatisé joue un rôle central dans l’automatisation de la culture cellulaire. Les systèmes de culture cellulaire automatisés permettent une production à grande échelle et augmentent la précision technique, la reproductibilité et l’efficacité du processus15. Par conséquent, les systèmes automatisés peuvent faciliter la production à grande échelle, ce qui est courant et bénéfique pour les environnements industriels16,17. Cependant, il existe peu d’études décrivant le développement de protocoles pour automatiser les systèmes de culture cellulaire 3D 7,18,19,20,21.
Mehesz et ses collaborateurs7 et Meseguer-Ripolles et ses collègues21 ont utilisé un protocole similaire pour biofabriquer des sphéroïdes ASC. Dans l’étude de Mehesz et al.7, les auteurs ont utilisé le même système de pipetage automatisé. Cependant, leur protocole n’a produit que 96 sphéroïdes, alors que le protocole développé dans le présent travail était capable de produire jusqu’à 3 072 sphéroïdes ASC à la fois, de taille et de forme homogènes. Meseguer-Ripolles et al.21 ont également utilisé un système de pipetage automatisé pour produire jusqu’à 73 sphéroïdes hépatiques. Une autre approche discutée pour fabriquer des sphéroïdes à grande échelle de nos jours est via des dispositifs microfluidiques. Cependant, les articles publiés jusqu’à présent ont exploré la technologie pour développer de meilleurs dispositifs capables de produire les sphéroïdes plutôt que d’augmenter l’échelle de fabrication des sphéroïdes 7,20.
Une autre méthode qui peut être utilisée pour fabriquer un grand nombre de sphéroïdes consiste à utiliser des flacons de spinner. Cependant, l’un des principaux problèmes concernant cette technique est la difficulté de contrôler la taille et la forme des sphéroïdes22,23. En outre, la bioimpression 3D était déjà appliquée aux sphéroïdes biofabriqués à grande échelle. Dans l’étude de Daly et Kelly19, les auteurs ont utilisé une technique à jet d’encre pour produire un grand nombre de sphéroïdes dans des microchambres de polycaprolactone. Les sphéroïdes étaient viables et homogènes en taille et en forme.
L’application principale du protocole décrit dans ce travail est de biofabriquer les sphéroïdes ASC à grande échelle nécessaires à la bioimpression 3D. Comme l’ont discuté Mironov et ses collaborateurs24, des milliers de sphéroïdes seront nécessaires pour biofabriquer des tissus complexes et des modèles d’organes. La méthode automatisée décrite dans ce protocole permettra la fabrication d’un grand nombre de sphéroïdes ASC pouvant être chargés directement dans la bioimprimante 3D. Il est également possible de différencier ces sphéroïdes en une voie mésodermique souhaitée pour concevoir des tissus musculo-squelettiques. De Moor et ses collaborateurs25 ont développé une méthode à haut débit pour fabriquer un grand nombre de sphéroïdes vascularisés pour de futures applications de bio-impression 3D.
L’équipement peut être modifié pour améliorer le protocole. Des versions plus récentes de l’équipement permettent l’utilisation d’un plus grand nombre de plaques, ce qui pourrait augmenter le nombre de sphéroïdes ASC produits. Cette même version récente permet l’empilement précis des plaques, ce qui permettrait également une meilleure efficacité du protocole. En conclusion, nous avons montré avec succès un protocole permettant la biofabrication jusqu’à 3 072 sphéroïdes ASC homogènes en taille et en forme en 15 min, et que cela est considéré comme la première étape pour construire une ligne de biofabrication pour les applications d’ingénierie tissulaire.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Nous remercions l’Institut national de métrologie, de qualité et de technologie (INMETRO, RJ, Brésil) pour l’utilisation de ses installations. Cette étude a été partiellement soutenue par la Fondation Carlos Chagas Filho pour le soutien à la recherche de l’État de Rio de Janeiro (Faperj) (code financier: E26/202.682/2018 et E-26/010.001771/2019), le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) (code financier: 307460/2019-3) et l’Office de la recherche navale (ONR) (code financier: N62909-21-1-2091). Ce travail a été partiellement soutenu par le National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
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