Storskala, automatisert produksjon av fettavledede stamcellesfæroider for 3D-bioprinting
Summary
Her beskriver vi storskala produksjon av fettavledet stromal/ stamcelle (ASC) sfæroider ved hjelp av et automatisert pipetteringssystem for å frø cellesuspensjonen, og dermed sikre homogenitet av sfæroid størrelse og form. Disse ASC-sfæroidene kan brukes som byggesteiner for 3D-bioprintingsmetoder.
Abstract
Fettavledede stromale / stamceller (ASC) er en underpopulasjon av celler som finnes i den stromale vaskulære fraksjonen av humant subkutant fettvev anerkjent som en klassisk kilde til mesenkymale stromale / stamceller. Mange studier har blitt publisert med ASC for stillasbaserte vevstekniske tilnærminger, som hovedsakelig utforsket oppførselen til disse cellene etter såing på bioaktive stillaser. Stillasfrie tilnærminger dukker imidlertid opp for å konstruere vev in vitro og in vivo, hovedsakelig ved å bruke sfæroider, for å overvinne begrensningene i stillasbaserte tilnærminger.
Sfæroider er 3D-mikrotissuer dannet av selvmonteringsprosessen. De kan bedre etterligne arkitekturen og mikromiljøet til innfødte vev, hovedsakelig på grunn av forstørrelsen av celle-til-celle og celle-til-ekstracellulære matriseinteraksjoner. Nylig blir sfæroider hovedsakelig utforsket som sykdomsmodeller, narkotikascreeningstudier og byggesteiner for 3D-bioprinting. For 3D-bioprintingsmetoder er det imidlertid nødvendig med mange sfæroider, homogene i størrelse og form, for å biofabrikere komplekse vevs- og organmodeller. I tillegg, når sfæroider produseres automatisk, er det liten sjanse for mikrobiologisk forurensning, noe som øker reproduserbarheten av metoden.
Storskala produksjon av sfæroider regnes som det første obligatoriske trinnet for å utvikle en biofabrikasjonslinje, som fortsetter i 3D-bioprintingsprosessen og avsluttes i full modning av vevskonstruksjonen i bioreaktorer. Imidlertid er antall studier som utforsket den store ASC-sfæroidproduksjonen fortsatt knappe, sammen med antall studier som brukte ASC-sfæroider som byggesteiner for 3D-bioprinting. Derfor tar denne artikkelen sikte på å vise storskala produksjon av ASC-sfæroider ved hjelp av en ikke-klebende mikromoldert hydrogelteknikk som sprer ASC-sfæroider som byggesteiner for 3D-bioprintingsmetoder.
Introduction
Sfæroider betraktes som en stillasfri tilnærming i vevsteknikk. ASC-er er i stand til å danne sfæroider ved selvmonteringsprosessen. Sfæroidens 3D-mikroarkitektur øker det regenerative potensialet til ASC-er, inkludert differensieringskapasiteten i flere linjer 1,2,3. Denne forskningsgruppen har jobbet med ASC-sfæroider for brusk og beinvevsteknikk 4,5,6. Enda viktigere, sfæroider betraktes som byggesteiner i biofabrikasjon av vev og organer, hovedsakelig på grunn av deres fusjonskapasitet.
Bruken av sfæroider for vevsdannelse avhenger av tre hovedpunkter: (1) utvikling av standardiserte og skalerbare robotmetoder for deres biofabrikasjon7, (2) systematisk fenotyping av vevssfæroider8, (3) utvikling av metoder for montering av 3D-vev9. Disse sfæroider kan dannes med forskjellige celletyper og oppnås gjennom ulike metoder, inkludert hengende dråpe, reaggregering, mikrofluidikk og mikromolder 8,9,10. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper knyttet til homogeniteten av størrelse og form av sfæroider, gjenoppretting av sfæroider etter dannelse, antall produserte sfæroider, prosessautomatisering, arbeidsintensitet og kostnader11.
I mikromoldmetoden blir cellene dispensert og avsatt på bunnen av mikromolden på grunn av tyngdekraften. Den ikke-klebende hydrogelen tillater ikke at cellene fester seg til bunnen, og celle-til-celle-interaksjoner fører til dannelsen av en enkelt sfæroid per lavkonjunktur 8,12. Denne biofabrikasjonsmetoden genererer sfæroider av homogen og kontrollert størrelse, kan robotiseres for storskala produksjon på en tidseffektiv måte med minimal innsats, og har gode kostnadseffektivitetskritiske faktorer i utformingen av en biofabrikasjon av vevssfæroid 7,8. Denne metoden kan brukes til å danne sfæroider av hvilken som helst cellelinje for å forberede en ny vevstype med forutsigbare, optimale og kontrollerbare egenskaper8.
Biofabrikasjon er definert som “automatisert generering av biologisk funksjonelle produkter med strukturell organisering …”13. Derfor anses den automatiserte produksjonen av sfæroider som det første obligatoriske trinnet for å utvikle en biofabrikasjonslinje, som fortsetter i 3D-bioprintingsprosessen og avsluttes i full modning av det bioprintede vevet ved sfæroidfusjon. I denne studien, for å forbedre skalerbarheten til ASC-sfæroid biofabrikasjon, bruker vi et automatisert pipetteringssystem for å frø cellesuspensjonen, og sikrer dermed homogeniteten av sfæroid størrelse og form. Dette papiret viser at det var mulig å produsere et stort antall (tusenvis) sfæroider som trengs for 3D bioprinting tilnærminger til biofabricate mer komplekse vevsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen presenterer storskala generering av ASC-sfæroider ved hjelp av et automatisert pipettesystem. Det kritiske trinnet i protokollen er å nøyaktig sette opp programvaren for å sikre riktig volum cellesuspensjon, hastighet og avstand for pipettering. Parametrene beskrevet i protokollen ble bestemt etter en rekke forsøk for å optimalisere dispenseringen av ASC-cellesuspensjonen i brønnene på 12-brønnsplater som inneholder mikromolderte, ikke-klebende hydrogeler. Optimaliseringen ble evaluert ved å m?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasil) for bruken av deres fasiliteter. Denne studien ble delvis støttet av Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finanskode: E26/202.682/2018 og E-26/010.001771/2019, Nasjonalt råd for vitenskapelig og teknologisk utvikling (CNPq) (finanskode: 307460/2019-3), og Office of Naval Research (ONR) (finanskode: N62909-21-1-2091). Dette arbeidet ble delvis støttet av National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
