Summary
Her beskriver vi storskala produksjon av fettavledet stromal/ stamcelle (ASC) sfæroider ved hjelp av et automatisert pipetteringssystem for å frø cellesuspensjonen, og dermed sikre homogenitet av sfæroid størrelse og form. Disse ASC-sfæroidene kan brukes som byggesteiner for 3D-bioprintingsmetoder.
Abstract
Fettavledede stromale / stamceller (ASC) er en underpopulasjon av celler som finnes i den stromale vaskulære fraksjonen av humant subkutant fettvev anerkjent som en klassisk kilde til mesenkymale stromale / stamceller. Mange studier har blitt publisert med ASC for stillasbaserte vevstekniske tilnærminger, som hovedsakelig utforsket oppførselen til disse cellene etter såing på bioaktive stillaser. Stillasfrie tilnærminger dukker imidlertid opp for å konstruere vev in vitro og in vivo, hovedsakelig ved å bruke sfæroider, for å overvinne begrensningene i stillasbaserte tilnærminger.
Sfæroider er 3D-mikrotissuer dannet av selvmonteringsprosessen. De kan bedre etterligne arkitekturen og mikromiljøet til innfødte vev, hovedsakelig på grunn av forstørrelsen av celle-til-celle og celle-til-ekstracellulære matriseinteraksjoner. Nylig blir sfæroider hovedsakelig utforsket som sykdomsmodeller, narkotikascreeningstudier og byggesteiner for 3D-bioprinting. For 3D-bioprintingsmetoder er det imidlertid nødvendig med mange sfæroider, homogene i størrelse og form, for å biofabrikere komplekse vevs- og organmodeller. I tillegg, når sfæroider produseres automatisk, er det liten sjanse for mikrobiologisk forurensning, noe som øker reproduserbarheten av metoden.
Storskala produksjon av sfæroider regnes som det første obligatoriske trinnet for å utvikle en biofabrikasjonslinje, som fortsetter i 3D-bioprintingsprosessen og avsluttes i full modning av vevskonstruksjonen i bioreaktorer. Imidlertid er antall studier som utforsket den store ASC-sfæroidproduksjonen fortsatt knappe, sammen med antall studier som brukte ASC-sfæroider som byggesteiner for 3D-bioprinting. Derfor tar denne artikkelen sikte på å vise storskala produksjon av ASC-sfæroider ved hjelp av en ikke-klebende mikromoldert hydrogelteknikk som sprer ASC-sfæroider som byggesteiner for 3D-bioprintingsmetoder.
Introduction
Sfæroider betraktes som en stillasfri tilnærming i vevsteknikk. ASC-er er i stand til å danne sfæroider ved selvmonteringsprosessen. Sfæroidens 3D-mikroarkitektur øker det regenerative potensialet til ASC-er, inkludert differensieringskapasiteten i flere linjer 1,2,3. Denne forskningsgruppen har jobbet med ASC-sfæroider for brusk og beinvevsteknikk 4,5,6. Enda viktigere, sfæroider betraktes som byggesteiner i biofabrikasjon av vev og organer, hovedsakelig på grunn av deres fusjonskapasitet.
Bruken av sfæroider for vevsdannelse avhenger av tre hovedpunkter: (1) utvikling av standardiserte og skalerbare robotmetoder for deres biofabrikasjon7, (2) systematisk fenotyping av vevssfæroider8, (3) utvikling av metoder for montering av 3D-vev9. Disse sfæroider kan dannes med forskjellige celletyper og oppnås gjennom ulike metoder, inkludert hengende dråpe, reaggregering, mikrofluidikk og mikromolder 8,9,10. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper knyttet til homogeniteten av størrelse og form av sfæroider, gjenoppretting av sfæroider etter dannelse, antall produserte sfæroider, prosessautomatisering, arbeidsintensitet og kostnader11.
I mikromoldmetoden blir cellene dispensert og avsatt på bunnen av mikromolden på grunn av tyngdekraften. Den ikke-klebende hydrogelen tillater ikke at cellene fester seg til bunnen, og celle-til-celle-interaksjoner fører til dannelsen av en enkelt sfæroid per lavkonjunktur 8,12. Denne biofabrikasjonsmetoden genererer sfæroider av homogen og kontrollert størrelse, kan robotiseres for storskala produksjon på en tidseffektiv måte med minimal innsats, og har gode kostnadseffektivitetskritiske faktorer i utformingen av en biofabrikasjon av vevssfæroid 7,8. Denne metoden kan brukes til å danne sfæroider av hvilken som helst cellelinje for å forberede en ny vevstype med forutsigbare, optimale og kontrollerbare egenskaper8.
Biofabrikasjon er definert som "automatisert generering av biologisk funksjonelle produkter med strukturell organisering ..."13. Derfor anses den automatiserte produksjonen av sfæroider som det første obligatoriske trinnet for å utvikle en biofabrikasjonslinje, som fortsetter i 3D-bioprintingsprosessen og avsluttes i full modning av det bioprintede vevet ved sfæroidfusjon. I denne studien, for å forbedre skalerbarheten til ASC-sfæroid biofabrikasjon, bruker vi et automatisert pipetteringssystem for å frø cellesuspensjonen, og sikrer dermed homogeniteten av sfæroid størrelse og form. Dette papiret viser at det var mulig å produsere et stort antall (tusenvis) sfæroider som trengs for 3D bioprinting tilnærminger til biofabricate mer komplekse vevsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ASCene som ble brukt i denne studien var tidligere isolert fra friske humane donorer og kryopreservert som beskrevet14 i henhold til forskningsetisk komité ved Clementino Fraga Filho Universitetssykehus, Federal University of Rio de Janeiro, Brasil (25818719.4.0000.5257). Se Materialtabell for detaljer om alle materialer og utstyr som er brukt i denne studien.
1. Trypsinisering av ASC monolag ved passering tre
- Åpne vevskulturen 175 cm2 kolbe som inneholder monolaget av ASC ved 80 % sammenløp og kast supernatanten.
- Tilsett 7 ml fosfatbufret saltvann (PBS, 0,01 M) og vask monolaget to ganger. Kast deretter væsken.
- Tilsett 5 ml 0,125 % trypsin med 0,78 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA). Deretter ruges det i 5 minutter ved 37 °C.
- Tilsett 10 ml lavglukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM LOW) med 10 % føtalt bovint serum (FBS) til vevskulturen 175 cm2 kolbe og bland cellesuspensjonen godt med en 10 ml sorologisk pipette.
- Høst cellesuspensjonen med en 10 ml serologisk pipette og overfør den til et sentrifugerør på 50 ml. Deretter sentrifuge ved 400 × g i 5 minutter for å oppnå pellet av ASC. Resuspender cellepelleten ved hjelp av DMEM LOW som inneholder 10% FBS.
- Utføre en celletelling ved trypanekskludering.
- Etter telling, ta totalt 1 × 106 ASC-er i et separat sentrifugerør på 15 ml for å frø de 81 lavkonjunkturene mikromoldert med ikke-adherent hydrogel (totalt 10.000 celler / ml sådd her). For å så 256 resesjoner av mikromolded ikke-adherent hydrogel, ta totalt 5 × 105 ASC-er i et sentrifugerør (totalt 2,500 celler / ml sådd her).
2. Micromolded ikke-adherent agarose hydrogel fabrikasjon
- Klargjør 50 ml av en steril oppløsning av 2 % ultraren agarose i 0,9 % NaCl i ultrarent vann. Autoklav oppløsningen i 30 minutter ved 121 °C.
- Tilsett 500 μL steril 2% ultraren agaroseløsning i midten av en silikonform som inneholder 81 eller 256 sirkulære utsparinger.
- Etter 40 minutter, unmold den ultrarene agarose fra silikonformen og legg den i en brønn av en 12-brønns plastplate.
- Tilsett 2 ml DMEM LOW i brønnen med mikromoldet agarose og inkuber i en inkubator ved 37 °C i en 5 % CO2 atmosfære i minst 12 timer før ASC-ene sås.
3. Biofabrikasjon av ASC-sfæroider ved hjelp av det automatiserte pipetteringssystemet
- Kontroller følgende:
- Kontroller om laminær strømning er på, og luftstrømmen til skapet fungerer som den skal.
- Kontroller om utstyret er koblet til riktig spenning.
- Sjekk om nettbrettet er koblet til utstyret.
- Kontroller om høyden på kabinettbeskyttelsesglasset er i samme høyde som sensormerkingen av utstyret.
- Trykk på av/på-knappen på venstre side av utstyret og vent til nettbrettet og utstyret starter.
- Plasser spissboksene, stativet for sentrifugerør og platen som inneholder mikromolded agarosehydrogel i arbeidsområdet til utstyret.
- På nettbrettet med programvaren åpen, klikk først på Labware Editor.
- Sett opp et virtuelt arbeidsbord og velg posisjonene til pipettene, spissboksene, stativet for plastrørene og platene.
MERK: Det virtuelle arbeidsbordet må representere de fysiske posisjonene til tilbehøret i utstyret. - Klikk på Bytt til produksjon-knappen for å inkludere parametrene (se trinn 3.10) og kommandoer som utstyret vil utføre gjennom hele eksperimentet. Vent til en verktøylinje og en produser liste åpnes i programvaren.
- Til å begynne med, for å indikere kommandoene, inkluderer du antall prøver som skal pipetteres, og drar det til produksjonslisten.
MERK: Antall prøver er antall plastsentrifugerør som inneholder ASC-suspensjonen som skal sås i midten av mikromoldene. - Etter å ha angitt antall prøver, klikk på prøveoverføringskommandoknappen på programvaren for å overføre ASC-suspensjonen til brønnene på 12-brønnsplaten, som inneholder mikromoldene, og dra den til produksjonslisten.
- Klikk på Egenskaper for å sette opp start- og sluttposisjonene for utstyret for å overføre prøven.
- Vent til programvaren går tilbake til Arbeidstabell-siden . Klikk på Alternativer-knappen for å sette opp parametrene for automatisert såing av ASC-ene: i) Aspirasjonshastighet på 15,4 s-1; ii) Dispenserhastighet på 1 s-1; iii) Blåseforsinkelse på 0 ms; iv) Blåsehastighet på 15,4 s-1; v) Innledende slag på 100%. Velg Vann som standard væsketype.
- Sett opp parametrene for å blande ASC-ene for å oppnå en homogen suspensjon: i) Antall sykluser på 5; ii) Hastighet på 6,5 s-1; iii) Volum på 300 μL.
- Når du har konfigurert parameterne, legger du til tiden på 40 minutter i produksjonslisten.
MERK: Denne gangen er nødvendig for å vente på at ASC-suspensjonen skal dekantere i bunnen av mikromolden. - I produksjonslisten inkluderer du alternativet Reagensoverføring for å overføre sfæroidkulturmediet til de tilsvarende brønnene på platen.
- Gjenta trinn 3.9-3.11 for å konfigurere posisjons- og parameterkonfigurasjonene for å overføre sfæroidkulturmediet.
- Klikk på knappen med et hakesymbol på den øverste linjen i programvaren for å sikre at det ikke er noen programmeringsfeil.
- Klikk på Play-knappen (med et trekantsymbol) på den øverste linjen i programvaren for å starte programmet.
- La utstyret starte, som programmert, og vent til det lager en lyd, noe som indikerer at det er ferdig.
- Samle 12-brønnsplaten og inkuber den i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i minst 18 timer for at sfæroidene skal være fullstendig dannet og kompakte.
- Høst sfæroidene manuelt etter 1, 3 og 7 dagers kultur for analyse. Skyll mediet manuelt med en mikropipette for å frigjøre sfæroidene fra den mikromolderte ikke-klebende agarosehydrogelen.
- Etter 5 minutter, sjekk under mikroskopet for å avgjøre om sfæroidene er helt frigjort fra den mikromolderte ikke-adherent agarosehydrogelen.
- Samle sfæroidene manuelt ved hjelp av en mikropipette og overfør dem til et 15 ml sentrifugerør.
- Vask sfæroidene minst to ganger med 0,01 M PBS. Vurdere levedyktigheten og utføre biomekaniske analyser på de ferske sfæroidprøvene. For morfologianalyse (histologi) inkuberes sfæroidprøvene i 4 % paraformaldehyd i PBS i minst 18 timer ved 2-8 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det automatiske pipettesystemet kan så ASC-cellesuspensjonen i 12 brønner av en 12-brønns plate på 15 minutter. Ved hjelp av 81 mikromolded ikke-adherent hydrogel vil produsere 972 sfæroider på slutten av protokollen. Ved hjelp av 256 mikromolded ikke-adherent hydrogel vil produsere 3,072 sfæroider på slutten av protokollen. ASC-sfæroider ble analysert for homogeniteten av deres størrelse og form. ASC-sfæroider fra mikromolder med 81 resesjoner viste homogen diameter i kulturperioden i motsetning til ASC-sfæroider fra mikromolder med 256 resesjoner (figur 1C, D). Forholdet mellom de minste og største diametrene (sfærisitet) var nær 1 i ASC-sfæroider fra mikromolder med 81 og 256 resesjoner (figur 1E, F). Resultatene fra levedyktighets-, morfologi- og kraftanalyser (figur 2) gir bevis for vellykket, storskala produksjon av ASC-sfæroider.
Figur 1: ASC-sfæroider viste reproduserbarhet med høy diameter. Representative optiske mikrografer av ASC-sfæroider fra mikromolderte ikke-klebende hydrogeler med (A) 81 sirkulære resesjoner og (B) 256 sirkulære nedgangstider. (C,D) Sfæroid diameter på 1, 3 og 7 dager fra fem mikromoldede ikke-klebende hydrogeler med henholdsvis 81 og 256 sirkulære resesjoner. (E,F) Forholdet mellom de minste og største diametrene fra mikromolderte ikke-klebende hydrogeler med henholdsvis 81 og 256 sirkulære resesjoner. For å måle de minste og største diametrene til sfæroidene, ble bildene tatt ukentlig ved hjelp av et optisk mikroskop utstyrt med et digitalt kamera. Bredde og lengde ble målt ved hjelp av ImageJ-programvare. Et diameterforhold for hver sfæroid ble oppnådd ved å dele bredde etter lengde (sfæroid sfæriskhet). Totalt 85 sfæroider ble målt fra mikromoldede, ikke-klebende hydrogeler med 81 sirkulære nedgangstider, og totalt 160 sfæroider ble målt fra mikromoldede, ikke-klebende hydrogeler med 256 sirkulære lavkonjunkturer. Dataene uttrykkes som gjennomsnitt ± standardavvik. Stjernene indikerer verdier av P oppnådd ved ANOVA ikke-parametrisk og uparret etterfulgt av flere sammenligninger (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Skala barer = 100 μm. Forkortelse: ASC = fettvevstamme/stromale celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: ASC-sfæroider viste høy celle levedyktighet. (A) Fluorescensmikrografier av levedyktighetsanalyse av ASC-sfæroider på dag 7 fra mikromolderte, ikke-klebende hydrogeler med 256 sirkulære nedgangstider. Levende og døde celler observeres i henholdsvis grønt og rødt. Dødskontroll vises i innfellingen. (B) Seksjon av en ASC-sfæroid farget av hematoksylin og eosin fra mikromolderte, ikke-klebende hydrogeler med 81 sirkulære nedgangstider. De faste sfæroidprøvene ble innebygd i parafin, og prøvene ble kuttet i 5 μm tykkelsesseksjoner ved hjelp av en mikrotom. (C) Trykkmotstandskraft målt i μN AV ASC-sfæroider på dag 7. Dataene ble samlet inn fra fem sfæroider og uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavvik, i henhold til tidligere beskrevet metodikk5. Stjernene indikerer verdien av P oppnådd ved toveis ANOVA, ikke-parametrisk og uparret, etterfulgt av flere sammenligninger. Skala barer = 50 μm. Forkortelse: ASC = fettvevstamme/stromale celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer storskala generering av ASC-sfæroider ved hjelp av et automatisert pipettesystem. Det kritiske trinnet i protokollen er å nøyaktig sette opp programvaren for å sikre riktig volum cellesuspensjon, hastighet og avstand for pipettering. Parametrene beskrevet i protokollen ble bestemt etter en rekke forsøk for å optimalisere dispenseringen av ASC-cellesuspensjonen i brønnene på 12-brønnsplater som inneholder mikromolderte, ikke-klebende hydrogeler. Optimaliseringen ble evaluert ved å måle diameteren og sfærisiteten til sfæroidene. Området og høyden på de mikromolderte ikke-klebrige hydrogelene ble brukt til å beregne den ideelle hastigheten for å dispensere cellesuspensjonen. Hvis cellesuspensjonen blir sådd av utstyret med en annen dispenseringshastighet, vil dette direkte påvirke dannelsen av sfæroidene. Derfor er dette avgjørende parametere som skal optimaliseres etter forsøk med utstyret. Denne protokollen har noen begrensninger. Bare såing av ASC-ene i den ikke-adherente hydrogelen i mikromolden kan automatiseres, etterfulgt av tilsetning av cellekulturmedium. Funksjonene i systemet er begrenset av versjonen av utstyret og programvaren. Den største fordelen med denne reproduserbare tilnærmingen er imidlertid å produsere opptil 3,072 ASC-sfæroider - homogene i størrelse og form og levedyktige - med mindre risiko for menneskelige feil eller forurensning. Det store antallet biofabrikkerte ASC-sfæroider kan lastes direkte inn i en 3D-bioprinter for å produsere mer komplekse vevsmodeller.
Generelt er det allment kjent at nøyaktig og automatisert pipettering spiller en sentral rolle i automatiseringen av cellekulturen. Automatiserte cellekultursystemer muliggjør storskala produksjon og øker teknisk nøyaktighet, reproduserbarhet og prosesseffektivitet15. Derfor kan automatiserte systemer legge til rette for storskala produksjon, noe som er vanlig og gunstig for industrielle miljøer16,17. Det er imidlertid få studier som beskriver utviklingen av protokoller for å automatisere 3D-cellekultursystemer 7,18,19,20,21.
Mehesz og samarbeidspartnere7 og Meseguer-Ripolles og kolleger21 brukte en lignende protokoll for å biofabrikere ASC-sfæroider. I studien til Mehesz et al.7 brukte forfatterne det samme automatiserte pipetteringssystemet. Imidlertid produserte deres protokoll bare 96 sfæroider, mens protokollen utviklet i det nåværende arbeidet var i stand til å produsere opptil 3,072 ASC-sfæroider samtidig, homogene i størrelse og form. Meseguer-Ripolles et al.21 brukte også et automatisert pipetteringssystem for å produsere opptil 73 leversfæroider. En annen tilnærming som diskuteres for å fremstille sfæroider i stor skala i dag, er via mikrofluidikkenheter. Imidlertid har artiklene som er publisert så langt utforsket teknologien for å utvikle bedre enheter som kan produsere sfæroider i stedet for å øke skalaen for sfæroid fabrikasjon 7,20.
En annen metode som kan brukes til å fremstille et høyt antall sfæroider er ved å bruke spinnerflasker. Et hovedproblem angående denne teknikken er imidlertid vanskeligheten med å kontrollere størrelsen og formen på sfæroidene22,23. I tillegg ble 3D bioprinting også allerede brukt på biofabrikkerte sfæroider i stor skala. I studien av Daly og Kelly19 brukte forfatterne en blekkskriverteknikk for å produsere et stort antall sfæroider i polykaprolaktonmikrokammerkammer. Sfæroidene var levedyktige og homogene i størrelse og form.
Hovedanvendelsen av protokollen beskrevet i dette arbeidet er å biofabrikere ASC-sfæroider i stor skala som trengs for 3D-bioprinting. Som diskutert av Mironov og samarbeidspartnere24, vil tusenvis av sfæroider være nødvendige for å biofabrikere komplekse vev og organmodeller. Den automatiserte metoden beskrevet i denne protokollen vil tillate fabrikasjon av et stort antall ASC-sfæroider som kan lastes direkte i 3D-bioprinteren. Det er også mulig å differensiere disse sfæroidene til en ønsket mesodermal vei for å konstruere muskel- og skjelettvev. De Moor og samarbeidspartnere25 utviklet en høy gjennomstrømningsmetode for å fremstille et stort antall vaskulariserte sfæroider for fremtidige 3D bioprinting applikasjoner.
Utstyret kan modifiseres for å forbedre protokollen. Nyere versjoner av utstyret tillater bruk av et større antall plater, noe som kan øke antall PRODUSERTE ASC-sfæroider. Den samme siste versjonen tillater nøyaktig stabling av platene, og dette vil også gi en bedre effektivitet av protokollen. Avslutningsvis viste vi vellykket en protokoll som tillater biofabrikasjon opp til 3,072 ASC-sfæroider homogene i størrelse og form på 15 minutter, og at dette regnes som det første trinnet for å bygge en biofabrikasjonslinje for Tissue Engineering-applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasil) for bruken av deres fasiliteter. Denne studien ble delvis støttet av Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (Faperj) (finanskode: E26/202.682/2018 og E-26/010.001771/2019, Nasjonalt råd for vitenskapelig og teknologisk utvikling (CNPq) (finanskode: 307460/2019-3), og Office of Naval Research (ONR) (finanskode: N62909-21-1-2091). Dette arbeidet ble delvis støttet av National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
