Summary
Здесь мы описываем крупномасштабное производство сфероидов стромальных/стволовых клеток (ASC) жирового происхождения с использованием автоматизированной системы пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. Эти сфероиды ASC могут быть использованы в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.
Abstract
Стромальные/стволовые клетки , полученные из жировой ткани (ИСС), представляют собой субпопуляцию клеток, обнаруженных в стромальной сосудистой фракции подкожной жировой клетчатки человека, признанной классическим источником мезенхимальных стромальных / стволовых клеток. Многие исследования были опубликованы с ASC для подходов тканевой инженерии на основе каркасов, которые в основном изучали поведение этих клеток после их посева на биоактивные каркасы. Тем не менее, появляются подходы без каркаса для инженерии тканей in vitro и in vivo, в основном с использованием сфероидов, чтобы преодолеть ограничения подходов на основе каркасов.
Сфероиды представляют собой 3D-микроткани, образованные процессом самосборки. Они могут лучше имитировать архитектуру и микроокружение нативных тканей, в основном из-за увеличения межклеточных и межклеточных матриксных взаимодействий. В последнее время сфероиды в основном исследуются в качестве моделей заболеваний, исследований скрининга лекарств и строительных блоков для 3D-биопечати. Однако для подходов к 3D-биопечати для биофабрикатирования сложных моделей тканей и органов необходимы многочисленные сфероиды, однородные по размеру и форме. Кроме того, когда сфероиды производятся автоматически, существует мало шансов на микробиологическое загрязнение, повышающее воспроизводимость метода.
Крупномасштабное производство сфероидов считается первым обязательным этапом для разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием тканевой конструкции в биореакторах. Тем не менее, количество исследований, в которых изучалось крупномасштабное производство сфероидов ASC, по-прежнему ограничено, вместе с количеством исследований, в которых использовались сфероиды ASC в качестве строительных блоков для 3D-биопечати. Таким образом, эта статья направлена на то, чтобы показать крупномасштабное производство сфероидов ASC с использованием неадгезивного микроформованного гидрогеля, распространяющего СФЕРОИДЫ ASC в качестве строительных блоков для подходов к 3D-биопечати.
Introduction
Сфероиды считаются бесконтактным подходом в тканевой инженерии. ИСС способны образовывать сфероиды в процессе самосборки. 3D-микроархитектура сфероида увеличивает регенеративный потенциал ИСС, включая дифференциацию в несколько линий 1,2,3. Эта исследовательская группа работает со сфероидами ASC для инженерии хряща и костной ткани 4,5,6. Что еще более важно, сфероиды считаются строительными блоками в биофабрикации тканей и органов, в основном из-за их способности к слиянию.
Использование сфероидов для формирования тканей зависит от трех основных моментов: (1) разработка стандартизированных и масштабируемых роботизированных методов их биофабрикации7, (2) систематическое фенотипирование тканевых сфероидов8, (3) разработка методов сборки 3D-тканей9. Эти сфероиды могут быть сформированы с различными типами клеток и получены с помощью различных методов, включая висячую каплю, реагрегацию, микрофлюидику и микромолоды 8,9,10. Каждый из этих методов имеет преимущества и недостатки, связанные с однородностью размеров и формы сфероидов, восстановлением сфероидов после образования, количеством производимых сфероидов, автоматизацией процессов, трудоемкостью и затратами11.
В методе микроформования клетки дозируются и осаждаются в нижней части микромоли из-за силы тяжести. Неадгезивный гидрогель не позволяет клеткам прилипать к дну, а межклеточные взаимодействия приводят к образованию одного сфероида за спад 8,12. Этот метод биофабрикации генерирует сфероиды однородного и контролируемого размера, может быть роботизирован для крупномасштабного производства эффективным по времени способом с минимальными усилиями и имеет хорошие затратоэффективно-критические факторы при проектировании биофабрикации тканевого сфероида 7,8. Этот метод может быть применен для формирования сфероидов любой клеточной линии для получения нового типа ткани с предсказуемыми, оптимальными и контролируемыми характеристиками8.
Биофабрикация определяется как «автоматизированная генерация биологически функциональных продуктов со структурной организацией...»13. Поэтому автоматизированное производство сфероидов считается первым обязательным этапом разработки линии биофабрикации, которая продолжается в процессе 3D-биопечати и заканчивается полным созреванием биопечатной ткани путем слияния сфероидов. В этом исследовании, чтобы улучшить масштабируемость биофабрикации сфероидов ASC, мы используем автоматизированную систему пипетирования для посева клеточной суспензии, обеспечивая тем самым однородность размера и формы сфероида. В данной работе показано, что удалось получить большое количество (тысячи) сфероидов, необходимых для 3D-биопечати подходов к биофабрикату более сложных тканевых моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ИСС, используемые в этом исследовании, были ранее выделены от здоровых человеческих доноров и криоконсервированы, как описано14 в соответствии с Комитетом по этике исследований Университетской больницы Клементино Фрага Филью, Федеральный университет Рио-де-Жанейро, Бразилия (25818719.4.0000.5257). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах и оборудовании, используемых в этом исследовании.
1. Трипсинизация монослоя ASC при прохождении три
- Откройте тканевую культуру 175см2 колбы, содержащей монослой ИСС при 80% слиянии и выбросьте супернатант.
- Добавьте 7 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, 0,01 М) и дважды промыть монослой. Далее выбросьте жидкость.
- Добавьте 5 мл 0,125% трипсина с 0,78 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Далее инкубируют в течение 5 мин при 37 °C.
- Добавьте 10 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco с низким содержанием глюкозы (DMEM LOW) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в колбу тканевой культуры 175см2 и хорошо смешайте клеточную суспензию с 10 мл сорбологической пипеткой.
- Соберите клеточную суспензию с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и переложите ее в центрифужную трубку объемом 50 мл. Далее центрифугу на 400 × г в течение 5 мин для получения гранулы ИСС. Повторное суспендирование клеточной гранулы с использованием DMEM LOW , содержащей 10% FBS.
- Выполните подсчет ячеек путем исключения trypan.
- После подсчета возьмите в общей сложности 1 × 106 ASC в отдельной центрифужной трубке объемом 15 мл, чтобы засеять 81 рецессию, микроформованную неадгезионным гидрогелем (в общей сложности 10 000 клеток / мл, посеянных здесь). Чтобы засеять 256 рецессий микроформованного неадгезивного гидрогеля, возьмите в общей сложности 5 × 105 ИСС в центрифужную трубку (в общей сложности 2 500 клеток / мл, посеянных здесь).
2. Изготовление микроформованного неадгезивного гидрогеля агарозы
- Готовят 50 мл стерильного раствора 2% сверхчистой агарозы в 0,9% NaCl в сверхчистой воде. Автоклав раствора в течение 30 мин при 121 °C.
- Добавьте 500 мкл стерильного 2% сверхчистого раствора агарозы в центр силиконовой формы, содержащей 81 или 256 круглых углублений.
- Через 40 мин отформуйте сверхчистую агарозу из силиконовой формы и поместите ее в колодец из 12-луночной пластиковой пластины.
- Добавьте 2 мл DMEM LOW в лунку с микроформованной агарозой и инкубируйте в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение не менее 12 ч перед посевом ИСС.
3. Биофабрикация сфероидов ASC с помощью автоматизированной системы дозирования
- Проверьте следующее:
- Проверьте, включен ли ламинарный поток, и воздушный поток шкафа работает правильно.
- Проверьте, подключено ли оборудование к правильному напряжению.
- Проверьте, подключен ли планшет к оборудованию.
- Проверьте, совпадает ли высота защитного стекла шкафа с маркировкой датчика оборудования.
- Нажмите кнопку On/Off на левой стороне оборудования и дождитесь запуска планшета и оборудования.
- Расположите наконечники коробок, стойку для трубок центрифуги и пластину, содержащую микроформованный гидрогель агарозы, в рабочем пространстве оборудования.
- На планшете с открытым программным обеспечением сначала нажмите на Labware Editor.
- Настройте виртуальный рабочий стол и выберите положения пипеток, наконечников, стойки для пластиковых трубок и пластин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Виртуальный рабочий стол должен представлять физические положения аксессуаров в оборудовании. - Нажмите кнопку Переключиться на создание , чтобы включить параметры (см. шаг 3.10) и команды, которые оборудование будет выполнять на протяжении всего эксперимента. Дождитесь открытия панели инструментов и списка Produce в программном обеспечении.
- Изначально, чтобы указать команды, укажите количество образцов, подлежащих пипетированию, и перетащите их в список Produce.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество образцов представляет собой количество пластиковых центрифужных трубок, содержащих суспензию ASC, которая должна быть засеяна в центр микромолодов. - После ввода количества образцов нажмите на кнопку «Передача образца» на программном обеспечении, чтобы перенести суспензию ASC в скважины 12-луночной пластины, содержащей микромолди, и перетащите ее в Список продуктов.
- Нажмите « Свойства», чтобы настроить начальную и конечную позиции для оборудования для передачи образца.
- Подождите, пока программное обеспечение вернется на страницу Рабочая таблица. Нажмите на кнопку «Параметры», чтобы настроить параметры автоматического заполнения ИСС: i) Скорость аспирации 15,4 с-1; ii) Скорость дозирования 1 с-1; iii) Задержка удара 0 мс; iv) Скорость выдува 15,4 с-1; v) Начальный ход 100%.. Выберите Вода в качестве стандартного типа жидкости.
- Настройка параметров для смешивания ИСС для получения однородной суспензии: i) Количество циклов 5; ii) Скорость 6,5 с-1; iii) Объем 300 мкл.
- После настройки параметров добавьте время 40 мин в список производить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это время необходимо, чтобы подождать, пока суспензия ASC затвердеет в нижней части микроформовки. - В Список продуктов включите опцию Переноса реагента для переноса сфероидной питательной среды в соответствующие колодцы пластины.
- Повторите шаги 3.9-3.11, чтобы настроить положение и конфигурацию параметров для передачи сфероидной питательной среды.
- Нажмите на кнопку с символом проверки на верхней панели программного обеспечения, чтобы убедиться, что нет ошибки программирования.
- Нажмите кнопку Play (с символом треугольника) на верхней панели программного обеспечения, чтобы запустить программу.
- Дайте оборудованию запуститься, как запрограммировано, и подождите, пока оно издаст звук, указывающий на то, что оно закончилось.
- Соберите 12-луночную пластину и инкубируйте ее в инкубаторе при 37 °C, 5% CO2 в течение не менее 18 ч, чтобы сфероиды были полностью сформированы и компактны.
- Вручную собирают сфероиды после 1, 3 и 7 дней посева для анализа. Вручную промывайте среду микропипеткой, чтобы освободить сфероиды от микроформованного неадгезивного агарозного гидрогеля.
- Через 5 мин проверьте под микроскопом, чтобы определить, полностью ли сфероиды высвобождаются из микроформованного неадгезивного агарозного гидрогеля.
- Соберите сфероиды вручную с помощью микропипетки и перенесите их в центрифужную трубку объемом 15 мл.
- Промыть сфероиды не менее двух раз с 0,01 М PBS. Оцените жизнеспособность и выполните биомеханические анализы на свежих образцах сфероидов. Для морфологического анализа (гистологии) инкубируют образцы сфероидов в 4% параформальдегиде в PBS в течение не менее 18 ч при 2-8 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Автоматическая система пипеток может засеять суспензию ячейки ASC в 12 лунок одной 12-луночной пластины за 15 минут. Использование 81 микроформованного неадгезивного гидрогеля позволит получить 972 сфероида в конце протокола. Использование 256 микроформованных неадгезивных гидрогелей даст 3072 сфероида в конце протокола. Сфероиды ASC были проанализированы на однородность их размера и формы. Сфероиды ASC из микроформований с 81 рецессией показали однородный диаметр в течение периода культивирования в отличие от сфероидов ASC из микролинь с 256 рецессиями (рисунок 1C,D). Соотношение наименьшего и наибольшего диаметров (сферичность) было близко к 1 в сфероидах ASC из микроформ 81 и 256 рецессий (рисунок 1E,F). Результаты анализа жизнеспособности, морфологии и силы (рисунок 2) свидетельствуют об успешном крупномасштабном производстве сфероидов ASC.
Рисунок 1: Сфероиды ASC показали воспроизводимость высокого диаметра. Репрезентативные оптические микроснимки сфероидов ASC из микроформованных неадгезивных гидрогелей с (A) 81 круговой рецессией и (B) 256 круговыми рецессиями. (С,Г) Диаметр сфероида в 1, 3 и 7 дней из пяти микроформованных неадгезивных гидрогелей с 81 и 256 круговыми рецессиями соответственно. (Э,Ф) Соотношение наименьшего и наибольшего диаметров из микроформованных неадгезивных гидрогелей с 81 и 256 круговыми спадами соответственно. Чтобы измерить наименьшие и самые большие диаметры сфероидов, изображения получали еженедельно с помощью оптического микроскопа, оснащенного цифровой камерой. Ширина и длина измерялись с помощью программного обеспечения ImageJ. Отношение диаметров каждого сфероида было получено путем деления ширины на длину (сферичность сфероида). В общей сложности 85 сфероидов были измерены из микроформованных, неадгезивных гидрогелей с 81 круговой рецессией, и в общей сложности 160 сфероидов были измерены из микроформованных, неадгезивных гидрогелей с 256 круговыми рецессиями. Данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения. Звездочками обозначены значения P , полученные непараметрическим и непараметрическим ANOVA с последующим множественным сравнением (**P < 0,001; ****P < 0,0001). Шкала стержней = 100 мкм. Аббревиатура: ASC = стволовые/стромальные клетки жировой ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сфероиды ASC показали высокую жизнеспособность клеток. (A) Флуоресцентные микроснимки анализа жизнеспособности сфероидов ASC на 7-й день из микроформованных, неадгезивных гидрогелей с 256 круговыми рецессиями. Живые и мертвые клетки наблюдаются в зеленом и красном цветах соответственно. Контроль над смертью показан во вставке. (B) Участок сфероида ASC, окрашенного гематоксилином и эозином из микроформованных, неадгезивных гидрогелей с 81 круговой рецессией. Образцы фиксированных сфероидов были встроены в парафин, а образцы были разрезаны на участки толщиной 5 мкм с использованием микротома. (C) Сила сопротивления сжатию, измеренная в мкН сфероидов ASC на 7-й день. Данные были собраны из пяти сфероидов и выражены как среднее ± стандартное отклонение в соответствии с ранее описанной методологией5. Звездочки обозначают значение P , полученное с помощью двусторонней ANOVA, непараметрической и непарной, с последующим множественным сравнением. Шкала стержней = 50 мкм. Аббревиатура: ASC = стволовые/стромальные клетки жировой ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В данной работе представлена крупномасштабная генерация сфероидов ASC с использованием автоматизированной системы пипеток. Критическим этапом протокола является точная настройка программного обеспечения для обеспечения правильного объема суспензии ячейки, скорости и расстояния для пипетки. Параметры, описанные в протоколе, были определены после ряда испытаний по оптимизации дозирования суспензии ячейки ASC в скважины 12-луночных пластин, содержащих микроформованные, неадгезивные гидрогели. Оптимизация оценивалась путем измерения диаметра и сферичности сфероидов. Площадь и высота микроформованных неадгезивных гидрогелей использовали для расчета идеальной скорости дозирования клеточной суспензии. Если клеточная суспензия засеяна оборудованием с другой скоростью дозирования, это напрямую повлияет на образование сфероидов. Следовательно, это важнейшие параметры, которые необходимо оптимизировать после испытаний с оборудованием. Этот протокол имеет некоторые ограничения. Только посев ИСС в неадгезивный гидрогель в микромолоде может быть автоматизирован с последующим добавлением клеточной культуральной среды. Возможности системы ограничены версией оборудования и программным обеспечением. Однако основным преимуществом этого воспроизводимого подхода является производство до 3072 сфероидов ASC- однородных по размеру и форме и жизнеспособных - с незначительными рисками человеческих ошибок или загрязнения. Большое количество биофабрикированных сфероидов ASC может быть напрямую загружено в 3D-биопринтер для получения более сложных моделей тканей.
В целом, широко известно, что точное и автоматизированное пипетирование играет центральную роль в автоматизации клеточной культуры. Автоматизированные системы клеточных культур обеспечивают крупномасштабное производство и повышают техническую точность, воспроизводимость и эффективность процесса15. Таким образом, автоматизированные системы могут способствовать крупномасштабному производству, что является общим и выгодным для промышленных сред16,17. Тем не менее, существует несколько исследований, описывающих разработку протоколов для автоматизации систем 3D-культур клеток 7,18,19,20,21.
Мехес и его коллеги7 и Месегер-Рипольес и его коллеги21 использовали аналогичный протокол для биофабрикатных сфероидов ASC. В исследовании Mehesz et al.7 авторы использовали ту же автоматизированную систему пипетирования. Однако их протокол произвел только 96 сфероидов, тогда как протокол, разработанный в настоящей работе, смог получить до 3072 сфероидов ASC одновременно, однородных по размеру и форме. Meseguer-Ripolles et al.21 также использовали автоматизированную систему пипетирования для получения до 73 сфероидов печени. Другой подход, обсуждаемый для изготовления сфероидов в больших масштабах в настоящее время, - это устройства микрофлюидики. Тем не менее, в статьях, опубликованных до сих пор, исследовалась технология разработки лучших устройств, которые могут производить сфероиды, а не увеличивать масштаб для изготовления сфероидов 7,20.
Другой метод, который может быть использован для изготовления большого количества сфероидов, - это использование колб спиннера. Однако одной из основных проблем, касающихся этой техники, является сложность контроля размера и формы сфероидов22,23. Кроме того, 3D-биопечать также уже применялась к биофабрикатным сфероидам в больших масштабах. В исследовании Дейли и Келли19 авторы использовали струйную технику для получения большого количества сфероидов в микрокамерах поликапролактона. Сфероиды были жизнеспособными и однородными по размеру и форме.
Основным применением протокола, описанного в этой работе, является биофабрикат ASC сфероидов в больших масштабах, необходимых для 3D-биопечати. Как обсуждал Миронов и его коллеги24, тысячи сфероидов будут необходимы для биофабрикатизации сложных тканей и моделей органов. Автоматизированный метод, описанный в этом протоколе, позволит изготовить большое количество сфероидов ASC, которые могут быть загружены непосредственно в 3D-биопринтер. Также можно дифференцировать эти сфероиды по желаемому мезодермальному пути для инженерии тканей опорно-двигательного аппарата. De Moor и сотрудники25 разработали высокопроизводительный метод изготовления большого количества васкуляризированных сфероидов для будущих приложений 3D-биопечати.
Оборудование может быть модифицировано для улучшения протокола. Более поздние версии оборудования позволяют использовать большее количество пластин, что может увеличить количество производимых сфероидов ASC. Эта же последняя версия позволяет точно укладывать пластины, и это также обеспечит лучшую эффективность протокола. В заключение мы успешно показали протокол, позволяющий биофабрикацию до 3072 сфероидов ASC однородных по размеру и форме за 15 минут, и что это считается первым шагом к созданию линии биофабрикации для применения в тканевой инженерии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Национальный институт метрологии, качества и технологии (INMETRO, RJ, Бразилия) за использование их объектов. Это исследование было частично поддержано Фондом Карлоса Шагаса Филью по поддержке исследований штата Рио-де-Жанейро (Faperj) (финансовый кодекс: E26/202.682/2018 и E-26/010.001771/2019), Национальным советом по научно-техническому развитию (CNPq) (финансовый код: 307460/2019-3) и Управлением военно-морских исследований (ONR) (финансовый код: N62909-21-1-2091). Эта работа была частично поддержана Национальным центром науки и технологий по регенеративной медицине INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids - 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
