Storskalig, automatiserad produktion av fett-härledda stamcellsfäroider för 3D-bioprintning
Summary
Här beskriver vi storskalig produktion av fett-härledda stroma / stamcell (ASC) sfäroider med hjälp av ett automatiserat pipetteringssystem för att så cellsuspensionen, vilket säkerställer homogenitet av sfäroid storlek och form. Dessa ASC-sfäroider kan användas som byggstenar för 3D-bioprintningsmetoder.
Abstract
Fett-härledda stroma/ stamceller (ASC) är en subpopulation av celler som finns i den stromala vaskulära fraktionen av human subkutan fettvävnad som erkänns som en klassisk källa till mesenkymal stromal / stamceller. Många studier har publicerats med ASC för ställningsbaserade vävnadstekniska metoder, som främst utforskade beteendet hos dessa celler efter deras sådd på bioaktiva byggnadsställningar. Ställningsfria metoder växer dock fram för att konstruera vävnader in vitro och in vivo, främst genom att använda sfäroider, för att övervinna begränsningarna i ställningsbaserade tillvägagångssätt.
Sfäroider är 3D-mikrotissuer som bildas av självmonteringsprocessen. De kan bättre efterlikna arkitekturen och mikromiljön hos inhemska vävnader, främst på grund av förstoring av cell-till-cell och cell-till-extracellulära matrisinteraktioner. Nyligen utforskas sfäroider främst som sjukdomsmodeller, läkemedelsscreeningsstudier och byggstenar för 3D-bioprintning. För 3D-bioprintningsmetoder är emellertid många sfäroider, homogena i storlek och form, nödvändiga för att biofabricera komplexa vävnads- och organmodeller. Dessutom, när sfäroider produceras automatiskt, finns det liten chans för mikrobiologisk förorening, vilket ökar metodens reproducerbarhet.
Den storskaliga produktionen av sfäroider anses vara det första obligatoriska steget för att utveckla en biofabriceringslinje, som fortsätter i 3D-bioprintningsprocessen och avslutas i full mognad av vävnadskonstruktionen i bioreaktorer. Antalet studier som undersökte den storskaliga ASC-sfäroidproduktionen är dock fortfarande knapphändigt, tillsammans med antalet studier som använde ASC-sfäroider som byggstenar för 3D-bioprintning. Därför syftar denna artikel till att visa storskalig produktion av ASC-sfäroider med hjälp av en icke-adhesiv mikroformad hydrogelteknik som sprider ASC-sfäroider som byggstenar för 3D-bioprintningsmetoder.
Introduction
Sfäroider anses vara ett ställningsfritt tillvägagångssätt inom vävnadsteknik. ASC kan bilda sfäroider genom självmonteringsprocessen. Sfäroidens 3D-mikroarkitektur ökar den regenerativa potentialen hos ASC, inklusive differentieringskapaciteten i flera linjer 1,2,3. Denna forskargrupp har arbetat med ASC-sfäroider för brosk- och benvävnadsteknik 4,5,6. Ännu viktigare är att sfäroider betraktas som byggstenar i biofabrikationen av vävnader och organ, främst på grund av deras fusionskapacitet.
Användningen av sfäroider för vävnadsbildning beror på tre huvudpunkter: (1) utvecklingen av standardiserade och skalbara robotmetoder för deras biofabricering7, (2) systematisk fenotypning av vävnadssfäroider8, (3) utveckling av metoder för montering av 3D-vävnader9. Dessa sfäroider kan bildas med olika celltyper och erhållas genom olika metoder, inklusive hängande droppe, reaggregering, mikrofluidik och mikromold 8,9,10. Var och en av dessa metoder har fördelar och nackdelar relaterade till sfäroidernas homogenitet och form, återvinning av sfäroiderna efter bildning, antalet producerade sfäroider, processautomatisering, arbetsintensitet och kostnader11.
I mikromoldmetoden dispenseras cellerna och deponeras i botten av mikromolden på grund av tyngdkraften. Den icke-adhesiva hydrogelen tillåter inte cellerna att fästa vid botten, och cell-till-cell-interaktioner leder till bildandet av en enda sfäroid per recession 8,12. Denna biofabriceringsmetod genererar sfäroider av homogen och kontrollerad storlek, kan robotiseras för storskalig produktion på ett tidseffektivt sätt med minimal ansträngning och har goda kostnadseffektivitetskritiska faktorer vid utformningen av en biofabricering av vävnadssfäroid 7,8. Denna metod kan tillämpas för att bilda sfäroider av vilken cellinje som helst för att förbereda en ny vävnadstyp med förutsägbara, optimala och kontrollerbara egenskaper8.
Biofabricering definieras som “automatiserad generering av biologiskt funktionella produkter med strukturell organisation …”13. Därför anses den automatiserade produktionen av sfäroider vara det första obligatoriska steget för att utveckla en biofabriceringslinje, som fortsätter i 3D-bioprintningsprocessen och avslutas i full mognad av den bioprintade vävnaden genom sfäroidfusion. I denna studie, för att förbättra skalbarheten för ASC-sfäroidbiofabricering, använder vi ett automatiserat pipetteringssystem för att så cellsuspensionen, vilket säkerställer homogeniteten av sfäroidstorlek och form. Detta dokument visar att det var möjligt att producera ett stort antal (tusentals) sfäroider som behövs för 3D-bioprintningsmetoder för att biofabricera mer komplexa vävnadsmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument presenterar den storskaliga genereringen av ASC-sfäroider med hjälp av ett automatiserat pipettsystem. Det kritiska steget i protokollet är att exakt ställa in programvaran för att säkerställa rätt volym cellupphängning, hastighet och avstånd för pipettering. Parametrarna som beskrivs i protokollet bestämdes efter ett antal försök för att optimera doseringen av ASC-cellsuspensionen i brunnarna på 12-brunnsplattor innehållande de mikroformade, icke-vidhäftande hydrogelerna. Optimeringen ut…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO, RJ, Brasilien) för användningen av deras anläggningar. Denna studie stöddes delvis av Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support i delstaten Rio de Janeiro (Faperj) (finanskod: E26/202.682/2018 och E-26/010.001771/2019, National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (finanskod: 307460/2019-3) och Office of Naval Research (ONR) (finanskod: N62909-21-1-2091). Detta arbete stöddes delvis av National Center of Science and Technology on Regenerative Medicine-INCT Regenera (http://www.inctregenera.org.br/).
Materials
| 12-well plastic plate | Corning | 3512 | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | CLS430828 | |
| EpMotion 5070 | Eppendorf | 5070000282 | |
| epT.I.P.S. Motion | Eppendorf | 30015231 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15576028 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10082147 | |
| Low Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM LOW) | Gibco | 31600034 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 16 x 16 array | Sigma | Z764000 | |
| MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids – 9 x 9 array | Sigma | Z764019 | |
| phosphate saline buffer (PBS) | Sigma | 806552 | |
| sodium chloride (NaCl) | Sigma | S8776 | |
| tissue culture flask | Corning | 430720U | |
| trypan | Lonza | 17-942E | |
| trypsin | Gibco | 27250018 | |
| ultrapure agarose | Invitrogen | 16500100 |
References
- Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
- Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
- Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
- Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
- Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104 (2018).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027 (2017).
- Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007 (2017).
- Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
- Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
- Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755 (2015).
- Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
- Doulgkeroglou, M. -. K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
- Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101 (2016).
- Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
- Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366 (2020).
- Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502 (2021).
- Lee, G. -. H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548 (2018).
- Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C – Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
- De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009 (2018).
