Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteractie

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Dit protocol beschrijft een microscopische methode om pectine te detecteren in koffie-schimmel interactie.

Abstract

Plantencellen gebruiken verschillende structurele mechanismen, constitutief of inducerend, om zichzelf te verdedigen tegen schimmelinfecties. Inkapseling is een efficiënt induceerbaar mechanisme om de schimmel haustoria te isoleren van de protoplast van de plantencel. Omgekeerd is pectine, een van de polymere componenten van de celwand, een doelwit van verschillende pectolytische enzymen in necrotrofe interacties. Hier wordt een protocol gepresenteerd om pectine en schimmeldraden te detecteren door middel van optische microscopie. De pectinerijke inkapseling in de cellen van koffiebladeren die zijn geïnfecteerd door de roestschimmel Hemileia vastatrix en de mesofylcelwandmodificatie geïnduceerd door Cercospora coffeicola worden onderzocht. Laesiebladmonsters werden gefixeerd met de Karnovsky-oplossing, gedehydrateerd en ingebed in glycolmethacrylaat gedurende 2-4 dagen. Alle stappen werden gevolgd door vacuümpompen om lucht in de intercellulaire ruimtes te verwijderen en het inbeddingsproces te verbeteren. De ingebedde blokken werden verdeeld in 5-7 μm dikke secties, die werden afgezet op een glazen glijbaan bedekt met water en vervolgens verwarmd bij 40 °C gedurende 30 minuten. Vervolgens werden de dia's dubbel gekleurd met 5% katoenblauw in lactofenol om de schimmel te detecteren en 0,05% rutheniumrood in water om pectine (zure groepen polyuronzuren van pectine) te detecteren. Schimmel haustoria van Hemileia vastatrix bleken te zijn ingekapseld door pectine. Bij koffie cercosporiose vertoonden mesofylcellen oplossing van celwanden en werden intercellulaire schimmeldraden en conidioforen waargenomen. De hier gepresenteerde methode is effectief om een pectine-geassocieerde respons in de interactie tussen plant en schimmel te detecteren.

Introduction

Celwandafweermechanismen in planten zijn cruciaal om schimmelinfecties te beperken. Studies hebben veranderingen in celwanddikte en samenstelling gemeld sinds de19e eeuw 1,2. Deze veranderingen kunnen worden geïnduceerd door een schimmelpathogeen dat de vorming van een papilla stimuleert, waardoor schimmels de cel niet binnendringen of kunnen worden gebruikt om de schimmeldraden in te kapselen om de protoplast van de gastheercel te isoleren van de schimmelhaustoria. De productie van een dynamische celwandbarrière (d.w.z. papillen en een volledig ingekapseld haustorium) is belangrijk om de resistentie van planten te bevorderen3. Histopathologische studies op schimmelgerelateerde ziekten hebben het optreden van deze mechanismen onderzocht en hebben de celwandpolymeren, cellulose, hemicellulose (arabinoxylanen) en callose beschreven als resistentiemechanismen tegen schimmelaantasting 4,5,6,7.

De celwand is de eerste barrière tegen micro-organismen, waardoor de interactie tussen plant en schimmel wordt aangetast. Pectische polysacchariden vormen de celwand en zijn goed voor ongeveer 30% van de celwandsamenstelling in primaire cellen van eudicotplanten waarin homogalacturonanen het meest voorkomende polymeer zijn (ongeveer 60%)8. De Golgi scheidt complexe pectineverbindingen af waaruit de galacturonzuurketens bestaan, die al dan niet gemethyleerd kunnen worden 8,9. Sinds 2012 heeft de literatuur erop gewezen dat de mate van pectinemethylverestering van cruciaal belang is voor het bepalen van de compatibiliteit tijdens infectie door microbiële pectische enzymen 10,11,12. Er zijn dus protocollen nodig om de aanwezigheid en distributie van pectische verbindingen in plantschimmelpathosystemen te verifiëren.

Verschillende technieken zijn gebruikt om de inkapseling van papillen of haustoria te detecteren. De gebruikte referentiemethoden zijn transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) van vast weefsel en lichtmicroscopie van levende en vaste weefsels. Met betrekking tot TEM hebben verschillende studies de structurele rol van celwandacposities in schimmelresistentieaangetoond 13,14,15,16, en dat het gebruik van lectines en antilichamen een ingewikkelde methode is om koolhydraatpolymeren te lokaliseren16. Studies tonen echter aan dat lichtmicroscopie een belangrijke benadering is en dat de histochemische en immunohistochemische hulpmiddelen een beter begrip van de samenstelling van papillen en haustorium-omhullingmogelijk maken 6,7.

Pathogene schimmels vertonen twee hoofdtypen levensstijlen: biotrofisch en necrotroof. Biotrofe schimmels zijn afhankelijk van levende cellen voor hun voeding, terwijl necrotrofe schimmels de gastheercellen doden en vervolgens in de dode weefsels leven17. In Latijns-Amerika is koffiebladroest, veroorzaakt door de schimmel Hemileia vastatrix, een belangrijke ziekte in koffiegewassen18,19. Hemileia vastatrix vertoont een biotroof gedrag en, onder de structurele veranderingen waargenomen bij resistente koffiesoorten of cultivars, een overgevoeligheidsrespons, afzetting van callose, cellulose en lignine op de celwanden, evenals celhypertrofie14 zijn gemeld. Voor zover de auteurs weten, rapporteert de literatuur geen informatie over het belang van pectine in koffieroestbestendigheid. Aan de andere kant richten necrotrofe schimmels die cercosporiose veroorzaken zich op pectine via een reeks enzymen die geassocieerd zijn met celwandafbraak, zoals pectinasen en polygalacturonase20. Cercosporiose in koffie, veroorzaakt door de schimmel Cercospora coffeicola is ook een grote bedreiging voor koffiegewassen21,22. Deze schimmel veroorzaakt necrotische laesies in zowel bladeren als bessen. Na penetratie koloniseert C. coffeicola plantenweefsels via intracellulaire en intercellulaire routes 23,24,25.

Het huidige protocol onderzoekt de aanwezigheid van schimmelstructuren en pectine op celwanden. Dit protocol is nuttig om de plantrespons geassocieerd met pectine (gekleurd met rutheniumrode kleurstof, die specifiek is voor zure groepen polyuronzuren van pectine), geïnduceerd door de gastheer in een biotrofe interactie met schimmel te identificeren. Het helpt ook om het effect van necrotrofe schimmels op de afbraak van pectische celwanden te verifiëren. De huidige resultaten geven aan dat de dubbele kleuringsmethode effectief is om structuren en de voortplantingsfase van schimmels te onderscheiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van de bufferoplossing en reagentia

  1. Bereid 2 M cacodylaatbuffer door 4,28 g natriumcacodylaat toe te voegen aan 100 ml gedestilleerd water en stel de pH in op 7,25 met 0,2 N HCl.
  2. Bereid 100 ml van de Karnovsky-fixatieoplossing door 10 ml 25% waterig glutaaraldehyde, 10 ml 10% waterig formaldehyde, 25 ml 2 m cacodylaatbuffer en 0,5 ml 0,5 m CaCl2 26 te mengen. Vul het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water.
    OPMERKING: De oplossing kan 6 maanden in een koelkast worden bewaard.
    LET OP: De cacodylaatbufferoplossing is giftig; behandel daarom de fixerende oplossing in een zuurkast of een open ruimte. Vermijd het inademen van de oplossingsdampen en draag handschoenen tijdens het hanteren.
  3. Bereid een waterige Hoagland-voedingsoplossing door het volgende te mengen: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO 4.7H2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 en 36 mM FeSO 4,7H2O als ijzer-EDTA (ethyleendiamine tetra-azijnzuur)27.

2. Plantenmonsters en schimmelinenting

OPMERKING: Voor experimenten op bladeren die zijn aangetast door koffieroest, vijf zaailingen van 2 maanden oude Koffie arabica cv. Catuaí werden geteeld en bewaard in een kas in het Center of Nuclear Energy in Agriculture (CENA) van de Universiteit van São Paulo, Piracicaba, staat São Paulo, Brazilië.

  1. Kweek koffieplanten in plastic potten van 500 ml gevuld met waterige Hoagland-voedingsoplossing (pH van ~ 5,5) gedurende 4 maanden in een groeikamer die op 27 ± 3 ° C wordt gehouden met een fotoperiode van 12 uur gemaakt door LED-lampen bij de fotonenflux van 250 μmol fotonen s-1 m-2. Vervang de Hoagland voedingsoplossing elke week gedurende 4 maanden.
  2. Ent vier geëxpandeerde bladeren van vijf planten op hun abaxiale oppervlakken met 1 x 103 H. vastatrix uredospores volgens de in referentie28 beschreven methode. Houd de planten na inenting 48 uur in het donker door ze af te dekken met een zwarte plastic zak. Oogst de laesies 30 dagen na inenting.
  3. Oogst karakteristieke laesies veroorzaakt door Cercospora coffeicola van Coffea arabica cv. Obatã-fabrieken (coördinaten: -22.906506126269942, -47.015075902025266) in het Biologisch Instituut, Campinas, staat São Paulo, Brazilië. Voordat u het monster verwerkt, analyseert u de laesies in een stereomicroscoop om de aanwezigheid van koffie C. coffeicola conidia te verifiëren. Monteer vervolgens enkele dia's met de conidia om de ziekte-etiologie te bevestigen22.

3. Monsteroogst, fixatie en uitdroging

  1. Oogst met behulp van een scalpel en pincet een monster van ~ 10 mm2 bladeren in het middelste gebied van de laesie (gele vlekken; Figuur 1) en dompel het onder in 30 ml Karnovsky fixatieve oplossing (figuur 1 en figuur 2A). De fixatiestap kan 48 uur in een koelkast plaatsvinden.
  2. Onderwerp het bladmonster gedurende ten minste vier keer aan een laag vacuüm (500-600 mBar) met behulp van een oliepomp gedurende 15 minuten elk om de permeabiliteit van de fixerende oplossing in het bladweefsel te vergroten. Voer deze stap uit met monsterrotatie (figuur 1).
  3. Was het bladmonster na fixatie driemaal in 0,5 M cacodylaatbuffer (pH 7,2) verdund in gedestilleerd water gedurende 5 minuten en breng het vervolgens over in een gesorteerde ethanolische reeks (30%, 50%, 70%, 90% (2x) en 100% (2x)) gedurende 15 minuten bij elke ethanolconcentratie (figuur 1 en figuur 2B).

4. Historesin inbeddingsprocedure

  1. Breng de monsters geleidelijk over naar glycolmethacrylaat (GMA) in drie stappen, volgens de instructies van de fabrikant. Maak eerst oplossing A door het GMA-poeder (1 g) te mengen met 100 ml basishars (historesinekit; Tabel met materialen) onder magnetische agitatie en volg vervolgens de onderstaande stappen.
    1. Dompel de monsters onder in 1:2 Oplossing A: 100% ethanol gedurende 3 uur.
    2. Dompel de monsters onder in 1:1 Oplossing A: 100% ethanol gedurende 3 uur.
    3. Dompel de monsters gedurende 2-4 dagen onder in een pure basishars. Tijdens deze stap onderwerpt u de monsters ten minste vier keer per dag aan een laag vacuüm gedurende 15 minuten gevolgd door rotatie.

5. Polymerisatie

OPMERKING: Het polymerisatieproces vereist 1,2 ml plastic mallen, basishars en verharder (zie Tabel met materialen voor de details van de commerciële kit).

  1. Meng 15 ml oplossing A (stap 4.1) met 1 ml van de verharder in een bekerglas met rotatie gedurende 2 minuten om de polymerisatieoplossing (oplossing B) te produceren.
  2. Plaats 1,2 ml van de polymerisatieoplossing (oplossing B) in plastic mallen. Breng met behulp van een houten prikeel de laesiebladmonsters over van pure basishars naar oplossing B (figuur 2C). Vermijd het gebruik van een pincet, omdat deze weefselverplettering kunnen veroorzaken.
  3. Zorg ervoor dat bladmonsters snel loodrecht op de kunststof mallen worden georiënteerd, omdat oplossing B binnen 5 minuten snel stroperig wordt. Meer dan één laesiebladmonster kan in een enkele mal worden geplaatst.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de bovenstaande stap meerdere keren te oefenen voordat u veel monsters aanvraagt. Wanneer er veel monsters zijn, is de polymerisatietijd anders tussen de mallen en kan de loodrechte oriëntatie van de bladmonsters moeilijk te bereiken zijn.
  4. Wanneer de loodrechte oriëntatie van de bladmonsters is bereikt, wacht u 30 minuten en brengt u de plastic mal over naar een plastic of glazen kamer met silicagel om vocht te voorkomen. Wacht 2-3 uur voor polymerisatie.
  5. Zodra de hars en het bladmonster na de periode van 2-3 uur zijn gepolymeriseerd, maakt u het resulterende blok los van de plastic mal door de blokbasis te schuren met een schuurvijl. Lijm het blok vervolgens op een stuk hout (figuur 2D).

6. Doorsnede

  1. Snijd met behulp van een roterende microtoom uitgerust met stalen messen van 8 cm (figuur 2E) het blok in secties van 5 μm dik. Plaats de secties op glazen platen bedekt met gedestilleerd water. Breng de dia's met de over water zwevende secties over op een hete plaat bij 40 °C om te drogen en de hechting van de secties op de glasplaten te bevorderen.
  2. Label na het drogen (figuur 2F) de glasplaten met de blokreferentienaam en het dianummer.

7. Dubbel kleurproces

  1. Bedek de secties met 2 ml 5% katoenblauw in lactofenol (40% glycerol, 20% fenol en 20% melkzuur in water) en verwarm ze op een hete plaat bij 45 °C gedurende 5 minuten (figuur 3A).
  2. Verwijder de overtollige kleurstof door de dia driemaal te wassen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (figuur 3B-D).
  3. Kleur met 2 ml 0,01% rutheniumrood in water gedurende 1 minuut (figuur 3E).
  4. Verwijder de overtollige kleurstof door de plaat driemaal te wassen in een bekerglas gevuld met gedestilleerd water (figuur 3F,G).
  5. Doe een druppel gedestilleerd water over de secties en bedek de secties met een afdekplaat van 24 mm x 60 mm voor het uitvoeren van lichtmicroscopieanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De katoenblauwe lactofenolkleuring op de GMA-ingebedde sectie onthulde de aanwezigheid van verschillende schimmelstructuren tussen en in koffie mesofylcellen in zowel biotrofe als necrotrofe schimmelinteracties.

In het biotrofe pathosysteem verschijnen, wanneer gekleurd met behulp van de dubbele kleuringsmethode, Hemileia vastatrix-schimmeldraden met celwanden en het dichte protoplastgehalte in donkerblauw in zowel sponsachtig als palissadeparenchym (figuur 4A, B). Ook de haustoriummoedercel (Hmc) en de haustoria vertonen een sterke donkerblauwe kleur (figuur 4C). Bij counterstained met rutheniumrood is de schimmelverdeling in de intercellulaire ruimten duidelijk gedefinieerd (figuur 4D). De aanwezigheid van een donkerblauwe Hmc helpt om de infectiezone te detecteren. Tijdens de interactie brak H. vastatrix Hmc de celwand van de gastheer en ontwikkelde een haustoriale hals die kon worden omgeven door pectische verbindingen (figuur 4E,F). Niettemin is de pectinerijke inkapseling (roze-rode kleur) van de haustoriale nek niet in staat om haustoriale vorming te voorkomen (figuur 4E, F). In sommige gevallen omhulde de pectinerijke inkapseling het haustorium onvolledig (figuur 4G) en in sommige gevallen is het haustorium volledig ingekapseld (figuur 4H).

In de necrotrofe interactie was het dubbele kleuringsprotocol ook nuttig om de interactie van Cercospora coffeicola met koffie mesofylweefsels te verifiëren. Aan de laesiegrens, waar de schimmel niet aanwezig is, behield de pectinerijke celwand zijn integriteit (figuur 5A). De dubbele kleuringsmethode toonde de aanwezigheid van intercellulaire schimmeldraden aan (figuur 5B,C). In interactiezones leken pectinecelwanden hun integriteit te verliezen door ontbinding (figuur 5B,C). Voortplantingsstructuren, zoals conidiofore, werden gevonden in de adaxiale epidermis (figuur 5D). In de substomatische kamer werden C. coffeicola hyfen gevonden als krulstructuren. Het palissadeparenchym in het laesiegebied lijkt celwandlysis te ondergaan (figuur 5E).

Figure 1
Figuur 1: Details van de afzonderlijke stappen in het protocol om laesieweefsels te oogsten. Oogst het stuk van de laesie met een scalpel en een pincet. Dompel de bladmonsters onder in de fixatieve oplossing. Onderwerp de monsters aan vacuümpompen en rotatie. Volg het protocol voor de uitdrogings- en inbeddingsprocessen. Het gepolymeriseerde monster is verdeeld in een roterende microtoom. De dia's met laesiesecties worden gemonteerd en gekleurd om schimmeldraden en pectinerijke celwanden te verifiëren met behulp van de dubbele kleuringsmethode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Details van de afzonderlijke stappen van het monstergedeelte vóór dubbele kleuring. (A) Fixatiestap. B) dehydratatie in gesorteerde ethanolseries; het bladweefsel wordt bij elke concentratie gedurende 15 minuten in ethanol geïncubeerd. (C) Polymerisatie in de plastic mal. (D) Blok gepolymeriseerd monster gelijmd op een stuk hout. (E) Houtverlijmd blok op de microtoom voor het doorsnedeproces. (F) Weefselsecties op de dia (aangegeven door pijlen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Details van de afzonderlijke stappen van het protocol voor dubbele kleuring. (A) Bedek de delen met druppels katoenblauw lactofenol en verwarm de glaasjes op een hete plaat bij 45 °C. (B-C) Verwijder de overtollige kleurstof door ze in gedestilleerd water te wassen. (D) Secties op de glasplaten na het wassen (aangegeven met pijlen). (E) Bedek de secties met druppels rutheniumrood. (F-G) Verwijder de overtollige kleurstof door te wassen in gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Histochemisch protocol voor dubbele kleuring voor pectine- en schimmelstructuren in koffieroestlaesie. (A-C) Secties alleen gekleurd met katoenblauw lactofenol. Schimmeldraden zijn gekleurd in donkerblauw (pijlen). De haustoriummoedercel (Hmc) en haustorium (Ha) hebben een donkerblauwe kleur. (D-H) Dubbele kleuring met katoenblauw lactofenol en rutheniumrood. (D) Overzicht van puist (Pu) op een blad. (E-F) Haustorial nek (pijlen) met pectine (roze-rode kleur). (G) Pijlen geven het begin aan van pectinerijke inkapseling van haustorium. (H) Volledige inkapseling van haustorium door pectine (pijlen). Epi Aba - Epidermis abaxiale; Epi Ada - Epidermis adaxiaal; Sp - Sponsachtig parenchym; Pp - palissade parenchym. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Histochemisch protocol voor dubbele kleuring voor pectine- en schimmelstructuren in cercosporioselaesies in koffie mesofylweefsels. (A) Laesiegrens zonder schimmels. (B-F) Doorsneden van het laesieblad. (A) De integriteit van pectinerijke celwanden van het sponsachtige parenchym. (B-D,F) In de geïnfecteerde weefsels waren de Cercospora coffeicola-schimmeldraden duidelijk (pijlen) en veroorzaakten schade aan pectische celwanden. Het was mogelijk om de conidiofore onder de cuticula (CT) (D) te verifiëren. Epi Aba - Epidermis abaxiale; Epi Ada - Epidermis adaxiaal; Sp - Sponsachtig parenchym; Pp - Palisade Parenchym; St - Huidmondjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het huidige werk introduceert een alternatieve dubbelkleuring histochemische test om de pectinesamenstelling van celwanden te onderzoeken die haustoria inkapselt in een biotroof pathosysteem. Het doel is ook om de effectiviteit aan te tonen van de methode om necrotrofe schimmels en celwandveranderingen te detecteren die hierdoor worden veroorzaakt. Hier kan pectine van koffieparenchymcelwanden zowel de nek als het haustorium van de roestschimmel Hemileia vastatrix inkapselen. Silva et al. hebben ook inkapseling door cellulose en callose beschreven in het koffie-H. vastatrix pathosysteem14,29. Onder de celwandpolymeren geassocieerd met afweermechanismen speelt pectine een belangrijke rol in het plant-pathogene systeem 10,11,12. Daarom is kennis van pectinefuncties van grote histopathologische waarde.

Cercosporiose in koffie, veroorzaakt door Cercospora coffeicola, beschadigt de bladweefsels en leidt uiteindelijk tot celdood. Deze symptomen worden voornamelijk veroorzaakt door de activiteit van cercosporine en celwandafbrekende enzymen20. Studies met rutheniumrood toonden een verlies van celwandintegriteit, vergelijkbaar met een eerdere studie over kakibladeren geïnfecteerd door Pseudocercospora kaki30. De histopathologische analyse met behulp van de dubbele kleuringsmethode toonde de aanwezigheid van de schimmeldraden aan en deze analyse is effectief om schimmeldraden in de intercellulaire ruimtes te detecteren. Als alternatief heeft scanning elektronenmicroscopie (SEM) werkzaamheid aangetoond om C. coffeicola hyphae25 te observeren; de beschikbaarheid van dergelijke geavanceerde apparatuur, samen met het moeizame werk van monstervoorbereiding, is echter een beperkende factor. Bovendien laat de SEM-analyse de chemische herkenning van pectine in celwanden niet toe. Omgekeerd is dubbele kleuring een belangrijke methode om pectineveranderingen te detecteren. De hier beschreven methode heeft echter een beperking met betrekking tot de resolutie van lichtmicroscopie die geen toename van details van de ultrastructuur van plant-schimmelinteractie toestaat. Ook is de hier gepresenteerde dubbele kleuringsmethode niet specifiek om schimmelsoorten te detecteren en moeten daarom aanvullende moleculaire essays worden uitgevoerd.

De monstervoorbereiding volgt routineprotocollen in de anatomie van de plant; sommige punten hebben echter speciale aandacht nodig. Fixatie is bijvoorbeeld een cruciale stap. De grootte van de monsters en de zorg bij het oogsten ervan zijn essentieel voor een goede fixatie. Tijd, temperatuur, pH en osmolariteit zijn cruciaal voor plantenweefsels31. De laesiebladweefsels zijn bovengrondse organen en moeten worden onderworpen aan een mild vacuüm om de fixatie te verbeteren. Het gebruik van glycolmethacrylaat (GMA) vereist ethanol als dehydratatieoplosmiddel; weefsels die niet goed zijn uitgedroogd, kunnen problemen opleveren tijdens het inbeddingsproces. Deze toestand wordt verergerd wanneer de plantenweefsels veel fenolische verbindingen bevatten, zoals in het geval van koffiebladeren. Bovendien is het omgaan met kleine delen van weefsels belangrijk; anders zijn alternatieve inbeddingsmethoden vereist32.

De hier gepresenteerde dubbele kleuringstechniek is een aanpassing van het protocol gerapporteerd door Marques et al.33. In dat protocol gebruikten de auteurs katoenblauw (5%) en 1% safranine om schimmelstructuren en plantencelwanden te onderscheiden. De techniek was nuttig om de aanwezigheid van schimmels in verschillende pathosystemen te detecteren, zoals Colletotrichum acutatum-citrusblaadjes en Guignardia citricarpa-citrusvruchten 33Plasmodiophora brassicae in Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina in Vitis labrusca35, en anderen. Onlangs hebben Marques en Soares36een reeks microscopische technieken samengesteld, waaronder de licht- en fluorescentiemethoden, om de plant- en schimmelkenmerken te onderscheiden37. In sommige regio's of landen, zoals Brazilië, zijn fluorescentiemicroscopen en SEM echter mogelijk niet beschikbaar; daarom is het gebruik van lichtmicroscopen een belangrijk en goedkoper alternatief voor onderzoek en zelfs didactische methoden die worden gebruikt op universiteiten en middelbare scholen. Schimmeldraden zijn microscopisch gedetecteerd in zowel plantaardige als dierlijke weefsels door katoenblauwe kleurstof 36,38,39,40. Dit hangt samen met de positieve reactie van de kleurstof met de chitinerijke schimmelwand40. De katoenblauwe formule bevat lactofenol, een oplossing die fungeert als een mordant voor het weefsel41, waardoor de schimmelstructuur behouden blijft wanneer deze wordt gemengd met katoenblauw. 

Hier werd 0,05% rutheniumrood gebruikt om safranine te vervangen. Het positieve aspect dat in deze studie wordt gepresenteerd, is dat pectine, een specifiek polymeer van de celwand, werd gekleurd om belangrijke kwalitatieve gegevens te leveren. Rutheniumrood is een reagens dat wordt gebruikt om zure groepen pectinepolyuronzuren te detecteren 42,43,44. Het is specifiek voor pectine en kleurt geen andere koolhydraatcomponenten van de celwand (d.w.z. cellulose of callose). Ketens van galacturonzuren gerangschikt in verschillende structurele en biochemische ruggengraat vormen pectine 8,9,45. De reactiviteit van rutheniumrood op de celwand hangt af van de mate van methylverestering11. De mate van methylverestering hangt af van de activiteit van pectinemethylesterasen (PME), en dus werd het rutheniumrood ook gebruikt als een hulpmiddel om de PME-activiteit te onderscheiden11.

De hier beschreven methode van dubbele kleuring is dus een nuttig hulpmiddel om pectinemodificaties in plant-schimmelinteracties te verifiëren. Voor zover de auteurs weten, is dit het eerste rapport van pectine in de haustoriale inkapseling van koffieroestschimmels. Interessant is dat de dubbele kleuringsmethode ook belangrijk was om schimmelstructuren te observeren, om de schade aan de pectinerijke celwand te beschrijven en om de voortplantingsstructuren van de schimmel te verifiëren. Verdere histopathologische studies naar roest, anthracnose, cercosporiose, smuts en andere biotrofe, hemibiotrofe en necrotrofe plant-schimmel interacties moeten worden uitgevoerd om het mogelijke gebruik van deze techniek in verschillende pathosystemen te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen Dr. Hudson W.P. de Carvalho bedanken voor de steun om dit werk te ontwikkelen. De auteurs zijn ook het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' dankbaar voor het leveren van de lichtmicroscopiefaciliteit. De auteurs bedanken Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício voor het leveren van laesies aan het plantmateriaal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

Biologie Nummer 180 Koffie schimmels haustorium histochemie pectine microscopie
Dubbele kleuringsmethode om pectine te detecteren in plant-schimmelinteractie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter