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Biology

Doppelfärbungsmethode zum Nachweis von Pektin in der Pflanzen-Pilz-Interaktion

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine mikroskopische Methode zum Nachweis von Pektin in der Kaffee-Pilz-Interaktion.

Abstract

Pflanzenzellen nutzen verschiedene strukturelle Mechanismen, entweder konstitutiv oder induzierbar, um sich vor einer Pilzinfektion zu schützen. Die Verkapselung ist ein effizienter induzierbarer Mechanismus, um die pilzliche Haustoria aus dem pflanzlichen Zell-Protoplasten zu isolieren. Umgekehrt ist Pektin, einer der polymeren Bestandteile der Zellwand, ein Ziel mehrerer pektolytischer Enzyme in nekrotrophen Wechselwirkungen. Hier wird ein Protokoll zum Nachweis von Pektin und Pilzhyphen durch optische Mikroskopie vorgestellt. Untersucht werden die pektinreiche Verkapselung in den Zellen von Kaffeeblättern, die mit dem Rostpilz Hemileia vastatrix infiziert sind, und die durch Cercospora coffeicola induzierte Mesophyll-Zellwandmodifikation . Läsionierte Blattproben wurden mit der Karnovsky-Lösung fixiert, dehydriert und für 2-4 Tage in Glykolmethacrylat eingebettet. Auf alle Schritte folgte ein Vakuumpumpen, um Luft in den Interzellularräumen zu entfernen und den Einbettungsprozess zu verbessern. Die eingebetteten Blöcke wurden in 5-7 μm dicke Abschnitte geschnitten, die auf einem mit Wasser bedeckten Glasobjektträger abgeschieden und anschließend 30 min lang auf 40 °C erhitzt wurden. Als nächstes wurden die Objektträger mit 5% Baumwollblau in Lactophenol doppelt gefärbt, um den Pilz nachzuweisen, und 0,05% Rutheniumrot in Wasser, um Pektin (saure Gruppen von Polyuronsäuren von Pektin) nachzuweisen. Es wurde festgestellt, dass pilzartige Haustorien von Hemileia vastatrix von Pektin eingekapselt sind. Bei der Kaffeezerkosporiose zeigten Mesophyllzellen eine Auflösung der Zellwände, und interzelluläre Hyphen und Konidiophoren wurden beobachtet. Die hier vorgestellte Methode ist effektiv, um eine Pektin-assoziierte Reaktion in der Pflanzen-Pilz-Interaktion nachzuweisen.

Introduction

Zellwand-Abwehrmechanismen in Pflanzen sind entscheidend, um Pilzinfektionen einzudämmen. Studien haben über Veränderungen der Zellwanddicke und -zusammensetzung seit dem 19. Jahrhundert berichtet 1,2. Diese Veränderungen können durch einen pilzlichen Krankheitserreger induziert werden, der die Bildung einer Papille stimuliert, die verhindert, dass Pilze in die Zelle eindringen, oder könnte verwendet werden, um die Hyphen zu verkapseln, um den Wirtszellprotoplast von der pilzlichen Haustoria zu isolieren. Die Herstellung einer dynamischen Zellwandbarriere (d.h. Papillen und ein vollständig ummanteltes Haustorium) ist wichtig, um die Pflanzenresistenz zu fördern3. Histopathologische Studien zu pilzbedingten Erkrankungen haben das Auftreten dieser Mechanismen untersucht und die Zellwandpolymere Cellulose, Hemicellulose (Arabinoxylane) und Callose als Resistenzmechanismen gegen Pilzbefallbeschrieben 4,5,6,7.

Die Zellwand ist die erste Barriere gegen mikroorganismische Angriffe und beeinträchtigt die Pflanzen-Pilz-Interaktion. Pektische Polysaccharide bilden die Zellwand und machen etwa 30% der Zellwandzusammensetzung in Primärzellen von Eudicot-Pflanzen aus, in denen Homogalacturonen das am häufigsten vorkommende Polymer sind (etwa 60%)8. Der Golgi sezerniert komplexe Pektinverbindungen, die die galakturonischen Säureketten umfassen, die methyliert sein können oder nicht 8,9. Seit 2012 weist die Literatur darauf hin, dass der Grad der Pektinmethylveresterung entscheidend für die Bestimmung der Verträglichkeit während der Infektion mit mikrobiellen pektischen Enzymen10,11,12 ist. Daher sind Protokolle erforderlich, um das Vorhandensein und die Verteilung von pektischen Verbindungen in pflanzlich-pilzlichen Pathosystemen zu überprüfen.

Verschiedene Techniken wurden verwendet, um die Verkapselung von Papillen oder Haustorien nachzuweisen. Die verwendeten Referenzmethoden sind die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) von festsitzendem Gewebe und die Lichtmikroskopie von lebendem und fixiertem Gewebe. In Bezug auf TEM haben mehrere Studien die strukturelle Rolle von Zellwandappositionen bei der Pilzresistenz 13,14,15,16 gezeigt und dass die Verwendung von Lektinen und Antikörpern eine komplizierte Methode ist, um Kohlenhydratpolymere zu lokalisieren 16. Studien zeigen jedoch, dass die Lichtmikroskopie ein wichtiger Ansatz ist und dass die histochemischen und immunhistochemischen Werkzeuge ein besseres Verständnis der Zusammensetzung von Papillen und Haustoriumhülleermöglichen 6,7.

Pathogene Pilze zeigen zwei Haupttypen von Lebensstilen: biotrophe und nekrotrophe. Biotrophe Pilze sind für ihre Ernährung auf lebende Zellen angewiesen, während nekrotrophe Pilze die Wirtszellen töten und dann in den toten Geweben leben17. In Lateinamerika ist Kaffeeblattrost, verursacht durch den Pilz Hemileia vastatrix, eine wichtige Krankheit bei Kaffeepflanzen18,19. Hemileia vastatrix zeigt ein biotrophes Verhalten, und unter den strukturellen Veränderungen, die bei resistenten Kaffeespezies oder -sorten beobachtet wurden, wurden eine Überempfindlichkeitsreaktion, Ablagerungen von Callose, Cellulose und Lignin an den Zellwänden sowie Zellhypertrophie14 berichtet. Nach Kenntnis der Autoren berichtet die Literatur nicht über die Bedeutung von Pektin bei der Kaffeerostbeständigkeit. Auf der anderen Seite zielen nekrotrophe Pilze, die Zerkosporiose verursachen, auf Pektin über eine Reihe von Enzymen, die mit dem Zellwandabbau assoziiert sind, wie Pektinas und Polygalacturonase20. Zerkosporiose im Kaffee, verursacht durch den Pilz Cercospora coffeicola ist auch eine große Bedrohung für Kaffeepflanzen21,22. Dieser Pilz verursacht nekrotische Läsionen sowohl in Blättern als auch in Beeren. Nach der Penetration besiedelt C. coffeicola Pflanzengewebe über intrazelluläre und interzelluläre Wege23,24,25.

Das vorliegende Protokoll untersucht das Vorhandensein von Pilzstrukturen und Pektin an den Zellwänden. Dieses Protokoll ist nützlich, um die Pflanzenreaktion zu identifizieren, die mit Pektin (mit rutheniumrotem Farbstoff gefärbt, der spezifisch für saure Gruppen von Polyuronsäuren von Pektin ist) verbunden ist, die vom Wirt in einer biotrophen Wechselwirkung mit Pilzen induziert wird. Es hilft auch, die Wirkung von nekrotrophen Pilzen auf den Abbau von pektischen Zellwänden zu überprüfen. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Doppelfärbungsmethode wirksam ist, um Strukturen und die Fortpflanzungsphase von Pilzen zu unterscheiden.

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Protocol

1. Herstellung der Pufferlösung und der Reagenzien

  1. Bereiten Sie 2 M Cacodylatpuffer vor, indem Sie 4,28 g Natriumcacodylat zu 100 ml destilliertem Wasser hinzufügen und den pH-Wert mit 0,2 N HCl auf 7,25 einstellen.
  2. Bereiten Sie 100 ml der Karnovsky-Fixierlösung vor, indem Sie 10 ml 25% wässriges Glutaraldehyd, 10 ml 10% wässriges Formaldehyd, 25 ml 2 M Cacodylatpuffer und 0,5 ml 0,5 M CaCl2 26 mischen. Erhöhen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml.
    HINWEIS: Die Lösung kann 6 Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden.
    ACHTUNG: Die Cacodylat-Pufferlösung ist giftig; Behandeln Sie daher die Fixierlösung in einem Abzug oder an einem offenen Bereich. Vermeiden Sie das Einatmen der Lösungsdämpfe und tragen Sie Handschuhe während der Handhabung.
  3. Wässrige Hoagland-Nährlösung durch Mischen von Folgendem herstellen: 3 mM Ca(NO 3)2.4H 2 O, 2 mM NH 4 H2PO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mMMgSO 4.7H 2 O, 9.07 mM MnSO 4, 0.765 mM ZnSO 4.7H2O, 46.4 mM H 3 BO 3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mMCuSO4 und 36 mM FeSO 4.7H2O als Eisen-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)27.

2. Pflanzenproben und Pilzimpfung

HINWEIS: Für Experimente an Blättern, die von Kaffeerost betroffen sind, fünf 2 Monate alte Sämlinge von Coffee arabica cv. Catuaí wurden in einem Gewächshaus im Zentrum für Kernenergie in der Landwirtschaft (CENA) der Universität von São Paulo, Piracicaba, Bundesstaat São Paulo, Brasilien, angebaut und gehalten.

  1. Züchten Sie Kaffeepflanzen in 500 ml Kunststofftöpfen, die mit wässriger Hoagland-Nährlösung (pH-Wert von ~ 5,5) gefüllt sind, 4 Monate lang in einer Wachstumskammer, die bei 27 ± 3 ° C mit einer Photoperiode von 12 h gehalten wird, die von LED-Lampen bei einem Photonenfluss von 250 μmol Photonen s-1 m-2 erzeugt wird. Ersetzen Sie die Hoagland-Nährlösung 4 Monate lang jede Woche.
  2. Beimpfen Sie vier expandierte Blätter von fünf Pflanzen auf ihren abaxialen Oberflächen mit 1 x 103 H. vastatrix uredospores nach dem in Referenz28 beschriebenen Verfahren. Nach der Impfung die Pflanzen 48 h im Dunkeln aufbewahren, indem Sie sie mit einer schwarzen Plastiktüte abdecken. Ernten Sie die Läsionen 30 Tage nach der Impfung.
  3. Charakteristische Läsionen, die durch Cercospora coffeicola verursacht werden, aus Coffea arabica cv. Obatã-Pflanzen (Koordinaten: -22.906506126269942, -47.015075902025266) am Biologischen Institut, Campinas, Bundesstaat São Paulo, Brasilien. Bevor Sie die Probe verarbeiten, analysieren Sie die Läsionen in einem Stereomikroskop, um das Vorhandensein von Kaffee C. coffeicola conidia zu überprüfen. Montieren Sie dann einige Folien mit den Konidien, um die Ätiologie der Krankheitzu bestätigen 22.

3. Probenentnahme, Fixierung und Dehydratisierung

  1. Ernten Sie mit einem Skalpell und einer Pinzette eine ~ 10 mm2-Blattprobe im mittleren Bereich der Läsion (gelbe Flecken; Abbildung 1) und tauchen Sie es in 30 ml Karnovsky-Fixierlösung ein (Abbildung 1 und Abbildung 2A). Der Fixierschritt kann 48 h im Kühlschrank erfolgen.
  2. Mindestens viermal wird die Blattprobe mit einer Ölpumpe für jeweils 15 min einem niedrigen Vakuum (500-600 mBar) unterzogen, um die Durchlässigkeit der fixierenden Lösung im Blattgewebe zu erhöhen. Führen Sie diesen Schritt mit der Beispielrotation aus (Abbildung 1).
  3. Nach der Fixierung wird die Blattprobe dreimal in 0,5 m Cacodylatpuffer (pH 7,2) gewaschen, der jeweils 5 min in destilliertem Wasser verdünnt ist, und dann in eine abgestufte ethanolische Serie (30%, 50%, 70%, 90% (2x) und 100% (2x)) für 15 min bei jeder Ethanolkonzentration überführt (Abbildung 1 und Abbildung 2B).

4. Historesin-Einbettungsverfahren

  1. Übertragen Sie die Proben schrittweise in drei Schritten auf Glykolmethacrylat (GMA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Stellen Sie zunächst Lösung A her, indem Sie das GMA-Pulver (1 g) mit 100 ml Basisharz mischen (Historesin-Kit; Tabelle der Materialien) unter magnetischer Bewegung, und führen Sie dann die folgenden Schritte aus.
    1. Tauchen Sie die Proben in 1:2 Lösung A: 100% Ethanol für 3 h.
    2. Tauchen Sie die Proben in 1:1 Lösung A: 100% Ethanol für 3 h.
    3. Tauchen Sie die Proben für 2-4 Tage in ein reines Basisharz. Setzen Sie die Proben während dieses Schritts mindestens viermal täglich für 15 Minuten einem niedrigen Vakuum aus, gefolgt von einer Rotation.

5. Polymerisation

HINWEIS: Der Polymerisationsprozess erfordert 1,2 ml Kunststoffformen, Grundharz und Härter (siehe Materialtabelle für die Details des kommerziellen Kits).

  1. Mischen Sie 15 ml Lösung A (Schritt 4.1) mit 1 ml des Härters in einem Becherglas mit Rotation für 2 Minuten, um die Polymerisationslösung (Lösung B) herzustellen.
  2. Geben Sie 1,2 ml der Polymerisationslösung (Lösung B) in Kunststoffformen. Übertragen Sie die Läsionsblattproben mit einem Holzmeißel aus reinem Basisharz in Lösung B (Abbildung 2C). Vermeiden Sie die Verwendung einer Pinzette, da diese zu einer Zerkleinerung des Gewebes führen kann.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Blattproben schnell senkrecht zu den Kunststoffformen ausgerichtet werden, da Lösung B innerhalb von 5 Minuten schnell viskos wird. Mehr als eine läsionierte Blattprobe kann in eine einzige Form gegeben werden.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, den obigen Schritt mehrmals zu üben, bevor Sie sich für viele Proben bewerben. Wenn es viele Proben gibt, ist die Polymerisationszeit zwischen den Formen unterschiedlich und die senkrechte Ausrichtung der Blattproben kann schwierig zu erreichen sein.
  4. Wenn die senkrechte Ausrichtung der Blattproben erreicht ist, warten Sie 30 Minuten und übertragen Sie dann die Kunststoffform in eine Kunststoff- oder Glaskammer, die Kieselgel enthält, um Feuchtigkeit zu vermeiden. Warten Sie 2-3 h auf die Polymerisation.
  5. Sobald das Harz und die Blattprobe nach der 2-3 h Periode polymerisiert sind, lösen Sie den resultierenden Block von der Kunststoffform, indem Sie den Blockboden mit einer Schleiffeile schleifen. Kleben Sie dann den Block auf ein Stück Holz (Abbildung 2D).

6. Schneiden

  1. Mit einem rotativen Mikrotom, das mit 8 cm langen Stahlklingen (Abbildung 2E) ausgestattet ist, schneiden Sie den Block in 5 μm dicke Abschnitte. Legen Sie die Abschnitte auf Glasobjektträger, die mit destilliertem Wasser bedeckt sind. Übertragen Sie die Objektträger mit den über Wasser schwebenden Abschnitten auf eine heiße Platte bei 40 ° C, um sie zu trocknen und die Haftung der Abschnitte an den Glasobjektträgern zu fördern.
  2. Beschriften Sie die Glasobjektträger nach dem Trocknen (Abbildung 2F) mit dem Blockreferenznamen und der Objektträgernummer.

7. Doppelter Färbeprozess

  1. Decken Sie die Abschnitte mit 2 ml 5% Baumwollblau in Lactophenol (40% Glycerin, 20% Phenol und 20% Milchsäure in Wasser) ab und erhitzen Sie sie auf einer heißen Platte bei 45 °C für 5 min (Abbildung 3A).
  2. Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie den Objektträger dreimal in einem mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas waschen (Abbildung 3B-D).
  3. Fleck mit 2 ml 0,01% Rutheniumrot in Wasser für 1 min (Abbildung 3E).
  4. Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie den Objektträger dreimal in einem mit destilliertem Wasser gefüllten Becherglas waschen (Abbildung 3F,G).
  5. Legen Sie einen Tropfen destilliertes Wasser über die Abschnitte und bedecken Sie die Abschnitte mit einem 24 mm x 60 mm großen Deckglas für die Durchführung einer Lichtmikroskopie-Analyse.

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Representative Results

Die baumwollblaue Lactophenolfärbung auf dem GMA-eingebetteten Abschnitt zeigte das Vorhandensein mehrerer Pilzstrukturen zwischen und in Kaffeemesophyllzellen sowohl in biotrophen als auch in nekrotrophen Pilzinteraktionen.

Im biotrophen Pathosystem erscheinen Hemileia vastatrix-Hyphen mit Zellwänden und der dichte Protoplastengehalt bei der Färbung mit der Doppelfärbungsmethode sowohl im schwammigen als auch im Palisadenparenchym dunkelblau (Abbildung 4A,B). Die Haustorium-Mutterzelle (Hmc) und die Haustoria weisen ebenfalls eine starke dunkelblaue Farbe auf (Abbildung 4C). Bei der Gegenfärbung mit Rutheniumrot ist die Pilzverteilung in den Interzellularräumen klar definiert (Abbildung 4D). Das Vorhandensein eines dunkelblauen Hmc hilft, die Infektionszone zu erkennen. Während der Interaktion brach H. vastatrix Hmc die Wirtszellwand und entwickelte einen Haustorialhals, der von pektischen Verbindungen umgeben sein könnte (Abbildung 4E, F). Dennoch ist die pektinreiche Verkapselung (rosa-rote Farbe) des Haustorialhalses nicht in der Lage, die Haustorialbildung zu verhindern (Abbildung 4E,F). In einigen Fällen umhüllte die pektinreiche Verkapselung das Haustorium unvollständig (Abbildung 4G) und in einigen Fällen ist das Haustorium vollständig verkapselt (Abbildung 4H).

In der nekrotrophen Wechselwirkung war das Doppelfärbungsprotokoll auch nützlich, um die Wechselwirkung von Cercospora coffeicola mit Kaffeemesophyllgewebe zu überprüfen. An der Läsionsgrenze, wo der Pilz nicht vorhanden ist, behielt die pektinreiche Zellwand ihre Integrität (Abbildung 5A). Die Doppelfärbungsmethode zeigte das Vorhandensein von interzellulären Hyphen (Abbildung 5B,C). In Interaktionszonen schienen Pektinzellwände durch Auflösung ihre Integrität zu verlieren (Abbildung 5B,C). Fortpflanzungsstrukturen wie Conidiophor wurden in der adaxialen Epidermis gefunden (Abbildung 5D). In der substomatischen Kammer wurden C. coffeicola hyphae als Curling-Strukturen gefunden. Das Palisadeparenchym in der läsionierten Region scheint einer Zellwandlyse zu unterliegen (Abbildung 5E).

Figure 1
Abbildung 1: Details zu den einzelnen Schritten im Protokoll zur Ernte von läsioniertem Gewebe. Ernten Sie das Stück der Läsion mit einem Skalpell und einer Pinzette. Tauchen Sie die Blattproben in die fixierende Lösung ein. Die Proben werden vakuumgepumpt und gedreht. Befolgen Sie das Protokoll für die Dehydratisierungs- und Einbettungsprozesse. Die polymerisierte Probe wird in einem rotativen Mikrotom geschnitten. Die Objektträger mit Läsionsabschnitten werden montiert und gefärbt, um pilzliche Hyphen und pektinreiche Zellwände mit der Doppelfärbungsmethode zu überprüfen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Details zu den einzelnen Schritten des Probenschnitts vor der Doppelfärbung. (A) Fixierungsschritt. B) Dehydratisierung in abgestuften Ethanolreihen; Das Blattgewebe wird bei jeder Konzentration 15 min lang in Ethanol inkubiert. (C) Polymerisation in der Kunststoffform. (D) Block einer polymerisierten Probe, die auf ein Stück Holz geklebt ist. (E) Holzverleimter Block, der für den Schnittprozess auf dem Mikrotom positioniert ist. (F) Gewebeabschnitte auf dem Objektträger (gekennzeichnet durch Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Details zu den einzelnen Schritten des Doppelfärbeprotokolls. (A) Decken Sie die Abschnitte mit Tropfen baumwollblauem Lactophenol ab und erhitzen Sie die Objektträger auf einer heißen Platte bei 45 °C. (B-C) Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff durch Waschen in destilliertem Wasser. (D) Abschnitte auf den Glasschienen nach dem Waschen (gekennzeichnet durch Pfeile). (E) Bedecken Sie die Abschnitte mit Tropfen Rutheniumrot. (F-G) Entfernen Sie den überschüssigen Farbstoff, indem Sie ihn in destilliertem Wasser waschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Histochemisches Doppelfärbungsprotokoll für Pektin- und Pilzstrukturen bei Kaffeerostläsionen. (A-C) Abschnitte, die nur mit baumwollblauem Lactophenol gefärbt sind. Pilzhyphen sind dunkelblau gefärbt (Pfeile). Die Haustorium-Mutterzelle (Hmc) und das Haustorium (Ha) haben eine dunkelblaue Farbe. (D-H) Doppelte Färbung mit baumwollblauem Lactophenol und Rutheniumrot. (D) Überblick über Pusteln (Pusteln) auf einem Blatt. (E-F) Haustorialhals (Pfeile) mit Pektin (rosa-rote Farbe). (G) Pfeile zeigen den Beginn der pektinreichen Verkapselung von Haustorium an. (H) Vollständige Verkapselung des Haustoriums durch Pektin (Pfeile). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Schwammiges Parenchym; Pp - Palisadenparenchym. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Histochemisches Doppelfärbungsprotokoll für Pektin- und Pilzstrukturen in Cercosporiose-Läsionen in Kaffee-Mesophyllgeweben. (A) Läsionsgrenze ohne Pilze. (B-F) Querschnitte des läsionierten Blattes. (A) Die Integrität der pektinreichen Zellwände des schwammigen Parenchyms. (B-D,F) In den infizierten Geweben waren die Cercospora coffeicola hyphen sichtbar (Pfeile) und verursachten Schäden in den pektischen Zellwänden. Es war möglich, das Konidiophor unter der Kutikula (CT) (D) nachzuweisen. Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Schwammiges Parenchym; pp - Palisadenparenchym; St - Stomata. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die vorliegende Arbeit stellt einen alternativen histochemischen Test zur Doppelfärbung vor, um die Pektinzusammensetzung von Zellwänden zu untersuchen, die Haustoria in einem biotrophen Pathosystem verkapseln. Ziel ist es auch, die Wirksamkeit der Methode zum Nachweis von nekrotrophen Pilzen und dadurch induzierten Zellwandveränderungen nachzuweisen. Hier kann Pektin der Kaffeeparenchym-Zellwände sowohl den Hals als auch das Haustorium des Rostpilzes Hemileia vastatrix verkapseln. Silva et al. haben auch die Verkapselung durch Cellulose und Callose im Kaffee-H. Vastatrix Pathosystem14,29 beschrieben. Unter den Zellwandpolymeren, die mit Abwehrmechanismen assoziiert sind, spielt Pektin eine wichtige Rolle im Pflanzenpathogensystem10,11,12. Daher ist die Kenntnis der Pektinfunktionen von großem histopathologischen Wert.

Zerkosporiose im Kaffee, verursacht durch Cercospora coffeicola, schädigt das Blattgewebe und führt schließlich zum Zelltod. Diese Symptome werden hauptsächlich durch die Aktivität von Cercosporin und Zellwandabbauenzymenverursacht 20. Studien mit Rutheniumrot zeigten einen Verlust der Zellwandintegrität, ähnlich einer früheren Studie über Kakiblätter, die mit Pseudocercospora kaki30 infiziert waren. Die histopathologische Analyse mit der Doppelfärbungsmethode zeigte das Vorhandensein der Pilzhyphen und diese Analyse ist wirksam, um Pilzhyphen in den Interzellularräumen nachzuweisen. Alternativ hat die Rasterelektronenmikroskopie (REM) eine Wirksamkeit bei der Beobachtung von C. coffeicola hyphae25 gezeigt; Die Verfügbarkeit solch ausgeklügelter Geräte sowie die mühsame Arbeit der Probenvorbereitung sind jedoch ein limitierender Faktor. Darüber hinaus erlaubt die REM-Analyse keine chemische Erkennung von Pektin in Zellwänden. Umgekehrt ist die doppelte Färbung eine wichtige Methode, um Pektinveränderungen zu erkennen. Die hier beschriebene Methode hat jedoch eine Einschränkung in Bezug auf die Auflösung der Lichtmikroskopie, die keine Zunahme der Details der Ultrastruktur der Pflanzen-Pilz-Interaktion zulässt. Auch die hier vorgestellte Doppelfärbungsmethode ist nicht spezifisch für den Nachweis von Pilzarten und es müssen daher zusätzliche molekulare Aufsätze durchgeführt werden.

Die Probenvorbereitung folgt Routineprotokollen in der Pflanzenanatomie; Einige Punkte bedürfen jedoch besonderer Aufmerksamkeit. Zum Beispiel ist die Fixierung ein kritischer Schritt. Die Größe der Proben und die Sorgfalt bei der Ernte sind für eine gute Fixierung unerlässlich. Zeit, Temperatur, pH-Wert und Osmolarität sind entscheidend für Pflanzengewebe31. Die läsionierten Blattgewebe sind Luftorgane und müssen einem leichten Vakuum unterzogen werden, um die Fixierung zu verbessern. Die Verwendung von Glykolmethacrylat (GMA) erfordert Ethanol als Dehydratisierungslösungsmittel; Gewebe, das nicht richtig dehydriert ist, kann während des Einbettungsprozesses Schwierigkeiten bereiten. Dieser Zustand wird verschlimmert, wenn das Pflanzengewebe viele phenolische Verbindungen enthält, wie im Fall von Kaffeeblättern. Darüber hinaus ist der Umgang mit kleinen Teilen des Gewebes wichtig; Andernfalls sind alternative Einbettungsmethoden erforderlich32.

Die hier vorgestellte Doppelfärbungstechnik ist eine Anpassung des Protokolls, das von Marques et al.33 berichtet wurde. In diesem Protokoll verwendeten die Autoren Baumwollblau (5%) und 1% Safranin, um Pilzstrukturen und Pflanzenzellwände zu unterscheiden. Die Technik war nützlich, um das Vorhandensein von Pilzen in verschiedenen Pathosystemen wie Colletotrichum acutatum-Zitrusblütenblättern und Guignardia citricarpa-Zitrusfrüchten 33Plasmodiophora brassicae in Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina in Vitis labrusca35 und anderen nachzuweisen. Vor kurzem haben Marques undSoares 36eine Reihe von mikroskopischen Techniken zusammengestellt, einschließlich der Licht- und Fluoreszenzmethoden, um die Pflanzen- und Pilzmerkmale37 zu unterscheiden. In einigen Regionen oder Ländern, wie Brasilien, sind Fluoreszenzmikroskope und SEM jedoch möglicherweise nicht verfügbar. Daher ist der Einsatz von Lichtmikroskopen eine wichtige und kostengünstigere Alternative für die Forschung und sogar für didaktische Methoden, die an Universitäten und Gymnasien eingesetzt werden. Pilzhyphen wurden sowohl in pflanzlichen als auch in tierischen Geweben durch den baumwollblauen Farbstoff36,38,39,40 mikroskopisch nachgewiesen. Dies hängt mit der positiven Reaktion des Farbstoffs mit der Chitin-reichen Pilzwand40 zusammen. Die baumwollblaue Formel enthält Lactophenol, eine Lösung, die als Beizmittel auf das Gewebe41 wirkt und dadurch die Pilzstruktur erhält, wenn sie mit Baumwollblau gemischt wird. 

Hier wurden 0,05% Rutheniumrot verwendet, um Safranin zu ersetzen. Der positive Aspekt, der in dieser Studie vorgestellt wird, ist, dass Pektin, ein spezifisches Polymer der Zellwand, gefärbt wurde, um wichtige qualitative Daten zu liefern. Rutheniumrot ist ein Reagenz zum Nachweis saurer Gruppen von Pektinpolyuronsäuren42,43,44. Es ist spezifisch für Pektin und färbt keine anderen Kohlenhydratbestandteile der Zellwand (z. B. Cellulose oder Callose). Ketten von Galacturonsäuren, die in verschiedenen strukturellen und biochemischen Rückgraten angeordnet sind, bilden Pektin 8,9,45. Die Reaktivität von Rutheniumrot zur Zellwand hängt vom Grad der Methylveresterungab 11. Der Grad der Methylveresterung hängt von der Aktivität der Pektinmethylesterasen (PME) ab, und daher wurde das Rutheniumrot auch als Werkzeug zur Unterscheidung der PME-Aktivität11 verwendet.

Daher ist die hier beschriebene Doppelfärbungsmethode ein nützliches Werkzeug, um Pektinmodifikationen in Pflanzen-Pilz-Interaktionen zu überprüfen. Nach bestem Wissen der Autoren ist dies der erste Bericht über Pektin in der haustorialen Verkapselung von Kaffeerostpilzen. Interessanterweise war die Doppelfärbungsmethode auch wichtig, um Pilzstrukturen zu beobachten, die Schäden an der pektinreichen Zellwand zu beschreiben und die Pilzfortpflanzungsstrukturen zu überprüfen. Weitere histopathologische Studien zu Rost, Anthracnose, Zerkosporiose, Schmutz und anderen biotrophen, hemibiotrophen und nekrotrophen Pflanzen-Pilz-Interaktionen sollten durchgeführt werden, um den möglichen Einsatz dieser Technik in verschiedenen Pathosystemen zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Hudson W. P. de Carvalho für die Unterstützung bei der Entwicklung dieser Arbeit. Die Autoren danken auch dem Labor für Elektronenmikroskopie "Prof. Elliot Watanabe Kitajima" für die Bereitstellung der Lichtmikroskopie-Anlage. Die Autoren danken Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício für die Versorgung des Pflanzenmaterials mit Läsionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologie Ausgabe 180 Kaffee Pilze Haustorium Histochemie Pektin Mikroskopie
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Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

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