Summary
このプロトコルは、コーヒー - 真菌相互作用におけるペクチンを検出するための顕微鏡的方法を記載する。
Abstract
植物細胞は、真菌感染から身を守るために、構成的または誘導性のいずれかの異なる構造機構を使用する。カプセル化は、植物細胞プロトプラストから真菌ハウストリアを単離するための効率的な誘導可能な機構である。逆に、細胞壁のポリマー成分の1つであるペクチンは、壊死的相互作用におけるいくつかのペプチド分解酵素の標的である。ここでは、光学顕微鏡によってペクチンおよび真菌菌糸を検出するためのプロトコルが提示される。錆病菌 ヘミレイア・バスタトリックス に感染したコーヒー葉の細胞へのペクチンリッチなカプセル化と 、セルコスポラ・コフェイコーラ によって誘導された葉肉細胞壁修飾が調査される。病変葉サンプルをカルノフスキー溶液で固定し、脱水し、グリコールメタクリレートに2〜4日間包埋した。すべてのステップに続いて、細胞間空間内の空気を除去し、包埋プロセスを改善するための真空ポンピングが続いた。埋め込まれたブロックを厚さ5〜7μmのセクションに切断し、これを水で覆われたスライドガラス上に堆積させ、続いて40°Cで30分間加熱した。次に、スライドをラクトフェノール中の5%コットンブルーで二重染色して真菌を検出し、水中の0.05%ルテニウムレッドでペクチン(ペクチンのポリウロン酸の酸性基)を検出した。 ヘミレイア・バスタトリックスの 真菌ハウストリアはペクチンによってカプセル化されていることが判明した。コーヒーセルコスポリオーシスでは、葉肉細胞が細胞壁の溶解を示し、細胞間菌糸および分生子色素が観察された。ここで提示される方法は、植物−真菌相互作用におけるペクチン関連応答を検出するのに有効である。
Introduction
植物の細胞壁防御機構は、真菌感染を抑制するために重要である。研究は、19世紀以来の細胞壁の厚さと組成の変化を報告している1,2。これらの変化は、真菌が細胞に入るのを妨げる乳頭の形成を刺激する真菌病原体によって誘発され得るか、または真菌ハウストリアから宿主細胞プロトプラストを単離するために菌糸を封入するために使用することができる。動的細胞壁障壁(すなわち、乳頭および完全に包まれたハウストリウム)の産生は、植物抵抗性を促進するために重要である3。真菌関連疾患に関する病理組織学的研究は、これらのメカニズムの発生を調査し、細胞壁ポリマー、セルロース、ヘミセルロース(アラビノキシラン)、およびカロースを真菌攻撃に対する耐性メカニズムとして記述している4、5、6、7。
細胞壁は微生物の攻撃に対する最初の障壁であり、植物 - 真菌相互作用を損なう。ペクティック多糖類は細胞壁を構成し、ホモガラクツロナンが最も豊富なポリマーである真二子植物の初代細胞における細胞壁組成の約30%(約60%)を占める8。ゴルジ体は、ガラクツロン酸鎖を構成する複雑なペクチン化合物を分泌し、メチル化されていてもいなくてもよい8,9。2012年以来、文献は、ペクチンメチルエステル化の程度が微生物ペクチン酵素10、11、12による感染時の適合性を決定するのに重要であることを指摘している。したがって、植物 - 真菌病態系におけるペクチック化合物の存在および分布を検証するためにプロトコルが必要である。
乳頭またはハウストリアのカプセル化を検出するために様々な技術が用いられてきた。使用される参照方法は、固定組織の透過型電子顕微鏡(TEM)および生体および固定組織の光学顕微鏡法である。TEMに関しては、いくつかの研究が真菌耐性における細胞壁アポジションの構造的役割を実証している13,14,15,16、およびレクチンおよび抗体の使用が炭水化物ポリマーを見つけるための複雑な方法であること16。しかし、研究は、光学顕微鏡法が重要なアプローチであり、組織化学的および免疫組織化学的ツールが乳頭およびハウスストリウム包帯の組成をよりよく理解することを可能にすることを示している6,7。
病原性真菌は、生物栄養性および壊死性の2つの主要なタイプのライフスタイルを示す。生物栄養性真菌は、その栄養のために生細胞に依存しているのに対し、壊死性真菌は宿主細胞を殺し、次いで死んだ組織に生息する17。ラテンアメリカでは、真菌Hemileia vastatrixによって引き起こされるコーヒー葉の錆は、コーヒー作物における重要な病気である18,19。ヘミレイア・バスタトリックスは、生物栄養挙動を示し、耐性コーヒー種または栽培品種で観察される構造変化のうち、過敏応答、細胞壁へのカロース、セルロース、およびリグニンの沈着、ならびに細胞肥大14が報告されている。著者の知る限り、文献はコーヒーの錆び抵抗性におけるペクチンの重要性に関する情報を報告していない。一方、セルコスポリオーシスを引き起こす壊死性真菌は、ペクチナーゼおよびポリガラクツロナーゼ20などの細胞壁分解に関連する一連の酵素を介してペクチンを標的とする。コーヒー中のセルコスポリア症は、真菌Cercospora coffeicolaによって引き起こされる、コーヒー作物21、22に対する主要な脅威でもある。この真菌は、葉と果実の両方に壊死性病変を引き起こす。浸透後、C.コフェイコーラは、細胞内および細胞間経路23、24、25を介して植物組織にコロニー形成する。
本プロトコールは、細胞壁上の真菌構造およびペクチンの存在を調査する。このプロトコールは、真菌との生物栄養相互作用において宿主によって誘導されるペクチン(ペクチンのポリウロン酸の酸性基に特異的であるルテニウム赤色色素で染色される)に関連する植物応答を同定するのに有用である。また、壊死性真菌がペクチック細胞壁の分解に及ぼす影響を検証するのにも役立ちます。本結果は、二重染色法が真菌の構造や生殖期の判別に有効であることを示している。
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Protocol
緩衝溶液及び試薬の調製
- 100 mLの蒸留水に4.28 gのカコジル酸ナトリウムを加えて2 Mカコジル酸緩衝液を調製し、0.2 N HClでpHを7.25に調整します。
- 10mLの25%グルタルアルデヒド水溶液、10mLの10%ホルムアルデヒド水溶液、25mLの2Mカコジル酸緩衝液、および0.5mLの0.5M CaCl226を混合して、100mLのカルノフスキー固定液を調製する。蒸留水で100mLまでの容量を作ります。
注:溶液は冷蔵庫に6ヶ月間保管することができます。
警告: カコジル酸緩衝溶液は有毒です。したがって、固定液溶液をヒュームフードまたはオープンエリアで処理してください。溶液蒸気を吸い込まないようにし、取り扱い中は手袋を着用してください。 - 3 mM Ca(NO3)2.4H 2 O、2 mM NH 4H2 PO4、5 mM KH 2PO4、2 mMMgSO 4.7H2O、9.07 mM MnSO 4、0.765 mM ZnSO4.7H 2 O、46.4 mMH3BO3、 0.09 mMNa2MoO4.H2O、0.01 mM CuSO4、および鉄-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)として36 mM FeSO4.7H2O2Oが挙げられる27。
2. 植物サンプルおよび真菌接種
注:コーヒーの錆びの影響を受けた葉の実験のために、 コーヒーアラビカ cvの5つの2ヶ月齢の苗木。カトゥアイはブラジルのサンパウロ州ピラシカバにあるサンパウロ大学の農業原子力センター(CENA)の温室で栽培され、保管されました。
- 250μmolの光子s-1 m-2の光子フラックスでLEDランプによって作成された12時間の光周期で27± 3°Cに保たれた成長チャンバー内で、ホーグランド水溶液(pH〜5.5)で満たされた500mLのプラスチックポットで4ヶ月間コーヒー植物を栽培する。ホーグランド養液を毎週4ヶ月間交換してください。
- それらのアブキシャル表面上の5つの植物から4つの膨張した葉を、参考文献28に記載の方法に従って1 x103H. vastatrix uredosporesに接種する。接種後、植物を黒いビニール袋で覆って暗闇の中で48時間保管してください。接種後30日目に病変を収穫する。
- Coffea arabica cvからCercospora cfeicolaによって引き起こされる特徴的な病変を収穫する。ブラジル、サンパウロ州カンピナスの生物研究所にあるオバタン植物(座標:-22.906506126269942、-47.015075902025266)。試料を処理する前に、実体顕微鏡で病変を分析し、コーヒーC.コフェイコーラ分生子の存在を検証した。次に、分生子とともにいくつかのスライドを装着し、疾患病因22を確認する。
3. サンプルの採取、固定、脱水
- メスとピンセットを使用して、病変の中央領域で〜10mm2の葉サンプルを採取する(黄色の斑点;図1)30mLのカルノフスキー固定液に浸漬する(図1および図2A)。固定ステップは、冷蔵庫で48時間行うことができます。
- 少なくとも4回、葉の組織における固定液の透過性を高めるために、オイルポンプを使用して葉サンプルを低真空(500〜600mBar)にそれぞれ15分間供する。この手順は、サンプルの回転で実行します(図1)。
- 固定後、蒸留水で希釈した0.5 Mカコジル酸緩衝液(pH 7.2)で葉サンプルを5分間それぞれ3回洗浄し、その後、段階的なエタノール系列(30%、50%、70%、90%(2x)、および100%(2x))に各エタノール濃度で15分間移す(図1 および 図2B)。
4. 保存埋め込み手順
- 製造元の指示に従って、サンプルを3つのステップでグリコールメタクリレート(GMA)に徐々に移します。まず、GMA粉末(1g)と塩基性樹脂100mLを混合して溶液Aを作る(ヒトレシンキット; 材料表)磁気攪拌下で、以下の手順に従ってください。
- サンプルを1:2溶液A:100%エタノールに3時間浸漬する。
- サンプルを1:1溶液A:100%エタノールに3時間浸漬する。
- サンプルを純粋な塩基性樹脂に2〜4日間浸漬する。このステップの間、サンプルを1日4回、15分間、低真空にかけ、その後回転させる。
5. 重合
注: 重合プロセスには、1.2 mL のプラスチック金型、基本樹脂、および硬化剤が必要です (市販のキットの詳細については、 材料表 を参照してください)。
- 15 mLの溶液A(ステップ4.1)と1 mLの硬化剤を2分間回転させるビーカーで混合し、重合溶液(溶液B)を作製した。
- 2 mLの重合溶液(溶液B)をプラスチック金型に入れる。木製のピックを使用して、病変葉サンプルを純粋な塩基性樹脂から溶液Bに移します(図2C)。ピンセットは組織の破砕を引き起こす可能性があるため、使用しないでください。
- 溶液Bが5分以内に迅速に粘性になるように、葉のサンプルをプラスチック金型に対して垂直に素早く配向させるようにしてください。複数の病変葉サンプルを単一のカビに入れることができる。
注:多くのサンプルを申請する前に、上記の手順を数回練習することをお勧めします。試料が多いと、鋳型間で重合時間が異なり、葉試料の垂直配向が達成しにくい場合がある。 - 葉サンプルの垂直配向が達成されたら、30分間待ってから、湿気を防ぐためにプラスチックモールドをシリカゲルを含むプラスチックまたはガラスチャンバに移す。重合のために2〜3時間待つ。
- 2〜3時間後に樹脂と葉サンプルが重合したら、ブロックベースをサンディングヤスリでサンディングして、得られたブロックをプラスチック金型から取り外します。次に、ブロックを木片に接着します(図2D)。
6. セクショニング
- 8cmのスチールブレードを備えた回転ミクロトーム(図2E)を使用して、ブロックを厚さ5μmのセクションに切断します。蒸留水で覆われたスライドガラスの上に切片を置きます。水上に浮いた切片を有するスライドを40°Cのホットプレートに移し、乾燥させ、スライドガラスへの切片の接着を促進する。
- 乾燥後(図2F)、スライドガラスにブロック参照名とスライド番号のラベルを付けます。
7. 二重染色プロセス
- ラクトフェノール(40%グリセロール、20%フェノール、および20%乳酸水)の5%コットンブルーの2mLで切片を覆い、45°Cのホットプレート上で5分間加熱する(図3A)。
- 蒸留水を満たしたビーカーでスライドを3回洗浄して余分な色素を除去する(図3B-D)。
- 2mLの0.01%ルテニウムレッドで1分間水中で染色する(図3E)。
- 蒸留水を満たしたビーカーでスライドを3回洗浄して余分な色素を除去します(図3F、G)。
- 切片の上に蒸留水1滴を入れ、光学顕微鏡分析を行うための24 mm x 60 mmのカバースリップで切片を覆います。
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Representative Results
GMA包埋部のコットンブルーラクトフェノール染色は、生物栄養性および壊死性真菌相互作用の両方において、コーヒー葉肉細胞間および内部にいくつかの真菌構造の存在を明らかにした。
生物栄養病原系において、二重染色法を用いて染色すると、細胞壁および緻密なプロトプラスト含量を含む ヘミレイア・バスタトリクス 菌糸は、海綿状および柵状実質の両方において濃い青色で現れる(図4A、B)。ハウストリア母細胞(Hmc)とハウストリアも強い濃い青色を呈する(図4C)。ルテニウムレッドで対比染色すると、細胞間空間における真菌分布が明確に定義される(図4D)。濃い青色のHMCの存在は、感染ゾーンを検出するのに役立ちます。相互作用の間、 H. vastatrix Hmcは宿主細胞壁を壊し、ペクティック化合物に囲まれるハウストリアルネックを発達させた(図4E、F)。それにもかかわらず、胸頸部のペクチンに富むカプセル化(ピンク - 赤色)は、ハウストリアル形成を防止することができない(図4E、F)。場合によっては、ペクチンに富むカプセル化がハウストリウムを不完全に包み込み(図4G)、場合によってはハウストリアムが完全にカプセル化されている(図4H)。
壊死性相互作用において、二重染色プロトコルは、 セルコスポラ・コフェイコーラ とコーヒー葉肉組織との相互作用を検証するのにも有用であった。真菌が存在しない病変境界では、ペクチンに富む細胞壁がその完全性を維持した(図5A)。二重染色法は、細胞間菌糸の存在を実証した(図5B、C)。相互作用ゾーンでは、ペクチン細胞壁は溶解のために完全性を失うように見えた(図5B、C)。分生子などの生殖構造は、副軸表皮に見出された(図5D)。底腔内には、 C. coffeicola 菌糸がカール構造として見出された。病変領域の柵実質は細胞壁溶解を受けるようである(図5E)。
図1:病変組織を採取するためのプロトコルにおける個々のステップの詳細。 メスとピンセットで病変の部分を収穫する。葉のサンプルを固定液に浸します。サンプルを真空ポンプと回転にかけます。脱水および埋め込みプロセスのプロトコルに従ってください。重合された試料は、回転ミクロトーム中で切片化される。病変切片を有するスライドを装着して染色し、二重染色法を用いて真菌菌糸およびペクチンに富む細胞壁を検証した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:二重染色前のサンプル切片の個々のステップの詳細。 (a)固着工程。(b)段階的エタノール系列における脱水;葉組織をエタノール中で各濃度で15分間インキュベートする。(c)プラスチック金型内部での重合。(D)木片に接着された重合サンプルのブロック。(E)切片化プロセスのためにミクロトーム上に配置された木材接着ブロック。(F)スライド上の組織切片(矢印で示す)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:二重染色プロトコルの個々のステップの詳細。 (A)綿青ラクトフェノールの滴で切片を覆い、45°Cのホットプレート上のスライドを加熱する(B-C)蒸留水で洗浄して余分な染料を除去する。(d)洗浄後のスライドガラス上の切片(矢印で示す)。(E)ルテニウムレッドの滴でセクションを覆います。(エフ-ジー)蒸留水で洗浄して余分な色素を除去する。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:コーヒー錆病変におけるペクチンおよび真菌構造の組織化学的二重染色プロトコル。 (A-C)切片は綿青ラクトフェノールのみで染色した。真菌菌糸は濃い青色(矢印)に染色されています。ハウストリウム母細胞(Hmc)とハウストリウム(Ha)は濃い青色を呈している。(D-H)二重染色はコットンブルーラクトフェノールとルテニウムレッドを用いた。(D)葉の上の膿疱(Pu)の概要。(E-F)ペクチン(ピンク - レッド色)とハウストリアルネック(矢印)。(g)矢印は、ハウストリウムのペクチンに富むカプセル化の始まりを示す。(h)ペクチン(矢印)によるハウストリウムの完全なカプセル化。エピアバ - 表皮アバキシャル;エピアダ - 表皮貞軸;Sp - 海綿状の実質;Pp - 柵実質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:コーヒー葉肉組織における頸管胞子嚢症病変におけるペクチンおよび真菌構造の組織化学的二重染色プロトコル。 (A)真菌のない病変境界。(B-F)病変した葉の断面。(a)海綿状実質のペクチンに富む細胞壁の完全性。(B-D,F)感染した組織では、Cercospora coffeicola hyphaeは明らかであり(矢印)、ペクチック細胞壁に損傷を与えた。キューティクル(CT)下の分生子(D)を検証することができた。エピアバ - 表皮アバキシャル;エピアダ - 表皮貞軸;Sp - 海綿状の実質;Pp - 柵の実質;セント - ストマタ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究は、ハウストリアを生物栄養病態系に封入する細胞壁のペクチン組成を調べるための代替二重染色組織化学的試験を導入する。その目的はまた、壊死性真菌およびそれによって誘導される細胞壁変化を検出する方法の有効性を実証することである。ここで、コーヒー実質細胞壁のペクチンは、錆病菌ヘミレイア・バスタトリクスの首とハウスリウムの両方をカプセル化することができる。Silvaらはまた、コーヒー−H.バスタトリックス病態系14、29におけるセルロースおよびカロースによるカプセル化について記載している。防御機構に関連する細胞壁ポリマーの中で、ペクチンは植物病原体系において重要な役割を果たしている10、11、12。したがって、ペクチン機能の知識は、病理組織学的に大きな価値がある。
Cercospora cfeicolaによって引き起こされるコーヒー中のセルコスポリオーシスは、葉の組織を損傷し、最終的に細胞死につながります。これらの症状は、主にセルコスポリンおよび細胞壁分解酵素20の活性によって引き起こされる。ルテニウムレッドを用いた研究は、Pseudocercospora kaki30に感染した柿の葉に関する以前の研究と同様に、細胞壁の完全性の喪失を実証した。 二重染色法を用いた病理組織学的解析により、真菌菌糸の存在が実証され、細胞間空間における真菌菌糸の検出に有効である。あるいは、走査型電子顕微鏡(SEM)は、C. coffeicola 菌糸25を観察する有効性を示した。しかし、このような洗練された機器の可用性は、サンプル調製の面倒な作業とともに、制限要因です。さらに、SEM分析は、細胞壁におけるペクチンの化学的認識を可能にしない。逆に、二重染色はペクチン変化を検出するための重要な方法である。しかしながら、ここで記載される方法は、植物−真菌相互作用の超微細構造の詳細の増加を許さない光学顕微鏡の分解能に関して制限を有する。また、ここで提示された二重染色法は、真菌種を検出するのに特異的ではなく、したがって、追加の分子エッセイを実施しなければならない。
サンプル調製は、植物解剖学における日常的なプロトコルに従う。ただし、いくつかの点には特別な注意が必要です。たとえば、固定は重要なステップです。サンプルのサイズと収穫の注意は、良好な固定に不可欠です。時間、温度、pH、および浸透圧は、植物組織31にとって極めて重要である。病変した葉の組織は空中器官であり、固定を改善するために穏やかな真空に従わなければならない。グリコールメタクリレート(GMA)の使用は、脱水溶媒としてエタノールを必要とする。適切に脱水されていない組織は、埋め込みプロセス中に困難を引き起こす可能性があります。この状態は、コーヒーの葉の場合のように、植物組織に多くのフェノール化合物がある場合に悪化する。さらに、組織の小さな部分を扱うことが重要です。それ以外の場合は、代替の埋め込み方法が必要です32。
ここで提示された二重染色技術は、Marques et al.33によって報告されたプロトコルの適応である。そのプロトコルでは、著者らはコットンブルー(5%)と1%のサフラニンを使用して、真菌構造と植物細胞壁を区別した。この技術は、Colletotrichum acutatum-citrus petalsおよびGuignardia citricarpa-citrus fruit33Plasmodiophora brassicae in Arabidopsis thaliana34、Elsinoë ampelina in Vitis labrusca35など、さまざまな病態系における真菌の存在を検出するのに有用であった。最近、Marques and Soares36は、植物および真菌の特徴を区別するために、光および蛍光法を含む一連の顕微鏡的技術を編纂した37。ただし、ブラジルなどの一部の地域や国では、蛍光顕微鏡やSEMが利用できない場合があります。したがって、光学顕微鏡の使用は、研究のための重要かつ安価な代替手段であり、大学や高校で採用されている教訓的な方法でさえもあります。真菌菌糸は、綿青色染料36、38、39、40によって植物および動物組織の両方で顕微鏡的に検出されている。これは、キチンに富む真菌壁40との色素の陽性反応に関連している。コットンブルー式は、ラクトフェノールを含み、これは、組織41に対する媒染剤として作用する溶液であり、それによってコットンブルーと混合したときに真菌構造を保存する。
ここでは、0.05%のルテニウムレッドがサフラニンの代わりに使用された。この研究で提示された肯定的な側面は、細胞壁の特定のポリマーであるペクチンが染色され、重要な定性的データを提供することである。ルテニウムレッドは、ペクチンポリウロン酸42、43、44の酸性基を検出するために使用される試薬である。それはペクチンに特異的であり、細胞壁の他の炭水化物成分(すなわち、セルロースまたはカロース)を染色しない。異なる構造的および生化学的骨格に配置されたガラクツロン酸の鎖は、ペクチン8、9、45を構成する。細胞壁に対するルテニウムレッドの反応性は、メチルエステル化の程度に依存する11。メチルエステル化の程度はペクチンメチルエステラーゼ(PME)の活性に依存するため、ルテニウムレッドはPME活性11を区別するためのツールとしても使用された。
したがって、ここで説明する二重染色法は、植物 - 真菌相互作用におけるペクチン修飾を検証するための有用なツールである。著者の知る限りでは、これはコーヒー錆菌のハウストリオカプセル化におけるペクチンの最初の報告です。興味深いことに、二重染色法は、真菌構造を観察し、ペクチンに富む細胞壁によって引き起こされる損傷を記述し、真菌の生殖構造を検証するためにも重要であった。錆、炭疽菌、セルコスポリオーシス、スマットおよび他の生物栄養性、ヘミ生物栄養性、および壊死性植物 - 真菌相互作用に関するさらなる組織病理学的研究を実施して、異なる病態系におけるこの技術の潜在的な使用を調査するべきである。
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Disclosures
著者らは利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
著者らは、この研究を発展させるための支援について、ハドソン・W・P・デ・カルヴァーリョ博士に感謝したい。著者らはまた、電子顕微鏡研究所「北島エリオット渡辺教授」が光顕微鏡施設を提供してくれたことにも感謝している。著者らは、植物材料に病変を供給したFlávia Rodrigues Alves Patrício博士に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blades DB80 HS | Leica | 14035838383 | Sectioning |
| Cacodylate buffer | EMS | # 11652 | Fixation |
| Cotton Blue Lactophenol | Metaquímica | 70SOLSIG024629 | Staining |
| Formaldehyde | EMS | #15712 | Fixation |
| Glutaraldehyde | EMS | #16216 | Fixation |
| Historesin Kit | Technovit /EMS | #14653 | Historesin for embedding |
| Hot plate | Dubesser | SSCD25X30-110V | Staining |
| Microscopy | Zeiss | #490040-0030-000 | Image capture |
| Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Sectioning |
| Plastic molding cup tray | EMS | 10176-30 | Staining |
| Ruthenium red | LABHouse | #006004 | Staining |
| Software Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | Image capture |
| Vaccum pump | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | Fixation |
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