Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dubbelfärgningsmetod för att detektera pektin i interaktion mellan växter och svampar

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Detta protokoll beskriver en mikroskopisk metod för att detektera pektin i kaffe-svampinteraktion.

Abstract

Växtceller använder olika strukturella mekanismer, antingen konstitutiva eller inducerbara, för att försvara sig mot svampinfektion. Inkapsling är en effektiv inducerbar mekanism för att isolera svamp haustoria från växtcellens protoplast. Omvänt är pektin, en av de polymera komponenterna i cellväggen, ett mål för flera pektolytiska enzymer i nekrotrofa interaktioner. Här presenteras ett protokoll för att detektera pektin och svamphyfer genom optisk mikroskopi. Den pektinrika inkapslingen i cellerna i kaffeblad infekterade av rostsvampen Hemileia vastatrix och mesofyllcellväggsmodifieringen inducerad av Cercospora coffeicola undersöks. Lesionerade bladprover fixerades med Karnovsky-lösningen, uttorkades och inbäddades i glykolmetakrylat i 2-4 dagar. Alla steg följdes av vakuumpumpning för att avlägsna luft i de intercellulära utrymmena och förbättra inbäddningsprocessen. De inbäddade blocken sektionerades i 5-7 μm tjocka sektioner, som deponerades på en glasrutschbana täckt med vatten och därefter upphettades till 40 ° C i 30 minuter. Därefter dubbelfärgades bilderna med 5% bomullsblå i laktofenol för att detektera svampen och 0,05% ruteniumrött i vatten för att detektera pektin (sura grupper av polyuroniska syror av pektin). Svamp haustoria av Hemileia vastatrix befanns vara inkapslad av pektin. Vid kaffecercosporios uppvisade mesofyllceller upplösning av cellväggar och intercellulära hyfer och konidioforer observerades. Metoden som presenteras här är effektiv för att detektera ett pektinassocierat svar i interaktionen mellan växter och svampar.

Introduction

Cellväggsförsvarsmekanismer i växter är avgörande för att begränsa svampinfektion. Studier har rapporterat förändringar i cellväggens tjocklek och sammansättning sedan 1800-talet 1,2. Dessa förändringar kan induceras av en svamppatogen som stimulerar bildandet av en papilla, vilket förhindrar att svampar kommer in i cellen eller kan användas för att kapsla in hyferna för att isolera värdcellens protoplast från svamp haustoria. Produktionen av en dynamisk cellväggsbarriär (dvs. papiller och ett helt inneslutet haustorium) är viktigt för att främja växtresistens3. Histopatologiska studier på svamprelaterade sjukdomar har undersökt förekomsten av dessa mekanismer och har beskrivit cellväggspolymererna, cellulosa, hemicellulosa (arabinoxylaner) och callos som resistensmekanismer mot svampangrepp 4,5,6,7.

Cellväggen är den första barriären mot mikroorganismangrepp, vilket försämrar interaktionen mellan växt och svamp. Pektiska polysackarider komponerar cellväggen och står för cirka 30% av cellväggskompositionen i primära celler av eudikotväxter där homogalakturonaner är den vanligaste polymeren (ungefär 60%)8. Golgi utsöndrar komplexa pektinföreningar som utgör galakturonsyrakedjorna, som kan eller inte kan metyleras 8,9. Sedan 2012 har litteraturen påpekat att graden av pektinmetylförestring är avgörande för att bestämma kompatibiliteten under infektion med mikrobiella pektiska enzymer 10,11,12. Således krävs protokoll för att verifiera närvaron och fördelningen av pektiska föreningar i växtsvamppatosystem.

Olika tekniker har använts för att detektera inkapsling av papiller eller haustoria. Referensmetoderna som används är transmissionselektronmikroskopi (TEM) av fast vävnad och ljusmikroskopi av levande och fasta vävnader. När det gäller TEM har flera studier visat den strukturella rollen av cellväggsappositioner i svampresistens 13,14,15,16, och att användningen av lektiner och antikroppar är en invecklad metod för att lokalisera kolhydratpolymerer 16. Studier visar dock att ljusmikroskopi är ett viktigt tillvägagångssätt och att de histokemiska och immunohistokemiska verktygen möjliggör en bättre förståelse av sammansättningen av papiller och haustoriumhölje 6,7.

Patogena svampar visar två huvudtyper av livsstilar: biotrofisk och nekrotrofisk. Biotrofa svampar är beroende av levande celler för sin näring medan nekrotrofa svampar dödar värdcellerna och lever sedan i de döda vävnaderna17. I Latinamerika är kaffebladrost, orsakad av svampen Hemileia vastatrix, en viktig sjukdom i kaffegrödor18,19. Hemileia vastatrix uppvisar ett biotrofiskt beteende och bland de strukturella förändringar som observerats hos resistenta kaffearter eller sorter har ett överkänslighetssvar, avsättning av callos, cellulosa och lignin på cellväggarna samt cellhypertrofi14 rapporterats. Såvitt författarna vet rapporterar litteraturen inte information om pektins betydelse för kafferostmotstånd. Å andra sidan riktar sig nekrotrofa svampar som orsakar cercosporios pektin via en uppsättning enzymer associerade med cellväggsnedbrytning, såsom pektinaser och polygalakturonas20. Cercosporiosis i kaffe, orsakad av svampen Cercospora coffeicola är också ett stort hot mot kaffegrödor21,22. Denna svamp orsakar nekrotiska lesioner i både löv och bär. Efter penetration koloniserar C. coffeicola växtvävnader genom intracellulära och intercellulära vägar 23,24,25.

Det nuvarande protokollet undersöker förekomsten av svampstrukturer och pektin på cellväggar. Detta protokoll är användbart för att identifiera växtresponsen associerad med pektin (färgad med ruteniumrött färgämne, vilket är specifikt för sura grupper av polyuroniska syror av pektin), inducerat av värden i en biotrofisk interaktion med svamp. Det hjälper också till att verifiera effekten av nekrotrofa svampar på nedbrytningen av pektiska cellväggar. De nuvarande resultaten indikerar att dubbelfärgningsmetoden är effektiv för att diskriminera strukturer och reproduktionsfasen hos svampar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av buffertlösningen och reagenserna

  1. Förbered 2 M kacodylatbuffert genom att tillsätta 4,28 g natriumkacodylat till 100 ml destillerat vatten och justera pH till 7,25 med 0,2 N HCl.
  2. Förbered 100 ml av Karnovsky fixativ lösning genom att blanda 10 ml 25% vattenhaltig glutaraldehyd, 10 ml 10% vattenhaltig formaldehyd, 25 ml 2 M kacodylatbuffert och 0,5 ml 0,5 M CaCl226. Gör upp volymen till 100 ml med destillerat vatten.
    OBS: Lösningen kan förvaras i kylskåp i 6 månader.
    VARNING: Cacodylatbuffertlösningen är giftig; hantera därför fixeringslösningen i en draghuva eller ett öppet område. Undvik att andas in lösningsångorna och använd handskar under hanteringen.
  3. Bereda vattenhaltig Hoagland näringslösning genom att blanda följande: 3 mM Ca (NO3) 2,4H 2O, 2 mMNH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4,7H 2O, 9,07 mM MnSO4, 0,765 mM ZnSO4,7H2 O, 46,4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 och 36 mM FeSO4,7H2O som järn-EDTA(etylenediamintetraättiksyra)27.

2. Växtprover och svampinokulering

OBS: För experiment på löv som påverkas av kafferost, fem 2 månader gamla plantor av Kaffe arabica cv. Catuaí odlades och hölls i ett växthus vid Center of Nuclear Energy in Agriculture (CENA) vid University of São Paulo, Piracicaba, São Paulo State, Brasilien.

  1. Odla kaffeplantor i 500 ml plastkrukor fyllda med vattenhaltig Hoagland näringslösning (pH på ~ 5,5) i 4 månader i en tillväxtkammare som hålls vid 27 ± 3 ° C med en 12 timmars fotoperiod skapad av LED-lampor vid fotonflödet av 250 μmol fotoner s-1 m-2. Byt ut Hoagland näringslösning varje vecka i 4 månader.
  2. Inokulera fyra expanderade blad från fem växter på deras abaxiala ytor med 1 x 103 H. vastatrix uredosporer enligt den metod som beskrivs i referens28. Efter ympning, håll plantorna i 48 timmar i mörkret genom att täcka dem med en svart plastpåse. Skörda lesionerna 30 dagar efter ympning.
  3. Skörda karakteristiska lesioner orsakade av Cercospora coffeicola från Coffea arabica cv. Obatã växter lokaliserade (koordinater: -22.906506126269942, -47.015075902025266) vid Biologiska institutet, Campinas, São Paulo State, Brasilien. Innan du bearbetar provet, analysera lesionerna i ett stereomikroskop för att verifiera närvaron av kaffe C. coffeicola conidia. Montera sedan några bilder med konidierna för att bekräfta sjukdomsetiologin22.

3. Provskörd, fixering och uttorkning

  1. Använd en skalpell och pincett och skörda ett ~ 10 mm2 bladprov vid mitten av lesionen (gula fläckar; Figur 1) och fördjupa den i 30 ml Karnovsky fixativ lösning (figur 1 och figur 2A). Fixeringssteget kan ske i kylskåp i 48 timmar.
  2. Under minst fyra gånger, utsätt bladprovet för ett lågt vakuum (500-600 mBar) med hjälp av en oljepump i 15 minuter vardera för att öka permeabiliteten hos den fixativa lösningen i bladvävnaden. Utför detta steg med provrotation (Figur 1).
  3. Efter fixering, tvätta bladprovet tre gånger i 0,5 M kacodylatbuffert (pH 7,2) utspätt i destillerat vatten i 5 minuter vardera och överför det sedan till en graderad etanolserie (30%, 50%, 70%, 90% (2x) och 100% (2x)) i 15 min vid varje etanolkoncentration (figur 1 och figur 2B).

4. Historesin inbäddningsförfarande

  1. Överför gradvis proverna till glykolmetakrylat (GMA) i tre steg, enligt tillverkarens instruktioner. Gör först lösning A genom att blanda GMA-pulvret (1 g) med 100 ml basiskt harts (historesinsats; Materialtabell) under magnetisk omrörning och följ sedan stegen nedan.
    1. Sänk ner proverna i 1:2 Lösning A: 100% etanol i 3 timmar.
    2. Sänk ner proverna i 1:1 Lösning A: 100% etanol i 3 timmar.
    3. Sänk ner proverna i ett rent basharts i 2-4 dagar. Under detta steg, utsätt proverna för ett lågt vakuum minst fyra gånger om dagen i 15 minuter följt av rotation.

5. Polymerisation

OBS: Polymerisationsprocessen kräver 1,2 ml plastformar, basharts och härdare (se Materialtabell för detaljerna i det kommersiella kitet).

  1. Blanda 15 ml lösning A (steg 4.1) med 1 ml härdare i en bägare med rotation i 2 min för att producera polymerisationslösningen (lösning B).
  2. Lägg 1,2 ml av polymerisationslösningen (lösning B) i plastformar. Överför de lesionerade bladproverna från rent basharts med hjälp av en träplockning till lösning B (figur 2C). Undvik att använda pincett eftersom de kan orsaka vävnadskrossning.
  3. Se till att snabbt orientera bladprover vinkelrätt mot plastformarna eftersom lösning B snabbt blir viskös inom 5 minuter. Mer än ett lesionerat bladprov kan placeras i en enda form.
    OBS: Det rekommenderas att öva ovanstående steg flera gånger innan du ansöker om många prover. När det finns många prover är polymerisationstiden annorlunda bland formarna och bladprovernas vinkelräta orientering kan vara svår att uppnå.
  4. När bladprovernas vinkelräta orientering uppnås, vänta i 30 minuter och överför sedan plastformen till en plast- eller glaskammare som innehåller kiselgel för att förhindra fuktighet. Vänta i 2-3 timmar för polymerisation.
  5. När hartset och bladprovet polymeriserats efter 2-3 timmarsperioden, lossa det resulterande blocket från plastformen genom att slipa blockbasen med en slipfil. Limma sedan blocket på en bit trä (Figur 2D).

6. Sektionering

  1. Skär blocket i 5 μm tjocka sektioner med hjälp av en roterande mikrotom utrustad med 8 cm stålblad (figur 2E). Placera sektionerna på glasrutschbanor täckta med destillerat vatten. Överför rutschkanorna med sektionerna som flyter över vatten till en kokplatta vid 40 °C för att torka och främja vidhäftningen av sektionerna till glasrutschbanorna.
  2. Efter torkning (figur 2F), märk glasglasen med blockets referensnamn och bildnummer.

7. Dubbel färgningsprocess

  1. Täck sektionerna med 2 ml 5 % bomullsblått i laktofenol (40 % glycerol, 20 % fenol och 20 % mjölksyra i vatten) och värm dem på en kokplatta vid 45 °C i 5 min (figur 3A).
  2. Ta bort överflödigt färgämne genom att tvätta bilden tre gånger i en bägare fylld med destillerat vatten (figur 3B-D).
  3. Fläck med 2 ml 0,01% ruteniumrött i vatten i 1 min (Figur 3E).
  4. Ta bort överflödigt färgämne genom att tvätta bilden tre gånger i en bägare fylld med destillerat vatten (figur 3F,G).
  5. Lägg en droppe destillerat vatten över sektionerna och täck sektionerna med en 24 mm x 60 mm täckglas för att utföra ljusmikroskopianalys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den bomullsblå laktofenolfärgningen på den GMA-inbäddade sektionen avslöjade närvaron av flera svampstrukturer mellan och inuti kaffemesofyllceller i både biotrofa och nekrotrofa svampinteraktioner.

I det biotrofa patosystemet, när det färgas med dubbelfärgningsmetoden, uppträder Hemileia vastatrix hyfer innehållande cellväggar och det täta protoplastinnehållet i mörkblått i både svampigt och palisadparenkym (figur 4A,B). Haustoriummodercellen (Hmc) och haustoria uppvisar också en stark mörkblå färg (figur 4C). När den är motfärgad med ruteniumrött definieras svampfördelningen i de intercellulära utrymmena tydligt (figur 4D). Närvaron av en mörkblå Hmc hjälper till att upptäcka infektionszonen. Under interaktionen bröt H. vastatrix Hmc värdcellväggen och utvecklade en haustoriell hals som kunde omges av pektiska föreningar (Figur 4E,F). Ändå kan den pektinrika inkapslingen (rosa-röd färg) i haustorialhalsen inte förhindra haustoriell bildning (figur 4E,F). I vissa fall inneslöt den pektinrika inkapslingen haustoriumet ofullständigt (figur 4G) och i vissa fall är haustoriet helt inkapslat (figur 4H).

I den nekrotrofa interaktionen var dubbelfärgningsprotokollet också användbart för att verifiera interaktionen mellan Cercospora coffeicola och kaffe mesofyllvävnader. Vid lesionsgränsen, där svampen inte är närvarande, behöll den pektinrika cellväggen sin integritet (Figur 5A). Den dubbla färgningsmetoden visade närvaron av intercellulära hyfer (figur 5B,C). I interaktionszoner tycktes pektincellväggar förlora sin integritet på grund av upplösning (figur 5B,C). Reproduktiva strukturer, såsom konidiofor, hittades i adaxial epidermis (figur 5D). I den substomatiska kammaren hittades C. coffeicola hyfer som curlingstrukturer. Palisadparenkymet i det lesionerade området verkar genomgå cellväggslys (figur 5E).

Figure 1
Figur 1: Detaljer om de enskilda stegen i protokollet för att skörda lesionerade vävnader. Skörda lesionsbiten med en skalpell och en pincett. Sänk ner bladproverna i fixeringslösningen. Utsätt proverna för vakuumpumpning och rotation. Följ protokollet för uttorknings- och inbäddningsprocesserna. Det polymeriserade provet är sektionerat i en roterande mikrotom. Bilderna med lesionssektioner monteras och färgas för att verifiera svamphyfer och pektinrika cellväggar med hjälp av dubbelfärgningsmetoden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Detaljer om de enskilda stegen i provavsnittet före dubbelfärgning. (A) Fixeringssteg. B) Uttorkning i graderade etanolserier. bladvävnaden inkuberas i etanol i 15 min vid varje koncentration. (C) Polymerisation inuti plastformen. (D) Block av polymeriserat prov limmat på en träbit. (E) Trälimmat block placerat på mikrotomen för sektionsprocessen. (F) Vävnadssektioner på diabilden (betecknas med pilar). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Detaljer om de enskilda stegen i dubbelfärgningsprotokollet. (A) Täck sektionerna med droppar bomullsblå laktofenol och värm rutschkanorna på en kokplatta vid 45 °C. (B-C) Ta bort överflödigt färgämne genom att tvätta i destillerat vatten. (D) Sektioner på glasrutschbanorna efter tvätt (betecknas med pilar). (E) Täck sektionerna med droppar ruteniumrött. (F-G) Ta bort överflödigt färgämne genom att tvätta i destillerat vatten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Histokemiskt dubbelfärgningsprotokoll för pektin- och svampstrukturer i kafferostskador. (A-C) Sektioner färgade endast med bomullsblå laktofenol. Svamphyfer är färgade i mörkblå (pilar). Haustoriummodercellen (Hmc) och haustorium (Ha) har en mörkblå färg. (D-H) Dubbelfärgning med bomullsblå lactophenol och ruteniumröd. (D) Översikt över pustul (Pu) på ett blad. (E-F) Haustorial hals (pilar) med pektin (rosa-röd färg). (G) Pilar indikerar början på pektinrik inkapsling av haustorium. (H) Fullständig inkapsling av haustorium med pektin (pilar). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Svampig parenkym; Pp - palisadparenkym. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Histokemiskt dubbelfärgningsprotokoll för pektin- och svampstrukturer i cercosporiosskador i kaffemasofyllvävnader. (A) Lesionsgräns utan svampar. (B-F) Tvärsnitt av det lesionerade bladet. (A) Integriteten hos pektinrika cellväggar i det svampiga parenkymet. (B-D,F) I de infekterade vävnaderna var Cercospora coffeicola hyfer uppenbara (pilar) och orsakade skador i pektiska cellväggar. Det var möjligt att verifiera konidioforen under nagelbandet (CT) (D). Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Svampig parenkym; Pp - Palisade Parenchyma; St - Stomata. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Föreliggande arbete introducerar ett alternativt dubbelfärgnings histokemiskt test för att undersöka pektinsammansättningen av cellväggar som kapslar in haustoria i ett biotrofiskt patosystem. Syftet är också att demonstrera metodens effektivitet för att detektera nekrotrofisk svamp och cellväggsförändringar inducerade av den. Här kan pektin av kaffeparenkymcellväggar kapsla in både halsen och haustoriumet hos rostsvampen Hemileia vastatrix. Silva et al. har också beskrivit inkapsling av cellulosa och kallos i kaffe-H. vastatrix patosystem14,29. Bland cellväggspolymererna associerade med försvarsmekanismer spelar pektin en viktig roll i växtpatogensystemet 10,11,12. Därför är kunskap om pektinfunktioner av stort histopatologiskt värde.

Cercosporios i kaffe, orsakad av Cercospora coffeicola, skadar bladvävnaderna och leder så småningom till celldöd. Dessa symtom orsakas huvudsakligen av aktiviteten hos cercosporin och cellväggsnedbrytande enzymer20. Studier med ruteniumrött visade en förlust av cellväggsintegritet, liknande en tidigare studie på persimmonblad infekterade av Pseudocercospora kaki30. Den histopatologiska analysen med användning av dubbelfärgningsmetoden visade närvaron av svamphyferna och denna analys är effektiv för att detektera svamphyfer i de intercellulära utrymmena. Alternativt har svepelektronmikroskopi (SEM) visat effekt för att observera C. coffeicola hyfer25; Tillgången till sådan sofistikerad utrustning, tillsammans med det mödosamma arbetet med provberedning, är emellertid en begränsande faktor. Dessutom tillåter SEM-analysen inte kemiskt erkännande av pektin i cellväggar. Omvänt är dubbelfärgning en viktig metod för att upptäcka pektinförändringar. Metoden som beskrivs här har emellertid en begränsning med avseende på upplösningen av ljusmikroskopi som inte tillåter en ökning av detaljerna i ultrastrukturen för växt-svampinteraktion. Den dubbla färgningsmetoden som presenteras här är inte heller specifik för att detektera svamparter och ytterligare molekylära uppsatser måste därför genomföras.

Provberedningen följer rutinmässiga protokoll i växtanatomi; Vissa punkter behöver dock särskild uppmärksamhet. Till exempel är fixering ett kritiskt steg. Storleken på proverna och omsorgen vid skörden av dem är avgörande för god fixering. Tid, temperatur, pH och osmolaritet är avgörande för växtvävnader31. De lesionerade bladvävnaderna är luftorgan och måste utsättas för ett milt vakuum för att förbättra fixeringen. Användningen av glykolmetakrylat (GMA) kräver etanol som ett uttorkningslösningsmedel; vävnader som inte är ordentligt uttorkade kan ge svårigheter under inbäddningsprocessen. Detta tillstånd förvärras när växtvävnaderna har många fenolföreningar, som i fallet med kaffeblad. Dessutom är det viktigt att hantera små delar av vävnader; I annat fall krävs alternativa inbäddningsmetoder32.

Dubbelfärgningstekniken som presenteras här är en anpassning av protokollet som rapporterats av Marques et al.33. I det protokollet använde författarna bomullsblå (5%) och 1% safranin för att skilja svampstrukturer och växtcellväggar. Tekniken var användbar för att detektera närvaron av svamp i olika patosystem, såsom Colletotrichum acutatum-citrusblad och Guignardia citricarpa-citrusfrukter 33Plasmodiophora brassicae i Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina i Vitis labrusca35 och andra. Nyligen sammanställde Marques och Soares36en serie mikroskopiska tekniker, inklusive ljus- och fluorescensmetoderna, för att skilja växt- och svampegenskaperna37. I vissa regioner eller länder, till exempel Brasilien, kanske fluorescensmikroskop och SEM inte är tillgängliga. Därför är användningen av ljusmikroskop ett viktigt och billigare alternativ för forskning och till och med didaktiska metoder som används vid universitet och gymnasier. Svamphyfer har mikroskopiskt detekterats i både växt- och djurvävnader av bomullsblått färgämne 36,38,39,40. Detta är relaterat till färgämnets positiva reaktion med den kitinrika svampväggen40. Den bomullsblå formeln innefattar laktofenol, vilket är en lösning som fungerar som ett mordant till vävnaden41 och därigenom bevarar svampstrukturen när den blandas med bomullsblå. 

Här användes 0,05% ruteniumrött för att ersätta safranin. Den positiva aspekten som presenteras i denna studie är att pektin, en specifik polymer av cellväggen, färgades för att ge viktiga kvalitativa data. Ruteniumrött är ett reagens som används för att detektera sura grupper av pektinpolyronsyror 42,43,44. Det är specifikt för pektin och fläckar inte andra kolhydratkomponenter i cellväggen (dvs cellulosa eller callose). Kedjor av galakturonsyror anordnade i olika strukturella och biokemiska ryggrader komponerar pektin 8,9,45. Reaktiviteten hos ruteniumrött till cellväggen beror på graden av metylförestring11. Graden av metylförestring beror på aktiviteten hos pektinmetylesteraser (PME), och därmed användes ruteniumrött också som ett verktyg för att diskriminera PME-aktiviteten11.

Således är dubbelfärgningsmetoden som beskrivs här ett användbart verktyg för att verifiera pektinmodifieringar i interaktioner mellan växter och svampar. Såvitt författarna vet är detta den första rapporten om pektin i den haustoriella inkapslingen av kafferostsvampar. Intressant nog var dubbelfärgningsmetoden också viktig för att observera svampstrukturer, för att beskriva skadorna på den pektinrika cellväggen och för att verifiera svampreproduktionsstrukturerna. Ytterligare histopatologiska studier på rost, antracnos, cercosporios, smuts och andra biotrofa, hemibiotrofa och nekrotrofa växt-svampinteraktioner bör genomföras för att undersöka den potentiella användningen av denna teknik i olika patosystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr. Hudson W. P. de Carvalho för stödet för att utveckla detta arbete. Författarna är också tacksamma för laboratoriet för elektronmikroskopi '' Prof. Elliot Watanabe Kitajima '' för att tillhandahålla ljusmikroskopianläggningen. Författarna tackar Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício för att ha försett växtmaterialet med skador.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

Biologi utgåva 180 Kaffe svampar haustorium histokemi pektin mikroskopi
Dubbelfärgningsmetod för att detektera pektin i interaktion mellan växter och svampar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter