Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Bitki-Mantar Etkileşiminde Pektini Tespit Etmek için Çift Boyama Yöntemi

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432

Summary

Bu protokol, kahve-mantar etkileşiminde pektini tespit etmek için mikroskobik bir yöntemi açıklar.

Abstract

Bitki hücreleri, kendilerini mantar enfeksiyonundan korumak için kurucu veya indüklenebilir farklı yapısal mekanizmalar kullanırlar. Enkapsülasyon, mantar haustoriasını bitki hücresi protoplastından izole etmek için etkili bir indüklenebilir mekanizmadır. Tersine, hücre duvarının polimerik bileşenlerinden biri olan pektin, nekrotrofik etkileşimlerde birkaç pektolitik enzimin hedefidir. Burada, optik mikroskopi yoluyla pektin ve mantar hiflerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Pas mantarı Hemileia vastatrix ile enfekte olmuş kahve yapraklarının hücrelerinde pektin bakımından zengin kapsüllenme ve Cercospora coffeicola tarafından indüklenen mezofil hücre duvarı modifikasyonu araştırılmıştır. Lezyonlu yaprak örnekleri Karnovsky çözeltisi ile sabitlendi, dehidre edildi ve 2-4 gün boyunca glikol metakrilat içine gömüldü. Tüm adımları, hücreler arası boşluklardaki havayı uzaklaştırmak ve gömme işlemini iyileştirmek için vakum pompalama izledi. Gömülü bloklar, suyla kaplı bir cam slayt üzerinde biriktirilen ve daha sonra 30 dakika boyunca 40 ° C'de ısıtılan 5-7 μm kalınlığında bölümlere ayrıldı. Daha sonra, slaytlar mantarı tespit etmek için laktofenolde% 5 pamuk mavisi ve pektini (pektinin poliüronik asitlerinin asidik grupları) tespit etmek için suda% 0.05 rutenyum kırmızısı ile çift boyandı. Hemileia vastatrix'in fungal haustoria'sının pektin tarafından kapsüllendiği bulundu. Kahve cercosporiosis'te mezofil hücrelerinde hücre duvarlarında çözünme görüldü ve hücreler arası hifa ve konidioforlar gözlendi. Burada sunulan yöntem, bitki-mantar etkileşiminde pektin ile ilişkili bir yanıtı tespit etmek için etkilidir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bitkilerde hücre duvarı savunma mekanizmaları mantar enfeksiyonunu engellemek için çok önemlidir. Çalışmalar, 19.yüzyıldan bu yana hücre duvar kalınlığı ve bileşimindeki değişiklikleri bildirmiştir 1,2. Bu değişiklikler, mantarların hücreye girmesini önleyen bir papilla oluşumunu uyaran bir mantar patojeni tarafından indüklenebilir veya konakçı hücre protoplastını mantar haustoriasından izole etmek için hifleri kapsüllemek için kullanılabilir. Dinamik bir hücre duvarı bariyerinin (yani, papillalar ve tamamen kaplanmış bir haustorium) üretimi, bitki direncini arttırmak için önemlidir3. Mantarla ilişkili hastalıklar üzerine yapılan histopatolojik çalışmalar bu mekanizmaların oluşumunu araştırmış ve hücre duvarı polimerleri, selüloz, hemiselüloz (arabinoksilans) ve kalozu mantar atağına direnç mekanizmaları olarak tanımlamıştır 4,5,6,7.

Hücre duvarı, mikroorganizma saldırısına karşı ilk bariyerdir ve bitki-mantar etkileşimini bozar. Pektik polisakkaritler hücre duvarını oluşturur ve homogalakturonanların en bol polimer (kabaca% 60) olduğu ödikot bitkilerinin birincil hücrelerinde hücre duvarı bileşiminin yaklaşık% 30'unu oluşturur8. Golgi, metillenmiş veya metillenemeyen galakturonik asit zincirlerini oluşturan kompleks pektin bileşiklerini salgılar 8,9. 2012 yılından bu yana, literatür, pektin metil esterifikasyon derecesinin, mikrobiyal pektik enzimler10,11,12 tarafından enfeksiyon sırasında uyumluluğu belirlemek için kritik öneme sahip olduğuna dikkat çekmiştir. Bu nedenle, bitki-mantar patosistemlerinde pektik bileşiklerin varlığını ve dağılımını doğrulamak için protokoller gereklidir.

Papilla veya haustoria'nın kapsüllenmesini tespit etmek için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Kullanılan referans yöntemleri sabit dokunun transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve canlı ve sabit dokuların ışık mikroskobudur. TEM ile ilgili olarak, çeşitli çalışmalar mantar direncinde hücre duvarı appozisyonlarının yapısal rolünü göstermiştir 13,14,15,16 ve lektinlerin ve antikorların kullanımının karbonhidrat polimerlerini bulmak için karmaşık bir yöntem olduğunu göstermiştir 16. Bununla birlikte, çalışmalar ışık mikroskobunun önemli bir yaklaşım olduğunu ve histokimyasal ve immünohistokimyasal araçların papilla ve haustorium encasement 6,7'nin bileşiminin daha iyi anlaşılmasını sağladığını göstermektedir.

Patojenik mantarlar iki ana yaşam tarzı türü gösterir: biyotrofik ve nekrotrofik. Biyotrofik mantarlar beslenmeleri için canlı hücrelere bağımlıyken, nekrotrofik mantarlar konakçı hücreleri öldürür ve daha sonra ölü dokularda yaşar17. Latin Amerika'da, Hemileia vastatrix mantarının neden olduğu kahve yaprağı pası, kahve bitkilerinde önemli bir hastalıktır18,19. Hemileia vastatrix biyotrofik bir davranış sergiler ve dirençli kahve türlerinde veya çeşitlerinde gözlenen yapısal değişiklikler arasında aşırı duyarlılık yanıtı, hücre duvarlarında kalloz, selüloz ve lignin birikimi ve hücre hipertrofisi14 bildirilmiştir. Yazarların bilgisine göre, literatür pektinin kahve pas direncindeki önemi hakkında bilgi vermemektedir. Öte yandan, cercosporiosise neden olan nekrotrofik mantarlar, pektinazlar ve poligalakturonaz20 gibi hücre duvarı bozulması ile ilişkili bir dizi enzim yoluyla pektin'i hedef alır. Cercospora coffeicola mantarının neden olduğu kahvedeki cercosporiosis de kahve bitkileri için büyük bir tehdittir21,22. Bu mantar hem yapraklarda hem de meyvelerde nekrotik lezyonlara neden olur. Penetrasyondan sonra, C. coffeicola bitki dokularını hücre içi ve hücreler arası yollar23,24,25 yoluyla kolonize eder.

Mevcut protokol, hücre duvarlarında mantar yapılarının ve pektinin varlığını araştırmaktadır. Bu protokol, konakçı tarafından mantar ile biyotrofik bir etkileşimde indüklenen pektin (pektinin poliüronik asitlerinin asidik gruplarına özgü rutenyum kırmızı boya ile boyanmış) ile ilişkili bitki tepkisini tanımlamak için yararlıdır. Ayrıca nekrotrofik mantarların pektik hücre duvarlarının bozulması üzerindeki etkisini doğrulamaya yardımcı olur. Mevcut sonuçlar, çift boyama yönteminin yapıları ve mantarların üreme evresini ayırt etmede etkili olduğunu göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Tamponlama çözeltisinin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. 100 mL damıtılmış suya 4.28 g sodyum kakodilat ekleyerek 2 M kakodilat tamponu hazırlayın ve pH'ı 0.2 N HCl ile 7.25'e ayarlayın.
  2. 10 mL% 25 sulu glutaraldehit, 10 mL% 10 sulu formaldehit, 25 mL 2 M kakodilat tamponu ve 0.5 mL 0.5 M CaCl 226'yı karıştırarak 100 mL Karnovsky fiksatif çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su ile hacmi 100 mL'ye kadar yapın.
    NOT: Çözelti buzdolabında 6 ay boyunca saklanabilir.
    DİKKAT: Kakodilat tamponlama çözeltisi toksiktir; bu nedenle, fiksatif çözeltiyi bir duman davlumbazında veya açık bir alanda tutun. Çözelti buharlarını solumaktan kaçının ve kullanım sırasında eldiven giyin.
  3. Aşağıdakileri karıştırarak sulu Hoagland besin çözeltisi hazırlayın: 3 mM Ca(NO 3)2.4H 2 O, 2 mM NH 4 H 2 PO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgSO 4.7H 2 O, 9.07 mM MnSO 4, 0.765 mM ZnSO 4.7H 2O, 46.4 mM H 3 BO 3, 0.09 mM Na2MoO4. H2 O, 0.01 mM CuSO 4 ve 36 mM FeSO4.7H 2O demir-EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) olarak27.

2. Bitki örnekleri ve mantar aşılama

NOT: Kahve pasından etkilenen yapraklar üzerinde yapılan deneyler için, beş adet 2 aylık Kahve arabica cv fidanıdır. Catuaí, Brezilya'nın São Paulo Eyaleti, Piracicaba, São Paulo Üniversitesi'nin Tarımda Nükleer Enerji Merkezi'nde (CENA) yetiştirildi ve bir serada tutuldu.

  1. 250 μmol foton s-1 m-2'nin foton akısında LED lambalar tarafından oluşturulan 12 saatlik bir fotoperiyotla 27 ± 3 ° C'de tutulan bir büyüme odasında 4 ay boyunca sulu Hoagland besin çözeltisi (pH ~ 5.5) ile doldurulmuş 500 mL plastik kaplarda kahve bitkileri yetiştirin. Hoagland besin çözeltisini 4 ay boyunca her hafta değiştirin.
  2. Referans28'de açıklanan yöntemi izleyerek beş bitkinin dört genişlemiş yaprağını abaksiyel yüzeylerine 1 x 103H. vastatrix üredosporlarla aşılayın. Aşılamadan sonra, bitkileri siyah bir plastik torba ile kaplayarak karanlıkta 48 saat saklayın. Aşılamadan 30 gün sonra lezyonları hasat edin. 
  3. Coffea arabica cv'den Cercospora coffeicola'nın neden olduğu karakteristik lezyonları hasat edin. ObatÜtesisleri (koordinatlar: -22.906506126269942, -47.015075902025266) Biyoloji Enstitüsü, Campinas, São Paulo Eyaleti, Brezilya'da bulunmaktadır. Numuneyi işlemeden önce, kahve C. coffeicola conidia'nın varlığını doğrulamak için lezyonları bir stereomikroskopta analiz edin. Ardından, hastalık etiyolojisini doğrulamak için konidia ile bazı slaytlar monte edin22.

3. Numune toplama, sabitleme ve dehidrasyon

  1. Bir neşter ve cımbız kullanarak, lezyonun orta bölgesinde ~ 10mm2 yaprak örneği toplayın (sarı lekeler; Şekil 1) ve 30 mL Karnovsky fiksatif çözeltisine daldırın (Şekil 1 ve Şekil 2A). Sabitleme adımı buzdolabında 48 saat boyunca gerçekleşebilir.
  2. En az dört kez, yaprak dokusundaki fiksatif çözeltinin geçirgenliğini arttırmak için yaprak numunesini her biri 15 dakika boyunca bir yağ pompası kullanarak düşük bir vakuma (500-600 mBar) maruz bırakın. Bu adımı örnek döndürme ile gerçekleştirin (Şekil 1).
  3. Fiksasyondan sonra, yaprak numunesini her biri 5 dakika boyunca damıtılmış suda seyreltilmiş 0,5 M kakodilat tamponunda (pH 7,2) üç kez yıkayın ve daha sonra her etanol konsantrasyonunda 15 dakika boyunca derecelendirilmiş bir etanolik seriye (% 30,% 50,% 70,% 90 (2x) ve% 100 (2x)) aktarın (Şekil 1 ve Şekil 2B).

4. Historesin gömme prosedürü

  1. Numuneleri, üreticinin talimatlarını izleyerek üç adımda kademeli olarak glikol metakrilatına (GMA) aktarın. İlk olarak, GMA tozunu (1 g) 100 mL bazik reçine (historesin kiti; Malzeme Tablosu) manyetik ajitasyon altında ve ardından aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Numuneleri 1:2 Çözelti A: 3 saat boyunca% 100 etanol içine batırın.
    2. Numuneleri 1:1 Çözelti A: 3 saat boyunca% 100 etanol içine daldırın.
    3. Numuneleri 2-4 gün boyunca saf bir bazik reçineye batırın. Bu adım sırasında, numuneleri 15 dakika boyunca günde en az dört kez düşük bir vakuma maruz bırakın ve ardından rotasyona tabi tutun.

5. Polimerizasyon

NOT: Polimerizasyon işlemi 1,2 mL plastik kalıplar, bazik reçine ve sertleştirici gerektirir (ticari kitin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakınız).

  1. Polimerizasyon çözeltisini (Çözelti B) üretmek için 15 mL çözelti A'yı (adım 4.1) 1 mL sertleştiriciyle 2 dakika boyunca dönen bir beherde karıştırın.
  2. Plastik kalıplara 1,2 mL polimerizasyon çözeltisi (Çözelti B) koyun. Tahta bir toplama kullanarak, lezyonlu yaprak örneklerini saf bazik reçineden Çözelti B'ye aktarın (Şekil 2C). Cımbız kullanmaktan kaçının, çünkü doku ezilmesine neden olabilirler.
  3. B çözeltisi 5 dakika içinde hızla viskoz hale geldiğinden, yaprak numunelerinin plastik kalıplara dik olarak hızlı bir şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Tek bir kalıba birden fazla lezyonlu yaprak örneği yerleştirilebilir.
    NOT: Birçok numuneye başvurmadan önce yukarıdaki adımı birkaç kez uygulamanız önerilir. Çok sayıda numune olduğunda, polimerizasyon süresi kalıplar arasında farklıdır ve yaprak numunelerinin dik oryantasyonunu elde etmek zor olabilir.
  4. Yaprak numunelerinin dik yönü elde edildiğinde, 30 dakika bekleyin ve ardından nemi önlemek için plastik kalıbı silika jel içeren plastik veya cam bir odaya aktarın. Polimerizasyon için 2-3 saat bekleyin.
  5. Reçine ve yaprak numunesi 2-3 saatlik süreden sonra polimerize edildikten sonra, blok tabanını bir zımpara dosyası ile zımparalayarak elde edilen bloğu plastik kalıptan ayırın. Ardından, bloğu bir tahta parçasına yapıştırın (Şekil 2D).

6. Bölümleme

  1. 8 cm'lik çelik bıçaklarla donatılmış döner bir mikrotom kullanarak (Şekil 2E), bloğu 5 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri damıtılmış suyla kaplı cam slaytlara yerleştirin. Su üzerinde yüzen kesitli slaytları 40 °C'de sıcak bir plakaya aktararak kurutun ve bölümlerin cam slaytlara yapışmasını teşvik edin.
  2. Kuruduktan sonra (Şekil 2F), cam slaytları blok referans adı ve slayt numarası ile etiketleyin.

7. Çift boyama işlemi

  1. Bölümleri laktofenol içinde 2 mL% 5 pamuk mavisi (% 40 gliserol,% 20 fenol ve% 20 laktik asit) ile örtün ve 5 dakika boyunca 45 ° C'de sıcak bir plaka üzerinde ısıtın (Şekil 3A).
  2. Slaytı damıtılmış suyla doldurulmuş bir beherde üç kez yıkayarak fazla boyayı çıkarın (Şekil 3B-D).
  3. 1 dakika boyunca suda 2 mL% 0.01 rutenyum kırmızısı olan leke (Şekil 3E).
  4. Slaytı damıtılmış suyla doldurulmuş bir beherde üç kez yıkayarak fazla boyayı çıkarın (Şekil 3F, G).
  5. Bölümlerin üzerine bir damla damıtılmış su koyun ve ışık mikroskobu analizi yapmak için bölümleri 24 mm x 60 mm'lik bir kapak kayması ile örtün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

GMA gömülü bölümdeki pamuk mavisi laktofenol boyaması, hem biyotrofik hem de nekrotrofik mantar etkileşimlerinde kahve mezofil hücreleri arasında ve içinde çeşitli mantar yapılarının varlığını ortaya koymuştur.

Biyotrofik patosistemde, çift boyama yöntemi kullanılarak boyandığında, hücre duvarları içeren Hemileia vastatrix hifleri ve yoğun protoplast içeriği hem süngerimsi hem de palisade parankimde koyu mavi renkte görünür (Şekil 4A,B). Haustorium ana hücresi (Hmc) ve haustoria da güçlü bir koyu mavi renk sergiler (Şekil 4C). Rutenyum kırmızısı ile karşı boyandığında, hücreler arası boşluklardaki mantar dağılımı açıkça tanımlanır (Şekil 4D). Koyu mavi bir Hmc'nin varlığı, enfeksiyon bölgesini tespit etmeye yardımcı olur. Etkileşim sırasında, H. vastatrix Hmc konakçı hücre duvarını kırdı ve pektik bileşiklerle çevrelenebilen bir haustorial boyun geliştirdi (Şekil 4E, F). Bununla birlikte, haustorial boynun pektin bakımından zengin kapsüllenmesi (pembe-kırmızı renk) haustorial oluşumu önleyemez (Şekil 4E, F). Bazı durumlarda, pektin bakımından zengin kapsülleme, haustoriumu eksik bir şekilde kaplar (Şekil 4G) ve bazı durumlarda, haustoryum tamamen kapsüllenir (Şekil 4H).

Nekrotrofik etkileşimde, çift boyama protokolü, Cercospora coffeicola'nın kahve mezofil dokuları ile etkileşimini doğrulamak için de yararlı olmuştur. Mantarın bulunmadığı lezyon sınırında, pektin bakımından zengin hücre duvarı bütünlüğünü korumuştur (Şekil 5A). Çift boyama yöntemi hücreler arası hifaların varlığını göstermiştir (Şekil 5B,C). Etkileşim bölgelerinde, pektin hücre duvarları çözünme nedeniyle bütünlüklerini kaybetmiş gibi görünmektedir (Şekil 5B,C). Konidiofor gibi üreme yapıları adaksiyal epidermiste bulundu (Şekil 5D). Substomatik odacıkta kıvrılma yapıları olarak C. coffeicola hyphae bulundu. Lezyonlu bölgedeki palisade parankimi hücre duvarı lizisine uğramış gibi görünmektedir (Şekil 5E).

Figure 1
Şekil 1: Lezyonlu dokuları toplamak için protokoldeki bireysel adımların ayrıntıları. Lezyonun parçasını bir neşter ve bir cıvıl cıvıl ile hasat edin. Yaprak örneklerini fiksatif çözeltiye batırın. Numuneleri vakum pompalama ve rotasyona tabi tutun. Dehidrasyon ve gömme işlemleri için protokolü izleyin. Polimerize numune döner bir mikrotom içinde bölümlenir. Lezyon kesitli slaytlar, çift boyama yöntemi kullanılarak mantar hiflerini ve pektin bakımından zengin hücre duvarlarını doğrulamak için monte edilir ve boyanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Çift boyama öncesi numune bölümünün bireysel adımlarının ayrıntıları. (A) Fiksasyon adımı. (B) Derecelendirilmiş etanol serilerinde dehidrasyon; yaprak dokusu her konsantrasyonda 15 dakika boyunca etanol içinde inkübe edilir. (C) Plastik kalıp içinde polimerizasyon. (D) Bir tahta parçasına yapıştırılmış polimerize numune bloğu. (E) Kesitleme işlemi için mikrotom üzerine yerleştirilmiş ahşap yapıştırılmış blok. (F) Slayttaki doku kesitleri (oklarla gösterilir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Çift boyama protokolünün bireysel adımlarının ayrıntıları. (A) Bölümleri pamuk mavisi laktofenol damlalarıyla örtün ve kızakları 45 °C'de sıcak bir plaka üzerinde ısıtın. (B-C) Damıtılmış suda yıkayarak fazla boyayı çıkarın. (D) Yıkandıktan sonra cam slaytlar üzerindeki bölümler (oklarla gösterilir). (E) Bölümleri rutenyum kırmızısı damlalarla örtün. (F-G) Damıtılmış suda yıkayarak fazla boyayı çıkarın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Kahve pas lezyonunda pektin ve mantar yapıları için histokimyasal çift boyama protokolü. (A-C) Sadece pamuk mavisi laktofenol ile boyanmış bölümler. Mantar hifleri koyu mavi renkte boyanır (oklar). Haustorium ana hücresi (Hmc) ve haustorium (Ha) koyu mavi bir renge sahiptir. (D-H) Pamuk mavisi laktofenol ve rutenyum kırmızısı kullanarak çift boyama. (D) Bir yaprak üzerindeki püstüle (Pu) genel bakış. (E-F) Pektin (pembe-kırmızı renk) ile haustorial boyun (oklar). (G) Oklar, haustorium'un pektin bakımından zengin kapsüllenmesinin başlangıcını gösterir. (H) Haustoriumun pektin (oklar) ile tam kapsüllenmesi. Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Süngerimsi parankim; Pp - palisade parankim. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Kahve mezofil dokularındaki cercosporiosis lezyonlarında pektin ve mantar yapıları için histokimyasal çift boyama protokolü. (A) Mantarsız lezyon sınırı. (B-F) Lezyonlu yaprağın kesitleri. (A) Süngerimsi parankimin pektin bakımından zengin hücre duvarlarının bütünlüğü. (B-D,F) Enfekte dokularda, Cercospora coffeicola hifleri belirgindi (oklar) ve pektik hücre duvarlarında hasara neden oldu. Kütikül (BT) (D) altındaki konidioforu doğrulamak mümkündü. Epi Aba - Epidermis abaxial; Epi Ada - Epidermis adaxial; Sp - Süngerimsi parankim; Pp - Palisade Parankim; St - Stomata. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma, biyotrofik bir patosistemde haustoriayı kapsülleyen hücre duvarlarının pektin bileşimini araştırmak için alternatif bir çift boyama histokimyasal testi sunmaktadır. Amaç ayrıca, nekrotrofik mantarı ve bunun neden olduğu hücre duvarı değişikliklerini tespit etmek için yöntemin etkinliğini göstermektir. Burada, kahve parankimi hücre duvarlarının pektini, pas mantarı Hemileia vastatrix'in hem boynunu hem de haustoriumunu kapsayabilir. Silva ve ark. ayrıca kahve-H. vastatrix pathosystem 14,29'da selüloz ve kaloz ile kapsüllenmeyi tanımlamışlardır. Savunma mekanizmaları ile ilişkili hücre duvarı polimerleri arasında pektin, bitki-patojen sisteminde önemli bir rol oynar10,11,12. Bu nedenle, pektin fonksiyonları hakkında bilgi sahibi olmak büyük histopatolojik değere sahiptir.

Cercospora coffeicola'nın neden olduğu kahvedeki Cercosporiosis, yaprak dokularına zarar verir ve sonunda hücre ölümüne yol açar. Bu semptomlar esas olarak cercosporin ve hücre duvarını parçalayan enzimlerin aktivitesinden kaynaklanır20. Rutenyum kırmızısı kullanan çalışmalar, Pseudocercospora kaki30 tarafından enfekte olmuş Trabzon hurması yaprakları üzerinde yapılan önceki bir çalışmaya benzer şekilde, hücre duvarı bütünlüğünün kaybolduğunu göstermiştir. Çift boyama yöntemi kullanılarak yapılan histopatolojik analiz, mantar hiflerinin varlığını göstermiştir ve bu analiz, hücreler arası boşluklarda mantar hiflerini tespit etmede etkilidir. Alternatif olarak, taramalı elektron mikroskobu (SEM), C. coffeicola hyphae25'i gözlemlemek için etkinlik göstermiştir; Bununla birlikte, bu tür sofistike ekipmanların mevcudiyeti, numune hazırlamanın zahmetli çalışmasıyla birlikte, sınırlayıcı bir faktördür. Ayrıca, SEM analizi, pektinin hücre duvarlarında kimyasal olarak tanınmasına izin vermez. Tersine, çift boyama pektin değişikliklerini tespit etmek için önemli bir yöntemdir. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemin, bitki-mantar etkileşiminin ultrayapısının ayrıntılarında bir artışa izin vermeyen ışık mikroskobunun çözünürlüğü ile ilgili bir sınırlaması vardır. Ayrıca, burada sunulan çift boyama yöntemi, mantar türlerini tespit etmek için spesifik değildir ve bu nedenle ek moleküler makaleler yapılmalıdır.

Numune hazırlama, bitki anatomisindeki rutin protokolleri takip eder; ancak, bazı noktalara özel dikkat gösterilmesi gerekir. Örneğin, sabitleme kritik bir adımdır. Numunelerin büyüklüğü ve hasattaki özen, iyi bir fiksasyon için gereklidir. Zaman, sıcaklık, pH ve ozmolarite bitki dokuları için çok önemlidir31. Lezyonlu yaprak dokuları hava organlarıdır ve fiksasyonu iyileştirmek için hafif bir vakuma maruz bırakılmalıdır. Glikol metakrilat (GMA) kullanımı, bir dehidrasyon çözücüsü olarak etanol gerektirir; Düzgün bir şekilde dehidre edilmeyen dokular, gömme işlemi sırasında zorluklar gösterebilir. Bu durum, bitki dokuları kahve yapraklarında olduğu gibi birçok fenolik bileşiğe sahip olduğunda kötüleşir. Ayrıca, dokuların küçük kısımlarıyla uğraşmak önemlidir; aksi takdirde, alternatif gömme yöntemleri gereklidir32.

Burada sunulan çift boyama tekniği, Marques ve ark.33 tarafından bildirilen protokolün bir uyarlamasıdır. Bu protokolde, yazarlar mantar yapılarını ve bitki hücre duvarlarını ayırt etmek için pamuk mavisi (% 5) ve% 1 safranin kullandılar. Bu teknik, Colletotrichum acutatum-narenciye yaprakları ve Guignardia citricarpa-citrus fruit 33 Arabidopsis thaliana34'teki Plasmodiophora brassicae, Vitis labrusca 35'teki Elsinoë ampelina ve diğerleri gibi farklı patosistemlerde mantar varlığını tespit etmek için yararlı oldu. Son zamanlarda, Marques ve Soares36, bitki ve mantar özelliklerini ayırt etmek için ışık ve floresan yöntemleri de dahil olmak üzere bir dizi mikroskobik teknik derledi37. Bununla birlikte, Brezilya gibi bazı bölgelerde veya ülkelerde, floresan mikroskoplar ve SEM kullanılamayabilir; Bu nedenle, ışık mikroskoplarının kullanımı, üniversitelerde ve liselerde kullanılan araştırma ve hatta didaktik yöntemler için önemli ve daha ucuz bir alternatiftir. Mantar hifaları hem bitki hem de hayvan dokularında pamuk mavisi boya36,38,39,40 ile mikroskobik olarak tespit edilmiştir. Bu, boyanın kitin bakımından zengin mantar duvarı40 ile pozitif reaksiyonu ile ilgilidir. Pamuk mavisi formülü, doku41'e mordan görevi gören ve böylece pamuk mavisi ile karıştırıldığında mantar yapısını koruyan bir çözelti olan laktofenol içerir. 

Burada, safraninin yerini almak için% 0.05 rutenyum kırmızısı kullanılmıştır. Bu çalışmada sunulan olumlu yön, hücre duvarının spesifik bir polimeri olan pektinin, önemli nitel veriler sağlamak için boyanmış olmasıdır. Rutenyum kırmızısı, pektin poliüronik asitlerin asidik gruplarını tespit etmek için kullanılan bir reaktiftir42,43,44. Pektine özgüdür ve hücre duvarının diğer karbonhidrat bileşenlerini (yani selüloz veya kalloz) lekelemez. Farklı yapısal ve biyokimyasal omurgalarda düzenlenmiş galakturonik asit zincirleri pektin 8,9,45'i oluşturur. Rutenyum kırmızısının hücre duvarına reaktivitesi, metil esterifikasyon derecesine bağlıdır11. Metil esterifikasyon derecesi, pektin metil esterazların (PME) aktivitesine bağlıdır ve bu nedenle rutenyum kırmızısı, PME aktivitesini ayırt etmek için bir araç olarak da kullanılmıştır11.

Bu nedenle, burada açıklanan çift boyama yöntemi, bitki-mantar etkileşimlerinde pektin modifikasyonlarını doğrulamak için yararlı bir araçtır. Yazarların bilgisinin en iyisine göre, bu, kahve pas mantarlarının haustorial kapsüllenmesinde pektinin ilk raporudur. İlginçtir ki, çift boyama yöntemi, mantar yapılarını gözlemlemek, pektin bakımından zengin hücre duvarına verilen hasarı tanımlamak ve mantar üreme yapılarını doğrulamak için de önemliydi. Paslar, antraknoz, cercosporiosis, smuts ve diğer biyotrofik, hemibiyotrofik ve nekrotrofik bitki-fungal etkileşimleri üzerine daha ileri histopatolojik çalışmalar, bu tekniğin farklı patosistemlerde potansiyel kullanımını araştırmak için yapılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Yazarlar, bu çalışmanın geliştirilmesine verdiği destek için Dr. Hudson W. P. de Carvalho'ya teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca ışık mikroskobu tesisini sağladığı için Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' ya minnettardır. Yazarlar, bitki materyaline lezyonlar sağladığı için Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício'ya teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3, (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5, (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204, (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9, (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169, (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6, (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173, (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18, (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94, (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119, (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60, (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21, (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49, (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9, (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159, (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160, (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169, (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37, (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65, (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48, (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12, (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171, (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).
Bitki-Mantar Etkileşiminde Pektini Tespit Etmek için Çift Boyama Yöntemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter