Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة مجهرية للكشف عن البكتين في التفاعل بين القهوة والفطريات.
Abstract
تستخدم الخلايا النباتية آليات هيكلية مختلفة ، إما تأسيسية أو مستحثة ، للدفاع عن نفسها من العدوى الفطرية. التغليف هو آلية فعالة للحث على عزل الهوستوريا الفطرية من بروتوبلاست الخلية النباتية. على العكس من ذلك ، فإن البكتين ، أحد المكونات البوليمرية لجدار الخلية ، هو هدف للعديد من الإنزيمات المحللة للبكتالوتيك في التفاعلات الضمورية. هنا ، يتم تقديم بروتوكول للكشف عن البكتين والفطريات من خلال المجهر الضوئي. يتم التحقيق في التغليف الغني بالبكتين في خلايا أوراق القهوة المصابة بفطر الصدأ Hemileia vastatrix وتعديل جدار خلية mesophyll الناجم عن Cercospora coffeicola . تم إصلاح عينات الأوراق المصابة بمحلول كارنوفسكي ، وتجفيفها ، وتضمينها في ميثاكريليت الجليكول لمدة 2-4 أيام. اتبعت جميع الخطوات عن طريق الضخ الفراغي لإزالة الهواء في المساحات بين الخلايا وتحسين عملية التضمين. تم تقسيم الكتل المدمجة إلى أقسام بسماكة 5-7 ميكرومتر ، والتي تم ترسيبها على شريحة زجاجية مغطاة بالماء وتم تسخينها لاحقا عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، كانت الشرائح ملطخة مرتين ب 5٪ قطن أزرق في لاكتوفينول للكشف عن الفطريات و 0.05٪ من الروثينيوم الأحمر في الماء للكشف عن البكتين (المجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين). تم العثور على الهوستوريا الفطرية من Hemileia vastatrix مغلفة بالبكتين. في cercosporiosis القهوة ، أظهرت خلايا mesophyll ذوبان جدران الخلايا ، ولوحظ hyphae بين الخلايا و conidiophoress. الطريقة المعروضة هنا فعالة للكشف عن الاستجابة المرتبطة بالبكتين في التفاعل بين النبات والفطريات.
Introduction
آليات الدفاع عن جدار الخلية في النباتات ضرورية لكبح العدوى الفطرية. وقد أبلغت الدراسات عن تغيرات في سمك جدار الخلية وتكوينها منذ القرن التاسععشر 1,2. يمكن أن تحدث هذه التغييرات بواسطة مسببات الأمراض الفطرية التي تحفز تكوين حليمة ، والتي تمنع الفطريات من دخول الخلية أو يمكن استخدامها لتغليف الواصلة لعزل بروتوبلاست الخلية المضيفة من الهوستوريا الفطرية. يعد إنتاج حاجز جدار خلية ديناميكي (أي الحليمات و haustorium مغلف بالكامل) مهما لتعزيز مقاومة النبات3. وقد بحثت الدراسات النسيجية المرضية على الأمراض المرتبطة بالفطريات في حدوث هذه الآليات ووصفت بوليمرات جدار الخلية والسليلوز والهيميسيلولوز (أرابينوكسيلان) والكالوز كآليات مقاومة للهجوم الفطري4،5،6،7.
جدار الخلية هو الحاجز الأول ضد هجوم الكائنات الحية الدقيقة ، مما يضعف التفاعل بين النبات والفطريات. تشكل السكريات البكتيكية جدار الخلية وتمثل حوالي 30٪ من تكوين جدار الخلية في الخلايا الأولية لنباتات اليوديكوت التي يكون فيها الهوموجالاكتورونان البوليمر الأكثر وفرة (حوالي 60٪)8. يفرز Golgi مركبات البكتين المعقدة التي تشكل سلاسل حمض الجالاكتورونيك ، والتي قد تكون أو لا تكون ميثيلية 8,9. منذ عام 2012 ، أشارت الأدبيات إلى أن درجة استرجاع ميثيل البكتين أمر بالغ الأهمية لتحديد التوافق أثناء العدوى بالإنزيمات البكتية الميكروبية 10،11،12. وبالتالي ، هناك حاجة إلى بروتوكولات للتحقق من وجود وتوزيع المركبات البكتيكية في النظم المرضية النباتية الفطرية.
تم استخدام تقنيات مختلفة للكشف عن تغليف الحليمات أو haustoria. الطرق المرجعية المستخدمة هي المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للأنسجة الثابتة والمجهر الضوئي للأنسجة الحية والثابتة. فيما يتعلق ب TEM ، أظهرت العديد من الدراسات الدور الهيكلي لتعيينات جدار الخلية في المقاومة الفطرية 13،14،15،16 ، وأن استخدام الليكتين والأجسام المضادة هو طريقة معقدة لتحديد موقع بوليمرات الكربوهيدرات 16. ومع ذلك ، تشير الدراسات إلى أن الفحص المجهري الضوئي هو نهج مهم وأن الأدوات الكيميائية النسيجية والكيميائية المناعية تسمح بفهم أفضل لتكوين الحليمات وتغليف الهوستوريوم 6,7.
تظهر الفطريات المسببة للأمراض نوعين رئيسيين من أنماط الحياة: التغذية الحيوية والميتة. تعتمد الفطريات الحيوية على الخلايا الحية لتغذيتها في حين أن الفطريات الميتة تقتل الخلايا المضيفة ، ثم تعيش في الأنسجة الميتة17. في أمريكا اللاتينية ، صدأ أوراق البن ، الناجم عن الفطريات Hemileia vastatrix ، هو مرض مهم في محاصيل البن18,19. يقدم Hemileia vastatrix سلوكا حيويا ، ومن بين التغيرات الهيكلية التي لوحظت في أنواع أو أصناف القهوة المقاومة ، تم الإبلاغ عن استجابة فرط الحساسية ، وترسب الكالوز والسليلوز واللجنين على جدران الخلايا ، وكذلك تضخم الخلايا14. على حد علم المؤلفين ، لا تقدم الأدبيات معلومات حول أهمية البكتين في مقاومة صدأ القهوة. من ناحية أخرى ، تستهدف الفطريات الميتة التي تسبب التهاب عنق الرحم البكتين عبر مجموعة من الإنزيمات المرتبطة بتدهور جدار الخلية ، مثل البكتيناز و polygalacturonase20. Cercosporiosis في البن ، الناجم عن الفطريات Cercospora coffeicola هو أيضا تهديد كبير لمحاصيل البن21,22. هذا الفطر يسبب آفات نخرية في كل من الأوراق والتوت. بعد الاختراق ، يستعمر C. coffeicola الأنسجة النباتية من خلال المسارات داخل الخلايا وبين الخلايا 23،24،25.
يبحث هذا البروتوكول في وجود هياكل فطرية وبكتين على جدران الخلايا. هذا البروتوكول مفيد لتحديد استجابة النبات المرتبطة بالبكتين (ملطخة بصبغة الروثينيوم الحمراء ، والتي هي خاصة بالمجموعات الحمضية من الأحماض البولي يورونيك من البكتين) ، التي يسببها المضيف في تفاعل حيوي مع الفطريات. كما أنه يساعد على التحقق من تأثير الفطريات الميتة على تدهور جدران الخلايا البكتيكية. تشير النتائج الحالية إلى أن طريقة التلطيخ المزدوج فعالة في التمييز بين الهياكل والمرحلة التناسلية للفطريات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد محلول التخزين المؤقت والكواشف
- تحضير 2 M كاكوديلات المخزن المؤقت عن طريق إضافة 4.28 غرام من كاكوديلات الصوديوم إلى 100 مل من الماء المقطر وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.25 مع 0.2 N HCl.
- تحضير 100 مل من محلول كارنوفسكي المثبت عن طريق خلط 10 مل من 25٪ غلوتارالدهيد المائي ، 10 مل من الفورمالديهايد المائي 10٪ ، 25 مل من 2 متر كاكوديليت المخزن المؤقت ، و 0.5 مل من 0.5 م كاكل226. تشكل الحجم إلى 100 مل بالماء المقطر.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالمحلول في الثلاجة لمدة 6 أشهر.
تنبيه: محلول التخزين المؤقت الكاكوديليت سام. لذلك ، تعامل مع الحل المثبت في غطاء الدخان أو منطقة مفتوحة. تجنب استنشاق أبخرة المحلول وارتداء القفازات أثناء المناولة. - تحضير محلول المغذيات المائية Hoagland عن طريق خلط ما يلي: 3 mM Ca(NO 3) 2.4H2O ، 2 mM NH 4 H 2 PO 4 ، 5 mM KH 2 PO 4 ، 2 mM MgSO 4.7H 2 O ، 9.07 mM MnSO 4 ، 0.765 mM ZnSO 4.7H 2 O، 46.4 mM H 3 BO 3 ، 0.09 mM Na2MoO4. H2O و 0.01 mM CuSO 4 و 36 mM FeSO4.7H 2O مثل الحديد-EDTA (حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك) 27.
2. عينات نباتية وتلقيح الفطريات
ملاحظة: بالنسبة للتجارب على الأوراق المتأثرة بصدأ القهوة ، خمس شتلات عمرها 2 شهر من Coffee arabica cv. تم زراعة Catuaí والاحتفاظ بها في دفيئة في مركز الطاقة النووية في الزراعة (CENA) بجامعة ساو باولو ، بيراسيكابا ، ولاية ساو باولو ، البرازيل.
- تنمو نباتات البن في أواني بلاستيكية سعة 500 مل مملوءة بمحلول مغذيات Hoagland المائي (درجة الحموضة ~ 5.5) لمدة 4 أشهر في غرفة نمو محفوظة عند 27 ± 3 درجات مئوية مع فترة ضوئية مدتها 12 ساعة تم إنشاؤها بواسطة مصابيح LED عند تدفق الفوتون 250 ميكرومول s-1 m-2. استبدل محلول المغذيات Hoagland كل أسبوع لمدة 4 أشهر.
- تلقيح أربع أوراق موسعة من خمسة نباتات على أسطحها المحورية مع 1 × 103 H. vastatrix uredospores باتباع الطريقة الموضحة في المرجع28. بعد التلقيح ، احتفظ بالنباتات لمدة 48 ساعة في الظلام عن طريق تغطيتها بكيس بلاستيكي أسود. حصاد الآفات بعد 30 يوما من التلقيح.
- الآفات المميزة للحصاد التي تسببها سيركوسبورا كوفيكولا من كوفيا أرابيكا السيرة الذاتية. تقع نباتات أوباتا (الإحداثيات: -22.906506126269942, -47.015075902025266) في المعهد البيولوجي، كامبيناس، ولاية ساو باولو، البرازيل. قبل معالجة العينة ، قم بتحليل الآفات في المجهر المجسم للتحقق من وجود القهوة C. coffeicola conidia. ثم ، قم بتركيب بعض الشرائح باستخدام conidia لتأكيد مسببات المرض22.
3. حصاد العينات وتثبيتها وجفافها
- باستخدام مشرط وملقط ، قم بحصاد عينة من الأوراق ~ 10 مم2 في المنطقة الوسطى من الآفة (بقع صفراء; الشكل 1) واغمره في 30 مل من محلول كارنوفسكي المثبت (الشكل 1 والشكل 2A). يمكن أن تتم خطوة التثبيت في الثلاجة لمدة 48 ساعة.
- لمدة أربع مرات على الأقل ، أخضع عينة الورقة لفراغ منخفض (500-600 مللي بار) باستخدام مضخة زيت لمدة 15 دقيقة لكل منها لزيادة نفاذية المحلول المثبت في أنسجة الأوراق. نفذ هذه الخطوة مع تدوير العينة (الشكل 1).
- بعد التثبيت ، اغسل عينة الورقة ثلاث مرات في مخزن مؤقت كاكوديليت 0.5 M (الرقم الهيدروجيني 7.2) مخفف في الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منها ثم انقلها إلى سلسلة إيثانولية متدرجة (30٪ ، 50٪ ، 70٪ ، 90٪ (2x) ، و 100٪ (2x)) لمدة 15 دقيقة عند كل تركيز إيثانول (الشكل 1 والشكل 2B).
4. Historesin إجراء التضمين
- انقل العينات تدريجيا إلى ميثاكريليت الجليكول (GMA) في ثلاث خطوات ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. أولا ، اصنع المحلول A عن طريق خلط مسحوق GMA (1 جم) مع 100 مل من الراتنج الأساسي (مجموعة historein ؛ جدول المواد) تحت التحريض المغناطيسي ، ثم اتبع الخطوات التالية.
- اغمر العينات في 1: 2 الحل A: 100٪ الإيثانول لمدة 3 ساعات.
- اغمر العينات في 1: 1 المحلول A: 100٪ الإيثانول لمدة 3 ساعات.
- اغمر العينات في راتنج أساسي نقي لمدة 2-4 أيام. خلال هذه الخطوة، قم بإخضاع العينات لفراغ منخفض أربع مرات على الأقل في اليوم لمدة 15 دقيقة متبوعة بالدوران.
5. البلمرة
ملاحظة: تتطلب عملية البلمرة قوالب بلاستيكية سعة 1.2 مل وراتنج أساسي ومصلب (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل المجموعة التجارية).
- امزج 15 مل من المحلول A (الخطوة 4.1) مع 1 مل من المصلب في كوب مع الدوران لمدة دقيقتين لإنتاج محلول البلمرة (الحل B).
- ضع 1.2 مل من محلول البلمرة (المحلول B) في قوالب بلاستيكية. باستخدام معول خشبي ، انقل عينات الأوراق المصابة من الراتنج الأساسي النقي إلى المحلول B (الشكل 2C). تجنب استخدام الملقط لأنها يمكن أن تسبب سحق الأنسجة.
- تأكد من توجيه عينات الأوراق بسرعة عموديا على القوالب البلاستيكية حيث يصبح المحلول B لزجا بسرعة في غضون 5 دقائق. يمكن وضع أكثر من عينة واحدة من الأوراق المصابة في قالب واحد.
ملاحظة: يوصى بممارسة الخطوة المذكورة أعلاه عدة مرات قبل التقدم بطلب للحصول على العديد من العينات. عندما يكون هناك العديد من العينات ، يختلف وقت البلمرة بين القوالب وقد يكون من الصعب تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق. - عندما يتم تحقيق الاتجاه العمودي لعينات الأوراق ، انتظر لمدة 30 دقيقة ، ثم انقل القالب البلاستيكي إلى غرفة بلاستيكية أو زجاجية تحتوي على هلام السيليكا لمنع الرطوبة. انتظر 2-3 ساعات للبلمرة.
- بمجرد بلمرة الراتنج وعينة الورقة بعد فترة 2-3 ساعات ، افصل الكتلة الناتجة عن القالب البلاستيكي عن طريق صنفرة قاعدة الكتلة بملف صنفرة. ثم ، قم بلصق الكتلة على قطعة من الخشب (الشكل 2D).
6. التقسيم
- باستخدام ميكروتوم دوار مجهز بشفرات فولاذية 8 سم (الشكل 2E) ، قم بقطع الكتلة إلى أقسام بسماكة 5 ميكرومتر. ضع الأقسام على شرائح زجاجية مغطاة بالماء المقطر. انقل الشرائح مع الأقسام العائمة فوق الماء إلى صفيحة ساخنة عند 40 درجة مئوية لتجف وتعزز التصاق الأقسام بالشرائح الزجاجية.
- بعد التجفيف (الشكل 2F) ، قم بتسمية الشرائح الزجاجية باسم مرجع الكتلة ورقم الشريحة.
7. عملية تلطيخ مزدوجة
- غطي الأقسام ب 2 مل من 5٪ قطن أزرق في لاكتوفينول (40٪ جليسرين ، 20٪ فينول ، و 20٪ حمض اللاكتيك في الماء) وقم بتسخينها على صفيحة ساخنة عند 45 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (الشكل 3A).
- قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر (الشكل 3B-D).
- وصمة عار مع 2 مل من 0.01 ٪ الروثينيوم الأحمر في الماء لمدة 1 دقيقة (الشكل 3E).
- قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق غسل الشريحة ثلاث مرات في كوب مملوء بالماء المقطر (الشكل 3F ، G).
- ضع قطرة من الماء المقطر فوق الأقسام وقم بتغطية الأقسام بغطاء 24 مم × 60 مم لإجراء تحليل مجهري خفيف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كشف تلطيخ لاكتوفينول أزرق قطني على القسم المدمج في GMA عن وجود العديد من الهياكل الفطرية بين وداخل خلايا ميزوفيل القهوة في كل من التفاعلات الفطرية الحيوية والميتة.
في النظام المرضي الحيوي ، عند تلطيخه باستخدام طريقة التلطيخ المزدوج ، تظهر Hyphae Hemileia vastatrix التي تحتوي على جدران الخلايا ومحتوى البروتوبلاستيدات الكثيف باللون الأزرق الداكن في كل من الحمة الإسفنجية و palisade (الشكل 4A ، B). تظهر الخلية الأم الهوستوريوم (Hmc) والهوستوريا أيضا لونا أزرق داكن قويا (الشكل 4C). عند تلطيخ الروثينيوم باللون الأحمر ، يتم تحديد التوزيع الفطري في المساحات بين الخلايا بوضوح (الشكل 4D). وجود HMC الأزرق الداكن يساعد على الكشف عن منطقة العدوى. أثناء التفاعل ، كسر H. vastatrix Hmc جدار الخلية المضيفة وطور رقبة هاوستوريال يمكن أن تكون محاطة بمركبات بكتيكية (الشكل 4E ، F). ومع ذلك ، فإن التغليف الغني بالبكتين (اللون الوردي والأحمر) للرقبة الهوستوريالية غير قادر على منع التكوين الهاوستوري (الشكل 4E ، F). في بعض الحالات ، قام التغليف الغني بالبكتين بتغليف الهاوستوريوم بشكل غير كامل (الشكل 4G) وفي بعض الحالات ، يتم تغليف الهاوستوريوم بالكامل (الشكل 4H).
في التفاعل النخري ، كان بروتوكول التلطيخ المزدوج مفيدا أيضا للتحقق من تفاعل Cercospora coffeicola مع أنسجة ميزوفيل القهوة. عند حدود الآفة ، حيث لا توجد الفطريات ، حافظ جدار الخلية الغني بالبكتين على سلامته (الشكل 5A). أظهرت طريقة التلطيخ المزدوج وجود hyphae بين الخلايا (الشكل 5B ، C). في مناطق التفاعل ، بدا أن جدران خلايا البكتين تفقد سلامتها بسبب الذوبان (الشكل 5B ، C). تم العثور على الهياكل التناسلية ، مثل conidiophore ، في البشرة المحورية (الشكل 5D). في الغرفة الفرعية ، تم العثور على C. coffeicola hyphae كهياكل تجعيد. يبدو أن حمة الباليسيد في المنطقة المصابة تخضع لتحلل جدار الخلية (الشكل 5E).
الشكل 1: تفاصيل الخطوات الفردية في بروتوكول حصاد الأنسجة المصابة. حصاد قطعة من الآفة مع مشرط والملقط. اغمر عينات الأوراق في المحلول المثبت. إخضاع العينات للضخ الفراغي والدوران. اتبع البروتوكول الخاص بعمليات الجفاف والتضمين. يتم تقسيم العينة المبلمرة في ميكروتوم دوار. يتم تركيب الشرائح ذات أقسام الآفات وتلوينها للتحقق من الهيفاي الفطرية وجدران الخلايا الغنية بالبكتين باستخدام طريقة التلطيخ المزدوج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تفاصيل الخطوات الفردية لقسم العينة قبل التلطيخ المزدوج. (أ) خطوة التثبيت. (ب) الجفاف في سلسلة الإيثانول المتدرجة؛ يتم احتضان أنسجة الأوراق في الإيثانول لمدة 15 دقيقة عند كل تركيز. (ج) البلمرة داخل القالب البلاستيكي. (د) كتلة من العينة المبلمرة الملصقة على قطعة من الخشب. (ه) كتلة لاصقة بالخشب موضوعة على الميكروتوم لعملية التقسيم. (و) مقاطع الأنسجة على الشريحة (يشار إليها بالأسهم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تفاصيل الخطوات الفردية لبروتوكول التلطيخ المزدوج. (أ) قم بتغطية الأقسام بقطرات من اللاكتوفينول الأزرق القطني وقم بتسخين الشرائح على صفيحة ساخنة عند 45 درجة مئوية. (B-C) قم بإزالة الصبغة الزائدة عن طريق الغسيل في الماء المقطر. (د) أقسام على الشرائح الزجاجية بعد الغسيل (يشار إليها بالأسهم). (ه) تغطية الأقسام بقطرات من الروثينيوم الأحمر. (F-G) إزالة الصبغة الزائدة عن طريق الغسيل في الماء المقطر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بروتوكول التلطيخ المزدوج الكيميائي النسيجي للبكتين والهياكل الفطرية في آفة صدأ القهوة. (أ-ج) أقسام ملطخة فقط مع لاكتوفينول القطن الأزرق. الضجيج الفطري ملطخ باللون الأزرق الداكن (السهام). الخلية الأم الهوستوريوم (Hmc) والهاوستوريوم (Ha) لهما لون أزرق داكن. (D-H) تلطيخ مزدوج باستخدام لاكتوفينول أزرق قطني وأحمر روثينيوم. (د) نظرة عامة على البثرة (Pu) على ورقة. (E-F) الرقبة Haustorial (الأسهم) مع البكتين (اللون الوردي والأحمر). (ز) تشير الأسهم إلى بداية تغليف الهوستوريوم الغني بالبكتين. (ح) التغليف الكامل للهوستوريوم بواسطة البكتين (الأسهم). Epi Aba - البشرة اللعينة. Epi Ada - البشرة adaxial. Sp - حمة إسفنجية. Pp - حمة باليسيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: بروتوكول التلطيخ المزدوج الكيميائي النسيجي للبكتين والهياكل الفطرية في آفات cercosporiosis في أنسجة ميزوفيل القهوة. (أ) حدود الآفة بدون فطريات. (ب-و) المقاطع العرضية للورقة المصابة. (أ) سلامة جدران الخلايا الغنية بالبكتين في الحمة الإسفنجية. (B-D,F) في الأنسجة المصابة ، كانت الهيفاي Cercospora coffeicola واضحة (السهام) وتسببت في تلف جدران الخلايا البكتيكية. كان من الممكن التحقق من الكونيديوفور تحت البشرة (CT) (D). Epi Aba - البشرة اللعينة. Epi Ada - البشرة adaxial. Sp - حمة إسفنجية. Pp - باليسيد بارينشيما. سانت - ستوماتا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقدم هذا العمل اختبارا نسيجيا كيميائيا بديلا مزدوج التلطيخ للتحقيق في تكوين البكتين لجدران الخلايا التي تغلف الهوستوريا في نظام مرضي حيوي. والهدف من ذلك أيضا هو إثبات فعالية الطريقة للكشف عن الفطريات الميتة وتغيرات جدار الخلية الناجمة عنها. هنا ، يمكن أن يغلف البكتين من جدران خلايا حمة القهوة كلا من الرقبة والهوستوريوم من فطر الصدأ Hemileia vastatrix. وصف سيلفا وآخرون أيضا التغليف بواسطة السليلوز والكالوز في نظام القهوة H. vastatrix المرضي14,29. من بين بوليمرات جدار الخلية المرتبطة بآليات الدفاع ، يلعب البكتين دورا مهما في نظام مسببات الأمراض النباتية 10،11،12. لذلك ، فإن معرفة وظائف البكتين ذات قيمة نسيجية مرضية كبيرة.
Cercosporiosis في القهوة ، الناجمة عن Cercospora coffeicola ، تدمر أنسجة الأوراق وتؤدي في النهاية إلى موت الخلايا. تحدث هذه الأعراض بشكل رئيسي بسبب نشاط سيركوسبورين وإنزيمات تحلل جدار الخلية20. أظهرت الدراسات التي استخدمت الروثينيوم الأحمر فقدان سلامة جدار الخلية ، على غرار دراسة سابقة على أوراق البرسيمون المصابة ب Pseudocercospora kaki30. أظهر التحليل النسيجي المرضي باستخدام طريقة التلطيخ المزدوج وجود hyphae الفطرية وهذا التحليل فعال للكشف عن hyphae الفطرية في المساحات بين الخلايا. بدلا من ذلك ، أظهر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) فعالية لمراقبة C. coffeicola hyphae25 ؛ ومع ذلك ، فإن توافر هذه المعدات المتطورة ، إلى جانب العمل الشاق لإعداد العينات ، هو عامل مقيد. علاوة على ذلك ، لا يسمح تحليل SEM بالتعرف الكيميائي على البكتين في جدران الخلايا. على العكس من ذلك ، يعد التلطيخ المزدوج طريقة مهمة للكشف عن تغيرات البكتين. ومع ذلك ، فإن الطريقة الموصوفة هنا لها قيود فيما يتعلق بدقة الفحص المجهري الضوئي الذي لا يسمح بزيادة في تفاصيل البنية الفائقة للتفاعل بين النبات والفطريات. أيضا ، فإن طريقة التلطيخ المزدوج المعروضة هنا ليست محددة للكشف عن الأنواع الفطرية ، وبالتالي يجب إجراء مقالات جزيئية إضافية.
يتبع إعداد العينة بروتوكولات روتينية في تشريح النبات. ومع ذلك ، تحتاج بعض النقاط إلى اهتمام خاص. على سبيل المثال ، التثبيت هو خطوة حاسمة. حجم العينات والرعاية في حصادها ضرورية للتثبيت الجيد. الوقت ودرجة الحرارة ودرجة الحموضة والأسمولية ضرورية للأنسجة النباتية31. أنسجة الأوراق المصابة هي أعضاء هوائية ويجب أن تخضع لفراغ خفيف لتحسين التثبيت. يتطلب استخدام ميثاكريلات الجليكول (GMA) الإيثانول كمذيب للجفاف. الأنسجة التي لا يتم تجفيفها بشكل صحيح يمكن أن تشكل صعوبات أثناء عملية التضمين. تزداد هذه الحالة سوءا عندما تحتوي الأنسجة النباتية على العديد من المركبات الفينولية ، كما هو الحال في أوراق القهوة. علاوة على ذلك ، من المهم التعامل مع أجزاء صغيرة من الأنسجة. خلاف ذلك ، هناك حاجة إلى طرق تضمين بديلة32.
تقنية التلطيخ المزدوج المعروضة هنا هي تكييف للبروتوكول الذي أبلغ عنه ماركيز وآخرون 33. في هذا البروتوكول ، استخدم المؤلفون القطن الأزرق (5٪) و 1٪ من السافرانين للتمييز بين الهياكل الفطرية وجدران الخلايا النباتية. كانت هذه التقنية مفيدة للكشف عن وجود الفطريات في الأنظمة المرضية المختلفة ، مثل بتلات كوليتوتريشوم أكوتاتوم الحمضيات و Guignardia citricarpa-citrus fruit33Plasmodiophora brassicae في Arabidopsis thaliana34 ، Elsinoë ampelina في Vitis labrusca35 ، وغيرها. في الآونة الأخيرة ، قام ماركيز وسواريس36بتجميع سلسلة من التقنيات المجهرية ، بما في ذلك طرق الضوء والتألق ، للتمييز بين ميزات النبات والفطريات37. ومع ذلك ، في بعض المناطق أو البلدان ، مثل البرازيل ، قد لا تكون المجاهر الفلورية و SEM متاحة. لذلك ، فإن استخدام المجاهر الضوئية هو بديل مهم وأرخص للبحث وحتى الأساليب التعليمية المستخدمة في الجامعات والمدارس الثانوية. تم الكشف عن hyphae الفطرية مجهريا في كل من الأنسجة النباتية والحيوانية بواسطة صبغة القطن الزرقاء 36،38،39،40. يرتبط هذا برد الفعل الإيجابي للصبغة مع الجدار الفطري الغني بالكيتين40. تتضمن تركيبة القطن الأزرق لاكتوفينول ، وهو محلول يعمل كمادة للأنسجة41 ، وبالتالي يحافظ على البنية الفطرية عند مزجه مع أزرق قطني.
هنا ، تم استخدام 0.05 ٪ من الروثينيوم الأحمر ليحل محل السافرانين. الجانب الإيجابي المقدم في هذه الدراسة هو أن البكتين ، وهو بوليمر محدد لجدار الخلية ، كان ملطخا لتوفير بيانات نوعية مهمة. الروثينيوم الأحمر هو كاشف يستخدم للكشف عن المجموعات الحمضية من أحماض البكتين البولي يورونيك42،43،44. وهو خاص بالبكتين ولا يلطخ مكونات الكربوهيدرات الأخرى في جدار الخلية (أي السليلوز أو الكاللوز). سلاسل من أحماض الجالاكتورونيك مرتبة في مختلف العمود الفقري الهيكلية والكيميائية الحيوية تشكل البكتين8،9،45. يعتمد تفاعل الروثينيوم الأحمر على جدار الخلية على درجة أسترة الميثيل11. تعتمد درجة استرجاع الميثيل على نشاط إستراز ميثيل البكتين (PME) ، وبالتالي تم استخدام أحمر الروثينيوم أيضا كأداة للتمييز بين نشاط PME11.
وبالتالي ، فإن طريقة التلطيخ المزدوج الموضحة هنا هي أداة مفيدة للتحقق من تعديلات البكتين في تفاعلات النباتات والفطريات. على حد علم المؤلفين ، هذا هو التقرير الأول عن البكتين في التغليف الهوستوري لفطريات صدأ القهوة. ومن المثير للاهتمام أن طريقة التلطيخ المزدوج كانت مهمة أيضا لمراقبة الهياكل الفطرية ، ووصف الأضرار التي لحقت بجدار الخلايا الغنية بالبكتين ، والتحقق من الهياكل التناسلية الفطرية. وينبغي إجراء المزيد من الدراسات النسيجية المرضية على الصدأ والجمرة الخبيثة وداء السيركوسبوريوسيس والتفحم وغيرها من التفاعلات بين النباتات والفطريات النباتية والميتة والمستحثة بيولوجيا للتحقيق في الاستخدام المحتمل لهذه التقنية في النظم المرضية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور هدسون دبليو بي دي كارفالهو على الدعم لتطوير هذا العمل. كما أعرب المؤلفون عن امتنانهم لمختبر المجهر الإلكتروني "البروفيسور إليوت واتانابي كيتاجيما" لتوفيره مرفق الفحص المجهري الضوئي. يشكر المؤلفون الدكتور فلافيا رودريغز ألفيس باتريسيو على تزويد المواد النباتية بالآفات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blades DB80 HS | Leica | 14035838383 | Sectioning |
| Cacodylate buffer | EMS | # 11652 | Fixation |
| Cotton Blue Lactophenol | Metaquímica | 70SOLSIG024629 | Staining |
| Formaldehyde | EMS | #15712 | Fixation |
| Glutaraldehyde | EMS | #16216 | Fixation |
| Historesin Kit | Technovit /EMS | #14653 | Historesin for embedding |
| Hot plate | Dubesser | SSCD25X30-110V | Staining |
| Microscopy | Zeiss | #490040-0030-000 | Image capture |
| Microtome (Leica RM 2540) | Leica | 149BIO000C1 14050238005 | Sectioning |
| Plastic molding cup tray | EMS | 10176-30 | Staining |
| Ruthenium red | LABHouse | #006004 | Staining |
| Software Axion Vision | Zeiss | #410130-0909-000 | Image capture |
| Vaccum pump | Prismatec | 131 TIPO 2 V.C. | Fixation |
References
- deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
- Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
- Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
- Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
- Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
- Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
- Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
- Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
- Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
- Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
- Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
- Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
- Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
- Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
- An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
- Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
- Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
- Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
- Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
- Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
- Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
- Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
- Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
- Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
- Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
- Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
- Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
- Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
- Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
- Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
- Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
- Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
- Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
- Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
- Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
- Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
- Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
- Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
- Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
- Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
- Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
- Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
- Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).
