Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Méthode de double coloration pour détecter la pectine dans l’interaction plante-champignon

Published: February 4, 2022 doi: 10.3791/63432
Automatic Translation
1, 2
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences, University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture, University of São Paulo

Summary

Ce protocole décrit une méthode microscopique pour détecter la pectine dans l’interaction café-champignon.

Abstract

Les cellules végétales utilisent différents mécanismes structurels, constitutifs ou inductibles, pour se défendre contre les infections fongiques. L’encapsulation est un mécanisme inductible efficace pour isoler l’haustoria fongique du protoplaste des cellules végétales. Inversement, la pectine, l’un des composants polymères de la paroi cellulaire, est la cible de plusieurs enzymes pectolytiques dans les interactions nécrotrophes. Ici, un protocole pour détecter la pectine et les hyphes fongiques par microscopie optique est présenté. L’encapsulation riche en pectine dans les cellules des feuilles de café infectées par le champignon de rouille Hemileia vastatrix et la modification de la paroi cellulaire mésophylle induite par Cercospora coffeicola sont étudiées . Les échantillons de feuilles lésionnées ont été fixés avec la solution de Karnovsky, déshydratés et incorporés dans du méthacrylate de glycol pendant 2 à 4 jours. Toutes les étapes ont été suivies par pompage sous vide pour éliminer l’air dans les espaces intercellulaires et améliorer le processus d’intégration. Les blocs incorporés ont été sectionnés en sections de 5 à 7 μm d’épaisseur, qui ont été déposées sur une lame de verre recouverte d’eau et ensuite chauffées à 40 ° C pendant 30 minutes. Ensuite, les lames ont été doublement colorées avec 5% de bleu de coton dans le lactophénol pour détecter le champignon et 0,05% de ruthénium rouge dans l’eau pour détecter la pectine (groupes acides d’acides polyuroniques de pectine). On a découvert que les haustoria fongiques d’Hemileia vastatrix étaient encapsulées par la pectine. Dans la cercosposporose du café, des cellules mésophylles ont présenté une dissolution des parois cellulaires, et des hyphes intercellulaires et des conidiophores ont été observés. La méthode présentée ici est efficace pour détecter une réponse associée à la pectine dans l’interaction plante-champignon.

Introduction

Les mécanismes de défense de la paroi cellulaire chez les plantes sont cruciaux pour contenir l’infection fongique. Des études ont rapporté des changements dans l’épaisseur et la composition de la paroi cellulaire depuis le19ème siècle 1,2. Ces changements peuvent être induits par un agent pathogène fongique qui stimule la formation d’une papille, ce qui empêche les champignons d’entrer dans la cellule ou pourrait être utilisé pour encapsuler les hyphes afin d’isoler le protoplaste de la cellule hôte de l’haustoria fongique. La production d’une barrière dynamique de la paroi cellulaire (c.-à-d. papilles et haustorium entièrement encastré) est importante pour favoriser la résistance des plantes3. Des études histopathologiques sur les maladies liées aux champignons ont étudié l’apparition de ces mécanismes et ont décrit les polymères de la paroi cellulaire, la cellulose, l’hémicellulose (arabinoxylanes) et le callose comme mécanismes de résistance à l’attaque fongique 4,5,6,7.

La paroi cellulaire est la première barrière contre les attaques micro-organismes, altérant l’interaction plante-champignon. Les polysaccharides pectiques composent la paroi cellulaire et représentent environ 30% de la composition de la paroi cellulaire dans les cellules primaires des plantes eudicot dans lesquelles les homogalacturones sont le polymère le plus abondant (environ 60%)8. Le Golgi sécrète des composés complexes de pectine qui composent les chaînes d’acide galacturonique, qui peuvent ou non être méthylées 8,9. Depuis 2012, la littérature a souligné que le degré d’estérification de la méthyle de pectine est essentiel pour déterminer la compatibilité lors de l’infection par des enzymes pectiques microbiennes 10,11,12. Ainsi, des protocoles sont nécessaires pour vérifier la présence et la distribution de composés pectiques dans les pathosystèmes plantes-champignons.

Diverses techniques ont été utilisées pour détecter l’encapsulation des papilles ou des haustoria. Les méthodes de référence utilisées sont la microscopie électronique à transmission (TEM) des tissus fixes et la microscopie optique des tissus vivants et fixes. En ce qui concerne la TEM, plusieurs études ont démontré le rôle structurel des appositions de paroi cellulaire dans la résistance fongique 13,14,15,16, et que l’utilisation de lectines et d’anticorps est une méthode complexe pour localiser les polymères glucidiques16. Cependant, des études montrent que la microscopie optique est une approche importante et que les outils histochimiques et immunohistochimiques permettent de mieux comprendre la composition des papilles et de l’enveloppe haustorium 6,7.

Les champignons pathogènes présentent deux principaux types de modes de vie: biotrophe et nécrotrophe. Les champignons biotrophes dépendent des cellules vivantes pour leur nutrition tandis que les champignons nécrotrophes tuent les cellules hôtes, puis vivent dans les tissus morts17. En Amérique latine, la rouille des feuilles de café, causée par le champignon Hemileia vastatrix, est une maladie importante dans les cultures de café18,19. Hemileia vastatrix présente un comportement biotrophe et, parmi les changements structurels observés chez les espèces de café ou les cultivars résistants, une réponse d’hypersensibilité, un dépôt de callose, de cellulose et de lignine sur les parois cellulaires, ainsi qu’une hypertrophie cellulaire14 ont été rapportés. À la connaissance des auteurs, la littérature ne rapporte pas d’informations sur l’importance de la pectine dans la résistance à la rouille du café. D’autre part, les champignons nécrotrophes qui causent la cércospose ciblent la pectine via un ensemble d’enzymes associées à la dégradation de la paroi cellulaire, telles que les pectinases et la polygalacturonase20. La cercosposporose dans le café, causée par le champignon Cercospora coffeicola est également une menace majeure pour les cultures de café21,22. Ce champignon provoque des lésions nécrotiques dans les feuilles et les baies. Après pénétration, C. coffeicola colonise les tissus végétaux par les voies intracellulaires et intercellulaires 23,24,25.

Le présent protocole étudie la présence de structures fongiques et de pectine sur les parois cellulaires. Ce protocole est utile pour identifier la réponse végétale associée à la pectine (colorée avec du colorant rouge ruthénium, qui est spécifique aux groupes acides d’acides polyuroniques de pectine), induite par l’hôte dans une interaction biotrophique avec un champignon. Il aide également à vérifier l’effet des champignons nécrotrophes sur la dégradation des parois cellulaires pectiques. Les résultats actuels indiquent que la méthode de double coloration est efficace pour discriminer les structures et la phase de reproduction des champignons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation de la solution tampon et des réactifs

  1. Préparer un tampon de cacodylate de 2 M en ajoutant 4,28 g de cacodylate de sodium à 100 mL d’eau distillée et ajuster le pH à 7,25 avec 0,2 N HCl.
  2. Préparer 100 mL de la solution fixative de Karnovsky en mélangeant 10 mL de glutaraldéhyde aqueux à 25 %, 10 mL de formaldéhyde aqueux à 10 %, 25 mL de tampon cacodylate 2 M et 0,5 mL de CaCl2 26 à 0,5 M. Porter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée.
    REMARQUE: La solution peut être conservée au réfrigérateur pendant 6 mois.
    ATTENTION : La solution tampon de cacodylate est toxique; par conséquent, manipulez la solution fixatrice dans une hotte ou dans un espace ouvert. Évitez d’inhaler les vapeurs de la solution et portez des gants lors de la manipulation.
  3. Préparer la solution nutritive aqueuse hoagland en mélangeant les éléments suivants :3 mM Ca(NO 3)2,4H2 O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO 4,7H2O, 9,07 mM MnSO4, 0,765 mM ZnSO4,7H 2O, 46,4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 et 36 mM FeSO4,7H 2O sous forme de fer-EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique)27.

2. Échantillons de plantes et inoculation de champignons

REMARQUE: Pour les expériences sur les feuilles affectées par la rouille du café, cinq plants de café arabica cv âgés de 2 mois. Les catuaí ont été cultivés et conservés dans une serre au Centre de l’énergie nucléaire dans l’agriculture (CENA) de l’Université de São Paulo, Piracicaba, État de São Paulo, Brésil.

  1. Cultivez des plants de café dans des pots en plastique de 500 mL remplis de solution nutritive aqueuse Hoagland (pH d’environ 5,5) pendant 4 mois dans une chambre de croissance maintenue à 27 ± 3 °C avec une photopériode de 12 h créée par des lampes LED au flux de photons de 250 photons μmol s-1 m-2. Remplacez la solution nutritive Hoagland chaque semaine pendant 4 mois.
  2. Inoculer quatre feuilles expansées de cinq plantes sur leurs surfaces abaxiales avec 1 x 103 H. vastatrix uredospores selon la méthode décrite à la référence28. Après l’inoculation, gardez les plantes pendant 48 h dans l’obscurité en les recouvrant d’un sac en plastique noir. Récoltez les lésions 30 jours après l’inoculation.
  3. Lésions caractéristiques de la récolte causées par Cercospora coffeicola de Coffea arabica cv. Plantes d’Obatã situées (coordonnées: -22.906506126269942, -47.015075902025266) à l’Institut biologique, Campinas, État de São Paulo, Brésil. Avant de traiter l’échantillon, analysez les lésions dans un stéréomicroscope pour vérifier la présence de C . coffeicola conidia de café. Ensuite, montez quelques diapositives avec les conidies pour confirmer l’étiologie de la maladie22.

3. Récolte, fixation et déshydratation des échantillons

  1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler, prélever un échantillon d’environ 10 mm2 feuilles dans la région médiane de la lésion (taches jaunes; Graphique 1) et l’immerger dans 30 mL de solution fixatrice de Karnovsky (Figure 1 et Figure 2A). L’étape de fixation peut avoir lieu dans un réfrigérateur pendant 48 h.
  2. Pendant au moins quatre fois, soumettre l’échantillon de feuilles à un vide faible (500-600 mBar) à l’aide d’une pompe à huile pendant 15 minutes chacune pour augmenter la perméabilité de la solution fixatrice dans le tissu foliaire. Effectuez cette étape avec rotation de l’échantillon (Figure 1).
  3. Après fixation, laver l’échantillon de feuilles trois fois dans un tampon cacodylate de 0,5 M (pH 7,2) dilué dans de l’eau distillée pendant 5 min chacun, puis le transférer dans une série éthanolique graduée (30 %, 50 %, 70 %, 90 % (2x) et 100 % (2x)) pendant 15 min à chaque concentration d’éthanol (figure 1 et figure 2B).

4. Procédure d’intégration d’Historesin

  1. Transférer progressivement les échantillons en méthacrylate de glycol (GMA) en trois étapes, en suivant les instructions du fabricant. Tout d’abord, faites la solution A en mélangeant la poudre de GMA (1 g) avec 100 mL de résine de base (kit d’historésine; Tableau des matériaux) sous agitation magnétique, puis suivez les étapes ci-dessous.
    1. Immerger les échantillons dans la Solution A 1:2 : 100% éthanol pendant 3 h.
    2. Immerger les échantillons dans la Solution A 1:1 : 100 % d’éthanol pendant 3 h.
    3. Immergez les échantillons dans une résine de base pure pendant 2 à 4 jours. Au cours de cette étape, soumettez les échantillons à un vide faible au moins quatre fois par jour pendant 15 minutes, suivi d’une rotation.

5. Polymérisation

REMARQUE: Le processus de polymérisation nécessite des moules en plastique de 1,2 mL, de la résine de base et un durcisseur (voir le tableau des matériaux pour les détails du kit commercial).

  1. Mélanger 15 mL de solution A (étape 4.1) avec 1 mL du durcisseur dans un bécher avec rotation pendant 2 min pour produire la solution de polymérisation (solution B).
  2. Mettre 1,2 mL de la solution de polymérisation (Solution B) dans des moules en plastique. À l’aide d’un pic en bois, transférer les échantillons de feuilles lésionnées de la résine de base pure à la solution B (figure 2C). Évitez d’utiliser une pince à épiler car elles peuvent provoquer un écrasement des tissus.
  3. Assurez-vous d’orienter rapidement les échantillons de feuilles perpendiculairement aux moules en plastique car la solution B devient rapidement visqueuse en 5 minutes. Plus d’un échantillon de feuilles sectionnées peut être placé dans un seul moule.
    REMARQUE: Il est recommandé de pratiquer l’étape ci-dessus plusieurs fois avant de demander de nombreux échantillons. Lorsqu’il y a beaucoup d’échantillons, le temps de polymérisation est différent entre les moules et l’orientation perpendiculaire des échantillons de feuilles peut être difficile à réaliser.
  4. Lorsque l’orientation perpendiculaire des échantillons de feuilles est atteinte, attendez 30 minutes, puis transférez le moule en plastique dans une chambre en plastique ou en verre contenant du gel de silice pour éviter l’humidité. Attendez 2-3 h pour la polymérisation.
  5. Une fois que la résine et l’échantillon de feuille sont polymérisés après la période de 2-3 h, détachez le bloc résultant du moule en plastique en ponçant la base du bloc avec une lime de ponçage. Ensuite, collez le bloc sur un morceau de bois (Figure 2D).

6. Sectionnement

  1. À l’aide d’un microtome rotatif équipé de lames en acier de 8 cm (Figure 2E), coupez le bloc en sections de 5 μm d’épaisseur. Placez les sections sur des lames de verre recouvertes d’eau distillée. Transférer les lames avec les sections flottant au-dessus de l’eau sur une plaque chauffante à 40 °C pour sécher et favoriser l’adhérence des sections aux lames de verre.
  2. Après séchage (Figure 2F), étiquetez les lames de verre avec le nom de référence du bloc et le numéro de la diapositive.

7. Processus de double coloration

  1. Couvrir les sections avec 2 mL de bleu de coton à 5 % de lactophénol (40 % de glycérol, 20 % de phénol et 20 % d’acide lactique dans de l’eau) et les chauffer sur une plaque chauffante à 45 °C pendant 5 min (Figure 3A).
  2. Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée (Figure 3B-D).
  3. Tacher avec 2 mL de 0,01 % de ruthénium rouge dans l’eau pendant 1 min (Figure 3E).
  4. Enlevez l’excès de colorant en lavant la lame trois fois dans un bécher rempli d’eau distillée (Figure 3F,G).
  5. Placez une goutte d’eau distillée sur les sections et couvrez les sections avec un couvercle de 24 mm x 60 mm pour effectuer une analyse par microscopie optique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La coloration au lactophénol bleu coton sur la section incorporée au GMA a révélé la présence de plusieurs structures fongiques entre et à l’intérieur des cellules mésophylles du café dans les interactions fongiques biotrophes et nécrotrophes.

Dans le pathosystème biotrophique, lorsqu’il est coloré à l’aide de la méthode de double coloration, les hyphes d’Hemileia vastatrix contenant des parois cellulaires et la teneur dense en protoplastes apparaissent en bleu foncé dans le parenchyme spongieux et palissade (Figure 4A, B). La cellule mère haustorium (Hmc) et l’haustoria présentent également une forte couleur bleu foncé (Figure 4C). Lorsqu’il est contre-coloré avec du rouge de ruthénium, la distribution fongique dans les espaces intercellulaires est clairement définie (Figure 4D). La présence d’un Hmc bleu foncé aide à détecter la zone d’infection. Au cours de l’interaction, H. vastatrix Hmc a brisé la paroi de la cellule hôte et a développé un cou haustorial qui pourrait être entouré de composés pectiques (Figure 4E, F). Néanmoins, l’encapsulation riche en pectine (couleur rose-rouge) du cou haustorial n’est pas capable d’empêcher la formation haustoriale (Figure 4E,F). Dans certains cas, l’encapsulation riche en pectine a enveloppé l’haustorium de manière incomplète (figure 4G) et dans certains cas, l’hatorium est entièrement encapsulé (figure 4H).

Dans l’interaction nécrotrophe, le protocole de double coloration a également été utile pour vérifier l’interaction de Cercospora coffeicola avec les tissus mésophylles du café. À la limite de la lésion, là où le champignon n’est pas présent, la paroi cellulaire riche en pectine a conservé son intégrité (figure 5A). La méthode de double coloration a démontré la présence d’hyphes intercellulaires (Figure 5B,C). Dans les zones d’interaction, les parois cellulaires de la pectine semblaient perdre leur intégrité en raison de la dissolution (Figure 5B,C). Des structures reproductrices, telles que le conidiophore, ont été trouvées dans l’épiderme adaxial (Figure 5D). Dans la chambre substomatique, les hyphes de C. coffeicola ont été trouvés comme structures de curling. Le parenchyme palissade dans la région lésionnée semble subir une lyse de la paroi cellulaire (Figure 5E).

Figure 1
Figure 1 : Détails des différentes étapes du protocole de prélèvement des tissus lésionnés. Récoltez le morceau de la lésion avec un scalpel et une pince. Immerger les échantillons de feuilles dans la solution fixatrice. Soumettez les échantillons au pompage sous vide et à la rotation. Suivez le protocole pour les processus de déshydratation et d’intégration. L’échantillon polymérisé est sectionné dans un microtome rotatif. Les lames avec des sections de lésion sont montées et colorées pour vérifier les hyphes fongiques et les parois cellulaires riches en pectine à l’aide de la méthode de double coloration. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Détails des différentes étapes de la section de l’échantillon avant la double coloration. (A) Étape de fixation. B) Déshydratation dans les séries d’éthanol gradué; le tissu foliaire est incubé dans de l’éthanol pendant 15 min à chaque concentration. (C) Polymérisation à l’intérieur du moule en plastique. D) Bloc d’échantillon polymérisé collé sur un morceau de bois. (E) Bloc collé au bois positionné sur le microtome pour le processus de sectionnement. (F) Sections de tissus sur la diapositive (signalées par des flèches). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Détails des différentes étapes du protocole de double coloration. (A) Couvrir les sections avec des gouttes de lactophénol bleu coton et chauffer les lames sur une plaque chauffante à 45 °C. (B-C) Enlever l’excès de colorant en les lavant à l’eau distillée. (D) Sections sur les lames de verre après lavage (désignées par des flèches). E) Couvrir les sections avec des gouttes de ruthénium rouge. (F-G) Enlevez l’excès de colorant en le lavant à l’eau distillée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Protocole histochimique de double coloration pour la pectine et les structures fongiques dans la lésion de rouille du café. (A-C) Sections colorées uniquement avec du lactophénol bleu coton. Les hyphes fongiques sont tachés en bleu foncé (flèches). La cellule mère haustorium (Hmc) et haustorium (Ha) ont une couleur bleu foncé. (D-H) Double coloration à l’aide de lactophénol bleu coton et de ruthénium rouge. (D) Vue d’ensemble de la pustule (Pu) sur une feuille. (E-F) Cou haustorial (flèches) avec pectine (couleur rose-rouge). (G) Les flèches indiquent le début de l’encapsulation riche en pectine de l’haustorium. (H) Encapsulation complète de l’haustorium par la pectine (flèches). Epi Aba - Epiderme abaxial; Epi Ada - Epiderme adaxial; Sp - Parenchyme spongieux; Pp - palissade parenchyme. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Protocole histochimique de double coloration pour la pectine et les structures fongiques dans les lésions de cercospose dans les tissus mésophylles du café. (A) Bordure de lésion sans champignons. (B-F) Sections transversales de la feuille lésionnée. (A) L’intégrité des parois cellulaires riches en pectine du parenchyme spongieux. (B-D,F) Dans les tissus infectés, les hyphes de Cercospora coffeicola étaient évidents (flèches) et causaient des dommages aux parois cellulaires pectiques. Il a été possible de vérifier le conidiophore sous la cuticule (CT) (D). Epi Aba - Epiderme abaxial; Epi Ada - Epiderme adaxial; Sp - Parenchyme spongieux; Pp - Palisade Parenchyme; St - Stomates. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le présent travail introduit un test histochimique alternatif à double coloration pour étudier la composition en pectine des parois cellulaires qui encapsule l’haustoria dans un pathosystème biotrophique. L’objectif est également de démontrer l’efficacité de la méthode pour détecter les champignons nécrotrophes et les changements de paroi cellulaire induits par celui-ci. Ici, la pectine des parois cellulaires du parenchyme du café peut encapsuler à la fois le cou et l’haustorium du champignon de rouille Hemileia vastatrix. Silva et al. ont également décrit l’encapsulation par la cellulose et le callose dans le pathosystème du café-H. vastatrix 14,29. Parmi les polymères de paroi cellulaire associés aux mécanismes de défense, la pectine joue un rôle important dans le système phytopathogène 10,11,12. Par conséquent, la connaissance des fonctions de la pectine est d’une grande valeur histopathologique.

La cercosposporose dans le café, causée par Cercospora coffeicola, endommage les tissus foliaires et conduit éventuellement à la mort cellulaire. Ces symptômes sont principalement causés par l’activité de la cércosporine et des enzymes dégradant la paroi cellulaire20. Des études utilisant du rouge de ruthénium ont démontré une perte d’intégrité de la paroi cellulaire, similaire à une étude précédente sur les feuilles de kaki infectées par Pseudocercospora kaki30. L’analyse histopathologique utilisant la méthode de double coloration a démontré la présence des hyphes fongiques et cette analyse est efficace pour détecter les hyphes fongiques dans les espaces intercellulaires. Alternativement, la microscopie électronique à balayage (MEB) a montré son efficacité pour observer C. coffeicola hyphae25; cependant, la disponibilité d’un équipement aussi sophistiqué, ainsi que le travail laborieux de préparation des échantillons, est un facteur limitant. De plus, l’analyse SEM ne permet pas la reconnaissance chimique de la pectine dans les parois cellulaires. Inversement, la double coloration est une méthode importante pour détecter les changements de pectine. Cependant, la méthode décrite ici a une limitation en ce qui concerne la résolution de la microscopie optique qui ne permet pas une augmentation des détails de l’ultrastructure de l’interaction plante-fongique. En outre, la méthode de double coloration présentée ici n’est pas spécifique pour détecter les espèces fongiques et des essais moléculaires supplémentaires doivent donc être menés.

La préparation de l’échantillon suit les protocoles de routine en anatomie végétale; toutefois, certains points nécessitent une attention particulière. Par exemple, la fixation est une étape critique. La taille des échantillons et le soin apporté à leur récolte sont essentiels pour une bonne fixation. Le temps, la température, le pH et l’osmolarité sont cruciaux pour les tissus végétaux31. Les tissus foliaires sectionnés sont des organes aériens et doivent être soumis à un léger vide pour améliorer la fixation. L’utilisation du méthacrylate de glycol (GMA) nécessite de l’éthanol comme solvant de déshydratation; les tissus qui ne sont pas correctement déshydratés peuvent présenter des difficultés pendant le processus d’intégration. Cette condition est aggravée lorsque les tissus végétaux contiennent de nombreux composés phénoliques, comme dans le cas des feuilles de café. De plus, il est important de traiter de petites parties de tissus; sinon, d’autres méthodes d’intégration sont requises32.

La technique de double coloration présentée ici est une adaptation du protocole rapporté par Marques et al.33. Dans ce protocole, les auteurs ont utilisé du bleu de coton (5%) et 1% de safranine pour distinguer les structures fongiques et les parois cellulaires des plantes. La technique a été utile pour détecter la présence de champignons dans différents pathosystèmes, tels que Colletotrichum acutatum-pétales d’agrumes et Guignardia citricarpa-agrumes 33Plasmodiophora brassicae chez Arabidopsis thaliana34, Elsinoë ampelina dans Vitis labrusca35, et d’autres. Récemment, Marques et Soares36ont compilé une série de techniques microscopiques, y compris les méthodes de lumière et de fluorescence, pour distinguer les caractéristiques végétales et fongiques37. Cependant, dans certaines régions ou certains pays, comme le Brésil, les microscopes à fluorescence et le MEB peuvent ne pas être disponibles; par conséquent, l’utilisation de microscopes optiques est une alternative importante et moins coûteuse pour la recherche et même les méthodes didactiques utilisées dans les universités et les lycées. Les hyphes fongiques ont été détectés au microscope dans les tissus végétaux et animaux par le colorant bleu de coton 36,38,39,40. Ceci est lié à la réaction positive du colorant avec la paroi fongique riche en chitine40. La formule bleu de coton comprend du lactophénol, qui est une solution qui agit comme un mordant pour le tissu41, préservant ainsi la structure fongique lorsqu’elle est mélangée avec du bleu de coton. 

Ici, 0,05% de rouge de ruthénium a été utilisé pour remplacer la safranine. L’aspect positif présenté dans cette étude est que la pectine, un polymère spécifique de la paroi cellulaire, a été colorée pour fournir des données qualitatives importantes. Le rouge de ruthénium est un réactif utilisé pour détecter les groupes acides acides d’acides polyuroniques de pectine 42,43,44. Il est spécifique à la pectine et ne tache pas les autres composants glucidiques de la paroi cellulaire (c’est-à-dire la cellulose ou le callose). Des chaînes d’acides galacturoniques disposées dans différentes épines dorsales structurelles et biochimiques composentla pectine 8,9,45. La réactivité du ruthénium rouge à la paroi cellulaire dépend du degré d’estérification méthylique11. Le degré d’estérification méthylique dépend de l’activité des pectine méthylestérases (PME), et donc le rouge de ruthénium a également été utilisé comme outil pour discriminer l’activité PME11.

Ainsi, la méthode de double coloration décrite ici est un outil utile pour vérifier les modifications de la pectine dans les interactions plantes-champignons. À la connaissance des auteurs, il s’agit du premier rapport sur la pectine dans l’encapsulation haustoriale des champignons de la rouille du café. Fait intéressant, la méthode de double coloration était également importante pour observer les structures fongiques, pour décrire les dommages causés à la paroi cellulaire riche en pectine et pour vérifier les structures de reproduction fongiques. D’autres études histopathologiques sur les rouilles, l’anthracnose, la cércospoliose, les smuts et d’autres interactions biotrophes, hémibiotrophes et nécrotrophes entre les plantes et les champignons devraient être menées pour étudier l’utilisation potentielle de cette technique dans différents pathosystèmes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Hudson W. P. de Carvalho pour le soutien apporté au développement de ce travail. Les auteurs sont également reconnaissants au Laboratoire de microscopie électronique ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' d’avoir fourni l’installation de microscopie optique. Les auteurs remercient le Dr Flávia Rodrigues Alves Patrício d’avoir fourni le matériel végétal avec des lésions.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , Wiley Blackwell. New York. 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , International Publishing. Berkeley Heights. 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. Methods in Plant Histology. , The University of Chicago Press. Chicago. 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. Plant Physiology. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).

Tags

Biologie Numéro 180 Café champignons haustorium histochimie pectine microscopie
Méthode de double coloration pour détecter la pectine dans l’interaction plante-champignon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G.… More

Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter