Summary
يقدم هذا البروتوكول تقنية جراحية جديدة لزراعة كلى الفئران مع التركيز على استراتيجية مفاغرة شريانية معدلة. كما يتم تقديم تقنية خياطة الأوعية الدموية بما في ذلك طريقة بسيطة وأكثر أمانا لمفاغرة الحالب والمثانة. هذه التعديلات تقصر وقت العملية وتحسن معدل نجاح عملية زرع الكلى بالفئران.
Abstract
زرع الكلى في الفئران هو إجراء جراحي معقد وصعب. وهناك عدد قليل جدا من المنشورات التي تبين الخطوات الرئيسية لهذه العملية. لذلك ، تقدم هذه المقالة التقنية وتشير إلى المحاذير الجراحية المرتبطة بهذه العملية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح تعديلات مهمة مقارنة بالإجراء التقليدي. أولا ، يتم قطع رقعة من الشريان الأورطي البطني وإعدادها بحيث يتم نقل التشعبات القريبة من الشريان الكلوي ، بما في ذلك الشريان الحالبي مع الكلى المانحة في كتلة. هذا يقلل من خطر نخر الحالب ويتجنب تطور انسداد المسالك البولية. ثانيا ، تم إثبات طريقة جديدة لمفاغرة الأوعية الدموية تسمح للمشغل بزيادة أو تقليل حجم المفاغرة بمرونة بعد بدء تروية زرع الكلى بالفعل. هذا يتجنب تطور تضيقات الأوعية الدموية والنزيف داخل البطن. ثالثا ، يتم عرض تقنية تمكن من مفاغرة الحالب المانح الحساس والمثانة المتلقية التي لا تسبب صدمة. يمكن أن يؤدي اعتماد هذا البروتوكول إلى تقصير وقت التشغيل وتقليل الضرر الذي يلحق بمثانة المتلقي ، وبالتالي زيادة كبيرة في معدل نجاح العملية للفئران المتلقية.
Introduction
منذ أن طور Sakowitz et al. نماذج الفئران لزرع الكلى في عام 1973 لأول مرة1 ، فقد ثبت أنه أداة تجريبية مهمة لدراسة آليات الإصابة الإقفارية المزروعة والرفض المناعي وكذلك لتطوير علاجات جديدة تهدف إلى إطالة أمد البقاء على قيد الحياة وربما لتحقيق التسامح المناعي. ومع ذلك ، فقد أثبتت التقنية الجراحية أنها معقدة ومتطلبة للغاية ، وأحيانا لها مضاعفات مثل تضيقات مفاغرة الأوعية الدموية التي تؤدي إلى فشل زرع الكلى غير المناعي قبل الكلوي2 ، والفشل الكلوي الناجم عن نقص التروية والنخر اللاحق للحالب المزروع ، وتضيقات مفاغرة الحالب المزروع و / أو المثانة البول لدى المتلقي مما يؤدي إلى اضطراب في تدفق البول. كل هذه هي الأسباب التي تجعل زراعة الكلى في الفئران لم يتم تطويرها بشكل أكبر وبالتالي لا تستخدم على نطاق واسع. لا يزال إنشاء نموذج فعال ومستقر طويل الأجل لزراعة كلى الفئران دون مضاعفات الأوعية الدموية والمسالك البولية له أهمية لا يمكن الاستغناء عنها للعديد من الدراسات في مجال زراعة الأعضاء مع التركيز على المناعة الكلوية بوساطة ولكن أيضا الأمراض المعدية3. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع عمليات زرع الأعضاء الأخرى في نماذج الفئران مثل زراعة الرئة والقلب والأمعاء4,5 ، يوفر نموذج زراعة الكلى للفأر فرصة لدراسة البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل حتى في وضع التباين الرئيسي في مستضد التوافق النسيجي 3,6. وقد تبين أيضا أنه في نفس بيئة مجموعات الإجهاد بين المتبرع والمتلقي ، تتميز عمليات زرع الأعضاء المختلفة مثل القلب أو الكلى بديناميكيات وبداية مختلفة لرفض allograft3. علاوة على ذلك ، من وجهة نظر أمراض الكلى ، فهو نموذج أكثر ملاءمة لدراسة الآليات التنظيمية المناعية بوساطة المتني في سياق أحداث الرفض الحاد والمزمن من تجارب زراعة الجلد البسيطة.
على أساس التقارير السابقة حول التقنية الجراحية لزرع الكلى في الفئران3،7،8،9 ، نوضح هنا التحسينات الموثوقة التالية التي تم تطبيقها بنجاح خلال السنوات العشر الماضية ضمن مجموعتنا 10،11،12: أولا ، يتم الحفاظ على الشريان الحالبي بأمان حيث يتم استئصال الشريان الكلوي في كتلة واحدة. جنبا إلى جنب مع الجزء المعني من الشريان الأورطي البطني. ثانيا ، تقنية جديدة وبسيطة وسريعة لمفاغرة الأوعية الدموية بدون عقدة حيث لا يتم ربط الغرزة النهائية من المفاغرة بنهاية التعادل العلوي مثل النهج التقليدي ولكنها تظل حرة. تمكن هذه التقنية من زيادة أو تقليل حجم المفاغرة بعد التروية الكلوية لتجنب تضيق الأوعية الدموية والنزيف داخل البطن. ثالثا ، تم استخدام إبر حقنة 21 جم و 30 جم كأداة توجيه ثقب مساعدة من أجل زرع الحالب المانح في جدار المثانة المتلقي مما يقلل من الضرر الذي يلحق بالمثانة المتلقي ويسهل تكوين مفاغرة خالية من التضيق.
في هذا التقرير ، قارنا أيضا التقنية التقليدية المستخدمة على نطاق واسع مع التقنية المعدلة التي تم إنشاؤها في مختبرنا ولم نجد فرقا كبيرا في درجة ضمور الكلى الأنبوبي وتليف الأنسجة الخلالية لزرع الكلى. في الدراسات السابقة ، قارنا أيضا نتائج هذه التقنية الجديدة بالطريقة التقليدية من حيث النزيف الموضعي والجلطة ووقت إجراء مفاغرة الأوعية ومعدل البقاء على قيد الحياة. وجدنا تحسينات مثل التخفيضات الكبيرة في أحداث الجلطة المحلية (1.1٪ مقابل 6.6٪) ، وتقليل الوقت لإجراء المفاغرة ، والكسب غير المشروع الجيني للكلى القابل للتكرار على المدى الطويل (95٪ مقابل 84٪ مع النهج الكلاسيكي)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن التوجيه 2010/63/EU الصادر عن البرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية (بطاقة أخلاقيات الحيوان: وزارة سلامة الأغذية والأدوية في ولاية سكسونيا السفلى ، # 33.9-42502-04-11/0492). قم بإجراء الإجراءات باستخدام الأدوات الجراحية المعقمة والمواد الاستهلاكية (الأوتوكلاف) وحاول الحفاظ على منطقة العمليات معقمة قدر الإمكان.
ملاحظة: عملت الفئران الذكور C57BL/6J كمتبرعين ومتلقين (نموذج زرع syngeneic) في حين عملت الفئران Balb / c كمتلقين للألوغرافت الكلوي (نموذج لدراسة نموذج رفض allograft الحاد9). كان عمر الفئران بين 8-12 أسبوعا ، وكان وزنها ~ 25-30 جم عند الزرع وتم إيواؤها في ظل ظروف قياسية. تم إنشاء البيانات الواردة في هذه المخطوطة من قبل أربعة جراحين ذوي خبرة في جراحة الفئران.
1. الخطوات التحضيرية
- بالنسبة للجراحة ، استخدم مجموعة من الأدوات المجهرية ، بما في ذلك مقص مجهري ، ملقط دقيق ، حامل إبرة ، مشابك مرقئ مرقئ دقيقة ، وقلم كهربائي. قم بإجراء الغرز باستخدام خيوط النايلون أحادية النايلون 7/0er أو 10/0er أو 4/0er.
- للتخدير ، ضع الفأر في الصندوق لاستنشاق الأيزوفلوران (2٪) لمدة 40-60 ثانية من أجل الحث على فقدان الوعي.
- بمجرد تخدير الماوس ، قم بوزن الماوس.
- وفقا لوزن الفأر ، ضع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (100 مجم / كجم) + زيلازين (10 مجم / كجم) + أسيبرومازين (2 مجم / كجم) لتخدير الفأر13. تأكد من تخدير الماوس من خلال ملاحظة عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
- عندما يصبح التخدير ساري المفعول ، قم بقص فرو البطن. ثم ، قم بإصلاح الماوس على طاولة التشغيل عن طريق شل حركة الأطراف بشكل فضفاض باستخدام شريط لاصق معقم.
- تطهير بطن الماوس بعد وضع الماوس على طاولة العمليات. قم بإجراء التطهير باستخدام فرك بالتناوب من يوديد البوفيدون (اليودوفور) والكحول ، ثلاث مرات (استخدم نمطا متحد المركز ، وابدأ الفرك في منتصف البطن وانتقل إلى الخارج) ، ثم قم بلف الماوس بشكل صحيح باستخدام منشفة جراحية متجذرة.
- ضع مرهم العين وحافظ على العقم طوال العملية.
ملاحظة: لا ينصح بالمضادات الحيوية طوال الإجراء لأن هذه المواد قد تؤثر على الاستجابات المناعية.
2. إجراءات تشغيل المتبرع
- استخدم المقص لقطع الجلد وإجراء شق عبر البطن يبلغ حوالي 3-4 سم. قطع عضلات جدار البطن. قم بتغطية الأحشاء ونقلها بحذر باستخدام شاش ملحي مشرب.
- استخدم قطعة قطن لإزالة الأمعاء والمعدة والطحال بلطف نحو الجانب الأيمن (من وجهة نظر الماوس) ، وقم بتغطيتها وتحريكها بحذر بعيدا بشاش ملحي مشرب.
- استخدم الملقط الدقيق لفضح الكلى اليسرى والشريان الأورطي والوريد الأجوف السفلي (IVC).
- استخدم قلم رصاص كهربائي جراحي كي الأوردة القطنية اليسرى ، بما في ذلك فروعها الأساسية والأوعية الصغيرة الأخرى جنبا إلى جنب مع وعاء الغدة الكظرية الأيسر ، بعناية.
- استخدم المقص الدقيق والملقط لتشريح الحالب الأيسر وتعبئته بحذر من الأنسجة المحيطة. نظيفة قطعها بالقرب من المثانة البولية. تعبئة المنطقة الأبهرية بين الشرايين الكلوية اليسرى واليمنى حوالي 2 مم في الطول.
- استخدم ملقط صغير لفصل الوريد الأجوف السفلي (IVC) والشريان الأورطي ، ثم استخدم ملقطا منحنيا للمرور تحت الشريان الأورطي لوضع ربطة عنق فضفاضة من خياطة الحرير 7-0 حول هذا الوعاء.
- قم بتثبيت منطقة الشريان الأورطي أسفل الشريان الكلوي الأيمن والوريد الأجوف السفلي (IVC) باستخدام اثنين من المشابك الوعائية الدقيقة مقاس 5 مم.
- انقل الوريد الكلوي الأيسر من الوريد الأجوف.
- استخدم حقنة لطرد الشريان الأورطي ب 1 مل من محلول الهيبارين الملحي (60 U / mL).
- استخدم ملقط صغير لشد الرباط المطبق في الخطوة 2.5. ثم ، قطع الشريان الأورطي أسفل الرباط وكذلك تحت المشبك القريب. مع هذا ، يتم تضمين التشعبات القريبة من الشريان الكلوي (يرجى ملاحظة أنه يجب قطع فتحة الشرايين بدقة ، وإلا فإنها ستؤثر على المفاغرة) والشريان الحالبي ونقلها في كتلة. تحضير بعناية ، بحيث يتم الحفاظ على الشريان الحالبي الحساس تماما.
- استخدم قلم الرصاص الكهربائي الجراحي والملقط لتحرير الكلى اليسرى والأوعية المرتبطة بها تماما عن طريق كي جميع الأوعية المحيطة بحذر الأنسجة. إزالة الكلى وتخزينها في محلول ملحي في 4 درجات مئوية.
- القتل الرحيم للفأر المانح المخدر عن طريق قطع الرأس.
3. إجراء عملية المستلم
- قم بإجراء الخطوات الجراحية الأولية (بما في ذلك التخدير والتعقيم، انظر الخطوات من 1.1 إلى 1.7) كما هو موضح للفأر المتبرع.
- استخدم المقص لفتح البطن عن طريق شق متوسط (طوله حوالي 2.5 سم) ، ثم قم بتغطية أعضاء البطن بشاش مبلل باستخدام محلول ملحي.
- حافظ بعناية على الشريان الأورطي اللعابي والوريد الأجوف السفلي (IVC) وتأكد من كي كل فرع من فروع الأوعية الكبيرة. استخدم الكي الكهربائي أيضا لتشريح الحالب الأيسر بعناية في وضع قريب من حوض الكلى. ثم، قم بإزالة الكلى اليسرى.
- استخدم الملقط الصغير وبراعم القطن لفضح الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي وفصلهما عن الأنسجة الدهنية المحيطة (طولها أكثر من 4 مم تقريبا).
- استخدم اثنين من المشابك الوعائية الدقيقة وضعها بالقرب منها وبعيدا على كل من الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي البطني في وقت واحد.
- استخدم حامل إبرة صغير لتوجيه إبرة خياطة أحادية الخيط 10/0 (مصنوعة من الألياف الاصطناعية ذات السطح الأملس) ، والتي يتم وضعها عبر جدار الشريان الأورطي بطريقة قريبة إلى بعيدة.
- حقق بضع الشرايين البيضاوي بحوالي 1 مم مع جر تصاعدي لطيف للخياطة ، مع القطع مباشرة أسفل الوجه السفلي للإبرة بمقص منحني ناعم.
- استخدم المقص الدقيق لقطع الوريد الأجوف السفلي (IVC) طوليا بطول كاف يبلغ حوالي 1.5 مم. ضع هذا الشق أقل قليلا من نظيره الأبهري.
- إجراء مفاغرة الشريان الأورطي من المتبرع والمتلقي بطريقة شاملة. ضع كلية المتبرع على الجانب الأيمن من الوريد الأجوف السفلي للمتلقي مع محاذاة كفة الشريان الأورطي البطني للمتبرع مع مفاغرة الشريان الأورطي البطني للمتلقي.
- استخدم حامل إبرة صغير وخيطين منفصلين 10-0 لخياطة الأطراف القريبة والبعيدة من المفاغرة.
- بعد الربط ، اترك الغرز الطويلة ، بما في ذلك الإبرة ، في مكانها. خياطة الجانب الأيسر من الجدار الأبهري للمفاغرة باستمرار مع اثنين من الغرز متباعدة بالتساوي في اتجاه بعيد قريب.
- بعد الغرزة الأخيرة ، قم بتوجيه الخيط من خلال سمك جزئي لجدار الوعاء فوق ربطة عنق خياطة البقاء العلوية.
- استخدم ملقط صغير لممارسة الجر اللطيف في وقت واحد إلى الطرف القصير من ربطة الخياطة السفلية.
ملاحظة: في هذه التقنية الجديدة الخالية من العقدة، لا ترتبط الغرزة الأخيرة بالطرف القصير من ربطة العنق العلوية. - استخدم الملقط الصغير لتحويل الكلى المزروعة إلى وضعها الطبيعي. الآن خياطة باستمرار الجدار الأيمن من مفاغرة الأبهر باستخدام ثلاث غرز بطريقة قريبة إلى بعيدة.
ملاحظة: بالمقارنة مع التقنية الجراحية التقليدية 7,8 يتم دمج الخيط الأخير مع ربطة العنق البعيدة القريبة. لا تربطه بنهاية الخيط السفلي ، قم بقصه ليترك طولا حرا يتراوح بين 2-3 مم بدلا من ذلك. - قم بإجراء المفاغرة الوريدية باستخدام نفس إجراء الخياطة كما هو موضح سابقا مع اختلاف الحاجة إلى أربع إلى خمس غرز لكل جانب من جوانب المفاغرة. يتم ترك الغرزة النهائية كنهاية حرة بطول مماثل لمفاغرة الأبهر الموصوفة أعلاه.
- بعد الانتهاء من كل من المفاغرة ، استخدم مسحة جافة لممارسة ضغط لطيف نحو المنطقة المخيطة لمدة تتراوح بين 10 و 20 ثانية.
- استخدم ملقط قضيب مشبك لإزالة كلا المشابك، أولا في الجزء السفلي ثم العلوي. شطف تجويف البطن مع 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم عند درجة حرارة 38.0 درجة مئوية.
- مراقبة تروية الكلى المزروعة.
4. زرع الحالب
- استخدم حامل إبرة صغير لاختراق مثانة بول المتلقي بخياطة 10/0 (إبرة مستقيمة) وأدخلها في تجويف إبرة 21 جم للحصول على إرشادات (انظر الشكل التكميلي 1 أ).
- الآن قم بتوجيه إبرة 21 G لخياطة ثقب في مكان تطبيق الإبرة السابق (الشكل التكميلي 1b).
- اسحب إبرة 21 جم (الشكل التكميلي 1 ج).
- استخدم حامل إبرة صغير وخياطة 10/0 لخياطة (بدون ربطة) نهاية الحالب المشذبة وثقب المثانة باستخدام هذه الخياطة 10/0 مرة أخرى في مكان إدخالها (الشكل التكميلي 1 د).
- استخدم حامل إبرة صغير لسحب خيوط 10/0 والحالب إلى المثانة البولية من خلال الثقب المبني (الشكل التكميلي 1e).
- استخدم حامل إبرة صغيرة وخياطة أخرى بنسبة 10/0 لمفاغرة الحالب المتبرع إلى مثانة بول المتلقي. هنا ، قم بتوصيل الغشاء الخارجي للحالب بالغشاء الخارجي لجدار المثانة ، وقم بإجراء خيوط متقطعة باستخدام 3 إلى 4 غرز. أخيرا ، اسحب خياطة الجر (الشكل التكميلي 1f).
- استخدم الملقط لوضع الأمعاء مرة أخرى في تجويف البطن. قم بإجراء خيوط من طبقتين (أولا عضلات البطن تليها الجلد) لإغلاق جرح البطن باستخدام خيوط 4/0.
- ضع الفئران المزروعة في غرفة الأكسجين والتحكم في درجة الحرارة للتعافي بعد الجراحة.
- بالنسبة للتسكين بعد العملية الجراحية ، أعط ميتاميزول مباشرة 200 ملغم / كغم لكل نظام تشغيل بعد العملية.
أربعة و 16 ساعة بعد العملية تعطي ميتاميزول 200 ملغم / كغم لكل نظام تشغيل بالإضافة إلى كاربروفين (5 ملغ / كغ) s.c. في المتابعة الإضافية ، ضع Carprofen (5 mg / kg) s.c. على الفئران المزروعة كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام متتالية بعد العملية13. إذا كانت هناك أي علامات على عدم كفاية تسكين البوبرينورفين 0.05 مغ / كغ يعطى بالإضافة إلى ذلك كل 8 ساعات s.c.
5. استئصال الكلية المقابل والتضحية بالفأر المتلقي
ملاحظة: إجراء استئصال الكلية المضاد للفأر المتلقي بعد 5 أيام من الزرع.
- قم بإجراء استئصال الكلية المضاد للفأر المزروع بعد 5 أيام من الزرع تحت التخدير. قم بقطع الشرايين والأوردة الكلوية اليمنى الذاتية للمتلقي ، وإزالة الكلى اليمنى وإغلاق تجويف البطن. الرعاية بعد العملية الجراحية والتسكين هي نفسها كما هو موضح من قبل (انظر الخطوة 4.7).
- رفع وتسجيل حالة الماوس. توفير مسكن الفأر المزروع بعد العملية الجراحية والغذاء وإمدادات المياه.
- بعد أربعة أسابيع من الزرع ، ضحى بنصف الفئران المزروعة وقم بإجراء تلطيخ H & E لعمليات زرع الكلى.
- بعد 12 أسبوعا من الزرع ، قم بالتضحية بالفئران المتبقية وإجراء تلطيخ Masson Gold لعمليات زرع الكلى هذه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد أربعة أسابيع من الزرع ، أظهرت كل من التقنية المعدلة وكذلك التقنية التقليدية علامات معتدلة على ضمور أنبوبي كلوي14,15 عند مقارنتها بالكلى المعاكسة الأصلية (الشكل 1). لم تظهر درجة ضمور الأنابيب الكلوية أي فرق كبير بين التقنيتين المختلفتين. أظهر تلطيخ ماسون غولدنر الثلاثي اللون 14,15 من الكلى بعد 12 أسبوعا من الزرع بشكل موحد علامات واضحة على تليف الأنسجة الخلالية عند مقارنتها بالكلى الطبيعية غير المزروعة (الشكل 2).
لقد حققنا سابقا في نتائج هذه التقنية الجديدة بدون عقدة (n = 175) وقارناها بالنهج الكلاسيكي (n = 122) من حيث الجوانب التقنية للإجراء والمضاعفات أثناء العملية الجراحية وما بعد الجراحة (انظر أيضا الجدول 1)10. ارتبطت التقنية المعدلة الموضحة هنا بانخفاض حدوث أحداث الجلطات الشريانية أو الوريدية داخل الطعم (الشكل 3 ب ، 1.1٪ مقابل 6.6٪). كان الوقت اللازم لإجراء المفاغرة أقل بكثير (الشكل 3 أ) ، وتم تحقيق بقاء طويل الأجل على الطعم الكلوي القابل للتكرار بشكل كبير (95٪ مقابل 84٪ ، p < 0.001 ، الشكل 3 ج) على النحو الذي يحدده بقاء المتلقي على قيد الحياة بعد 12 أسبوعا من الزرع. بالإضافة إلى ذلك ، لا يؤثر تطبيق إجراء الزرع المعدل هذا على وظيفة اللوغراف الكلوي كما تم تقييمه بواسطة الكرياتينين في الدم خلال فترة المراقبة البالغة 12 أسبوعا10.
| التقليديه | تقنية جديدة بدون عقدة | |
| (ن = 122) | (ن = 175) | |
| أوقات التشغيل | ||
| الوقت اللازم لمفاغرة الشرايين (دقيقة) | 9.2 ± 0.09 | 7.5 ± 0.06** |
| وقت المفاغرة الوريدية (دقيقة) | 9.1 ± 0.10 | 7.5 ± 0.05** |
| معدلات المضاعفات | ||
| خثار | 8 (6.6%) | 2 (1.1٪)* |
| نزيف موضعي | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| معدل النجاح | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong,S., Lewis AG., Kunter U., et al. تقنية بلا عقدة لزراعة الكلى في الماوس. J زرع. Epub2012:127215,(2012). | ||
الجدول 1: مقارنة هذه التقنية الجديدة (n = 175) بالتقنية التقليدية (n = 122) من حيث الجوانب الفنية للإجراء والمضاعفات أثناء العملية الجراحية وبعد العملية الجراحية10. تمثل الأرقام أوقات التشغيل بالدقائق لكل إجراء (متوسط ± SD).
الشكل 1: النتائج النسيجية التمثيلية التي تقيم ضمور أنبوبي. تلطيخ عمليات زرع الكلى بعد 4 أسابيع من الزرع (40x): (أ) الكلى الطبيعية غير المزروعة ، (ب) التقنية التقليدية ، و (ج) التقنية المعدلة لزرع الكلى المتزامن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج النسيجية التمثيلية لتقييم التليف الخلالي. تلطيخ ماسون غولدنر ثلاثي الألوان بعد 12 أسبوعا من الزرع (40x) من (أ) الكلى الطبيعية غير المزروعة ، (ب) التقنية التقليدية ، و (ج) التقنية المعدلة لزرع الكلى المتلازم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة أوقات تشغيل مفاغرة السفينة، وتواتر المضاعفات، ومعدلات النجاح بين التقنية المعدلة والتقنية التقليدية10 تصور البارغراف الواردة في (أ) وقت التشغيل اللازم لإجراء مفاغرة السفينة؛ (ب) وتصور البارجرافات الواردة في الفقرة (أ) وقت التشغيل اللازم لإجراء مفاغرة السفينة؛ (ب) وتصور العبارات البيانية الواردة في الفقرة (أ) وقت التشغيل اللازم لإجراء مفاغرة السفينة؛ (ب) وتصور البيانات البيانية الواردة في الفقرة (أ) وقت التشغيل اللازم لإجراء مفاغرة السفينة؛ (ب) وتصور البارجرافات الواردة في الفقرة (أ) وقت التشغيل اللازم لإجراء مفاغرة السفينة؛ (ب) وتصور البيانات البيانية الواردة في الفقرة (أ) وقت التشغيل اللازم لإجراء مفاغرة السفينة؛ (ب) وتصور البيانات البيانية الواردة في الفقرة (أ) وقت التشغيل اللازم لإجراء وتصور الأشرطة البيانية الواردة في الفقرة (ب) أحداث تجلط الدم داخل الكسب غير المشروع ومشاكل النزيف الموضعي؛ في حين أن البارغراف في (ج) تظهر معدل نجاح أعلى للتقنية الجديدة بدون عقدة وفقا للبقاء على قيد الحياة أكبر من 12 أسبوعا بعد الزرع بعد الزرع الإضافي للكلية الأصلية المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: نظرة عامة على البنية التشريحية (الألواح العلوية أ و ب) وخطوط استئصال الشريان الأورطي والشريان الكلوي لكل من التقنية التقليدية (ج) والتقنية المعدلة (د) (أ) الشريان الأورطي البطني ، (ب) الشريان الكلوي ، (ج) الشريان الحالبي ، (د) الكلى ، (ه) الحالب. يتم تصوير الأوعية الوريدية (V. cava ، بما في ذلك Vv. renales) على أنها خطوط منقطة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عرض توضيحي مثالي لخياطة بدون عقدة لمفاغرة وعاء الشريان تظهر (أ) الشريان الأورطي البطني ، (ب) الشريان الكلوي ، و (ج) تقنية الخياطة بدون عقدة حيث لا يتم ربط الغرزة الأخيرة من المفاغرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: مفاغرة الحالب المتبرع مع المثانة البول المتلقي. (أ) اختراق المثانة البولية للمتلقي بخيط أحادي 10/0 وإدخاله في تجويف إبرة 21 جم ، (ب) توجيه إبرة 21 جم لإجراء ثقب موجود في ثقب الإبرة السابق ، (ج) سحب إبرة 21 جم ، (د) خياطة نهاية الحالب المشذبة بخياطة 10/0 وثقب المثانة بخياطة 10/0 مرة أخرى في مكان دخولها ، (ه) ثم اسحب الخيط 10/0 والحالب إلى المثانة البولية من خلال الثقب المبني ، (و) ومفاغرة الحالب المتبرع إلى مثانة المتلقي مع خياطة أخرى 10/0. أخيرا ، اسحب خياطة الجر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في حين أن نموذج زراعة الجلد في الفئران بسيط وسهل الأداء لدراسة أحداث الرفض المناعي ، فقد ثبت أن التقنيات الجراحية للتحقيق بشكل أكثر تحديدا في التغيرات الالتهابية المرتبطة بالمناعة بعد القلب16 وزرع الكلى10 معقدة ومتطلبة للغاية. من وجهة نظر أخصائي أمراض الكلى المزروع ، لا يزال إنشاء نموذج فعال ومستقر طويل الأجل لزراعة الكلى للفئران له أهمية لا يمكن الاستغناء عنها للعديد من الدراسات الوظيفية والمناعية. بالإضافة إلى ذلك ، بالمقارنة مع عمليات زرع الأعضاء الأخرى ، يمكن لنموذج زراعة الكلى الفأر تحقيق بقاء طويل الأمد حتى مع وجود اختلافات معينة في مستضدات التوافق النسيجي الرئيسية التي تنطوي على فرصة لدراسة آليات التنظيم المناعي في التطور طويل الأجل لكل من الرفض أو تحديد العوامل الأساسية لإثبات التسامح المناعيالجانبي 3.
كما هو موضح سابقا ، فإن زراعة الكلى في الفئران هي إجراء صعب ، ومعدلات نجاح حتى الجراحين ذوي الخبرة تختلف اختلافا كبيرا بين 40 و 95٪ 10،17،18،19،20. فيما يتعلق بتقارير فرق البحث المختلفة في جميع أنحاء العالم حول هذه التقنية الجراحية ، قمنا بإجراء التعديلات التالية مقارنة بالنهج الكلاسيكي مما أدى إلى العديد من التحسينات.
أولا ، يتم قطع رقعة من الشريان الأورطي البطني وإعدادها بحيث يتم نقل التشعبات القريبة من الشريان الكلوي والشريان الحالبي ، بما في ذلك الكلى المانحة في كتلة. هذه المناورة لا تحافظ فقط على إمدادات الدم ووظيفتها ووظيفة الحالب لدى المتبرع من خلال تجنب إصابة الأنسجة المحيطة بالحالب وبالتالي منع استسقاء الكلية بعد العملية الجراحية ، ولكنها تمنع أيضا تضيقات الشريان الكلوي بعد العملية الجراحية (الشكل 4). وبالتالي ، يتم تجنب نقص تروية زرع الكلى بوساطة تضيق في الشريان الكلوي أو ناجم عن استسقاء الكلية بوساطة الحالب الضيق والإقفاري ، مما يمثل اثنين من الجوانب الرئيسية لتحقيق البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في هذا النموذج. ومع ذلك ، هناك متغيرات تشريحية لنسل الشريان الحالبي. على سبيل المثال ، في بعض الفئران ، ينشأ الشريان الحالبي من الجذع الرئيسي للشريان الأورطي البطني بدلا من الشريان الكلوي ويكون موضع هذا النسل في الغالب حوالي 0.2 إلى 0.5 مم بعيدا عن ذرية الشريان الكلوي (كما هو موضح في الشكل 4). من تجربتنا ، يمكننا تقدير حدوث الشريان الحالبي الذي ينشأ مباشرة من الشريان الأورطي في حوالي 20٪ من الفئران الذكور C57BL/6J (ملاحظة غير منشورة) ، وأكثر ندرة في سلالات أخرى من الفئران مثل BALBc. في بعض الطرق الجراحية التقليدية المبلغ عنها ، تم إهمال هذا الوعاء الغذائي المهم في بعض الأحيان للحماية ، حيث تم تجاهله وربطه مباشرة أو كيه بالكهرباء.
خاصة في هذه الحالات من المتغيرات التشريحية عندما ينشأ نسل الشريان الحالبي للفأر من الجذع الرئيسي للشريان الأورطي البطني أسفل نسل الشريان الكلوي ، فإن طريقة نقل الكتلة وإعادة بناء مفاغرة الأبهر هذه أكثر ملاءمة. يمكن للجراحين ذوي الخبرة حتى أن يقرروا متى يستخدمون المفاغرة التقليدية أو المعدلة في الكتلة .
ثانيا ، تطبيق تقنية جديدة وبسيطة وسريعة لمفاغرة الأوعية الدموية بدون عقدة حيث لا يتم ربط الغرزة النهائية للمفاغرة بنهاية التعادل العلوي مثل النهج التقليدي ولكنها تظل حرة بدلا من ذلك يوفر ميزة قيمة (انظر الشكل 5). لا تزال هذه التقنية تسمح بزيادة أو تقليل حجم المفاغرة بعد بدء عملية إعادة تروية زرع الكلى. هذا يتجنب تطور تضيقات الأوعية الدموية والنزيف داخل البطن. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن سحب الذيول الحرة لغرز التثبيت في كلا الطرفين في اتجاهين متعاكسين لضبط المفاغرة وتوسيعها بمرونة لتجنب تضيق الشرايين أو الأوردة. وبالتالي ، فإن تقنية الخياطة تعمل على تحسين معدل تحمل أخطاء الجراحة وهي صديقة للمبتدئين20.
ثالثا ، لإجراء مفاغرة الحالب المانحة والمثانة المتلقية بشكل غير مؤلم ، تم استخدام إبر حقنة 21 G و 30 G كأدوات مساعدة لتوجيه الثقب. في الفئران ، الحالب رقيق جدا وحساس للغاية لإجراء مفاغرة من طرف إلى طرف. عادة ، يتم سحب الحالب المتبرع مباشرة إلى المثانة باستخدام ملقط لتوجيه الحالب بعد ثقب المثانة بإبرة حقنة. لقد قمنا بتحسين هذه الطريقة بشكل أكبر ، باستخدام إبرة حقنة أرق قطرها 30 جم كدليل لإبرة حقنة 21 جم (إجراء Seldinger). باستخدام هذه التقنية اللامؤلمة ، لا تخترق إبرة حقنة 21 G المثانة بأكملها ، مما يقلل من تلف المثانة وصعوبة زرع الحالب17 (الشكل التكميلي 1).
الخطوة الحاسمة للبروتوكول هي تكوين فتحة الشرايين. في كلتا الحالتين (المتبرع والمتلقي) يجب قطعها بدقة ، وإلا فإنها ستؤثر على جودة المفاغرة. علاوة على ذلك ، في هذه التقنية الجديدة بدون عقدة ، لا ترتبط الغرزة الأخيرة بالخيط المعقود. بعد المفاغرة ، يجب على الجراح في البداية إبقاء الفغرة المفاغرة صغيرة. ثم ، بعد إعادة التروية ، اسحب نهايات الخيط في النهايات العلوية والسفلية من أجل تكبيره. خطوة حاسمة أخرى يجب على المرء أن يكون على دراية بها هي تحديد موضع شق الشريان الكلوي المتبرع به حيث يجب تحديد الشريان الحالبي لحمايته.
أحد القيود الرئيسية لهذه التقنية هو - إلى جانب التحسينات الموصوفة - أن المشغل لا يزال بحاجة إلى تلبية المتطلبات العالية لأن جدران السفينة صغيرة وعطاء للغاية. بدون ممارسة مكثفة ومثابرة ، سيكون معدل نجاح الجراحة منخفضا.
باختصار ، يوضح هذا التقرير إمكانية تطبيق تعديل تقني على إجراء زراعة الكلى في الفئران. أثبت إجراء الجراحة المقدم هنا أنه طريقة قيمة وموثوقة كانت بمثابة عنصر أساسي في العديد من المنشورات البحثية خلال السنوات ال 10 الماضية 3,19,20. بالمقارنة مع نموذج الجراحة الكلاسيكي والراسخ على نطاق واسع ، توفر الطريقة الموضحة هنا العديد من التحسينات المهمة التي تؤدي إلى معدلات مضاعفات أقل ومعدل بقاء أطول على قيد الحياة في إعداد زراعة الكلى syngeneic3. من المهم الإشارة إلى أن كلتا التقنيتين (المعدلة والتقليدية) تشتركان في نفس المضاعفات الإضافية التي تؤثر على وفيات المتلقي مثل الموت بسبب التلف الحشوي ، وتسرب البول ، واستسقاء الكلية ، والالتهابات ، وما إلى ذلك ، والتي لم تختلف. باختصار ، تعمل هذه التقنية الجراحية الجديدة على تحسين معدل النجاح الكلي والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل مما يجعلها أداة موثوقة لدراسة الاستجابة المناعية بعد زراعة الكلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي.
Acknowledgments
نشكر فريق الدكتور تيانتيان باي على المساعدة في التعليق الصوتي ، والآنسة ميان باو على مساعدتها في التوضيح الطبي. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) لتعزيز التعاون الدولي (HO2581/4-1 إلى AH) والمؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (NSFC ؛ # 81760291 إلى FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
