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Biology

펄스 진폭 변조된 엽록소 형광계를 이용한 작물에서의 비광화학적 담금질의 고처리량 분석

Published: July 06, 2022
doi:
10.3791/63485
, , , , ,
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences,University of Cambridge

Summary

이 프로토콜은 펄스 진폭 변조된 엽록소 형광 측정법에 의한 비광화학적 담금질의 완화를 측정하기 위한 고처리량 방법을 도입한다. 이 방법은 현장에서 자란 글리신 맥스 에 적용되며 유전 적 다양성 또는 번식 집단을 스크리닝하기 위해 다른 종에 적응할 수 있습니다.

Abstract

광합성은 현대 작물 품종에 최적화되어 있지 않으므로 개선의 기회를 제공합니다. 비 광화학 담금질 (NPQ)의 완화를 가속화하는 것은 광합성 성능을 향상시키는 효과적인 전략으로 입증되었습니다. 그러나, NPQ 개선을 위한 번식 가능성 및 NPQ 완화의 유전적 기초에 대한 완전한 이해는 현장 재배 작물 식물로부터의 오버샘플링 및 데이터 수집의 한계로 인해 부족하다. 이전 보고서를 기반으로 펄스 진폭 변조 (PAM) 엽록소 형광 측정법을 사용하여 글리신 맥스 (대두)에서 NPQ 이완 속도를 분석하기위한 고처리량 분석을 제시합니다. 잎 디스크는 실험실로 운반하기 전에 현장에서 재배 한 콩에서 샘플링되어 NPQ 이완이 폐쇄 된 PAM 형광계에서 측정됩니다. NPQ 이완 파라미터는 고조도에서 저조도로의 전환 후 측정된 NPQ 값에 이중 지수 함수를 피팅하여 계산됩니다. 이 방법을 사용하면 하루 안에 수백 개의 유전자형을 테스트 할 수 있습니다. 이 절차는 NPQ 완화의 변이에 대한 돌연변이 및 다양성 패널을 선별 할 수있는 잠재력을 가지고 있으므로 기본 및 응용 연구 질문 모두에 적용될 수 있습니다.

Introduction

광합성은 광흡수, 일차 전자 전달, 에너지 안정화, 광합성 생성물의 합성 및 수송1로 구성된다. 각 단계를 이해하는 것은 작물 광합성 효율을 높이기위한 노력을 안내하는 데 중요합니다. 빛은 광합성 속도에 영향을 미치며, 광자의 형태로 에너지 공급의 균형을 맞추어야하며 등가물을 줄이기위한 수요가 필요합니다. 공급이 수요를 초과할 때, 예를 들어 고조도 하에서, 또는 구내성 폐쇄에 의해 야기된CO2 고정의 감소된 동안, 환원 전력의 축적은 광합성 장치를 손상시키고 전자 수송을 손상시킬 가능성이 있는 반응성 산소 종 형성의 확률을 증가시킨다. 따라서 손상을 방지하기 위해 식물은 반응성 산소 종의 해독 및 여기된 엽록소 상태 (NPQ)2의 비 광화학적 담금질을 포함한 몇 가지 광보호 메커니즘을 개발했습니다.

높은 광합성 속도를 유지하는 것은 현장 환경에서 어려운 일입니다. 계절 및 일주일 변화는 바람으로 인한 잎 움직임 및 일시적인 구름 덮개와 같은 환경 변동과 함께 광합성을 위해 식물이받는 빛의 양과 강도의 변화를 일으킵니다 3. NPQ는 과도한 광 에너지를 방출하고 고조도에서 지속적인 광합성 속도를 허용하면서 광손상을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다4. 그러나, 고조도 전이 동안 연장된 NPQ는 탄소 감소5에 사용될 수 있는 에너지를 계속 소산시킨다. 결과적으로 NPQ의 이완을 가속화하면 광합성6의 효율을 높일 수 있으므로 NPQ 완화는 작물 개선을위한 매력적인 대상이됩니다.

펄스 진폭 변조된 엽록소 형광(PAM) 분석은 측정 가능한 파라미터(보충 표 1 및 보충 표 2)7,8,9로부터 NPQ를 계산하는데 사용될 수 있다. 이 기사는 생식 형질의 자연 변이를 스크리닝하기 위해 현장 재배 식물에서 NPQ 이완률을 결정하는 데 중점을 둡니다. 그러나, PAM 엽록소 형광 분석 분석은 또한 조류에서 고등 식물에 이르는 종에 적용되는 매우 다양한 목적을 위해 사용될 수 있으며,다른 곳에서 검토된다 7,8,9.

어두운 적응 잎 또는 세포에서, 광계 II (PSII) 반응 센터는 전자를 받기 위해 개방되어 있으며 NPQ는 없다. 저강도 측정광을 켜면 엽록소 형광을 유도하면서 PSII를 통한 전자 수송을 피할 수 있습니다. 이러한 암적응 상태에서 기록된 최소 형광은 파라미터 Fo에 의해 설명된다. 어두운 적응 잎에 고강도 광 펄스를 적용하면 퀴논 A 부위에 결합된 퀴논의 첫 번째 안정한 전자 수용체 풀을 빠르게 감소시킬 수 있다. 이것은 일시적으로 PSII 반응 센터의 전자 전달 능력을 차단하며, PSII 반응 센터는 폐쇄되어 물 분해로 전자를 수신 할 수 없다고합니다. 짧은 펄스 지속 시간을 사용함으로써, NPQ를 자극할 시간이 불충분하다. 생성된 엽록소 형광은 NPQ 또는 최대 형광, Fm의 부재 하에 수득가능한 최대값과 동등하다. 최소 형광과 최대 형광의 차이는 가변 형광, Fv로 지칭된다. 광계 II (Fv /Fm)의 최대 광화학 양자 수율은 다음 방정식을 사용하여이 두 매개 변수에서 계산됩니다.

Fv/F m = (F m-Fo)/F m

이것은 광계 기능과 스트레스의 중요한 지표를 제공 할 수 있습니다. actinic (광합성) 빛을 켜면 비 광화학 담금질이 자극되며, 포화 플래시의 후속 적용은 광에 적응 된 최대 형광 인 FM ‘의 측정을 가능하게합니다. 어두운 형광과 광적응된 최대 형광의 차이를 비교함으로써, NPQ는 스턴-볼머 방정식10에 따라 계산될 수 있다:

NPQ = F m / Fm ‘ – 1

고등 식물에서, NPQ는 qE, qT, qZ, qI 및 qH를 포함하는 적어도 다섯 개의 별개의 성분으로 구성된 것으로 기술되었다. NPQ와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 그러나 qE는 대부분의 플랜트에서 NPQ의 주요 구성 요소로 간주됩니다. qE의 완전한 참여를 위한 결정적인 인자는 틸라코이드 막을 가로지르는 양성자 구배의 축적, 광계 II 서브유닛 S11,12의 활성, 및 탈에폭시화된 크산토필, 안테락산틴, 루테인, 및 특히 제아잔틴13을 포함하는 것으로 밝혀졌다. qE는 모든 NPQ 성분 중 가장 빠른 속도를 완화시키며(< 2분)14, 따라서 qE의 가역적 활성화는 시프팅 광도에 대한 적응에 특히 중요하다. NPQ 완화의 두 번째 느린 단계 (~ 2-30 분)는 상태 전이와 관련된 qT와 제아잔틴을 비올라잔틴15로 상호 변환하는 qZ를 모두 포함합니다. NPQ의 느린 이완(> 30분)은 색소체 리포칼린 단백질(19,20)에 의해 매개되는 PSII의 말초 안테나에서 지속적인 담금질되는 qH와 같은 광손상 담금질(qI)16 및 광손상(17,18)과 무관하게 처리되는 과정 모두를 포함할 수 있다.

NPQ는 높은 빛에 노출되는 동안 증가합니다. 저조도로의 후속 전달은 NPQ의 하향 조절을 초래할 수 있습니다. 빠르고, 중간이며, 느린 이완 단계의 붕괴는 이중 지수 함수15,21,22,23의 파라미터에서 포착될 수 있다.

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

이중 지수 함수에 대한 이론적 근거는 qE (Aq1), qZ 및 qT (Aq2)의 결합 된 완화, 해당 시간 상수 τq1 및 τq2, qI 및 광손상 독립적 프로세스 (Aq3)를 포함하는 장기 NPQ를 포함한 가상의 담금질기의 1 차 활용 가정을 기반으로합니다. 이와 같이, 이지수 함수는 이론적 근거(24)가 결여된 더 단순한 힐 방정식에 비해 엽록소 형광을 담금질하는데 관여하는 다중 연결된 생물학적 과정의 보다 현실적인 표현을 제공한다.

NPQ는 간단한 핸드헬드 장치(27)로부터 보다 진보된 폐쇄 시스템(28)에 이르기까지 다양한 상업적으로 이용가능한 PAM 플루오로미터(25,26)를 사용하여 측정될 수 있다. 그러나 이러한 접근법 중 몇 가지의 한계는 상대적으로 낮은 처리량으로 인해 여러 장치와 연구원 팀 없이는 대규모 식물 컬렉션을 선별하는 것이 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 McAusland et al.은 절제된 잎 조직을 기반으로 한 절차를 개발하여 두 밀 품종29 사이의 엽록소 형광의 차이를 확인하는 데 사용했습니다. 이 접근법의 매력은 단일 장치로 여러 식물에서 가져온 잎 디스크를 이미징하면 하루 내에 수백 개의 유전자형을 쉽게 선별 할 수 있다는 것입니다. 이것은 게놈 광범위한 연관 연구의 일환으로 NPQ 이완의 변이를 평가하거나 작물 광합성 효율을 높이고 궁극적으로 수확 할 수있는 잠재력을 가진 번식 집단을 스크리닝하는 것을 가능하게합니다.

McAusland et al.29의 발견을 바탕으로, 우리는 글리신 맥스 (G.max; 대두)에서 NPQ 이완 속도의 높은 처리량 스크리닝을 위해 잎 디스크의 PAM 엽록소 형광 분석을 사용합니다. 이 프로토콜은 널리 사용되는 FluorCam26과 같은 상업적으로 이용 가능한 다른 폐쇄 PAM 시스템과 비교할 수있는 CF Imager25를 사용합니다. 샘플을 적응시킬 수 있는 어두운 공간을 통해 사용자는 96웰 플레이트, 페트리 접시 및 작은 식물을 이미지화할 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 개별 식물의 순차적 분석과 비교하여 리프 디스크를 사용하여 제공되는 처리량이 증가한다는 것입니다. 본원에서 우리는 대표적인 결과, 및 현장 재배 식물에서 NPQ의 샘플링, 측정 및 분석을 위한 방법을 제시한다.

Protocol

1. 종자 심기 비옥하고 배수가 잘되지만 모래 토양이 아니며 pH가 거의 6.5 인 밭을 선택하십시오. 괭이로 땅을 득점하여 0.75m 간격의 1.2m 행 플롯을 표시하십시오. 토양 온도가 25 ~ 30 ° C 사이인 성장기 초에 각 플롯을 따라 3cm 깊이에서 G.max cv. IA3023의 50 종자 / m를 심습니다.참고 : 유전 적 다양성을 스크리닝하기 위해 여러 가지 다른 유전자형이 성장하고 비교 ?…

Representative Results

도 1A는 현장 성장 대두에서 NPQ의 전형적인 측정을 묘사한다. 식물은 2021 년 여름 동안 일리노이 주 우르바나 (위도 40.084604 °, 경도 -88.227952 °)에서 재배되었으며 씨앗은 6 월 5 일에 심어졌습니다. 2021. 잎 디스크는 종자를 심은 지 30 일 후에 샘플링되었고, 제공된 프로토콜로 측정이 이루어졌다(표 1). Fv/Fm 및 NPQ 값은 각 리프 디스크에 대해 계산되었?…

Discussion

리프 디스크의 신중한 선택과 취급은 NPQ의 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위해 매우 중요합니다. 첫째, 핀셋으로 거친 취급과 같은 조직의 손상은 스트레스를 유발하여 광합성의 최대 양자 효율에 대한 낮은 값을 초래합니다. 비응력 플랜트는 일반적으로 약 0.8318의 F v/Fm 값을 가지며, 광합성 성능의 감소를 나타내는 상당한 감소를 나타냅니다<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 Bill & Melinda Gates Foundation, Food and Agriculture Research 재단 및 영국 외국, 연방 및 개발 사무소가 보조금 번호 OPP1172157로 자금을 지원하는 연구 프로젝트 RIPE (Realize Increase Photosynthetic Efficiency)에 의해 지원됩니다.

Materials

24 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012929 Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012931 Country of Origin: United States of America
Aluminum foil Antylia Scientific  61018-56 Country of Origin: United States of America
Black marker pen Sharpie SAN30001 Country of Origin: United States of America
CF imager Technologica Ltd. N/A chlorophyll fluorescence imager
Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm Humboldt Mfg Co H9665 Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software Technologica Ltd. N/A imaging software
Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters Amazon  B07P6XCTGV Country of Origin: United States of America
Marker stakes John Henry Company KN0151 Country of Origin: United States of America
Paper scissors VWR 82027-596 Country of Origin: United States of America
Parafilm Bemis Company Inc.  S3-594-6 Semi -transparent flexible film
Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers Fisher Scientific 14-130M Country of Origin: United States of America
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Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M., Hinkle, A., Kromdijk, J., Burgess, S. J. High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry. J. Vis. Exp. (185), e63485, doi:10.3791/63485 (2022).
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