Summary
이 프로토콜은 펄스 진폭 변조된 엽록소 형광 측정법에 의한 비광화학적 담금질의 완화를 측정하기 위한 고처리량 방법을 도입한다. 이 방법은 현장에서 자란 글리신 맥스 에 적용되며 유전 적 다양성 또는 번식 집단을 스크리닝하기 위해 다른 종에 적응할 수 있습니다.
Abstract
광합성은 현대 작물 품종에 최적화되어 있지 않으므로 개선의 기회를 제공합니다. 비 광화학 담금질 (NPQ)의 완화를 가속화하는 것은 광합성 성능을 향상시키는 효과적인 전략으로 입증되었습니다. 그러나, NPQ 개선을 위한 번식 가능성 및 NPQ 완화의 유전적 기초에 대한 완전한 이해는 현장 재배 작물 식물로부터의 오버샘플링 및 데이터 수집의 한계로 인해 부족하다. 이전 보고서를 기반으로 펄스 진폭 변조 (PAM) 엽록소 형광 측정법을 사용하여 글리신 맥스 (대두)에서 NPQ 이완 속도를 분석하기위한 고처리량 분석을 제시합니다. 잎 디스크는 실험실로 운반하기 전에 현장에서 재배 한 콩에서 샘플링되어 NPQ 이완이 폐쇄 된 PAM 형광계에서 측정됩니다. NPQ 이완 파라미터는 고조도에서 저조도로의 전환 후 측정된 NPQ 값에 이중 지수 함수를 피팅하여 계산됩니다. 이 방법을 사용하면 하루 안에 수백 개의 유전자형을 테스트 할 수 있습니다. 이 절차는 NPQ 완화의 변이에 대한 돌연변이 및 다양성 패널을 선별 할 수있는 잠재력을 가지고 있으므로 기본 및 응용 연구 질문 모두에 적용될 수 있습니다.
Introduction
광합성은 광흡수, 일차 전자 전달, 에너지 안정화, 광합성 생성물의 합성 및 수송1로 구성된다. 각 단계를 이해하는 것은 작물 광합성 효율을 높이기위한 노력을 안내하는 데 중요합니다. 빛은 광합성 속도에 영향을 미치며, 광자의 형태로 에너지 공급의 균형을 맞추어야하며 등가물을 줄이기위한 수요가 필요합니다. 공급이 수요를 초과할 때, 예를 들어 고조도 하에서, 또는 구내성 폐쇄에 의해 야기된CO2 고정의 감소된 동안, 환원 전력의 축적은 광합성 장치를 손상시키고 전자 수송을 손상시킬 가능성이 있는 반응성 산소 종 형성의 확률을 증가시킨다. 따라서 손상을 방지하기 위해 식물은 반응성 산소 종의 해독 및 여기된 엽록소 상태 (NPQ)2의 비 광화학적 담금질을 포함한 몇 가지 광보호 메커니즘을 개발했습니다.
높은 광합성 속도를 유지하는 것은 현장 환경에서 어려운 일입니다. 계절 및 일주일 변화는 바람으로 인한 잎 움직임 및 일시적인 구름 덮개와 같은 환경 변동과 함께 광합성을 위해 식물이받는 빛의 양과 강도의 변화를 일으킵니다 3. NPQ는 과도한 광 에너지를 방출하고 고조도에서 지속적인 광합성 속도를 허용하면서 광손상을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다4. 그러나, 고조도 전이 동안 연장된 NPQ는 탄소 감소5에 사용될 수 있는 에너지를 계속 소산시킨다. 결과적으로 NPQ의 이완을 가속화하면 광합성6의 효율을 높일 수 있으므로 NPQ 완화는 작물 개선을위한 매력적인 대상이됩니다.
펄스 진폭 변조된 엽록소 형광(PAM) 분석은 측정 가능한 파라미터(보충 표 1 및 보충 표 2)7,8,9로부터 NPQ를 계산하는데 사용될 수 있다. 이 기사는 생식 형질의 자연 변이를 스크리닝하기 위해 현장 재배 식물에서 NPQ 이완률을 결정하는 데 중점을 둡니다. 그러나, PAM 엽록소 형광 분석 분석은 또한 조류에서 고등 식물에 이르는 종에 적용되는 매우 다양한 목적을 위해 사용될 수 있으며,다른 곳에서 검토된다 7,8,9.
어두운 적응 잎 또는 세포에서, 광계 II (PSII) 반응 센터는 전자를 받기 위해 개방되어 있으며 NPQ는 없다. 저강도 측정광을 켜면 엽록소 형광을 유도하면서 PSII를 통한 전자 수송을 피할 수 있습니다. 이러한 암적응 상태에서 기록된 최소 형광은 파라미터 Fo에 의해 설명된다. 어두운 적응 잎에 고강도 광 펄스를 적용하면 퀴논 A 부위에 결합된 퀴논의 첫 번째 안정한 전자 수용체 풀을 빠르게 감소시킬 수 있다. 이것은 일시적으로 PSII 반응 센터의 전자 전달 능력을 차단하며, PSII 반응 센터는 폐쇄되어 물 분해로 전자를 수신 할 수 없다고합니다. 짧은 펄스 지속 시간을 사용함으로써, NPQ를 자극할 시간이 불충분하다. 생성된 엽록소 형광은 NPQ 또는 최대 형광, Fm의 부재 하에 수득가능한 최대값과 동등하다. 최소 형광과 최대 형광의 차이는 가변 형광, Fv로 지칭된다. 광계 II (Fv /Fm)의 최대 광화학 양자 수율은 다음 방정식을 사용하여이 두 매개 변수에서 계산됩니다.
Fv/F m = (F m-Fo)/F m
이것은 광계 기능과 스트레스의 중요한 지표를 제공 할 수 있습니다. actinic (광합성) 빛을 켜면 비 광화학 담금질이 자극되며, 포화 플래시의 후속 적용은 광에 적응 된 최대 형광 인 FM '의 측정을 가능하게합니다. 어두운 형광과 광적응된 최대 형광의 차이를 비교함으로써, NPQ는 스턴-볼머 방정식10에 따라 계산될 수 있다:
NPQ = F m / Fm ' - 1
고등 식물에서, NPQ는 qE, qT, qZ, qI 및 qH를 포함하는 적어도 다섯 개의 별개의 성분으로 구성된 것으로 기술되었다. NPQ와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 그러나 qE는 대부분의 플랜트에서 NPQ의 주요 구성 요소로 간주됩니다. qE의 완전한 참여를 위한 결정적인 인자는 틸라코이드 막을 가로지르는 양성자 구배의 축적, 광계 II 서브유닛 S11,12의 활성, 및 탈에폭시화된 크산토필, 안테락산틴, 루테인, 및 특히 제아잔틴13을 포함하는 것으로 밝혀졌다. qE는 모든 NPQ 성분 중 가장 빠른 속도를 완화시키며(< 2분)14, 따라서 qE의 가역적 활성화는 시프팅 광도에 대한 적응에 특히 중요하다. NPQ 완화의 두 번째 느린 단계 (~ 2-30 분)는 상태 전이와 관련된 qT와 제아잔틴을 비올라잔틴15로 상호 변환하는 qZ를 모두 포함합니다. NPQ의 느린 이완(> 30분)은 색소체 리포칼린 단백질(19,20)에 의해 매개되는 PSII의 말초 안테나에서 지속적인 담금질되는 qH와 같은 광손상 담금질(qI)16 및 광손상(17,18)과 무관하게 처리되는 과정 모두를 포함할 수 있다.
NPQ는 높은 빛에 노출되는 동안 증가합니다. 저조도로의 후속 전달은 NPQ의 하향 조절을 초래할 수 있습니다. 빠르고, 중간이며, 느린 이완 단계의 붕괴는 이중 지수 함수15,21,22,23의 파라미터에서 포착될 수 있다.
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
이중 지수 함수에 대한 이론적 근거는 qE (Aq1), qZ 및 qT (Aq2)의 결합 된 완화, 해당 시간 상수 τq1 및 τq2, qI 및 광손상 독립적 프로세스 (Aq3)를 포함하는 장기 NPQ를 포함한 가상의 담금질기의 1 차 활용 가정을 기반으로합니다. 이와 같이, 이지수 함수는 이론적 근거(24)가 결여된 더 단순한 힐 방정식에 비해 엽록소 형광을 담금질하는데 관여하는 다중 연결된 생물학적 과정의 보다 현실적인 표현을 제공한다.
NPQ는 간단한 핸드헬드 장치(27)로부터 보다 진보된 폐쇄 시스템(28)에 이르기까지 다양한 상업적으로 이용가능한 PAM 플루오로미터(25,26)를 사용하여 측정될 수 있다. 그러나 이러한 접근법 중 몇 가지의 한계는 상대적으로 낮은 처리량으로 인해 여러 장치와 연구원 팀 없이는 대규모 식물 컬렉션을 선별하는 것이 어렵습니다. 이 문제를 해결하기 위해 McAusland et al.은 절제된 잎 조직을 기반으로 한 절차를 개발하여 두 밀 품종29 사이의 엽록소 형광의 차이를 확인하는 데 사용했습니다. 이 접근법의 매력은 단일 장치로 여러 식물에서 가져온 잎 디스크를 이미징하면 하루 내에 수백 개의 유전자형을 쉽게 선별 할 수 있다는 것입니다. 이것은 게놈 광범위한 연관 연구의 일환으로 NPQ 이완의 변이를 평가하거나 작물 광합성 효율을 높이고 궁극적으로 수확 할 수있는 잠재력을 가진 번식 집단을 스크리닝하는 것을 가능하게합니다.
McAusland et al.29의 발견을 바탕으로, 우리는 글리신 맥스 (G.max; 대두)에서 NPQ 이완 속도의 높은 처리량 스크리닝을 위해 잎 디스크의 PAM 엽록소 형광 분석을 사용합니다. 이 프로토콜은 널리 사용되는 FluorCam26과 같은 상업적으로 이용 가능한 다른 폐쇄 PAM 시스템과 비교할 수있는 CF Imager25를 사용합니다. 샘플을 적응시킬 수 있는 어두운 공간을 통해 사용자는 96웰 플레이트, 페트리 접시 및 작은 식물을 이미지화할 수 있습니다. 이 접근법의 주요 장점은 개별 식물의 순차적 분석과 비교하여 리프 디스크를 사용하여 제공되는 처리량이 증가한다는 것입니다. 본원에서 우리는 대표적인 결과, 및 현장 재배 식물에서 NPQ의 샘플링, 측정 및 분석을 위한 방법을 제시한다.
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Protocol
1. 종자 심기
- 비옥하고 배수가 잘되지만 모래 토양이 아니며 pH가 거의 6.5 인 밭을 선택하십시오. 괭이로 땅을 득점하여 0.75m 간격의 1.2m 행 플롯을 표시하십시오.
- 토양 온도가 25 ~ 30 ° C 사이인 성장기 초에 각 플롯을 따라 3cm 깊이에서 G.max cv. IA3023의 50 종자 / m를 심습니다.
참고 : 유전 적 다양성을 스크리닝하기 위해 여러 가지 다른 유전자형이 성장하고 비교 될 것으로 예상됩니다. 유전자형 당 2-5 행의 식물은 무작위 블록 설계로 배열됩니다. 기후 조건이 토양 유형, 온도 및 하루 길이를 포함하여 콩의 성장에 적합한지 여부를 고려해야합니다.
2. 현장에서 잎 샘플 수집
- 발아 후 30 일 후에 현장 사이트에서 식물을 샘플링하십시오.
참고 : 30 일 후에 콩 식물은 식물 단계에있을 것입니다. 샘플링 전 발아 후 일수는 다루어지는 생물학적 질문에 달려 있습니다. - 24웰 플레이트의 웰을 증류수로 1/3까지 채웁니다. 뚜껑과 플레이트의 측면에 샘플링할 반복실험으로 라벨을 붙입니다.
- 샘플링 할 식물 상단에서 가장 어린 완전히 확장 된 잎을 선택하십시오. 잎을 고무 마개에 대고 잡으십시오.
- #2 훔볼트 코르크 보어를 잎을 통해 누르고 비틀어서 미드 리브를 피하면서 디스크를 자릅니다. 기술 반복실험을 위해 동일한 리프에서 5개의 디스크를 연속적으로 수집합니다. 이동 중 또는 샘플링으로 인해 잎 조직이 손상된 경우 필요한 것보다 각 플롯에 대해 약 30 % 더 많은 잎 디스크를 가져 가십시오.
참고: 생물학적 반복실험(플롯 또는 식물)의 수와 기술 반복실험 횟수(동일한 플랜트 또는 플롯의 리프 디스크)는 실험 설계에 따라 달라질 수 있습니다. - 코튼 면봉을 사용하여 코르크 보어에서 잎 디스크를 24 웰 플레이트의 단일 웰로 밀어 넣으십시오. 모든 리프 디스크가 물에 떠 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 우물 측면에 달라 붙은 잎 디스크를 면봉으로 떠있는 위치로 부드럽게 옮깁니다.
- 다음 플롯으로 이동하고 2.3~2.5단계를 반복합니다. 코크 보러에서 잎 디스크를 면봉을 사용하여 24 웰 플레이트의 별도의 웰로 밀어 넣으십시오. 이 단계를 반복하여 세 번째 생물학적 복제를 수집합니다.
- 완전한 24웰 플레이트가 샘플링될 때까지 2.6단계를 반복한다. 뚜껑을 덮고 반투명하고 유연한 필름으로 밀봉하십시오. 접시를 직사광선, 가방, 상자 또는 빈 냉각기(얼음 없음)에 보관하십시오.
3. 분석을 위한 샘플 준비
- 샘플링 후 깨끗한 실험실 공간으로 돌아갑니다. 밀봉된 플레이트의 뚜껑을 탭하여 운반 중에 뚜껑에 붙어 있는 리프 디스크를 제거합니다. 필름 포장을 풀고 뚜껑을 분리합니다.
- 잎 디스크를 24웰 플레이트의 첫 번째 위치에서 신선한 96웰 플레이트로 옮기고, 잎 디스크는 웰 바닥에서 평평하게 아래로 향하게 합니다.
- 비강 흡입기 필터를 반으로 자릅니다. 생성 된 필터를 물에 반쯤 담그고 종이 타월에 담그면 과도한 액체를 제거하십시오. 습도를 유지하기 위해 리프 디스크가있는 우물에 필터를 삽입하십시오.
- 24웰 플레이트의 첫 번째 위치에서 두 번째 리프 디스크를 가져와 96웰 플레이트의 다음 사용 가능한 위치에 아래로 향하게 놓습니다. 단계 3.3에서 생성된 비강 필터의 나머지 절반을 물에 담그고 종이 타월에 담그고 두 번째 잎 디스크로 웰에 삽입하십시오.
- 24웰 플레이트의 첫 번째 위치에서 세 번째 리프 디스크에 대해 3.3~3.4단계를 반복합니다.
- 24웰 플레이트의 두 번째 위치로 이동하고 3.3~3.5단계를 반복합니다.
- 모든 웰에 리프 디스크와 비강 흡입기 필터가 삽입된 경우 뚜껑을 플레이트에 놓습니다. 이미징을 위해 플레이트의 방향을 맞추기 위해 오른쪽 상단 모서리에 테이프를 붙입니다.
- 플레이트를 반투명하고 유연한 필름으로 밀봉하고 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸십시오. 플롯 ID와 플레이트 ID를 알루미늄 호일에 씁니다.
- NPQ의 처음 두 단계 (qE, qT, qZ)의 이완을 위해 최소 30 분 동안 어두운 상자 또는 캐비닛에 플레이트를 놓습니다. NPQ의 장기 단계가 관심이있는 경우 이미징 전에 1 시간의 더 길고 어두운 잠복기를 사용하십시오.
- 분석 중에 초점을 맞추기 위해 추가 더미 플레이트를 준비하십시오. 이렇게하려면 잎 디스크를 신선한 96 웰 플레이트의 각 모서리에 놓고 중앙에 하나씩 놓습니다. 이전 플레이트와 마찬가지로 비강 필터로 리프 디스크를 고정하십시오. 플레이트를 밀봉하고 실온(24°C), ∼50% 상대 습도의 어둠 속에서 인큐베이션한다.
4. 엽록소 형광 이미저를 이용한 비광화학적 담금질 측정
- 이미저를 켜고 이미징 소프트웨어를 엽니다. 설정 > 프로토콜을 클릭하여 PAM 실험 프로토콜의 단계 입력을 위한 창을 엽니다. 기계의 기술 사양은 보충 표 3에 나와 있습니다.
- 포화 펄스로 시작하여 상자에 20 초를 입력하여 어두운 적응 광합성의 최대 양자 효율을 측정하도록 프로그램을 설정하십시오 : 지연 후. 펄스 적용 상자를 클릭하고 상자에 1을 입력합니다: 이 횟수.
- 펄스 PPFD를 6152로, 펄스 길이를 800ms로 설정하고, 모든 펄스로 F' & Fm' 이미지 가져 오기 상자를 선택합니다. 다음에 삽입 을 클릭하여 프로토콜에 두 번째 단계를 추가합니다.
- 상자에 30초를 입력합니다: 지연 후. 악티닉 변경 옵션을 선택하고 상자에 50을 입력합니다: Actinic PPFD, 챔버의 광도를 50PPFD로 설정합니다.
- 다음에 삽입을 클릭하여 프로토콜에 새 단계를 추가합니다. 상자에 150초 입력: 지연 후 펄스 적용을 선택하고 상자에 4를 입력합니다: 이 횟수로, 악티닉 라이트가 50PPFD로 유지되는 동안 150초마다 4배 연속으로 측정 펄스를 적용합니다.
- 프로토콜의 완전한 정보는 표 1에 제공되고, 단계 4.2 및 4.3을 사용하여 광 강도를 변경하고, 포화 펄스의 사이클을 입력하기 위해 단계 4.4 및 4.5를 사용한다. 표 1에 제공된 값에 따라 각 단계의 지연 및 광 강도를 조정한다. 프로토콜을 알려진 위치에 .pcl 파일로 저장합니다.
- 조명을 끄고 더미 플레이트를 샘플 스테이지에 놓고 샘플 스테이지 높이를 설정하여 리프 디스크가 장비 바닥보다 140mm 높이가 되도록 합니다. 더미 플레이트는 초점을 맞출 때 빛이 반복적으로 플레이트 위에 깜박이기 때문에 사용됩니다. 이를 위해서는 측정해야 할 샘플의 다시 어두운 적응이 필요하며 광손상을 일으킬 수 있습니다.
- 이미 저 카메라 및 하드웨어 카메라에 연결/연결 끊 기 아이콘을 클릭하여 카메라를 시작합니다. 밑면에 두 개의 녹색 선이 있는 빨간색 양면 화살표 아이콘으로 표시되는 초점(형광) 기호를 클릭합니다. 렌즈와 노출을 조정하여 플레이트에 초점을 맞춥니다.
- 초점(형광) 아이콘을 다시 클릭하여 깜박이는 빛을 끕니다. 어둠 속에서 일하면서 더미 플레이트를 분석 할 플레이트로 교체하십시오.
- 지도 이미지 카메라 아이콘을 클릭합니다. 팝업 창의 막대가 녹색 영역에 위치할 때까지 조리개를 열거나 닫아 이미지 노출을 조정합니다.
- 조리개를 조정할 때마다 노출이 올바르게 조정되고 계측기가 이미지를 촬영할 때까지 다시 시도 단추를 클릭합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이미지 격리 적용 을 선택하여 배경 신호를 차단합니다. 초점이 맞춰진 리프 영역은 회색으로, 배경은 파란색으로 표시됩니다.
- 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 이미지 수정 풀다운 메뉴에서 히스토그램 및 감마 레벨을 조정하여 리프 디스크만 포함하도록 관심 영역/픽셀을 선택합니다.
- 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 높음 및 낮음 컷 삭제(색상 맵) 를 선택하여 연한 파란색으로 강조 표시된 영역을 삭제합니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 스트레이 삭제(헤비) 를 선택하여 적어도 세 개의 다른 픽셀을 건드리지 않는 픽셀을 제거합니다.
참고: 이미지의 격리된 섬으로 나타나는 모든 영역은 별도로 분석되어 최종 데이터 출력에 포함됩니다. 이미지 격리 및 빗나간 픽셀을 제거하면 깨끗하고 이해하기 쉬운 데이터가 생성됩니다. - 프로토콜 실행 아이콘을 클릭하여 프로그램을 시작하면 화면 하단에 프로토콜이 실행 될 때까지 남은 시간을 알려주는 타이머가 나타납니다.
- 프로토콜이 완료 될 때까지 기다렸다가 파일 > 다른 이름으로 저장을 클릭하고 데이터를 .igr 파일로 저장하십시오. 다른 샘플 플레이트 실행을 시작하기 전에 창의 오른쪽 상단에 있는 빨간색 십자선을 클릭하여 창을 닫습니다.
- 새로 > 파일을 선택하여 다음 샘플에 대한 새 파일을 열고 모든 플레이트가 측정될 때까지 4.10~4.15단계를 반복합니다.
참고 : 결과에 대한 일주기 규제의 잠재적 영향을 최소화하기 위해 4 시간 이하의 기간 내에 플레이트를 측정하는 것이 좋습니다.
5. 엽록소 형광 데이터 처리
- 이미징 소프트웨어에서 .igr 파일을 엽니다. 파일 > 폴더로 내보내기를 클릭하여 데이터를 내보내 필요한 모든 파일이 있는 새 폴더를 만듭니다.
- MapAndLabelDiscs.m(보충 파일 1), ProcessFoFm.m(보충 파일 2) 및 ProcessNPQdata.m(보충 파일 3) 및 R 파일: create_file_to_process의 다음 세 가지 MATLAB 파일을 결과 폴더에 복사합니다. R (보충 파일 4).
- MATLAB에서 MapAndLabelDiscs.m(보충 파일 1)을 열고 실행합니다. 팝업 창에서 생성된 번호가 매겨진 리프 디스크의 맵을 .png 파일로 저장하여 리프 디스크 번호 매기기를 나중에 확인합니다.
- MATLAB에서 ProcessFoFm.m(보충 파일 2) 파일을 열고 실행하여 각 리프 디스크의 Fo 및 FM 값을 계산합니다. ProcessNPQdata.m(보충 파일 3)을 실행하여 각 시점에서 NPQ 값을 계산합니다.
- 파일 create_file_to_process를 엽니다. Rstudio의 R (보충 파일 4)을 클릭하고 5 행의 코드에 날짜를 추가하십시오. create_file_to_process.R.의 8행에 플레이트 번호를 추가합니다.
- create_file_to_process을 실행합니다. R을 사용하여 Fv/FM 값과 NPQ 데이터를 접미사 -cf-summary.csv를 사용하여 데이터의 이름을 따서 명명된 하나의 파일로 통합합니다. 5.3단계의 .png 파일을 사용하여 5.5단계의 cf-요약 파일에서 리프 디스크 번호 매기기를 확인합니다. 플롯 번호 및 가입과 관련된 추가 기능 정보.
- R 스크립트 CF-data-processing_2.R(보충 파일 5)을 열고 줄 13을 작업 디렉토리 경로로 변경하십시오. CF-data-processing_2.R의 16행을 5.5단계에서 파일 이름으로 변경합니다.
- CF-data-processing_2.R의 48행을 출력 파일의 이름으로 변경합니다. 스크립트 CF-data-processing_2.R을 실행하여 커브 피팅에 대한 데이터의 형식을 다시 지정합니다.
- MATLAB에서 스크립트 MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m(보충 파일 6)을 열고 5행을 5.8단계의 출력 파일 이름으로 변경합니다. MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m의 85 행을 새 출력 파일 이름으로 변경하십시오. 스크립트 MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m을 실행하여 NPQ 완화 매개 변수를 계산합니다.
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Representative Results
도 1A는 현장 성장 대두에서 NPQ의 전형적인 측정을 묘사한다. 식물은 2021 년 여름 동안 일리노이 주 우르바나 (위도 40.084604 °, 경도 -88.227952 °)에서 재배되었으며 씨앗은 6 월 5 일에 심어졌습니다. 2021. 잎 디스크는 종자를 심은 지 30 일 후에 샘플링되었고, 제공된 프로토콜로 측정이 이루어졌다(표 1). Fv/Fm 및 NPQ 값은 각 리프 디스크에 대해 계산되었고(보충 표 4), NPQ 이완 파라미터는 이중 지수 함수를 피팅하여 계산되었다(표 2). Fv/Fm을 결정하기 위해 초기 포화 플래시를 측정한 후, 리프 디스크는 저조도(50μmol m-2s-1)에 노출되었고 측정된 NPQ는 < 1이었다(그림 1A). 고조도(2000 μmol m-2 s-1)로 이송되면, NPQ는 15분 후에 최대값 4에 도달하여 증가하였다. 저조도로의 복귀로 NPQ (Aq1)의 초기 감소가 1.07 분 (τq1)의 시간 상수로 발생했으며 24.5 분 (τq2)의 시간 상수를 갖는 2 느린 이완 단계 (Aq2)가 뒤 따랐다. 프로토콜의 끝에 남아있는 잔여 NPQ(∼0.5)는 상수(Aq3)에 의해 포획되었다.
그림 1B는 실패한 측정의 예를 보여줍니다. 높은 빛으로 옮겨지면 NPQ (0.38)가 최소한으로 증가하여 긴장을 풀지 않습니다. 데이터를 면밀히 검사한 결과, 리프 디스크의 응력(0.27)을 나타내는 낮은 Fv/FM 값을 가지며 데이터를 폐기해야 합니다.
도 1: 현장 성장 대두를 이용한 NPQ 측정 데이터. (A) G.max cv. IA3023의 NPQ 활성화 및 이완 동역학. 데이터는 표준 편차를 나타내는 오차 막대가 있는 다섯 개의 생물학적 (별개의 필드 플롯) 및 세 개의 기술적(동일한 플롯의 리프 디스크) 반복실험의 평균으로 표시됩니다. (b) G.max cv. IA3023을 사용한 실패한 기술 복제의 예(n=1). 그래프 상단의 회색 및 흰색 막대는 2000 μmol m-2 s-1(흰색 막대)의 광합성 광자 플럭스 밀도 (PPFD), 50 μmol m-2 s-1 (회색 막대)의 PPFD로 조명 기간을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 걸음 | 지연 | 행동 | 사이클 | PPFD (μmol m-2 s-1) |
| 1 | 0초 | 변경 액티닉 | - | 0 |
| 2 | 20초 | 펄스 적용 | 1 | 6152 |
| 3 | 30초 | 변경 액티닉 | - | 50 |
| 4 | 150초 | 펄스 적용 | 4 | 6152 |
| 5 | 30초 | 변경 액티닉 | - | 2000 |
| 6 | 150초 | 펄스 적용 | 6 | 6152 |
| 7 | 0초 | 변경 액티닉 | - | 50 |
| 8 | 150초 | 펄스 적용 | 2 | 6152 |
| 9 | 5 분 | 펄스 적용 | 9 | 6152 |
| 10 | 20초 | 변경 액티닉 | - | 0 |
표 1: 이미저와 함께 사용되는 엽록소 형광 이미징 프로토콜.
| 담당자 | aq1 | τq1 / 분 | aq2 | τq2 / 분 | Aq3 | 최대 NPQ | R2 |
| 1 | 2.00 | 1.12 | 1.88 | 16.62 | 0.29 | 4.17 | 0.9999 |
| 2 | 2.14 | 1.17 | 1.70 | 13.68 | 0.34 | 4.17 | 0.9999 |
| 3 | 1.82 | 0.78 | 1.88 | 18.42 | 0.36 | 4.05 | 0.9997 |
| 4 | 2.05 | 1.28 | 1.67 | 26.89 | 0.15 | 3.87 | 0.9999 |
| 5 | 1.72 | 1.01 | 1.81 | 21.22 | 0.52 | 4.05 | 0.9998 |
| 평균의 | 1.94 | 1.07 | 1.79 | 19.37 | 0.33 | 4.06 | |
| 증권 시세 표시기 | 0.17 | 0.19 | 0.10 | 5.02 | 0.13 | 0.12 |
표 2: G.max cv. IA3023에 대한 NPQ 이완 파라미터를 계산하였다. Aq1, Aq2 및 Aq3에 대한 값은 단위가 없으며, τq1 및 τq2에 대한 값은 최소로 보고됩니다. 약어: MaxNPQ = 빛에 기록된 최대 NPQ 값, Rep = 단일 플롯에 해당하는 생물학적 복제 수, 여기서 이중 지수 함수는 3개의 기술적 반복실험(리프 디스크)을 사용하여 적합합니다. S.D.는 표준 편차를 나타냅니다.
보충 표 1: 원고에 사용 된 방정식에 대한 설명. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 2: 원고에서 논의 된 매개 변수 값에 대한 설명. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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보충 표 4: 제공된 프로토콜을 사용하여 G.max cv. IA3023 리프 디스크의 F v/FM및 NPQ 값을 계산했습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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보충 파일 2: 이미저 및 보충 파일 1에서 제공하는 데이터 출력을 사용하여 리프 디스크당 Fo, Fm, Fm' 및 Fv/Fm 값을 계산하는 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : 보충 파일 2의 데이터 출력을 사용하여 프로토콜 동안 각 시점에서 리프 디스크당 NPQ 값을 계산하는 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4: 보충 파일 3의 출력에 보조 파일 2에 의해 계산된 Fv/FM 값으로 주석을 추가하는 R 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5 : 보충 파일 4 의 데이터를 다시 포맷하여 이중 지수 감쇠 함수를 완화 후 계산된 NPQ 값에 맞출 수 있도록 하는 R 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6 : NPQ 값을 계산하고 보충 파일 5의 데이터 출력을 사용하여 완화 매개 변수를 계산하는 이중 지수 감쇠 함수 에 맞추는 스크립트입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
리프 디스크의 신중한 선택과 취급은 NPQ의 신뢰할 수 있는 측정을 얻기 위해 매우 중요합니다. 첫째, 핀셋으로 거친 취급과 같은 조직의 손상은 스트레스를 유발하여 광합성의 최대 양자 효율에 대한 낮은 값을 초래합니다. 비응력 플랜트는 일반적으로 약 0.8318의 F v/Fm 값을 가지며, 광합성 성능의 감소를 나타내는 상당한 감소를 나타냅니다9. 그러나, 현장 조건 하에서 성장한 식물은 전형적으로 경미한 스트레스를 경험하며, 따라서 FvFm > 0.75의 역치는 광합성 감소(30)의 시작에 대한 한계로서 이것을 선택한 이전 연구에 따라 포함되도록 설정되었다. 리프 디스크를 제자리에 고정하는 데 사용되는 비강 흡입기 필터의 취급은 또 다른 일반적인 문제의 원인입니다. 비강 흡입기 필터가 과포화되면 과도한 물은 잎 생리학에 부정적인 영향을 미치고 또한 낮은 양자 효율로 이어집니다. 다른 브랜드가 다른 양의 물을 보유 할 수 있으므로 실험 전반에 걸쳐 동일한 브랜드를 사용해야합니다. 셋째, 현장에서 재배 한 식물은 강우량, 온도, 습도 및 곤충 압력의 차이와 함께 변동하는 환경을 경험합니다. 식물의 성장 단계는 또한 엽록소 형광의 효율성에 기여합니다. 엽록산 잎이나 광범위한 해충 피해는 샘플링 할 때 피해야합니다. 비교를 할 때, 유사한 발달 단계에서 잎을 일관되게 선택하는 것은 실험 소음을 줄이는 데 필수적입니다. 비광화학적 담금질의 활성화 및 이완 속도는 잎 나이와 식물 발달 단계31에 따라 달라질 수 있으며, 이는 광 흡수, 엽록체 발달, 에너지 상태 및 장기 음영 사이의 균형의 차이의 결과입니다. 따라서 전형적인 선택은 가장 최근에 완전히 팽창 된 잎의 비율을 성숙한 엽록체와 비교하는 것입니다.
이 프로토콜은 현장에서 재배 된 콩의 분석을 위해 설계되었지만 온실 재배 물질 또는 기타 고등 식물의 샘플링 및 측정을 위해 수정 될 수 있습니다. 프로토콜을 조정할 때 몇 가지 고려 사항이 중요합니다. 첫째, 소음을 줄이고 바이어스의 도입을 피하기 위해 실험 설계를 고려해야합니다. 이 분야에서, 대두 유전자형은 일반적으로 연속으로 50-100 식물의 플롯에서 성장하며, 각 플롯은 단일 생물학적 복제물로 간주됩니다. 각 플롯은 전체 식물 생리학에 영향을 줄 수있는 다양한 토양, 노출 및 배수 조건을 경험할 수 있습니다. 따라서 랜덤 블록과 같은 적절한 플롯 설계를 선택하면 바이어스를 피하고 현장 변동성을 줄일 수 있습니다. 플롯 내에서 변동을 최소화하려면 여러 반복실험(세 번에서 다섯 번까지)을 측정하고 플롯 내에서 서로 다른 플랜트의 디스크를 가져가는 것이 좋습니다. 그러나 온실 또는 챔버 재배 재료로 작업 할 때 단일 식물은 동일한 잎에서 가져온 여러 디스크로 생물학적 복제를 구성 할 수 있습니다. 또한, 식물 위치는 경험 한 조건의 편향을 방지하기 위해 일주일에 여러 번 회전해야합니다. 둘째, 이 프로토콜에 사용된 화학광 강도는 일리노이에서 화창한 날에 대두 캐노피가 경험하는 최대 및 최소 광도를 반영합니다(W 88°13ʹ42ʺ/N 40°06ʹ31ʺ). 실험 설정 및 분석중인 식물에 따라 더 현실적인 측정 조건을 제공하기 위해 특정 성장 환경에 맞게 광도를 조정하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 샘플링 절차와 측정 프로토콜 모두 다른 폐쇄형 PAM 형광계 시스템과 함께 사용하도록 조정할 수 있으며, 측정 소프트웨어를 작동하는 데 필요한 단계를 지정된 장치에 맞게 조정해야 한다는 조항이 있습니다.
접근법의 주요 한계는 이중 지수 함수에 의해 계산 된 매개 변수 값의 해석입니다. NPQ에 기여하는 생물학적 과정이 종마다 다를 수 있기 때문에 다른 고등 식물 또는 조류에 절차를 적용하는 경우 특히 중요합니다. 예를 들어, 일부 이끼류와 조류는 PsbS가 아닌 LHCSR 단백질을 함유하고 있습니다 (검토를 위해32 참조). 또한, 생물학적 과정의 상대적 중요성은 상태 전이 또는 qT와 함께 다양 할 수 있으며, 이는 광수확 복합체의 최대 80 %가 광계 I과 II33 사이에서 가역적으로 이동할 수있는 고등 식물보다 조류에서 Aq2 성분의 더 중요한 부분을 나타냅니다. 따라서, 이지수 함수가 이완 동역학22,29를 지배하는 생물학적 과정을 설명하는 최선의 선택은 아닐 수 있으며, 이것은 선택의 종에 대해 경험적으로 평가되어야 한다는 것을 고려하여야 한다. 억제제 및 언커플러34,35의 적용 또는 돌연변이체21,23의 연구를 포함하는 신중한 실험은 NPQ 완화에 기여하는 과정에 대한 통찰력을 제공하기 위해 사용될 수 있지만, 결론을 도출하는 데에는 주의를 기울여야 한다.
여기에 제시된 방법은 챔버 재배 식물의 광합성 성능을 평가하기 위해 폐쇄 PAM 이미저를 사용한 McAusland et al.29의 방법과 유사합니다. 그러나, 잎 샘플을 96-웰 플레이트가 아닌 축축한 여과지 상에 배치하고, O2 및CO2 농도를 조절하기 위해 맞춤형 챔버에서 조직을 인큐베이션함으로써, McAusland 등은 광합성 파라미터29를 평가하는 더 넓은 범위의 측정을 수행할 수 있었다. 여기에 제시된 접근법의 주요 장점은 맞춤형 장비를 필요로하지 않는 방법의 단순성과 현장 재배 물질로부터 샘플을 수집 할 수있는 잎 조직의 초기 샘플링을위한 24 웰 플레이트의 사용, 잠재적으로 연구자가 스크리닝 할 수있는 유전자형의 수를 증가시키는 것입니다.
요약하면, PAM 엽록소 형광 분석은 광합성 효율의 측정을위한 강력한 기술입니다. 그러나 기존의 측정은 플랜트별로 수행되므로 걸리는 시간 또는 분석을 수행 할 수있는 인력 및 장비의 수만큼 스크리닝 용량이 제한됩니다. 96웰 플레이트에서 리프 디스크를 사용하면 많은 유전자형을 동시에 측정할 수 있는 수단을 제공하여 분석 처리량을 증가시킵니다. 단일 연구자(29)에 의해 짧은 시간 내에 많은 유전자형의 스크리닝을 용이하게 함으로써, NPQ 이완의 측정을 게놈 전체 연관 연구를 수행할 수 있는 잠재력을 가진 광합성의 천연 다양성을 스크리닝하는 데 적용할 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을보고하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 Bill & Melinda Gates Foundation, Food and Agriculture Research 재단 및 영국 외국, 연방 및 개발 사무소가 보조금 번호 OPP1172157로 자금을 지원하는 연구 프로젝트 RIPE (Realize Increase Photosynthetic Efficiency)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
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