Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Высокопроизводительный анализ нефотохимического закалки сельскохозяйственных культур с использованием флуорометрии с импульсно-амплитудной модуляцией хлорофилла

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63485
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,3, 1,2
1Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Plant Biology, Morrill Hall, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Environmental Plant Physiology group, Department of Plant Sciences, University of Cambridge

Summary

Протокол вводит высокопроизводительный метод измерения релаксации нефотохимического гашения импульсно-амплитудной флюорометрией хлорофилла. Метод применяется к выращиваемому в полевых условиях Glycine max и может быть адаптирован к другим видам для скрининга генетического разнообразия или размножающихся популяций.

Abstract

Фотосинтез не оптимизирован в современных сортах сельскохозяйственных культур, а потому дает возможность для улучшения. Ускорение релаксации нефотохимического закалки (NPQ) оказалось эффективной стратегией для повышения эффективности фотосинтеза. Тем не менее, потенциал для размножения для улучшения NPQ и полного понимания генетической основы релаксации NPQ отсутствует из-за ограничений перевыборки и сбора данных с растений, выращенных в полевых условиях. Основываясь на предыдущих отчетах, мы представляем высокопроизводительный анализ для анализа скорости релаксации NPQ в Glycine max (соя) с использованием флуорометрии хлорофилла с амплитудной амплитудой (PAM). Листовые диски отбираются из выращенных в полевых условиях соевых бобов перед транспортировкой в лабораторию, где релаксация NPQ измеряется в закрытом PAM-флуорометре. Параметры релаксации NPQ рассчитываются путем подгонки биэкспоненциальной функции к измеренным значениям NPQ после перехода от высокого к низкому освещению. Используя этот метод, можно протестировать сотни генотипов в течение дня. Эта процедура имеет потенциал для скрининга мутантных и разнообразных панелей на предмет вариаций в релаксации NPQ и, следовательно, может быть применена как к фундаментальным, так и к прикладным исследовательским вопросам.

Introduction

Фотосинтез состоит из поглощения света, переноса первичных электронов, стабилизации энергии, а также синтеза и переноса продуктов фотосинтеза1. Понимание каждого шага имеет жизненно важное значение для руководства усилиями по повышению эффективности фотосинтеза сельскохозяйственных культур. Свет влияет на скорость фотосинтеза, требуя балансировки энергоснабжения, в виде фотонов, с потребностью в уменьшении эквивалентов. Когда предложение превышает спрос, например, при сильном освещении или во время пониженной фиксацииСО2 , вызванной закрытием устьичного устьица, накопление восстановительной мощности увеличивает вероятность образования активных форм кислорода с потенциалом повреждения фотосинтетического аппарата и нарушения переноса электронов. Поэтому для предотвращения повреждений растения разработали несколько фотозащитных механизмов, включая детоксикацию активных форм кислорода и нефотохимическое гашение возбужденных хлорофилловых состояний (NPQ)2.

Поддержание высоких темпов фотосинтеза является сложной задачей в полевых условиях. Сезонные и суточные изменения, наряду с колебаниями окружающей среды, такими как вызванные ветром движения листьев и переходный облачный покров, вызывают сдвиги в количестве и интенсивности света, получаемого растениями для фотосинтеза3. NPQ рассеивает избыточную световую энергию и может помочь предотвратить повреждение фотографий, обеспечивая при этом устойчивые темпы фотосинтеза при высоком освещении4. Однако длительный NPQ во время переходов с высокой на низкую освещенность продолжает рассеивать энергию, которая может быть использована для сокращения выбросов углерода5. В результате ускорение релаксации NPQ может повысить эффективность фотосинтеза6, что делает релаксацию NPQ привлекательной целью для улучшения урожая.

Анализ флуоресценции хлорофилла (PAM) с амплитудной амплитудой может быть использован для расчета NPQ по измеримым параметрам (Дополнительная таблица 1 и Дополнительная таблица 2)7,8,9. Эта статья посвящена определению скорости релаксации NPQ в растениях, выращенных в полевых условиях, с целью скрининга естественной изменчивости зародышевой плазмы. Тем не менее, флюорометрический анализ PAM хлорофилла также может быть использован для широкого спектра целей, применен к видам, начиная от водорослей до высших растений, и рассматривается в других местах 7,8,9.

В адаптированном к темноте листе или ячейке реакционные центры фотосистемы II (PSII) открыты для приема электронов, и нет NPQ. Включение измерительного света низкой интенсивности вызывает флуоресценцию хлорофилла, избегая при этом переноса электронов через PSII. Регистрируемая минимальная флуоресценция в этом адаптированном к темноте состоянии описывается параметром Fo. Применение светового импульса высокой интенсивности к адаптированному к темноте листу может быстро уменьшить первый стабильный пул акцепторов электронов хинонов, связанных с сайтом хинона А. Это временно блокирует емкость переноса электронов в реакционных центрах PSII, которые затем, как говорят, закрыты и не могут принимать электроны от расщепления воды. При использовании короткой длительности импульса недостаточно времени для стимуляции NPQ. Результирующая флуоресценция хлорофилла эквивалентна максимальному значению, получаемому при отсутствии NPQ, или максимальной флуоресценции, Fm. Разница между минимальной и максимальной флуоресценцией называется переменной флуоресценцией, Fv. Максимальный фотохимический квантовый выход фотосистемы II (Fv/Fm) вычисляется из этих двух параметров с использованием следующего уравнения:

Fv/Fm = (Fm-F o)/Fm

Это может обеспечить важный показатель функции фотосистемы и напряжения. Включение актинического (фотосинтетического) света стимулирует нефотохимическое гашение, а последующее применение насыщенной вспышки позволяет измерить адаптированную к свету максимальную флуоресценцию, Fm'. Сравнивая разницу между темной и адаптированной к свету максимальной флуоресценцией, NPQ можно рассчитать в соответствии с уравнением Штерна-Вольмера10:

NPQ = Fм/Fм' - 1

В высших растениях NPQ был описан как состоящий по меньшей мере из пяти различных компонентов, включая qE, qT, qZ, qI и qH. Точные механизмы, задействованные в НПК, до конца не изучены; однако qE считается основным компонентом NPQ на большинстве заводов. Было обнаружено, что решающие факторы для полного включения qE включают накопление протонного градиента через тилакоидную мембрану, активность субъединицы фотосистемы II S11,12 и деэпоксидированные ксантофиллы, антераксантин, лютеин и, в частности, зеаксантин13. qE расслабляет быстрее всех компонентов NPQ (< 2 мин)14, и поэтому обратимая активация qE особенно важна для адаптации к изменяющейся интенсивности света. Вторая более медленная фаза релаксации NPQ (~2-30 мин) охватывает как qT, связанный с переходами состояний, так и qZ, включающий взаимопревращение зеаксантина в виолаксантин15. Медленное расслабление (> 30 мин) NPQ может включать как фотоингибаторное закалку (qI)16, так и процессы, независимые от фотоповреждения 17,18, такие как qH, которое является устойчивым закалкой в периферических усиках PSII, опосредованным пластидным липокалиновым белком 19,20.

NPQ увеличивается во время воздействия высокого света. Последующий переход на слабый свет может привести к понижению регуляции NPQ. Распад быстрой, промежуточной и медленной фаз расслабления может быть уловлен в параметрах биэкспоненциальной функции 15,21,22,23

NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3

Теоретическая основа биэкспоненциальной функции основана на предположении об использовании первого порядка гипотетических гасячей, включая qE (Aq1), комбинированную релаксацию qZ и qT (Aq2) с соответствующими временными константами τq1 и τq2 и долгосрочный NPQ, включающий qI и фотоповреждающие независимые процессы (Aq3). Таким образом, биэкспоненциальная функция обеспечивает более реалистичное представление множественных связанных биологических процессов, участвующих в гашении флуоресценции хлорофилла, по сравнению с более простым уравнением Хилла, которое не имеет теоретической основы24.

NPQ может быть измерен с использованием различных коммерчески доступных PAM флуорометров25,26, от простых ручных устройств27 до более совершенных закрытых систем28. Однако ограничением некоторых из этих подходов является относительно низкая пропускная способность, что делает скрининг больших коллекций растений сложным без нескольких устройств и команды исследователей. Для решения этой проблемы McAusland et al. разработали процедуру, основанную на иссеченной листовой ткани, и использовали ее для выявления различий в флуоресценции хлорофилла между двумя сортами пшеницы29. Привлекательность этого подхода заключается в том, что визуализация листовых дисков, взятых из нескольких растений с помощью одного устройства, может облегчить скрининг сотен генотипов в течение дня. Это позволяет оценить вариации в релаксации NPQ в рамках исследований геномных ассоциаций или для скрининга размножающихся популяций с потенциалом повышения эффективности фотосинтеза сельскохозяйственных культур и, в конечном счете, урожайности.

Основываясь на результатах McAusland et al.29, мы используем флуоресцентный анализ флуоресценции ПАМ хлорофилла листовых дисков для высокопроизводительного скрининга скорости релаксации NPQ в Glycine max (G.max; соя). Этот протокол использует CF Imager25, который сопоставим с другими коммерчески доступными системами закрытого PAM, такими как популярная FluorCam26. С темной комнатой для адаптации образцов пользователи могут визуализировать 96-луночные тарелки, чашки Петри и небольшие растения. Ключевым преимуществом такого подхода является увеличение пропускной способности, обеспечиваемой использованием листовых дисков по сравнению с последовательным анализом отдельных растений. Здесь мы представляем репрезентативные результаты и метод отбора проб, измерения и анализа NPQ в растениях, выращенных в полевых условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Посадка семян

  1. Выбирайте полевой участок с плодородной, хорошо дренированной, но не песчаной почвой, и с рН почти 6,5. Разметьте участки с рядами длиной 1,2 м с интервалом 0,75 м, забив землю мотыгой.
  2. Посадите 50 семян/м G.max cv. IA3023 на глубину 3 см вдоль каждого участка в начале вегетационного периода, когда температура почвы составляет от 25 до 30 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для целей скрининга генетического разнообразия ожидается, что будет выращиваться и сравниваться несколько различных генотипов. Посадите по 2-5 рядов на генотип, расположенных в случайном блочном дизайне. Следует рассмотреть вопрос о том, соответствуют ли климатические условия росту соевых бобов, включая тип почвы, температуру и продолжительность дня.

2. Сбор образцов листьев с поля

  1. Возьмите пробу растений на полевом участке через 30 дней после прорастания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Через 30 дней растения сои будут находиться в вегетативной фазе. Количество дней после прорастания до отбора проб зависит от рассматриваемого биологического вопроса.
  2. Залейте колодцы 24-луночной плиты до 1/3-й дистиллированной водой. Пометьте крышку и боковую часть пластины репликами для отбора проб.
  3. Выберите самый молодой полностью расширенный лист в верхней части растения для отбора проб. Прижмите лист к резиновой пробке.
  4. Нажмите пробковый бур No 2 Гумбольдта через лист и скрутите, чтобы разрезать диск, избегая среднего ребра. Последовательно соберите 5 дисков из одного листа для технических реплик. Возьмите примерно на 30% больше листовых дисков для каждого участка, чем требуется в случае повреждения ткани листа при транспортировке или при отборе проб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество биологических реплик (участков или растений) и количество технических реплик (листовых дисков одного и того же растения или участка) могут варьироваться в зависимости от экспериментального проекта.
  5. Вытолкните листовые диски из пробкового бура в один колодец из 24-луночной пластины с помощью ватного тампона. Убедитесь, что все листовые диски плавают в воде. Если нет, осторожно переместите листовые диски, прилипшие к боковой части колодца, в плавающее положение ватным тампоном.
  6. Переходим к следующему графику и повторяем шаги с 2.3 по 2.5. Вытолкните листовые диски из пробкового бура в отдельный колодец в 24-луночной пластине с помощью ватного тампона. Повторите этот шаг, чтобы собрать третью биологическую реплику.
  7. Повторяйте шаг 2.6 до тех пор, пока не будет взят полный образец из 24 скважин. Поместите крышку и запечатайте полупрозрачной гибкой пленкой. Храните тарелку вдали от прямых солнечных лучей, в пакете, коробке или пустом охладителе (без льда).

3. Подготовка образцов к анализу

  1. Возвращение в чистое лабораторное помещение после отбора проб. Нажмите на крышку герметичной пластины, чтобы выбить листовые диски, прилипшие к крышке во время транспортировки. Распакуйте пленку и снимите крышку.
  2. Перенесите листовой диск из первого положения 24-луночной плиты в свежую пластину из 96 лунок, при этом листовой диск будет обращен плоско вниз на дне колодца.
  3. Разрежьте фильтр аспиратора для носа пополам. Опустите полученный фильтр наполовину в воду и нанесите на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Вставьте фильтр в колодец с листовым диском для поддержания влажности.
  4. Возьмите второй листовой диск из первого положения 24-луночной плиты и поместите лицевой стороной вниз в следующее доступное положение плиты из 96 скважин. Окуните оставшуюся половину назального фильтра, полученного на этапе 3.3, в воду и нанесите на бумажное полотенце, прежде чем вставить его в колодец со вторым листовым диском.
  5. Повторите шаги с 3.3 по 3.4 для диска третьего листа из первого положения 24-луночной пластины.
  6. Перейдите на второе место плиты с 24 скважинами и повторите шаги с 3,3 по 3,5.
  7. Поместите крышку на тарелку, когда во все колодцы вставлены листовые диски и фильтры для носа. Заклейте верхний правый угол, чтобы помочь сориентировать пластину в темноте для визуализации.
  8. Запечатайте пластины полупрозрачной, гибкой пленкой и оберните пластину в алюминиевую фольгу. Напишите идентификаторы участков и идентификатор пластины на алюминиевой фольге.
  9. Поместите пластины в темный ящик или шкаф минимум на 30 минут, чтобы обеспечить расслабление первых двух фаз NPQ (qE, qT, qZ). Используйте более длительный темный инкубационный период за 1 ч до визуализации, если долгосрочные фазы NPQ представляют интерес.
  10. Подготовьте дополнительную фиктивную пластину для фокусировки во время анализа. Для этого поместите листовой диск в каждый из углов свежей 96-луночной пластины и по одному в центре. Защитите листовые диски с помощью носовых фильтров, как это было сделано с предыдущими пластинами. Запечатайте пластину и инкубируйте в темноте при комнатной температуре (24 °C), относительной влажности ~50%.

4. Измерение нефотохимического закалки с помощью флуоресцентного тепловизора хлорофилла

  1. Включите тепловизор и откройте программное обеспечение для создания образов. Щелкните Параметры > протокола , чтобы открыть окно для ввода шагов в экспериментальном протоколе PAM. Технические характеристики машины приведены в дополнительной таблице 3.
  2. Настройте программу на запуск с насыщенного импульса для измерения максимальной квантовой эффективности адаптированного к темноте фотосинтеза, введя 20 с в коробку: После задержки. Щелкните поле Применить импульс и введите 1 в поле: Это количество раз.
  3. Установите пульс PPFD на 6152, длину импульса на 800 мс и установите флажок Принимать изображения F' & Fm' со всеми импульсами. Нажмите кнопку Вставить после , чтобы добавить второй шаг в протокол.
  4. Введите 30 с в поле: После задержки. Выберите опцию Изменить актинический и введите 50 в поле: Actinic PPFD, чтобы установить интенсивность света в камере на 50 PPFD.
  5. Нажмите кнопку Вставить после , чтобы добавить новый шаг в протокол. Введите 150 с в поле: После задержки выберите Применить импульс и введите 4 в поле: Это количество раз, чтобы применять измерительные импульсы каждые 150 с, 4 раза подряд, пока актинический свет удерживается при 50 PPFD.
  6. Полная информация о протоколе приведена в таблице 1, используйте шаги 4.2 и 4.3 для изменения интенсивности света и шаги 4.4 и 4.5 для входа в циклы насыщения импульсов. Отрегулируйте задержку и интенсивность света для каждой ступени в соответствии со значениями, указанными в таблице 1. Сохраните протокол в виде PCL-файла в известном расположении.
  7. Выключите свет, поместите фиктивную пластину на ступень образца и установите высоту стадии образца так, чтобы листовые диски находились на 140 мм выше основания инструмента. Используется фиктивная пластина, так как свет будет многократно мигать на пластину при фокусировке; это потребует повторной темной адаптации любых измеряемых образцов и может привести к фотоповреждениям.
  8. Щелкните значок Подключить/Отключить к камере Imager и аппаратной камере, чтобы запустить камеру. Щелкните символ Фокус (флуоресценция), представленный красным двусторонним значком стрелки с двумя зелеными линиями в основании. Отрегулируйте объектив и экспозицию, чтобы сфокусировать пластину.
  9. Щелкните значок Фокус (флуоресценция) еще раз, чтобы выключить мигающий индикатор. Работая в темноте, замените фиктивную пластину на анализируемую пластину.
  10. Щелкните значок камеры Map Image . Отрегулируйте экспозицию изображения, открыв или закрыв диафрагму, пока полоса во всплывающем окне не будет расположена в зеленой зоне.
  11. Нажимайте кнопку Try Again после каждой регулировки диафрагмы до тех пор, пока экспозиция не будет правильно отрегулирована и инструмент не получит изображение. Щелкните правой кнопкой мыши изображение и выберите Применить изоляцию изображения , чтобы заблокировать фоновые сигналы. Сфокусированная область листа будет отображаться серым цветом, а фон — синим.
  12. Выберите интересующую область/пиксели, чтобы включить только листовые диски, отрегулировав гистограмму и уровень гаммы в раскрывающемся меню «Изменить изображение», щелкнув правой кнопкой мыши на изображении.
  13. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Удалить высокие и низкие разрезы (цветовая карта), чтобы удалить светло-синюю выделенную область. Щелкните изображение правой кнопкой мыши и выберите «Удалить струи (тяжелые)», чтобы удалить все пикселы, которые не касаются по крайней мере трех других пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любые области на изображении, которые выглядят как изолированные острова, будут проанализированы отдельно и включены в окончательный вывод данных. Изоляция изображений и удаление блуждающих пикселей приводят к чистым, понятным данным.
  14. Щелкните значок Запустить протокол , чтобы запустить программу, в нижней части экрана появится таймер, сообщающий вам, сколько времени осталось для запуска протокола.
  15. Дождитесь завершения работы протокола, щелкните Файл > Сохранить как и сохраните данные в виде IGR-файла. Закройте окно, нажав на красный крестик в правом верхнем углу окна, прежде чем начать запускать другую табличку с образцами.
  16. Откройте новый файл для следующего примера, выбрав Файл > Создать и повторяйте шаги с 4.10 по 4.15, пока не будут измерены все пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется измерять пластины в течение 4 ч или менее, чтобы свести к минимуму потенциальное влияние циркадного регулирования на результаты

5. Обработка данных флуоресценции хлорофилла

  1. Откройте IGR-файл в программном обеспечении для создания образов. Экспортируйте данные, щелкнув Файл > Экспорт в папку, чтобы создать новую папку со всеми необходимыми файлами.
  2. Скопируйте в полученную папку следующие три файла MATLAB: MapAndLabelDiscs.m (Дополнительный файл 1), ProcessFoFm.m (Дополнительный файл 2) и ProcessNPQdata.m (Дополнительный файл 3), а также файл R: create_file_to_process. R (Дополнительный файл 4).
  3. Откройте MapAndLabelDiscs.m (Дополнительный файл 1) в MATLAB и запустите. Сохраните карту пронумерованных листовых дисков, сгенерированных во всплывающем окне, в виде файла .png, чтобы проверить нумерацию листовых дисков позже.
  4. Откройте файл ProcessFoFm.m (Дополнительный файл 2) в MATLAB и запустите для вычисления значений Fo и Fm для каждого конечного диска. Запустите ProcessNPQdata.m (дополнительный файл 3) для вычисления значений NPQ в каждый момент времени.
  5. Откройте файл create_file_to_process. R (Дополнительный файл 4) в Rstudio и добавьте дату в код в строке 5. Добавьте номер таблички в строку 8 в create_file_to_process.R.
  6. Запустите create_file_to_process. R для объединения значений Fv/Fm и данных NPQ в один файл, который назван в честь данных с суффиксом -cf-summary.csv. Проверьте нумерацию листовых дисков в файле cf-summary с шага 5.5 с помощью файла .png из шага 5.3. Дополнительная информация, касающаяся номера участка и присоединения.
  7. Откройте скрипт R CF-data-processing_2.R (дополнительный файл 5) и измените строку 13 на путь к рабочему каталогу. Измените строку 16 в CF-data-processing_2.R на имя файла с шага 5.5.
  8. Измените строку 48 в CF-data-processing_2.R на имя выходного файла. Запустите скрипт CF-data-processing_2.R, чтобы переформатировать данные для подгонки кривых.
  9. Откройте скрипт MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m (Дополнительный файл 6) в MATLAB и измените строку 5 на имя выходного файла из шага 5.8. Измените строку 85 в MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m на новое имя выходного файла. Запустите скрипт MatLab_NPQ_5_fit_model_v5.m для расчета параметров релаксации NPQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1А показано типичное измерение NPQ в выращенной в полевых условиях сое. Растения были выращены в Урбане, штат Иллинойс (широта 40,084604 °, долгота -88,227952 °) летом 2021 года, с семенами, посаженными 5 июня. 2021. После 30 дней посадки семян были отобраны листовые диски, и проведены измерения с предоставленным протоколом (табл. 1). Значения Fv/Fm и NPQ были рассчитаны для каждого листового диска (дополнительная таблица 4), а параметры релаксации NPQ были рассчитаны путем подгонки биэкспоненциальной функции (таблица 2). После первоначальной насыщенной вспышки для определения Fv/Fm листовые диски подвергались воздействию слабого освещения (50 мкмоль м−2с−1), и измеренный NPQ был < 1 (рисунок 1A). При переходе на высокий свет (2000 мкмоль м−2с−1) NPQ увеличивался, достигая максимального значения 4 через 15 мин. Возврат к слабому освещению вызвал быстрое начальное снижение NPQ (Aq1) с постоянной времени 1,07 мин (τq1), за которым последовала вторая более медленная фаза расслабления (Aq2) с постоянной времени 24,5 мин (τq2). Остаточный NPQ, оставшийся в конце протокола (~0,5), был захвачен константой (Aq3).

На рисунке 1B показан пример неудачного измерения. При переходе на высокий свет наблюдается минимальное увеличение NPQ (0,38), который не расслабляет. Тщательный осмотр данных показывает, что листовой диск имел низкое значение Fv/Fm , указывающее на напряжение (0,27), и данные должны быть отброшены.

Figure 1
Рисунок 1: Данные измерения NPQ с использованием выращенной в полевых условиях сои. (A) Кинетика активации и релаксации NPQ G.max cv. IA3023. Данные представлены в виде среднего значения пяти биологических (отдельные полевые участки) и трех технических (листовые диски из одного и того же участка) реплик с погрешностями, представляющими стандартное отклонение. (B) Пример неудачной технической репликации (n = 1) использования G.max cv. IA3023. Серые и белые полосы в верхней части графика указывают периоды освещения с плотностью потока фотонов фотосинтеза (PPFD) 2000 мкмоль m−2s−1 (белая полоса), PPFD 50 мкмоль m−2s−1 (серые полосы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Шаг Задержка Действие Циклов PPFD (мкмоль м-2 с-1 )
1 0 с Изменение актиника - 0
2 20 с Применение пульса 1 6152
3 30 с Изменение актиника - 50
4 150 с Применение пульса 4 6152
5 30 с Изменение актиника - 2000
6 150 с Применение пульса 6 6152
7 0 с Изменение актиника - 50
8 150 с Применение пульса 2 6152
9 5 мин Применение пульса 9 6152
10 20 с Изменение актиника - 0

Таблица 1: Протокол флуоресцентной визуализации хлорофилла для использования с тепловизором.

Репс Ак1 τq1 /мин Ак2 τq2 /мин Ак3 максНПК Р2
1 2.00 1.12 1.88 16.62 0.29 4.17 0.9999
2 2.14 1.17 1.70 13.68 0.34 4.17 0.9999
3 1.82 0.78 1.88 18.42 0.36 4.05 0.9997
4 2.05 1.28 1.67 26.89 0.15 3.87 0.9999
5 1.72 1.01 1.81 21.22 0.52 4.05 0.9998
Средний 1.94 1.07 1.79 19.37 0.33 4.06
С.Д. 0.17 0.19 0.10 5.02 0.13 0.12

Таблица 2: Расчетные параметры релаксации NPQ для G.max cv. IA3023. Значения для Aq1, Aq2 и Aq3 не имеют единиц, значения для τq1 и τq2 указаны в мин. Сокращениями: MaxNPQ = максимальное записанное значение NPQ в свете, Rep = число биологической репликации, соответствующее одному графику, где биэкспоненциальная функция подходит с использованием трех технических реплик (листовых дисков). S.D. представляет стандартное отклонение.

Дополнительная таблица 1: Описание уравнений, используемых в рукописи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 2: Описание значений параметров, обсуждаемых в рукописи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 3: Технические характеристики флуоресценции с амплитудной амплитудой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительная таблица 4: Рассчитаны значения Fv/Fm и NPQ листовых дисков G.max cv. IA3023 с использованием предоставленного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Дополнительный файл 1: Сценарий для сопоставления позиций конечного диска с использованием выходных данных, предоставленных тепловизором. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Сценарий для вычисления значений Fo, Fm, Fm', f и Fv/Fm на листовый диск с использованием выходных данных, предоставленных тепловизором и дополнительным файлом 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Сценарий для вычисления значений NPQ на конечный диск в каждый момент времени во время протокола с использованием выходных данных из дополнительного файла 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 4: Скрипт R для аннотирования выходных данных из дополнительного файла 3 со значениями Fv/Fm, рассчитанными дополнительным файлом 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 5: Скрипт R для переформатирования данных из дополнительного файла 4 для подгонки функции биэкспоненциального распада к вычисляемым значениям NPQ после релаксации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 6: Скрипт для установки функции биэкспоненциального распада для вычисления значений NPQ и вычисления параметров релаксации с использованием выходных данных из дополнительного файла 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Тщательный выбор и обращение с листовыми дисками имеют решающее значение для получения надежных измерений NPQ. Во-первых, повреждение ткани, такое как грубое обращение пинцетом, приведет к стрессу, что приведет к низким значениям максимальной квантовой эффективности фотосинтеза. Растения, не подвергающиеся стрессу, обычно имеют значения Fv/Fm около 0,8318, причем значительное снижение указывает на снижение эффективности фотосинтеза9. Однако растения, выращенные в полевых условиях, обычно испытывают умеренный стресс, поэтому порог FvFm > 0,75 был установлен для включения в соответствии с предыдущими исследованиями, которые выбрали это в качестве предела для начала снижения фотосинтеза30. Обработка носовых аспираторных фильтров, используемых для удержания листовых дисков на их месте, представляет собой еще один распространенный источник проблем. Если фильтры назального аспиратора перенасыщены, избыток воды негативно повлияет на физиологию листьев, что также приведет к низкой квантовой эффективности; одна и та же марка должна использоваться на протяжении всего эксперимента, так как разные бренды могут удерживать разное количество воды. В-третьих, растения, выращенные в полевых условиях, испытывают колебания окружающей среды с различиями в количестве осадков, температуре, влажности и давлении насекомых. Стадии роста растений также способствуют эффективности флуоресценции хлорофилла. При отборе проб следует избегать хлоротических листьев или обширного повреждения вредителями. При проведении сравнений последовательный выбор листьев на одинаковых стадиях развития имеет жизненно важное значение для уменьшения экспериментального шума. Скорость активации и релаксации нефотохимического закалки может варьироваться в зависимости от возраста листьев и стадии развития растений31, как следствие различий в балансе между поглощением света, развитием хлоропласта, энергетическим статусом и долгосрочным затенением. Поэтому типичным выбором является сравнение показателей от самого последнего полностью расширенного листа со зрелыми хлоропластами.

Этот протокол предназначен для анализа выращенной в полевых условиях сои, но может быть модифицирован для отбора проб и измерения тепличного материала или других высших растений. При адаптации протокола важно учитывать несколько соображений. Во-первых, следует учитывать экспериментальную конструкцию, чтобы уменьшить шум и избежать введения смещения. В полевых условиях генотипы сои обычно выращивают на участках по 50-100 растений подряд, каждый участок считается единой биологической репликой. Каждый участок может испытывать различные условия почвы, воздействия и дренажа, которые будут влиять на физиологию всего растения. Таким образом, выбор подходящего дизайна участка, такого как случайный блок, может избежать смещения и уменьшить изменчивость в полевых условиях. Чтобы свести к минимуму вариации в пределах участков, предлагается измерить несколько реплик (от трех до пяти) и взять диски из разных растений на участке. Однако при работе с тепличным или камерным материалом одно растение может представлять собой биологическую реплику с несколькими дисками, взятыми из одного и того же листа. Кроме того, положение растения следует поворачивать несколько раз в неделю, чтобы предотвратить смещение в испытываемых условиях. Во-вторых, интенсивность актинического света, используемая в этом протоколе, отражает максимальную и минимальную интенсивность света, испытываемую соевым навесом в солнечный день в Иллинойсе (W 88°13ʹ42ʺ/N 40°06ʹ31ʺ). В зависимости от экспериментальной установки и анализируемого растения целесообразно регулировать интенсивность света в зависимости от конкретной среды роста, чтобы обеспечить более реалистичные условия измерения. Наконец, как процедура отбора проб, так и протокол измерения могут быть адаптированы для использования с другими закрытыми системами флуорометра PAM с условием, что шаги, необходимые для работы измерительного программного обеспечения, должны быть скорректированы для данного устройства.

Основным ограничением подхода является интерпретация значений параметров, вычисляемых биэкспоненциальной функцией. Это особенно важно при применении процедуры к другим высшим растениям или водорослям, так как биологические процессы, способствующие NPQ, могут варьироваться между видами. Например, некоторые мхи и водоросли содержат белки LHCSR, а не PsbS (обзор см.32). Кроме того, относительная важность биологических процессов может варьироваться с переходами состояний или qT, представляя собой более важную часть компонента Aq2 в водорослях, чем в более высоких растениях, где до 80% светособирающих комплексов могут обратимо перемещаться между фотосистемами I и II33. Поэтому следует учитывать, что биэкспоненциальная функция не всегда может быть лучшим выбором для объяснения биологических процессов, управляющих кинетикой релаксации 22,29, и это должно быть оценено эмпирически для выбранного вида. Тщательные эксперименты, включая применение ингибиторов и разъединителей34,35 или изучение мутантов21,23, могут быть использованы для получения представления о процессах, способствующих расслаблению NPQ, но следует проявлять осторожность при составлении выводов.

Метод, представленный здесь, аналогичен методу McAusland et al.29, в котором использовался закрытый тепловизор PAM для оценки фотосинтетических характеристик растений, выращенных в камере. Однако, размещая образцы листьев на влажной фильтровальной бумаге, а не в 96-луночных пластинах, и инкубируя ткань в изготовленных на заказ камерах для контроля концентрацийO 2 и CO2 , McAusland et al. смогли выполнить более широкий спектр измерений, оценивающих параметры фотосинтеза29. Основные преимущества представленного здесь подхода включают простоту метода, который не требует специального оборудования, и использование 24-луночных пластин для первоначального отбора проб листовой ткани, что позволяет собирать образцы из выращенного в полевых условиях материала, потенциально увеличивая количество генотипов, которые исследователь может отсеять.

Таким образом, флуоресцентный анализ ПАМ-хлорофилла является мощным методом измерения эффективности фотосинтеза. Тем не менее, обычные измерения проводятся на основе каждого завода, ограничивая мощность скрининга либо по затраченному времени, либо по количеству людей и оборудования, доступных для выполнения анализов. Использование листовых дисков в 96-луночной пластине обеспечивает средство для измерения многих генотипов одновременно, увеличивая пропускную способность анализа. Облегчая скрининг многих генотипов за короткий промежуток времени одним исследователем29, можно применить измерение релаксации NPQ для скрининга естественного разнообразия фотосинтеза с потенциалом для выполнения общегеномных ассоциативных исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов

Acknowledgments

Эта работа поддерживается исследовательским проектом «Реализация повышенной эффективности фотосинтеза» (RIPE), который финансируется Фондом Билла и Мелинды Гейтс, Фондом исследований в области продовольствия и сельского хозяйства и Управлением иностранных дел, содружества и развития Великобритании под номером гранта OPP1172157.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012929 Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate Fisher Scientific FB012931 Country of Origin: United States of America
Aluminum foil Antylia Scientific  61018-56 Country of Origin: United States of America
Black marker pen Sharpie SAN30001 Country of Origin: United States of America
CF imager Technologica Ltd. N/A chlorophyll fluorescence imager
Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm Humboldt Mfg Co H9665 Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software Technologica Ltd. N/A imaging software
Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters Amazon  B07P6XCTGV Country of Origin: United States of America
Marker stakes John Henry Company KN0151 Country of Origin: United States of America
Paper scissors VWR 82027-596 Country of Origin: United States of America
Parafilm Bemis Company Inc.  S3-594-6 Semi -transparent flexible film
Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers Fisher Scientific 14-130M Country of Origin: United States of America

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blankenship, R. E. Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2021).
  2. Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
  3. Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
  4. Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
  5. Zhu, X. -G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
  6. Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
  7. Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
  8. Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
  9. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
  10. Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
  11. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  12. Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
  14. Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
  15. Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
  16. Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
  17. Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
  18. Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
  19. Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
  20. Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
  21. Dall'Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
  22. Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
  23. Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
  24. Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
  25. Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
  26. Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
  27. Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
  28. Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
  29. McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
  30. Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
  31. Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
  32. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
  33. Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
  34. Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
  35. Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).

Tags

Биология выпуск 185
Высокопроизводительный анализ нефотохимического закалки сельскохозяйственных культур с использованием флуорометрии с импульсно-амплитудной модуляцией хлорофилла
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M.,… More

Gotarkar, D., Doran, L., Burns, M., Hinkle, A., Kromdijk, J., Burgess, S. J. High-Throughput Analysis of Non-Photochemical Quenching in Crops Using Pulse Amplitude Modulated Chlorophyll Fluorometry. J. Vis. Exp. (185), e63485, doi:10.3791/63485 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter