Een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden uit te voeren

Summary

Dit protocol kan worden gebruikt om grootschalige ecologische onderzoeken uit te voeren van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden . Het belangrijkste voordeel van deze methode is de efficiënte organisatie en analyse van ecologische en moleculaire gegevens die verband houden met de nematoden die uit de natuur zijn verzameld.

Abstract

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelorganismen in de biologie, maar pas onlangs hebben onderzoekers zich gericht op de natuurlijke ecologie. De relatieve spaarzaamheid van informatie over C. elegans in zijn natuurlijke context komt voort uit de uitdagingen die gepaard gaan met de identificatie van de kleine nematode in de natuur. Ondanks deze uitdagingen heeft een toenemende focus op de ecologie van C. elegans een schat aan nieuwe informatie veroorzaakt over zijn leven buiten het laboratorium. De geïntensiveerde zoektocht naar C. elegans in de natuur heeft bijgedragen aan de ontdekking van veel nieuwe Caenorhabditis-soorten en onthulde dat congenerische nematoden vaak in het wild samenleven, waar ze zich voeden met microbiële bloemen geassocieerd met rottend plantaardig materiaal. De identificatie van nieuwe soorten heeft ook onthuld dat het androdioecious paringssysteem van mannetjes en zelfbevruchtende hermafrodieten drie keer onafhankelijk van elkaar is geëvolueerd binnen Caenorhabditis. De andere twee zelfzuchtige soorten, C. briggsae en C. tropicalis, delen de experimentele voordelen van C. elegans en hebben vergelijkende studies mogelijk gemaakt naar de mechanistische basis van belangrijke eigenschappen, waaronder zelfbevruchting. Ondanks deze vooruitgang valt er nog veel te leren over de ecologie en natuurlijke diversiteit van deze belangrijke soorten. We missen bijvoorbeeld nog steeds functionele informatie voor veel van hun genen, die alleen kan worden bereikt door een goed begrip van hun natuurlijke ecologie. Om ecologisch onderzoek naar zelfrijdende Caenorhabditis nematoden te vergemakkelijken, ontwikkelden we een zeer schaalbare methode om nematoden uit het wild te verzamelen. Onze methode maakt gebruik van mobiele dataverzamelingsplatforms, cloudgebaseerde databases en de R-softwareomgeving om het vermogen van onderzoekers te verbeteren om nematoden uit het wild te verzamelen, bijbehorende ecologische gegevens vast te leggen en wilde nematoden te identificeren met behulp van moleculaire barcodes.

Introduction

De laatste twee decennia is er meer belangstelling voor de ecologie van Caenorhabditis nematoden. Uit deze studies weten we dat de vrijlevende Caenorhabditis-soorten kunnen worden geïsoleerd uit kortstondige microhabitats in zowel gematigde als tropische streken, waar ze zich voeden met microbiële bloei geassocieerd met ontbindend plantaardig materiaal, soms in sympatry1,2,3,4,5,6,7,8 . We hebben ook geleerd dat convergente evolutie van zelfbevruchting drie keer in het geslacht heeft plaatsgevonden, en zelfvorming is de dominante reproductiewijze voor C. briggsae, C. elegans en C. tropicalis9,10. Onder deze selfers is C. elegans een van de meest bestudeerde dieren op aarde en is door onderzoekers gebruikt om kritische vooruitgang te boeken in de biologie. Belangrijk is dat de andere zelfrijdende Caenorhabditis-soorten veel van C. elegans experimentele voordelen delen en snel vergelijkende studies in het geslacht bevorderen. De cryptische aard van deze nematoden in het wild maakt het echter moeilijk om hun ecologie en natuurlijke diversiteit te bestuderen, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van de biologische functies van hun genen en de manieren waarop evolutie de genetische diversiteit tussen de soorten heeft ^gevormd10,11.

De grootste uitdaging voor het bestuderen van de ecologie van zelfzuchtige Caenorhabditis-nematoden in het wild is hun kleine formaat; volwassen nematoden zijn vaak 1 mm lang of minder. Deze uitdaging vereist dat onderzoekers substraten uit het wild bemonsteren en proberen nematoden van belang te scheiden van de substraten in het laboratorium zonder de mogelijkheid om dieren in het wild te observeren. Omdat zelfs getrainde experts het moeilijk vinden om zelf-zelfhoudende Caenorhabditis-nematoden onder de microscoop te onderscheiden van andere vrijlevende nematoden, worden nematoden meestal uit het substraat verwijderd, geïsoleerd en achtergelaten om zich te vermenigvuldigen voordat ze worden geïdentificeerd door sequentie-identiteit met behulp van gevestigde moleculaire barcodes3,12,13,14 . De tijd en moeite die nodig is om elk aaltje op deze manier te verwerken, vormt een organisatorische uitdaging, omdat onderzoekers in staat moeten zijn om de identiteit van elke in het laboratorium geïsoleerde nematode terug te voeren op het exacte substraat en de bijbehorende ecologische gegevens die in het veld zijn bemonsterd. Hier beschrijven we een stapsgewijs proces om zelf-zelfbindende Caenorhabditis-nematoden uit het veld efficiënt te verzamelen en te identificeren en deze isolaten op grote schaal getrouw te koppelen aan hun bijbehorende ruimtelijke en ecologische gegevens.

Deze verzamelmethode verhoogt de schaal en nauwkeurigheid van ecologische onderzoeken door gebruik te maken van mobiele dataverzamelingsplatforms, cloudgebaseerde databases en de R-softwareomgeving. Fulcrum is een aanpasbaar platform voor gegevensverzameling dat werkt met de meeste mobiele apparaten en waarmee gebruikers aangepaste applicaties kunnen bouwen om locatiegebaseerde gegevens (https://www.fulcrumapp.com) te verzamelen en te organiseren. Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het gebruik van aangepaste gegevensverzamelingstoepassingen om ruimtelijk expliciete ecologische gegevens uit het veld te organiseren en die gegevens nauwkeurig te koppelen aan de identiteit van nematoden die in het laboratorium zijn geïsoleerd. Het protocol legt ook uit hoe zelf-zelf-erende Caenorhabditis-nematoden efficiënt kunnen worden geïdentificeerd met behulp van gevestigde moleculaire barcodes. De gegevens van deze methoden kunnen eenvoudig en reproduceerbaar worden verwerkt met het bijbehorende R-softwarepakket easyFulcrum15 om de ecologie en genetische diversiteit van natuurlijke Caenorhabditis-populaties te verkennen.

Protocol

1. Voorbereiding van de collectie

1. Identificeer een locatie om Caenorhabditis-nematoden te onderzoeken.
   OPMERKING: In de meeste gematigde streken kunnen C. elegans en C. briggsae gemakkelijk worden geïsoleerd uit met de mens geassocieerde habitats zoals landbouwvelden of landelijke en stedelijke ^tuinen1. In subtropische en tropische gebieden zijn C. briggsae, C. elegans en C. tropicalis allemaal te vinden in de hierboven genoemde met de mens geassocieerde habitats, soms in de nabijheid van elkaar. C. elegans lijkt echter de voorkeur te geven aan koelere, drogere habitats dan de andere soorten in tropische ^habitats7,8. Elk van de soorten kan ook worden geïsoleerd van wilde habitats die niet geassocieerd zijn met mensen, maar deze habitats worden minder vaak bemonsterd.
2. Maak een Fulcrum-project om de verzameling en isolatie van gegevens te organiseren met de mobiele toepassingen voor gegevensverzameling.
   1. Maak online een account aan bij Fulcrum met behulp van een gratis ^{onderwijsovereenkomst16}. Voeg de toepassing Nematode Field Sampling toe aan een Fulcrum-account door op app toevoegen ^knop17 te klikken.
   2. Voeg de applicatie Nematode Isolation toe aan een account door op ADD APP ^button18 te klikken.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat elke reis naar een locatie wordt georganiseerd als het verzamelproject met behulp van de naamgevingsconventie 'YearMonthLocation', bijvoorbeeld 2020februariAustralia.
3. Voeg gebruikers toe aan het Fulcrum-account om hen toegang te geven tot het collectieproject. Zorg ervoor dat elke gebruiker de mobiele Fulcrum-applicatie downloadt om deel te nemen aan het project.
4. Druk een set QR-codelabels af om de collecties (C-labels) en de nematode-isolaties (S-labels) te volgen met de mobiele applicatie. Bevestig de C-labels aan plastic zakken met ritssluiting, rol de gelabelde zakken in groepen van 25 en wikkel ze met een elastiekje voor verpakking. Bewaar de set S-labels voor gebruik in het laboratorium.
   OPMERKING: In dit protocol zijn de collecties (substraten uit het veld) opgenomen in zakken of op borden en zijn ze gelabeld met C-labels. De geïsoleerde nematoden zijn gelabeld met S-labels. De C-labels worden gebruikt om unieke collecties te identificeren en de S-labels worden gebruikt om unieke nematodenisolaten te identificeren. Deze twee soorten labels worden gebruikt om de verbinding te leggen tussen een bepaalde collectie (C-label) en de nematoden geïsoleerd uit die collectie (S-labels) in de Fulcrum-database. Print twee keer zoveel S-labels als C-labels voor een inzamelproject omdat er gemiddeld twee aaltjes per collectie worden geïsoleerd. Meer S-labels kunnen later worden afgedrukt als dat nodig is. 2.500 unieke C-labels (Supplemental File 1) en 5.000 unieke S-labels (Supplemental File 2) worden verstrekt in het supplement.
5. Bereid 10 cm NGMA-platen voor voor verzamelingen en 3,5 cm NGMA-platen voor het isoleren van nematoden. Maak één bord van 10 cm en minstens twee platen van 3,5 cm per ^collectie21. Deze platen worden gezaaid met Escherichia coli stam OP50 volgens vastgestelde protocollen. Bewaar de platen voor gebruik bij 4 °C gedurende niet meer dan 1 maand.

2. Veldverzameling

OPMERKING: Caenorhabditis-nematoden worden meestal geïsoleerd uit rottend plantaardig materiaal, waaronder fruit, noten, zaden, peulen, bloemen, stengels, plantaardig strooisel en compost1,5,6,8. De beste substraten zijn rot en bijna onherkenbaar als vruchten of bloemen; vermijd substraten die te droog of nat zijn (figuur 1). Substraten worden het meest efficiënt uit het veld verzameld door in paren te werken. De persoon met de contactloze infraroodthermometer selecteert een substraat voor verzameling en verzamelt het monster terwijl zijn partner de Nematode Field Sampling-applicatie in Fulcrum gebruikt om de verzamelgegevens vast te leggen. Het paar collectoren zal dit proces herhalen totdat het gewenste aantal monsters is verzameld. De lijst van materialen die nodig zijn voor veldwerk is te vinden in (Aanvullende tabel 1).

1. Open de mobiele Fulcrum-app en selecteer Nematode Field Sampling in het vervolgkeuzemenu. Druk op + om een nieuwe record in het project te starten (figuur 2A). Maak een foto van het substraat.
2. Klik op het vakje in het midden bovenaan om het juiste incassoproject te selecteren dat in stap 1.2 is gemaakt (figuur 2B). Tik op het veld C-label onder aan de collectierecord en kies Scannen wanneer de prompt verschijnt. Scan de streepjescode op de verzameltas met de camera van het mobiele apparaat en tik vervolgens op Gereed in de rechterbovenhoek van het scherm.
3. Tik op het veld Substraat en selecteer een substraattype in het vervolgkeuzemenu. Voeg notities over het substraat toe door op het veld Substraatnotities te tikken en handmatig notities in te voeren.
4. Kies een landschap in het vervolgkeuzemenu. Kies het landschap dat de bemonsteringslocatie het beste vertegenwoordigt.
5. Kies een luchtweergave. Beschrijf bij het kiezen van het luchtbeeld de zichtbaarheid van de hemel op de bemonsteringslocatie (bijvoorbeeld een volledig uitzicht op de hemel zonder belemmerd uitzicht van bomen of andere structuren = vol).
6. Meet de oppervlaktetemperatuur van het substraat met de contactloze thermometer en noteer de waarde in het substraattemperatuurveld.
   OPMERKING: Houd de contactloze thermometer niet meer dan 14 inch van het substraat terwijl u de temperatuur registreert.
7. Meet de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid met het handheld-apparaat en neem deze gegevens op in de juiste velden.
   OPMERKING: Controleer of het apparaat voor omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid niet in de wacht staan. De meeteenheid verandert wanneer de knop wordt losgelaten. Houd het apparaat in een buitenzak om onregelmatige metingen te voorkomen.
8. Sla de record op in Fulcrum door linksboven in het scherm op Opslaan te tikken.
9. Verzamel ongeveer een eetlepel van het substraat zonder stokken of andere harde stukken door de opvangzak om te keren om deze als een "handschoen" te gebruiken om het substraat op te pakken en sluit vervolgens de zak af. Doe een papieren handdoek in de zak als het monster bijzonder vochtig is.
   OPMERKING: Plaats de zakken in warme klimaten in zachte koelers met koelerverpakkingen om de collecties koel te houden.
10. Nadat alle monsters voor de dag zijn verzameld, reinigt u de verzamelapparatuur, haalt u batterijen uit sondes, laadt u batterijen op, vriest u diepvriesverpakkingen opnieuw in. Synchroniseer de Fulcrum-verzamelingsgegevens door op de knop Synchroniseren linksboven in de toepassing Nematode Field Sampling te tikken.
    OPMERKING: De uploads kunnen enkele minuten duren zonder een sterke mobiele verbinding, dus het is misschien het beste om te wachten op WiFi-toegang. De gegevens blijven op mobiele apparaten staan en worden gesynchroniseerd met de cloud.
11. Verzend de monsters naar een thuisinstelling door ze 's nachts in een verzenddoos te plaatsen. Minimaliseer de tijd dat de monsters worden blootgesteld aan temperaturen lager dan 11 °C of meer dan 25 °C door pakketten te verzenden op dagen dat de lading wordt vervoerd.
    OPMERKING: De meeste verzendfaciliteiten verzenden geen lading 's nachts in het weekend op afgelegen locaties.

3. Uitbouwen van veldcollecties in het laboratorium

OPMERKING: In dit gedeelte wordt beschreven hoe u de overdracht van monsters van gelabelde verzamelzakken naar gelabelde platen organiseert. De monsters kunnen afkomstig zijn van een nachtelijke zending of rechtstreeks uit het veld.

1. Ontvang de verzending van collecties en inspecteer op kapotte zakken of ander bewijs van schade. Als zakken kapot zijn, gooi het materiaal dan weg en reinig de ongebroken verzamelzakken met 70% ethanol; vermijd het C-label op de zak met de ethanol, omdat dit het etiket zal verkleuren en het moeilijk leesbaar zal maken.
2. Noteer voor elke tas met ritssluiting het C-label op de zak en bevestig een bijpassend C-label op het deksel van een plaat van 10 cm die is gespot met OP50-bacteriën.
   OPMERKING: De gelabelde platen van 10 cm worden voor de rest van het protocol 'C-platen' genoemd. De eenvoudigste manier om de monsters te organiseren, is door de verzamelzakken op een laboratoriumbank te plaatsen met de bijpassende C-plaat erop (figuur 3).
3. Breng voor elke verzameling ongeveer een eetlepel monster van de verzamelzak over naar de C-plaat met behulp van een schone plastic lepel. Voeg het monster rond het bacteriële gazon toe in een halve maan- of ringvorm, bedek het bacteriële gazon niet volledig (figuur 4).
   OPMERKING: Houd de eetlepel schoon door deze in een bekerglas van 95% ethanol te plaatsen wanneer deze niet in gebruik is. Gebruik een papieren handdoek om de eetlepel te drogen voordat u extra monsters overbrengt.
4. Noteer de tijd dat de collecties werden overgebracht van verzamelzakken naar C-platen en bewaar de C-platen ten minste 24 uur bij kamertemperatuur (RT) voordat wordt geprobeerd nematoden in sectie 4 te isoleren.

4. Nematoden isoleren uit collecties

1. Open de Fulcrum-applicatie op het mobiele apparaat en kies Nematode Isolation in het toepassingsmenu (Afbeelding 5A). Maak een nieuwe isolatierecord door op het pictogram + rechtsonder te tikken (afbeelding 5B).
2. Controleer in het nieuwe isolatierecordscherm het juiste verzamelingsproject door de projectnaam aan te vinken die wordt weergegeven in het vak in het midden bovenaan. Als het verkeerde project wordt weergegeven, tikt u op de projectnaam om over te schakelen naar het juiste project (afbeelding 5C).
3. Tik op de knop Selecteren onder het veld C-label om het C-label te vinden dat is gekoppeld aan het monster waaruit nematoden worden geïsoleerd (figuur 5D). Tik op het pictogram Zoeken en tik vervolgens op het pictogram Scannen om de QR-code met C-label op de C-plaat met de camera van het apparaat te scannen. Zodra de QR-code is gescand, verschijnt er een C-labelrecord in het C-labelveld .
4. Tik op het camerapictogram in het veld Foto's om de camera van het apparaat te openen en gebruik deze om een foto te maken van het monster op de C-plaat met de QR-code zichtbaar (figuur 5E). Tik op Gereed om terug te keren naar het isolatiescherm.
   OPMERKING: Deze isolatierecordfoto's kunnen worden gebruikt om specifieke kenmerken van het substraat op een later tijdstip te verkennen.
5. Gebruik een ontleedmicroscoop om te zoeken naar nematoden op de C-plaat. Tik op het veld Wormen op Monster om de aanwezigheid van nematoden op het monster te registreren (figuur 5F). Tik op Ja als er nematoden op de C-plaat aanwezig zijn en tik op Nee als er geen aaltjes aanwezig zijn.
6. Tik op Tracks als alleen nematode tracks aanwezig zijn. Als er geen nematoden aanwezig zijn, parafilm dan de C-plaat en gooi deze weg in een biohazard bak.
   OPMERKING: Keer de C-plaat om over de biohazard afvalbak en tik zachtjes op de achterkant van de plaat om alle bemonsterde substraten los te maken. Deze stap maakt het gemakkelijker om nematoden te vinden en te isoleren die zich onder het substraat op de C-plaat kunnen bevinden.
7. Als er nematoden aanwezig zijn, isoleer dan maximaal vijf nematoden uit de C-plaat. Om een nematode te isoleren, brengt u één nematode over van de C-plaat naar een S-plaat met behulp van een platina draadprikker. Isoleer gezonde, gravid volwassenen indien mogelijk. Isoleer echter andere stadia als volwassenen niet worden gevonden.
   OPMERKING: Na isolatie hebben maximaal vijf S-platen elk een enkele nematode erop. Houd deze S-plaat(s) met geïsoleerde nematoden van dezelfde C-plaat samen georganiseerd in een nette stapel uit de buurt van andere S-platen totdat ze in Fulcrum worden ingevoerd.
8. Tik op het veld S-gelabelde platen om de S-plaat(s) in te voeren die voor deze isolatie worden gebruikt. Tik op de + in de rechterbenedenhoek. Tik op S-label en klik vervolgens op Scannen om de camera van het apparaat te openen. Gebruik de camera van het apparaat om de QR-code van het S-label op de S-plaat te scannen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de S-labelcode overeenkomt met de code op de plaat. Als het overeenkomt, tikt u op Gereed. Als dit niet het geval is, tikt u op Annuleren en opnieuw scannen totdat het overeenkomt en klikt u vervolgens op Gereed. Soms worden QR-codes van nabijgelegen platen per ongeluk gescand.
9. Nadat u elke S-plaat hebt ingevoerd, slaat u het item op met de knop Opslaan in de rechterbovenhoek. De inzending gaat verloren als deze niet wordt opgeslagen. Tik op de + in de rechterbenedenhoek om indien nodig meer S-gelabelde platen toe te voegen totdat alle nematoden geïsoleerd uit de C-plaat zijn ingevoerd. Nadat u alle S-gelabelde platen voor de isolatierecord hebt toegevoegd, tikt u op de knop < linksboven om terug te gaan naar het isolatie-opnamescherm.
   OPMERKING: Als u een isolatierecord wilt annuleren omdat fouten niet kunnen worden opgelost, klikt u linksboven op Annuleren . Met deze stap wordt een dialoogvenster geopend waarin wordt gevraagd of de record kan worden verwijderd zonder op te slaan. Klik desgewenst op Ja, Weggooien.
10. Tik op de knop Opslaan in de rechterbovenhoek zodra alle informatie correct is toegevoegd aan het isolatierecord. Vervolgens parafilm je de S-platen met geïsoleerde nematoden en zet ze apart in een gebied dat is aangewezen om S-platen met nematoden te houden.
11. Parafilm de C-plaat en gooi deze weg in de biohazard bak. Tik op het pictogram Synchroniseren om alle gegevens naar Fulcrum te uploaden.
12. Sorteer alle S-platen in alfanumerieke volgorde en plaats de S-platen in kartonnen dozen. Zorg ervoor dat de S-platen met de dekselzijde naar beneden en geparafilmd zijn. Stapel maximaal vier S-platen op één positie in de doos en label de kartonnen doos met de projectnaam, datum, tijd en een uniek doosnummer.
13. Bewaar de gelabelde dozen bij RT. Deze isolaten worden gecontroleerd op proliferatie om 48 uur en opnieuw om 168 uur indien nodig.

5. S-platen exporteren vanuit Fulcrum

OPMERKING: In deze sectie wordt beschreven hoe u S-labels die worden gebruikt in het isolatieproces kunt exporteren uit de Fulcrum-projectdatabase. Deze S-labels zullen worden gebruikt om prolifererende isofemalelijnen te volgen terwijl ze worden geïdentificeerd door sequentie-identiteit in secties 6-9.

1. Meld u aan bij de Fulcrum-website en selecteer de toepassing Nematode Isolation . Klik op Exporteren aan de linkerkant van het scherm. Klik hierop om het gewenste project te selecteren en schakel het selectievakje Nematode Isolation in. Klik op Volgende om een .zip bestand te downloaden dat het bestand 'nematode_isolation_s_labeled_plates.csv' bevat.
2. Open het bestand 'nematode_isolation_s_labeled_plates.csv' en sorteer het op de kolom 'S-label' in oplopende volgorde (het kleinste S-label staat bovenaan). Selecteer alle S-labels en kopieer ze uit de spreadsheet.
3. Navigeer met een webbrowser naar de wild isolaat genotypering sjabloon google sheet (wild_isolate_genotyping_template^).
   1. Maak een kopie van dit Google-blad door met de rechtermuisknop op het tabblad Genotypering-sjabloon te klikken en vervolgens de optie Kopiëren naar nieuwe spreadsheet te selecteren. Selecteer Spreadsheet openen om het nieuwe Google-werkblad weer te geven.
   2. Geef dit nieuwe blad de naam van het steunpuntproject gevolgd door 'wild_isolate_genotyping', bijvoorbeeld '2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping'.
      OPMERKING: Dit blad wordt in de rest van het protocol het 'genotyperingsblad' genoemd.
4. Plak de gekopieerde S-labels uit de kolom 'nematode_isolation_s_labeled_plates.csv' 's_label' in de genotyperingskolom met de titel 's_label'. Controleer de kolom 's_label_repeat_error' voor '1's. Een waarde van '1' in deze kolom betekent dat het S-label ergens op het genotyperingsvel wordt gedupliceerd. Als er doublures worden ontdekt, onderzoek en corrigeer ze dan voordat u verder gaat.
5. Vul de kolom 'isolation_box_number' van het genotyperingsblad in voor alle S-labels.

6. Controleer op proliferatie op S-platen

1. Controleer op prolifererende dieren op S-platen 48 uur na isolatie (gebruik de datum en tijd van de laatste isolatie op de doos uit stap 4.11 om de timing te begeleiden).
   OPMERKING: Prolifererende nematoden worden gekenmerkt door nakomelingen op de S-plaat.
2. Als een S-plaat woekert, voert u '1' in de kolom proliferation_48 op het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label '48 h proliferatie, vak 1'. Plaats maximaal 88 S-platen in een proliferatiedoos en begin vervolgens met het vullen van een nieuwe doos met het label '48 h proliferatie, doos 2'. Zorg ervoor dat de S-labels in alfanumerieke volgorde zijn georganiseerd in de 48 h-proliferatievakken.
   OPMERKING: Gooi de niet-prolifererende S-platen niet weg; deze platen worden om 168 uur na isolatie opnieuw gecontroleerd. Consolideer deze S-platen desgewenst in numerieke volgorde in vakjes met het label '48 h niet-prolifererend, vak X', maar vergeet niet te noteren wanneer de 168 h-controle op het nieuwe vak moet plaatsvinden.
3. Na het identificeren van alle prolifererende S-labels na 48 h, ga je verder met sectie 7 voor S-platen met proliferatie na 48 h.
4. Controleer de S-platen die niet woekeren bij 48 uur na isolatie opnieuw bij 168 uur na isolatie.
   1. Als een S-plaat zich nu verspreidt, voert u '1' in de kolom proliferation_168 op het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label '168 h proliferatie, vak 1'.
   2. Plaats maximaal 88 S-platen in een proliferatiedoos en begin vervolgens met het vullen van een nieuwe doos met het label '168 h proliferatie, doos 2'. Zorg ervoor dat u S-labels in alfanumerieke volgorde ordent in de 168 h proliferatievakken.
5. Gooi de S-platen weg die na 168 uur geen proliferatie hebben. Ga verder naar sectie 7 voor S-platen met proliferatie bij 168 h.

7. Lysis van isomellijnen

OPMERKING: Deze stap gebruikt de gegevensfiltertool in Google Sheets om lysis-werkbladen voor de S-platen in de proliferatievakken af te drukken. Het doel van de lysis werkbladen is om personeel te voorzien van de juiste posities voor S-labels in lysis strip buizen op de bank.

1. Open het genotyperingsblad voor het gewenste project en selecteer alle cellen door Cmd+A te typen. Klik op Gegevens > Een filter maken om een filterknop toe te voegen aan elke kolomkop. Gebruik de filterknoppen om alleen de S-platen weer te geven die worden gegenotypeerd. Als bijvoorbeeld alle S-platen met proliferatie bij 48 uur moeten worden gelyseerd: Klik op de filterknop in de kolom 'proliferation_48' en selecteer '1'.
2. Zodra het genotypering google sheet is gefilterd, bekijkt u de lijst met weergegeven S-labels om er zeker van te zijn dat dit de S-labels zijn die op het werkblad moeten worden afgedrukt.
   1. Voer in de kolom 'strip_tube_number' van het google-blad voor genotypering elke 11 rijen een uniek nummer in.
   2. Voer de stripbuisnummers voor een project in opeenvolgende volgorde in, beginnend bij 1 en nooit gedupliceerd. Voer in de 'strip_tube_position' 2 tot en met 12 in voor elk stripbuisnummer.
      OPMERKING: Gebruik 12-buiss stripbuizen voor lysis. De eerste positie (strip_tube_position 1) is controle, maar de besturingselementen worden niet toegevoegd aan de lysis-werkbladen (alleen de strip_tube_positions worden toegevoegd, 2-12). Op het moment van lysis wordt de positieve controlestam 'N2' als positieve controle toegevoegd aan positie 1 van elke even genummerde stripbuis. Er worden geen wormen toegevoegd aan positie 1 van elke oneven genummerde stripbuis als negatieve controle.
3. Filter het genotypering google sheet verder om alleen de S-labels op te nemen in één te lyseren proliferatievak en selecteer vervolgens de kolommen 's_label' tot en met 'lysis_notes'. Druk een lysis-werkblad af voor elke proliferatiedoos die moet worden gelyseerd.
4. Klik op het vervolgkeuzemenu in het veld Afdrukken en selecteer Geselecteerde cellen. Klik op Volgende in de rechterbovenhoek en gebruik vervolgens het dialoogvenster om het lysis-werkblad voor het proliferatievak af te drukken.
5. Herhaal stap 7.3-7.5 om een lysis-werkblad af te drukken voor elk proliferatievak.
   OPMERKING: Elke proliferatiedoos bevat maximaal 88 S-platen, wat overeenkomt met acht 12-well stripbuizen.
6. Bereid 12-well stripbuizen voor voor alle monsters die zullen worden gelyseerd. Label een stripbuis met een unieke 'strip_tube_number' toegewezen in het lysis werkblad. Dit etiket moet op de dopstrook en de stripbuis worden geschreven om verwarring te voorkomen als ze gescheiden zijn. De EVEN stripbuizen hebben een positieve controle (N2 wormen) in positie 1. De ODD stripbuizen hebben een negatieve controle (geen wormen) in positie 1.
7. Vul voldoende lysisbuffer aan (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM _MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% gelatine met proteïnase K toegevoegd aan een eindconcentratie van 0,4 mg/ml) voor alle monsters en voeg 5% extra toe voor pipetfouten. Schaal indien nodig.
   OPMERKING: De lysisbuffer kan het beste worden bereid door alle ingrediënten behalve proteïnase K te combineren en in te vriezen in 10-50 ml aliquots bij -20 °C. Ontdooi aliquots en houd ze vóór gebruik op 4 °C; voeg vlak voor gebruik proteïnase K toe en meng grondig. Houd de lysisbuffer op ijs tijdens het werken.
8. Rangschik de S-platen voor een bepaalde stripbuis in volgorde met behulp van het afgedrukte lysis-werkblad als leidraad.
9. Maak een stripbuis los en voeg 8 μL lysisbuffer toe aan elke dop met een repeatpipettor. Voeg de lysisbuffer toe aan één strook doppen tegelijk, omdat de lysisbuffer zal verdampen als deze bij RT wordt achtergelaten en onbedekt wordt gelaten. Kies 3-5 dieren van de bronplaten (S-plaat of N2-voorraadplaat voor positieve controles) in de juiste dopposities die op het lysis-werkblad worden aangegeven. Noteer notities voor elke S-plaat met minder dan 5 wormen die naar de lysis zijn geplukt in het gedeelte lysis_notes van het lysis-werkblad.
10. Nadat u nematoden in elke positie van de stripbuis hebt geladen, plaatst u de dopstrook terug op de stripbuis. Stem de gemarkeerde dop (positie 1) af op de gemarkeerde buis (positie 1). Eenmaal afgedekt, centrifugeer de stripbuis kort totdat de nematoden zich op de bodem van de buis bevinden.
11. Plaats de strip in de -80 °C vriezer tot deze volledig bevroren is (minimaal 10 min). Herhaal stap 7.9 tot en met 7.11 totdat aan alle strips nematoden zijn toegevoegd voor lysis. Organiseer de buisstrips in numerieke volgorde.
12. Verwijder de sets stripbuizen en voer het lysisprogramma uit in een thermocycler: 1 uur bij 60 °C, 15 min bij 95 °C, vasthouden bij 12 °C. Wanneer het lysisprogramma is voltooid, draait u de monsters op 300 x g gedurende 15 s bij RT en bewaart u de lysaten bij -80 °C gedurende maximaal 1 week.
13. Organiseer de buisstrips in numerieke volgorde met behulp van 96-well plaathouders en voeg een label toe met een proliferatiedoosnummer, stripbuisnummerbereik, datum en de initialen van de onderzoeker. Werk de genotyperingsbladkolommen 'lysis_date' en 'lysis_notes' bij met informatie uit het lysis-werkblad.

8. PCR van SSU- en ITS2-sequenties

OPMERKING: In dit gedeelte vindt u instructies voor het uitvoeren van twee afzonderlijke PCR's voor elke gelyseerde S-plaat. De eerste primerset versterkt een 500-bp fragment van het 18S rDNA small subunit gene (SSU); oECA1271 = forward primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = reverse primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA ¹². Deze PCR wordt gebruikt om de kwaliteit van het template DNA te controleren. De PCR versterkt het SSU-gebied voor bijna alle nematodensoorten. Als de SSU PCR niet versterkt, suggereert dit resultaat dat de lysiskwaliteit slecht is en de lysis moet worden herhaald voor deze S-plaat. De tweede primerset versterkt een 2.000 bp-fragment van het interne getranscribeerde spacergebied tussen de 5,8S- en 28S-rDNA-genen (ITS2); oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. Het ITS2 PCR-product is Sanger gesequenced en de sequentie wordt gebruikt om nematoden in het geslacht Caenorhabditis te identificeren tot het soortniveau door sequentieovereenkomst.

1. Gebruik het filtergereedschap in het genotyperingsblad om alleen de S-labels weer te geven die voor PCR moeten worden gebruikt.
   1. Werk de pcr_plate_number bij en pcr_well kolommen in het genotyperingsblad. Om degradatie van lysismateriaal te voorkomen, worden de SSU en ITS2 PCR's tegelijkertijd uitgevoerd.
   2. Gebruik dezelfde pcr_plate_number voor de ITS2- en SSU-PCR's, ook al zijn dit afzonderlijke reacties in afzonderlijke platen. Ze worden onderscheiden met 'SSU'- of 'ITS2'-labels.
2. Wijs een pcr_plate_number toe aan acht of minder stripbuizen (één stripbuis per rij van de 96-well PCR-plaat, gerangschikt in oplopende volgorde, bijvoorbeeld het laagste stripbuisnummer bovenop). Wijs vervolgens een pcr_plate_well toe aan elk S-label in de stripbuizen.
   OPMERKING: De bandbuizen zijn in oplopende volgorde gerangschikt, waarbij het laagste bandbuisnummer is toegewezen aan rij A en het hoogste nummer in rij H. Positie 1 van alle bandbuizen is toegewezen aan kolom 1. Daarom wordt stripbuis nummer 1, positie 1 toegewezen aan PCR-plaatnummer 1, nou ja A01.
3. Label 96-well PCR-plaat(s) voor de monsters die voor PCR zullen worden gebruikt. Label elke PCR-plaat met de volgende informatie: projectnaam, PCR-type, PCR-kenteken en datum van PCR (bijvoorbeeld 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Label ook de plaat met de stripbuisnummers die in elke rij worden geladen.
4. Haal het lysismateriaal uit de -80 °C vriezer en ontdooi de stripbuizen met het lysismateriaal op ijs. Terwijl het lysismateriaal ontdooit, bereidt u ITS2- en SSU-mastermixen in afzonderlijke buizen op ijs. De SSU- en ITS2 PCR-recepten zijn te vinden in aanvullende tabel 2.
   OPMERKING: Bereid 100 reacties van PCR-mastermix voor elke 96-well plaat om een pipetteerfout mogelijk te maken. Gebruik een conisch mengsel van 15 ml of 50 ml om de mastermix vast te houden als er grote volumes moeten worden gebruikt.
5. Vortex de mastermix voorzichtig tot Taq over het mengsel is verdeeld. Eenmaal gemengd, aliquot 38 μL van het mastermengsel in de juiste putten van de PCR-platen op ijs. Gebruik steriele v-bodemgoten voor eenmalig gebruik en een 12-well meerkanaals pipet om de mastermix over te brengen naar de PCR-platen.
6. Draai de ontdooide lysisstripbuizen naar beneden om lysismateriaal van de doppen te verwijderen. Verwijder voorzichtig de deksels van alle stripbuizen die in de eerste PCR-plaat worden geladen. Gebruik een meerkanaals pipet met een laag volume (12-well of 8-well) om 2 μL lysaat toe te voegen aan de juiste put in de PCR-plaat. Pipetteer het lysaat eenmaal op en neer voordat u de 2 μL verwijdert.
   OPMERKING: Controleer de tips om er zeker van te zijn dat ze de lysis bevatten voor de overdracht. Vergeet niet om tips tussen rijen of kolommen te wijzigen.
7. Bedek de PCR-plaat met PCR-lijmfolie en gebruik een roller om een strakke afdichting te creëren. Nadat de folie is aangebracht, draait u de PCR-platen kort in een centrifuge. Houd de plaat op ijs totdat deze klaar is om in de thermocycler te lopen.
8. Voer de PCR's uit met het juiste thermocycler-programma. Raadpleeg aanvullende tabel 2 voor de details van de SSU- en ITS2 PCR-programma's.
9. Herhaal stap 8.4- 8.8 totdat alle PCR's zijn uitgevoerd.
10. Terwijl de PCR-reacties lopen, giet u een 100 ml 1,5% agarose-gel. Elke gel bevat monsters of een enkele PCR-plaat.
    1. Voeg 1,5 g agarose toe aan een kolf van 500 ml, voeg vervolgens 100 ml 1x TAE-buffer toe (aanvullende tabel 3) en draai om te mengen. Magnetron om de gel op te lossen en af te koelen.
    2. Zodra de oplossing is afgekoeld, voegt u 5 μL ethidiumbromideoplossing van 10 mg/ml toe en mengt u om te combineren. Giet de oplossing in een gietbak met vier 25-well kammen, zodat de gel plaats biedt aan 96 monsters plus een ladder voor elke rij in de gel.
       OPMERKING: Ethidiumbromide is een krachtig mutageen. Gebruik bij het hanteren van ethidiumbromide een laboratoriumjas, chemicaliënbestendige handschoenen en een chemische veiligheidsbril.
11. Vlak voordat de PCR klaar is, voegt u 6x ladende kleurstof toe aan een wegwerptrog en gebruikt u een meerkanaals pipet om 2 μL 6x ladende kleurstof toe te voegen aan elke put van een nieuwe 96-well PCR-plaat. Deze plaat wordt gebruikt om de monsters in de gel te laden. Maak genoeg van deze platen om alle monsters te huisvesten.
12. Wanneer de PCR's klaar zijn, verwijdert u de PCR-platen en centrifugeert u ze kort op 300 x g gedurende 15 s bij RT. Bewaar de PCR-platen op ijs totdat de PCR-producten op een gel kunnen worden uitgevoerd.
    1. Om de producten op een gel uit te voeren, gebruikt u een 12-well meerkanaals pipet om 5 μL van elk monster toe te voegen aan de juiste put van een 96-well plaat met 2 μL 6x ladende kleurstof.
    2. Laad vervolgens 6 μL van dit mengsel in elke put van een recent gegoten gel. Laad 6 μL van 1 KB plus ladder in de eerste put van elke rij van de gel.
       OPMERKING: Om de putjes van de gel te vullen, kan het nodig zijn om rij A en rij B van de PCR-plaat in de eerste rij van de gel af te wisselen. Om verwarring te voorkomen, neemt u de gel_number en gel_position op in het genotyperingsblad voor elk PCR-monster.
13. Plaats een nieuw foliedeksel op de resterende PCR in de plaat(en) en bewaar deze bij 4 °C. Deze reactieproducten zullen worden gebruikt voor sequencing in stap 9.
14. Laat de PCR-producten gedurende 20 minuten op de gel op 120 V lopen. Stel de gel voor en noteer welke S-labels ITS2- en/of SSU PCR-producten opleveren in de kolommen 'pcr_product_its2' en 'prc_product_ssu' van het genotyperingsvel. Markeer de aanwezigheid van een band met een '1'; markeer een '0' voor geen enkele band.

9. Nematoden identificeren met Sanger sequencing en sequence BLAST

OPMERKING: Deze sectie bevat instructies voor het sequentiëren van de ITS2-amplicons van de S-labels, het uitlijnen van die sequenties met behulp van het BLAST-algoritme en het parseren van de BLAST-resultaten om de nematoden op de S-platen te identificeren.

1. Gebruik voor elk monster dat ITS2-positief is, het resterende ITS2 PCR-product voor Sanger-sequencing met behulp van de voorwaartse primer oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Zorg ervoor dat de sequencing-uitvoerbestanden eenvoudig aan een S-label kunnen worden gekoppeld door de kolommen 'sequencing_plate' en 'sequencing_well' van elk S-label in het genotyperingsblad op te nemen.
2. Haal de .seq-uitvoerbestanden voor elk S-label op van het sequencingplatform. Rangschik de SEQ-bestanden voor een project in één map met .seq-bestanden voor elke batch sequencing in submappen.
3. Open het opdrachtregelinterfacegereedschap en navigeer naar de bovenste map met de .seq-bestanden door het commando in te voeren: cd . Als het nog niet bestaat, maak dan een samengevoegde FASTA voor alle .seq-bestanden door het volgende commando in te voeren: voor dir in */; doe cd $dir; voor bestand in *.seq; echo ">"$file; cat $file; klaar >>.. /all_seqs.fa; cd ..; klaar.
   OPMERKING: Deze code maakt een samengevoegd FASTA-bestand met de naam 'all_seqs.fa' van alle .seq-bestanden in de projectmap. Dit bestand kan worden gebruikt in de NCBI online nucleotide BLAST-tool om de ITS2-sequentie van elk S-label snel uit te lijnen met de sequentiedatabase van NCBI.
4. Navigeer in een webbrowser naar de NBCI BLAST-website20 en klik op de knop Bestand kiezen. Selecteer het all_seqs.fa-bestand dat zojuist is gemaakt en klik vervolgens op de knop Enigszins vergelijkbare reeksen (BLASTn). Klik op de BLAST-knop onderaan de pagina om de BLAST-zoekopdracht te starten.
5. Werk het genotyperingsblad bij met de BLAST-resultaten voor elk S-label. Gebruik de filtertool om het bijwerken van het google-blad met genotypering gemakkelijker te maken. Klik op Gegevens > Een filter maken om een filterknop toe te voegen aan elke kolomkop. Filter de kolom sequencing_plate om de sequencingplaten te selecteren die moeten worden bijgewerkt met BLAST-resultaten.
6. Gebruik het vervolgkeuzemenu op de NCBI BLAST-resultatenpagina om de resultaten voor elke ITS2-reeks van de S-plaat te controleren (figuur 6).
7. Controleer of er geen BLAST-hits zijn. Een reeks-ID in de vervolgkeuzelijst met het voorvoegsel * heeft geen blast hits. Voer voor deze S-labels 'no hit ' in de kolom manual_blast_notes van het genotyperingsblad in.
8. Controleer op een mogelijke nieuwe Caenorhabditis-soort . Klik op de link op de bovenste treffer om de uitlijning te visualiseren (figuur 6). Als de tophit (1) een Caenorhabditis-soort is, (2) de uitlijning meer dan vijf mismatches in het midden van de reeks bevat en (3) de querydekking groter is dan 50%, suggereert dit resultaat dat het isolaat een nieuwe Caenorhabditis-soort kan zijn (figuur 7). Voor deze S-platen invoeren, de soort van de bovenste BLAST hit in de kolom 'species_id', voer een 1 in de kolom 'possible_new_caeno_sp', en 'mogelijk nieuwe Caeno sp.' in de kolom 'manual_blast_notes' samen met procent identiteit, (bijvoorbeeld 'mogelijk nieuwe Caeno sp. 89% identiteit').
9. Voor S-plaatsequenties die BLAST naar een Caenorhabditis-soort , voert u de volledige geslachts- en soortnaam van de top BLAST-hit in de kolom 'species_id' in. Bijvoorbeeld 'Caenorhabditis elegans'.
10. Voor S-plaatsequenties die BLAST naar een niet-Caenorhabditis-soort , voer alleen het geslacht van de bovenste BLAST-hit gevolgd door 'sp.' in de kolom 'species_id' in. Deze notatie betekent dat het isolaat een onbekende soort is binnen het benoemde geslacht. Bijvoorbeeld 'Oscheius sp.'.
    OPMERKING: De ITS2-sequentie kan niet worden gebruikt om isolaten betrouwbaar te identificeren tot het soortniveau buiten het geslacht Caenorhabditis3,13.
11. Vermeld 1 in de kolom 'make_strain_name' van het genotyperingsblad als 'species_id' = 'Caenorhabditis elegans', 'Caenorhabditis briggsae', of 'Caenorhabditis tropicalis', OF 'possible_new_caeno_sp' = 1.
12. Noem de stammen met unieke namen volgens de nomenclatuurconventies van Caenorhabditis , d.w.z. een unieke laboratoriumaanduiding bestaande uit 2-3 hoofdletters gevolgd door een nummer voor elke unieke ^stam23. Voer de stamnamen in de kolom 'strain_name' in.
13. Nadat stammen zijn benoemd, kunnen ze worden gecryopreserveerd met behulp van vastgestelde protocollen ²⁴.

10. Verwerking van de verzamelgegevens met het easyFulcrum-pakket in R

OPMERKING: In deze stap wordt beschreven hoe u de verzamelingsgegevens (C-labels) en de isolatiegegevens van de nematoden (S-labels) aan elkaar koppelt met behulp van het pakket easyFulcrum R. De software bevat functies die de Fulcrum-gegevens verder verbinden met de genotyperingsgegevens van het genotyperingsblad, zodat S-label species-identiteiten en stamnamen in één gegevensframe worden georganiseerd.

1. Maak een nieuwe map met de naam voor het collectieproject. Rangschik de mappenstructuur in de map om te voldoen aan de vereisten die worden beschreven in het R-pakket ^{easyFulcrum15}.
2. Navigeer naar de Fulcrum-website en meld u aan. Exporteer de onbewerkte projectgegevens uit de Fulcrum-database met behulp van de gegevensexporttool van de Fulcrum-website aan de linkerkant en selecteer de volgende selectievakjes: project, inclusief foto's, inclusief GPS-gegevens, veldbemonstering en isolatie.
   OPMERKING: De Fulcrum-gegevens voor het project worden geëxporteerd als vijf bestanden met een door komma's gescheiden waarde (.csv). De volledige projectgegevens worden samengevoegd tot één gegevensframe met behulp van het easyFulcrum-pakket in R.
3. Verplaats de vijf .csv bestanden die vanuit Fulcrum zijn geëxporteerd naar de projectmap die in stap 10.1 is gemaakt, zoals aangegeven in het easyFulcrum-vignet21.
4. Open een Rstudio-sessie en installeer het easyfulcrum-pakket in R door de volgende opdrachten in te voeren in de R-console 'install.packages("devtools")' en 'devtools::install_github("AndersenLab/easyfulcrum")'.
5. Open een nieuw R-script en volg de aanwijzingen in het easyfulcrum-vignet om de verzamelgegevens te ^verwerken21.

Representative Results

Dit protocol is gebruikt om Caenorhabditis-nematoden te verzamelen van meerdere locaties, waaronder Hawaï en Californië. Het succespercentage van de isolatie voor Caenorhabditis-nematoden varieert afhankelijk van de verzamellocatie, het klimaat, de bemonsteringservaring en de bemonsterde substraattypen. Het protocol is gebruikt om uitgebreid de Hawaiiaanse eilanden te bemonsteren, waar negen verzamelprojecten zijn uitgevoerd over meerdere jaren en seizoenen. De isolatiesuccespercentages voor zelfrijdende Caenorhabditis-soorten zijn bijna identiek voor C. briggsae (162 van de 4.506 monsters, 3,6%) en C. elegans (163 van 4.506 monsters, 3,6%), en veel lager voor C. tropicalis (26 van 4.506 monsters, 0,58%)⁸. Elk van de zelfrijdende soorten is verrijkt op rottende fruit- en bloemsubstraten ten opzichte van de andere substraatcategorieën. Monster rottende fruit- en bloemsubstraten als de onderzoeker probeert het slagingspercentage te maximaliseren in plaats van substraatvoorkeuren te karakteriseren. Het slagingspercentage varieert echter met de kwaliteit van het geselecteerde substraat. Onder fruit- en bloemsubstraten zullen die substraten die te droog, nat of vers zijn, bijvoorbeeld waarschijnlijk geen Caenorhabditis-nematoden opleveren.

De schaalbaarheid van dit verzamelprotocol blijkt uit het aantal collecties dat een enkel paar onderzoekers uit het wild kan verzamelen. In oktober 2018 was een paar onderzoekers die dit verzamelprotocol gebruikten bijvoorbeeld in staat om in totaal meer dan 1.000 monsters in 7 dagen te verzamelen van meerdere locaties op twee Hawaiiaanse eilanden. Dit veldteam stuurde de monsters 's nachts naar het laboratorium, waar een team van acht onderzoekers meer dan 2.000 nematoden uit de monsters isoleerde toen ze aankwamen. Een belangrijk voordeel van dit protocol is dat het de kosten in verband met bemonstering op afgelegen locaties minimaliseert door de apparatuur en het personeel dat in het veld nodig is, te verminderen. Met behulp van dit protocol kan een klein veldteam zich concentreren op bemonstering, terwijl het isolatieteam de monsters in hun thuisinstelling kan verwerken met behulp van fragiele en zware apparatuur zoals ontleedmicroscopen en agarplaten voor het isoleren van nematoden. Bovendien maakt de implementatie van de mobiele dataverzamelingsapplicatie het mogelijk om alle veldgegevens die aan de monsters zijn gekoppeld, rechtstreeks aan het C-label te koppelen, waardoor het isolatieteam onafhankelijk van het veldteam kan werken tijdens het verwerken van monsters.

Onderzoekers die dit verzamelprotocol gebruiken, moeten rekening houden met de inspanning die nodig is om nematoden te isoleren voorafgaand aan een verzamelproject. De isolatie- en identificatiestappen zijn snelheidsbeperkend en een klein verzamelteam kan isolatoren snel overweldigen met monsters. Bovendien kan de laboratoriumruimte die nodig is om veel collecties te verwerken, het lopende onderzoek verstoren (figuur 3). Bovendien vereisen sommige geïsoleerde nematoden extra inspanning om te genotyperen. Ongeveer 2% van de isolaten wordt bijvoorbeeld niet versterkt met de SSU PCR-primerset na de eerste lysispoging en moet opnieuw worden gelyseerd om ervoor te zorgen dat het lysismateriaal geschikt is voor versterking met de ITS2-primerset (figuur 8). Bovendien slaagt ongeveer 3% van de isolaten er niet in om kwaliteitssequenties te produceren na een eerste ronde van Sanger-sequencing. Voor deze isolaten is vaak een nieuwe ronde van lysis, ITS2 PCR en Sanger-sequencing vereist, wat de overdrachtstijd voor het isolatieteam kan verlengen. Belangrijk is dat sequentie-identiteit alleen niet voldoende bewijs is om een nieuwe Caenorhabditis-soort te rechtvaardigen (figuur 7). Om het verhogen van een isolaat als een nieuwe Caenorhabditis-soort goed te rechtvaardigen , moet extra inspanning worden geleverd om paringsexperimenten uit te voeren en een getypt exemplaar vast te ^stellen13. Een formele morfologische beschrijving van het getypte specimen heeft ook de voorkeur, maar is niet ^vereist3. Samen suggereren deze overwegingen dat onderzoekers die dit verzamelprotocol aannemen, baat zullen hebben bij proeftests van de isolatie- en identificatiestappen om ervoor te zorgen dat middelen correct worden toegewezen voordat een verzamelproject begint. Belangrijk is dat zelfs kleine verzamelprojecten van dit protocol kunnen profiteren, omdat het proces zeer reproduceerbaar is en de gegevens gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd voor kwaliteitscontroledoeleinden in verschillende laboratoriumgroepen.

Figuur 1: Substraatvoorbeelden. (A) In het midden van de afbeelding wordt een ideale rottende vrucht getoond (1), de vrucht is bijna onherkenbaar. Minder verrot fruit wordt in de buurt getoond; vermijd het proeven van vers gevallen vruchten (2). (B) Bovenaan wordt een ideaal afgebroken bloem weergegeven (3). Vermijd het proeven van vers gevallen bloemen (4). (C) Het donkere bladstrooisel onder de bovenste laag droge bladeren is ideaal bij het bemonsteren van caenorhabditis-nematoden (5). Vermijd het bemonsteren van droog bladstrooisel (6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: De mobiele applicatie Nematode Field Sampling. (A) Het eerste scherm na het openen van de Nematode Field Sampling-applicatie op een Apple-apparaat in Fulcrum. De rode pijl rechtsonder wijst naar de knop + die wordt gebruikt om een nieuwe collectierecord te maken. (B) Een voorbeeld van een nieuwe collectierecord die wordt weergegeven op een Apple-apparaat. De rode pijl wijst naar het veld 'Project' boven aan het scherm met collectierecords. Zorg ervoor dat u het juiste project selecteert bij het nemen van steekproeven in het veld. Het projectveld wordt standaard ingesteld op het laatste project dat is gebruikt bij het maken van volgende verzamelingsrecords. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Verzamelzakken en verzamelplaten georganiseerd voorafgaand aan het uitzetten van monsters. Deze figuur toont de monsters in C-gelabelde verzamelzakken aan de linkerkant. Elke collectiezak heeft een bijpassend C-gelabeld bord van 10 cm erop. Aan de rechterkant zijn verzamelplaten van 10 cm die monstermateriaal bevatten nadat het uit de verzamelzakken is overgebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Een verzamelplaat (C-plaat) met een goed overgebracht monster. Een C-plaat van 10 cm met ontbindend fruit geplaatst op de rand van het bacteriële gazon. Het C-label is bevestigd aan het plaatdeksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: De mobiele applicatie Nematode isolation. (A) Het applicatieselectiescherm in de Fulcrum mobiele applicatie. De rode pijl wijst naar de toepassing Nematode Isolation . (B) Het eerste scherm na het openen van de Nematode Isolation-applicatie op een Apple-apparaat in Fulcrum. De rode pijl rechtsonder wijst naar de knop + die wordt gebruikt om een nieuwe isolatierecord te maken. (C) Een voorbeeld van een nieuwe isolatierecord die wordt weergegeven op een Apple-apparaat. De rode pijl wijst naar het veld 'Project' boven aan het isolatierecordscherm. Zorg ervoor dat u het juiste project selecteert bij het isoleren. Het projectveld wordt standaard ingesteld op het laatste project dat wordt gebruikt bij het maken van volgende isolatierecords. (D) Nadat gebruikers op het veld Selecteren onder C-label hebben getikt, tikken ze op de zoekknop (rode pijl) om het C-label te vinden waaruit ze nematoden isoleren. (E) Nadat het C-label is geselecteerd, zullen gebruikers de C-plaat fotograferen met behulp van de camera van het apparaat. (F) Gebruikers voeren dan in of er nematoden op de C-plaat zitten of niet. S-labels worden aan het isolatierecord toegevoegd als er nematoden moeten worden geïsoleerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: NCBI BLAST-resultatenpagina. (1) Het vervolgkeuzemenu dat wordt gebruikt om de BLAST-resultaten voor alle sequenties te bekijken. (2) De beschrijving van de huidige volgorde geselecteerd uit de vervolgkeuzelijst. In dit geval worden de resultaten voor S-label S-05554 getoond. (3) De top BLAST hit voor S-05554 wordt getoond. De paarse tekst geeft aan dat op de koppeling om deze uitlijning te visualiseren is geklikt. Zorg ervoor dat u de uitlijningen met het oog inspecteert om mogelijke nieuwe Caenorhabditis-soorten te identificeren, zie stap 9.8 hierboven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Voorbeelden van NCBI BLAST-uitlijningsvisualisatie. (A) Een voorbeeld van de ITS2-queryreeks van een isolaat die is uitgelijnd met een C. kamaaina-onderwerpsequentie . (1) De procentuele identiteit van de uitlijning (89%), wat laag is voor een top BLAST-hit. (2) Een mismatch tussen de query en de onderwerpvolgorde (G tot en met A). (3) Een opening van vier basenparen in de onderwerpsequentie gemaakt door het uitlijningsalgoritme; hiaten in de query of het onderwerp duiden op een slechte uitlijning. (4) Een gegeneraliseerd gebied in het midden van de uitlijning met veel mismatches en hiaten. Een regio als deze suggereert dat de querysequentie afkomstig kan zijn van een nieuwe Caenorhabditis-soort . Getoond is een actueel uitlijningsvoorbeeld van een nieuwe soort, C. oiwi, die in 2017 werd ontdekt. (B) Een voorbeeld van een goede afstemming tussen de ITS2-queryreeks van een isolaat en een onderwerpsequentie. (5) De procentuele identiteit van de uitlijning (99%), wat meestal betekent dat de querysequentie afkomstig is van een isolaat van dezelfde soort als het onderwerp. (6) Een centraal gebied van de afstemming met perfecte identiteit. Een gebied als dit suggereert dat de query isolaat waarschijnlijk dezelfde soort is als het onderwerp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: SSU- en ITS2 PCR-producten. De bovenste gel toont PCR-producten die zijn gegenereerd met de SSU-primerset voor 12 representatieve monsters. Links is als referentie een DNA-ladder opgenomen. De SSU PCR producten voor Caenorhabditis nematoden zijn ongeveer 500 bp lang. Monsters 2-12 versterkt met de SSU primer set, maar monster één niet. De afwezigheid van een 500 bp SSU-amplicon voor monster één suggereert dat het lysismateriaal van slechte kwaliteit was en dat het monster opnieuw moet worden gelyseerd. De onderste gel toont PCR-producten die zijn gegenereerd met de ITS2-primerset voor dezelfde 12 monsters die in de bovenste gel worden weergegeven. De ladder en monsters staan voor beide gels in dezelfde richting. Zes van de 12 samples werden niet versterkt met de ITS2 primer set. De monsters met SSU- en ITS2-banden zijn Sanger-gesequenced en geïdentificeerd door sequentieovereenkomst met behulp van het NCBI BLAST-algoritme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: C-labels. Een PDF-bestand met 2500 unieke C-labels. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: S-labels. Een PDF-bestand met 5000 unieke S-labels. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Veldmaterialen. Een paklijst van materialen die in het veld worden gebruikt om nematoden te bemonsteren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: PCR-recepten en thermocyclercondities. Een tabel met PCR-recepten en thermocyclercondities voor de ITS2- en SSU-PCR's. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Elektroforese bufferrecepten. Een recept voor 0,5 M pH 8,0 Ethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EDTA) en de TRIS-acetaat-EDTA (TAE) bufferoplossing. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Dit protocol bevat kritieke stappen die met de nodige voorzichtigheid moeten worden uitgevoerd. Het is bijvoorbeeld belangrijk dat de veld- en isolatieteams zorgvuldig het juiste verzamelproject in de toepassing selecteren voordat ze monsters uit het veld verzamelen of nematoden isoleren van de monsters in het laboratorium. In het geval dat het verkeerde verzamelproject wordt geselecteerd, kunnen de foutieve gegevensrecords het beste worden gecorrigeerd in de Fulcrum-database met behulp van de online tools voor het bewerken van records. Dit proces kan vervelend zijn voor veel misplaatste records. De database bewaart echter alle wijzigingen in records, zodat een volledige controle van verzamelings- en isolatierecords mogelijk is. De andere kritieke stappen in dit protocol omvatten de behandeling van monsters uit het veld en de nematoden die uit die monsters zijn geïsoleerd. Om ervoor te zorgen dat Caenorhabditis-nematoden de bemonsterings- en verzendingsstappen overleven, moet de temperatuur van de monsters tussen 4 °C en 25 °C worden gehouden. Temperaturen boven 25 °C kunnen steriliteit veroorzaken in C. elegans14. Zorg ervoor dat monsters waar mogelijk binnen vijf dagen van verzamelzakken naar verzamelplaten worden overgebracht om het verlies aan nematoden te minimaliseren. Nadat nematoden zijn geïsoleerd, is het van cruciaal belang dat ze worden gegenotypeerd en gecryopreserveerd voordat ze vergaan. Het is moeilijk om levende aaltjes te vinden op S-platen die meer dan twee tot drie weken oud zijn omdat schimmel- en bacteriële besmetting de S-platen onherbergzaam kunnen maken.

Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende soorten gegevens die onderzoekers mogelijk willen verzamelen terwijl ze in het veld zijn. Het is bijvoorbeeld eenvoudig om de toepassing 'Nematode field sampling' aan te passen met nieuwe gegevensinvoervelden met behulp van de online GUI van Fulcrum voor het bewerken van toepassingen. Bovendien kan het data-analysepakket, easyFulcrum, deze bewerkingen accommoderen bij het verwerken van de nieuwe ^gegevens15. Een andere wijziging die gebruikers aantrekkelijk kunnen vinden, is om een andere bemonsteringsmethode in het veld te gebruiken. In plaats van afzonderlijke substraten te bemonsteren, willen onderzoekers misschien grotere gebieden bemonsteren die meerdere substraattypen bevatten. Deze grotere monsters kunnen het beste in het laboratorium worden verwerkt met behulp van de Baermann-trechter- of trayextractiemethoden13. Belangrijk is dat het gebruik van C-labels en S-labels nog steeds van toepassing is op deze technieken en daarom compatibel is met mobiele applicaties.

De primaire beperkingen van dit protocol hebben betrekking op de verwerkingstijd van nematoden voorafgaand aan isolatie in het laboratorium. Ten eerste maakt de vertragingstijd tussen monsterverzameling en isolatie van nematoden het onmogelijk om de ontwikkelingsstadia van nematoden op een bepaald monster op het moment van verzameling vast te leggen. Ten tweede zijn de frequentie van mannetjes en outcrossing in de natuur belangrijke evolutionaire vragen voor het zelf bepalen van Caenorhabditis-nematoden10. Deze methode is niet geschikt om deze vragen aan te pakken, omdat nematoden waarschijnlijk meerdere generaties voorafgaand aan isolatie hebben doorlopen. Vertraagde isolatie betekent dat direct bewijs van mannelijke frequentie in de natuur onmogelijk is. Bovendien betekent de multi-generatie vertraging tijdens de genotyperingsstappen dat genomisch bewijs van outcrossing (heterozygositeit) zal worden geërodeerd voordat een nematodenstam kan worden gesequenced. Om heterozygositeit in de natuur te identificeren, worden de nakomelingen geproduceerd door een nematode die direct geïsoleerd is van de natuur gebruikt voor sequencing2. Een andere mogelijke beperking van dit protocol is dat het bevooroordeeld is in de richting van de identificatie van zelf-Caenorhabditis. Dit komt omdat geïsoleerde nematoden van zichzelf zichzelf ontwikkelende soorten een grotere kans hebben om zich te vermenigvuldigen dan obligate outcrossers, die zich alleen zullen vermenigvuldigen als een bevrucht vrouwtje wordt geïsoleerd.

Deze verzamelmethode is gebaseerd op bestaande ^{verzamelprotocollen13,14}. De belangrijkste vooruitgang van deze techniek is het gebruik van mobiele technologie en aangepaste software om de organisatie van enorme hoeveelheden ecologische en moleculaire gegevens in verband met grootschalige verzamelprojecten te vergemakkelijken. De ecologische gegevens die met behulp van dit verzamelprotocol worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om openstaande vragen voor natuurlijke populaties van Caenorhabditis-soorten aan te pakken. Gegevens die met deze methode zijn gegenereerd, zijn bijvoorbeeld gebruikt om nichevoorkeuren voor de soort op de Hawaiiaanse eilanden te ontdekken. Bovendien kunnen onderzoekers door het sequentiëren van de genomen van gecryopreserveerde nematoden onderzoeken hoe patronen van genetische variatie gecorreleerd zijn met ecologische gegevens. Dergelijk onderzoek kan handtekeningen van lokale aanpassing in Caenorhabditis-populaties blootleggen en belangrijke inzichten verschaffen in de relevantie van genetische variatie in natuurlijke ^contexten8. Om een functioneel begrip te krijgen van veel genen in Caenorhabditis-nematoden, zijn waarschijnlijk ecologische studies ^vereist11. Zelfs voor C. elegans mist een groot deel van de genen functionele annotaties, ondanks dat het het eerste meercellige dier is dat wordt gesequenced en een van de meest grondig bestudeerde dieren op aarde is. Dit verzamelprotocol is ontwikkeld om deze kenniskloof aan te pakken door de verzameling van wilde Caenorhabditis-nematoden en de studie van hun ecologie en natuurlijke genetische diversiteit te vergemakkelijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive labels	Avery	61533	Printing the C-labels and S-labels
Agarose	Thomas Scientific	C748D75	agarose gel preparation
Backpack			A backpack for each team member to hold equipment, samples, food, and water for the day.
Cardboard boxes	Fisher Scientific	AS261	Storage of S-plates
Centrifuge	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Collection bags	Zip-lock	NA	Collection of substrates
Digital temperature/humidity meter	Preciva	HT-86	Measurement of ambient temperature and humidity
Disecting scope	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Disposible reservoirs	USA Scientific	1306-1010	Aliquoting PCR master mixes and loading dye
DNA ladder, 1 KB plus	Thermo Scientific	SM0243	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
dNTPs	Thomas Scientific	CB4430-2	PCR master mix component
easyFulcrum R package	NA	NA	An R package for processing collection data http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html
EDTA solution (0.5 M pH 8.0)	NA	NA	See supplemental table 3 for recipe
Ethanol (95%)	NA	NA	Plating out samples, spoon sterilization
Ethidium bromide solution (10 mg/mL)	VWR	97064-602	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
External battery charger for mobile device	NA	NA	External battery charger and charging cable for iPhone or Android
Flask (500 mL)	Fisher Scientific	FB501500	agarose gel preparation
Food	NA	NA	Pack accordingly
Gel electrophoresis apparatus	Thermo Scientific	B2	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel loading dye, 6x	NEB	B7022S	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
ITS2 primer set	NA	NA	oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC
ITS2 sequencing primer	NA	NA	oECA306 = forward primer CACTTTCAAGCAACCCGAC
Lysis buffer	NA	NA	Nematode lysis, see protocol for recipe
Microwave	NA	NA	agarose gel preparation
Mobile device	NA	NA	Charged phone in airplane mode. The Fulcrum app GPS positions are inaccurate compared to the GPS positions extracted from pictures. This setting ensures that you use less power and get more precise GPS measurements.
NGMA plates, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713	C-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
NGMA plates, 3.5 cm	Greiner Bio-One	5662-7102Q	S-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
Non-contact infrared thermometer	Etekcity	B00837ZGRY	Measurement of substrate temperature
Paper towels	NA	NA	Paper towels for absorbing excess moisture in a bagged sample.
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Plate sealing
PCR adhesive foil	VWR	60941-126	PCR adhesive foil
PCR buffer (10x)	Thomas Scientific	CB3702-7	PCR master mix component
PCR plates (96-well)	Thomas Scientific	1149K04	SSU and ITS2 PCRs
Pencil	NA	NA
Plastic spoons	NA	NA	Plating out samples
Platinum pick	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Pre-labeled ziplock collection bags	NA	NA	Bundles of zip-lock plastic bags pre-labelled with C-label barcodes. Each bundle should contain 25 barcoded bags wrapped with a rubber band.
Proteinase K	Sigma	3115879001	Nematode lysis, added to lysis buffer just prior to use
R software	NA	NA	R software: A language and environment for statistical computing https://www.R-project.org/
Soft cooler bag and ice pack	NA	NA	Collection coolers and cooler packs to keep samples cool when ambient temperature is above 25 °C.
Spare batteries	NA	NA	Extra batteries for sampling equipment
SSU primer set	NA	NA	oECA1271 = forward primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = reverse primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA
Strip tube caps (12-well)	Thomas Scientific	1159V29	Nematode lysis
Strip tubes (12-well)	Thomas Scientific	1159V31	Nematode lysis
TAE buffer (1x)	NA	NA	Visualizing SSU and ITS2 PCR products. See supplemental table 3 for recipe
Taq polymerase	Thomas Scientific	C775Y45	PCR master mix component
Thermocycler	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Water	NA	NA	Pack accordingly