En svært skalerbar tilnærming for å utføre økologiske undersøkelser av selfing caenorhabditis Nematodes

Summary

Denne protokollen kan brukes til å utføre store økologiske undersøkelser av selfing Caenorhabditis nematoder. Den viktigste fordelen med denne metoden er effektiv organisering og analyse av økologiske og molekylære data knyttet til nematodene samlet inn fra naturen.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en av de viktigste modellorganismer i biologi, men bare nylig har forskere fokusert på sin naturlige økologi. Den relative sparsomheten av informasjon om C. elegans i sin naturlige sammenheng kommer fra utfordringene som er involvert i identifiseringen av den lille nematoden i naturen. Til tross for disse utfordringene har et økende fokus på økologien til C. elegans forårsaket et vell av ny informasjon om livet utenfor laboratoriet. Det intensiverte søket etter C. elegans i naturen har bidratt til oppdagelsen av mange nye Caenorhabditis-arter og avslørt at congeneric nematoder ofte samboer i naturen, hvor de spiser på mikrobielle blomster forbundet med rotting plantemateriale. Identifiseringen av nye arter har også avslørt at det androdioecious parringssystemet av menn og selvbefruktende hermafroditter har utviklet seg tre ganger uavhengig innen Caenorhabditis. De to andre selvgående artene, C. briggsae og C. tropicalis, deler de eksperimentelle fordelene med C. elegans og har gjort det mulig for komparative studier i det mekanistiske grunnlaget for viktige egenskaper, inkludert selvbefruktning. Til tross for disse fremskrittene gjenstår mye å lære om økologien og det naturlige mangfoldet av disse viktige artene. For eksempel mangler vi fortsatt funksjonell informasjon for mange av genene deres, som kanskje bare oppnås gjennom en forståelse av deres naturlige økologi. For å lette økologisk forskning på selfing Caenorhabditis nematoder, utviklet vi en svært skalerbar metode for å samle nematoder fra naturen. Vår metode benytter seg av mobile datainnsamlingsplattformer, skybaserte databaser og R-programvaremiljøet for å forbedre forskernes evne til å samle inn nematoder fra naturen, registrere tilknyttede økologiske data og identifisere ville nematoder ved hjelp av molekylære strekkoder.

Introduction

De siste to tiårene har brakt økt interesse for økologien til Caenorhabditis nematoder. Fra disse studiene vet vi at de frittlevende Caenorhabditis-artene kan isoleres fra flyktige mikrohabitater i både tempererte og tropiske regioner, hvor de spiser på mikrobielle blomster forbundet med nedbrytende plantemateriale, noen ganger i sympatry1,2,3,4,5,6,7,8 . Vi har også lært at konvergent evolusjon av selvbefruktning har skjedd i slekten tre ganger, og selv er den dominerende reproduksjonsmodusen for C. briggsae, C. elegans og C. tropicalis9,10. Blant disse selfers er C. elegans et av de mest studerte dyrene på jorden og har blitt brukt av forskere til å gjøre kritiske fremskritt innen biologi. Det er viktig at de andre selfing Caenorhabditis-artene deler mange av C. elegans eksperimentelle fordeler og fremmer raskt komparative studier i slekten. Imidlertid gjør den kryptiske naturen til disse nematodene i naturen det vanskelig å studere deres økologi og naturlige mangfold, noe som er avgjørende for å forstå de biologiske funksjonene til genene deres og måtene evolusjonen har formet genetisk mangfold blant ^artene10,11.

Den største utfordringen med å studere økologien til selvbestemt Caenorhabditis nematoder i naturen er deres lille størrelse; voksne nematoder er ofte 1 mm lange eller mindre. Denne utfordringen krever at forskere prøver substrater fra naturen og forsøker å skille nematoder av interesse fra substratene i laboratoriet uten evnen til å observere dyr i naturen. Fordi selv trente eksperter finner det vanskelig å diskriminere selvbestemte Caenorhabditis nematoder fra andre frittlevende nematoder under mikroskopet, blir nematoder vanligvis fjernet fra substratet, isolert og overlatt til å spre seg før de identifiseres ved sekvensidentitet ved hjelp av etablerte molekylære ^{strekkoder3,12,13,14} . Tiden og innsatsen som kreves for å behandle hver nematode på denne måten presenterer en organisatorisk utfordring, da forskere må kunne spore identiteten til hver nematode isolert i laboratoriet tilbake til det eksakte substratet og tilhørende økologiske data som er samplet i feltet. Her beskriver vi en trinnvis prosess for effektivt å samle inn og identifisere selvbestemte Caenorhabditis nematoder fra feltet og trofast koble disse isolerer med deres tilhørende romlige og økologiske data i høy skala.

Denne innsamlingsmetoden øker omfanget og nøyaktigheten av økologiske undersøkelser ved å bruke mobile datainnsamlingsplattformer, skybaserte databaser og R-programvaremiljøet. Fulcrum er en tilpassbar datainnsamlingsplattform som fungerer med de fleste mobile enheter og lar brukerne bygge tilpassede applikasjoner for å samle og organisere stedsbaserte data (https://www.fulcrumapp.com). Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner om hvordan du bruker tilpassede datainnsamlingsprogrammer for å organisere romlig eksplisitte økologiske data fra feltet og nøyaktig koble disse dataene til identiteten til nematoder isolert i laboratoriet. Protokollen forklarer også hvordan du effektivt identifiserer selvbestemt Caenorhabditis nematoder ved hjelp av etablerte molekylære strekkoder. Dataene fra disse metodene kan behandles enkelt og reprodusert med den medfølgende R-programvarepakken easyFulcrum15 for å utforske økologien og genetisk mangfold av naturlige Caenorhabditis-populasjoner.

Protocol

1. Oppsamlingsforberedelse

1. Identifiser et sted å undersøke Caenorhabditis nematoder.
   MERK: I de fleste tempererte områder kan C. elegans og C. briggsae lett isoleres fra menneskerelaterte habitater som jordbruksmarker eller landlige og urbane ^hager1. I subtropiske og tropiske regioner kan C. briggsae, C. elegans og C. tropicalis alle finnes i de menneskelige tilknyttede habitatene som er oppført ovenfor, noen ganger i nærheten av hverandre. Imidlertid synes C. elegans å foretrekke kjøligere, tørrere habitater enn de andre artene i tropiske ^habitater7,8. Hver av artene kan også isoleres fra ville habitater som ikke er forbundet med mennesker, men disse habitatene prøves sjeldnere.
2. Opprett et Fulcrum-prosjekt for å organisere innsamlings- og isolasjonsdataene med mobile datainnsamlingsprogrammer.
   1. Opprett en konto hos Fulcrum online ved hjelp av en gratis ^{utdanningsavtale16}. Legg til Nematode Field Sampling-applikasjonen i en Fulcrum-konto ved å klikke på ADD APP-knappen17.
   2. Legg til Nematode Isolation-applikasjonen i en konto ved å klikke på ADD APP-knappen18.
      MERK: Det anbefales at hver tur til et sted er organisert som sitt innsamlingsprosjekt ved hjelp av navnekonvensjonen 'YearMonthLocation', for eksempel 2020FebruaryAustralia.
3. Legg til brukere i Fulcrum-kontoen for å gi dem tilgang til samlingsprosjektet. Forsikre deg om at hver bruker laster ned Fulcrum-mobilapplikasjonen for å delta i prosjektet.
4. Skriv ut et sett med QR-kodeetiketter for å spore samlingene (C-etiketter) og nematodeisolasjonene (S-etikettene) med mobilapplikasjonen. Fest C-etikettene til zip-lock plastposer, rull de merkede posene i grupper på 25, og pakk dem med et gummibånd for pakking. Oppbevar settet med S-etiketter for bruk i laboratoriet.
   MERK: Gjennom hele denne protokollen finnes samlingene (substrater fra feltet) i poser eller på plater og er merket med C-etiketter. De isolerte nematodene er merket med S-etiketter. C-etikettene brukes til å identifisere unike samlinger, og S-etikettene brukes til å identifisere unike nematodeisolasjoner. Disse to typene etiketter brukes til å opprette forbindelsen mellom en bestemt samling (C-etikett) og nematodene isolert fra samlingen (S-etiketter) i Fulcrum-databasen. Skriv ut dobbelt så mange S-etiketter som C-etiketter for et samlingsprosjekt fordi i gjennomsnitt to nematoder er isolert per samling. Flere S-etiketter kan skrives ut senere om nødvendig. 2500 unike C-etiketter (Supplemental File 1) og 5000 unike S-etiketter (Supplemental File 2) er gitt i tillegget.
5. Forbered 10 cm NGMA-plater for samlinger og 3,5 cm NGMA-plater for isolering av nematoder. Lag en 10 cm plate og minst to 3,5 cm plater per ^oppsamling21. Disse platene er sådd med Escherichia coli stamme OP50 etter etablerte protokoller. Oppbevar platene før bruk ved 4 °C i ikke mer enn 1 måned.

2. Feltsamling

MERK: Caenorhabditis nematoder er oftest isolert fra råtnende vegetabilsk materiale, inkludert frukt, nøtter, frø, pods, blomster, stilker, vegetal søppel og kompost1,5,6,8. De beste substratene er råtne og nesten ugjenkjennelige som frukt eller blomster; unngå substrater som er for tørre eller våte (figur 1). Substrater samles mest effektivt fra feltet ved å jobbe parvis. Personen med det infrarøde termometeret som ikke er kontakt, velger et substrat for innsamling og innsamling av prøven mens partneren bruker Nematode Field Sampling-programmet i Fulcrum til å registrere innsamlingsdataene. Paret av samlere vil gjenta denne prosessen til ønsket antall prøver er samlet inn. Du finner en liste over materialer som kreves for feltarbeid i (Supplerende tabell 1).

1. Åpne Fulcrum-mobilappen, velg Nematode Field Sampling fra rullegardinmenyen. Trykk + for å starte en ny post i prosjektet (figur 2A). Ta et bilde av substratet.
2. Klikk på boksen øverst i midten for å velge riktig innsamlingsprosjekt i trinn 1.2 (figur 2B). Trykk på C-label-feltet nederst i samlingsposten, og velg Skann når ledeteksten vises. Skann strekkoden på oppsamlingsposen ved hjelp av kameraet på mobilenheten, og trykk deretter på Ferdig øverst til høyre på skjermen.
3. Trykk på Substrat-feltet og velg en substrattype fra rullegardinmenyen. Legg til notater om substratet ved å tappe Substrat notater-feltet og skrive inn notater manuelt.
4. Velg et liggende på rullegardinmenyen. Velg landskapet som best representerer prøveområdet.
5. Velg en himmelutsikt. Når du velger himmelvisning, må du beskrive himmelsynligheten på prøvestedet (f.eks. en hel himmelvisning uten blokkert utsikt fra trær eller andre strukturer = full).
6. Mål overflatetemperaturen til substratet ved hjelp av det ikke-kontakttermometeret og registrer verdien i substrattemperaturfeltet.
   MERK: Hold termometeret som ikke er i kontakt, ikke mer enn 14 tommer fra underlaget mens du registrerer temperaturen.
7. Mål omgivelsestemperaturen og fuktigheten med den håndholdte enheten og registrer disse dataene i de riktige feltene.
   MERK: Kontroller at omgivelsestemperaturen og fuktighetsanordningen ikke er på vent. Målenheten endres når knappen slippes. Oppbevar enheten i en utvendig lomme for å unngå uregelmessige avlesninger.
8. Lagre posten i Fulcrum ved å trykke på Lagre øverst til venstre på skjermen.
9. Samle om en spiseskje av substratet uten pinner eller andre harde stykker ved å invertere oppsamlingsposen for å bruke den som en "hanske" for å plukke opp substratet, og forsegle deretter posen. Legg et papirhåndkle i posen hvis prøven er spesielt fuktig.
   MERK: I varme klimaer plasserer du posene i myke kjølere med kjølerpakker for å holde kolleksjonene kjølige.
10. Etter at alle prøvene er samlet inn for dagen, rengjør oppsamlingsutstyret, ta batterier ut av sonder, lad opp batteriene, frys frysepakkene på nytt. Synkroniser Fulcrum-innsamlingsdataene ved å trykke på Synkroniser-knappen øverst til venstre i Nematode Field Sampling-programmet .
    MERK: Opplastningene kan ta flere minutter uten en sterk mobilforbindelse, så det kan være best å vente på WiFi-tilgang. Dataene forblir på mobile enheter og synkroniseres til skyen.
11. Send prøvene til en hjemmeinstitusjon ved å plassere dem i en fraktboks over natten. Minimer tiden prøvene utsettes for temperaturer under 11 °C eller mer enn 25 °C ved å sende pakker på dager der lasten transporteres.
    MERK: De fleste fraktanlegg sender ikke last over natten i helgene på avsidesliggende steder.

3. Plating ut feltsamlinger i laboratoriet

MERK: Denne delen beskriver hvordan du organiserer overføring av prøver fra merkede oppsamlingsposer til merkede plater. Prøvene kan komme fra en forsendelse over natten eller direkte fra feltet.

1. Motta forsendelse av samlinger og inspiser for ødelagte poser eller andre bevis på skade. Hvis posene er ødelagte, kast materialet og rengjør de ubrutte oppsamlingsposene med 70% etanol; unngå C-etiketten på posen med etanol, da den vil misfarge etiketten og gjøre den vanskelig å lese.
2. Legg merke til C-etiketten på posen for hver zip-lock-pose, og fest en matchende C-etikett til lokket på en 10 cm plate som er flekket med OP50-bakterier.
   MERK: De merkede platene på 10 cm kalles "C-plater" for resten av protokollen. Den enkleste måten å organisere prøvene på er å plassere oppsamlingsposene på en labbenk med den matchende C-platen på toppen (figur 3).
3. For hver samling, overfør omtrent en spiseskje prøve fra oppsamlingsposen til C-platen ved hjelp av en ren plastskje. Tilsett prøven rundt bakteriell plen i en halvmåne- eller ringform, ikke dekk den bakterielle plenen helt (figur 4).
   MERK: Hold spiseskjeen ren ved å plassere den i et beger på 95% etanol når den ikke er i bruk. Bruk et papirhåndkle til å tørke spiseskjeen før du overfører flere prøver.
4. Registrer tiden samlingene ble overført fra oppsamlingsposer til C-plater og hold C-platene ved romtemperatur (RT) i minst 24 timer før du prøver å isolere nematoder i avsnitt 4.

4. Isolere nematoder fra samlinger

1. Åpne Fulcrum-applikasjonen på mobilenheten og velg Nematode Isolation fra applikasjonsmenyen (figur 5A). Lag en ny isolasjonspost ved å trykke på +-ikonet nederst til høyre (figur 5B).
2. I skjermbildet for ny isolasjonspost bekrefter du riktig samlingsprosjekt ved å merke av for prosjektnavnet som vises i boksen øverst i midten. Hvis feil prosjekt vises, trykker du prosjektnavnet for å bytte til riktig prosjekt (figur 5C).
3. Trykk på Velg-knappen under C-etikettfeltet for å finne C-etiketten som er knyttet til prøven som nematoder isoleres fra (figur 5D). Trykk på Søk-ikonet , og trykk deretter på Skann-ikonet for å skanne C-etikett QR-koden på C-platen med enhetskameraet. Når QR-koden er skannet, vises en C-etikettpost i C-etikettfeltet .
4. Trykk på Kamera-ikonet i Bilder-feltet for å åpne enhetskameraet og bruke det til å ta et bilde av prøven på C-platen med QR-koden synlig (figur 5E). Trykk på Ferdig for å gå tilbake til Isolasjon-skjermen.
   MERK: Disse isolasjonsopptaksbildene kan brukes til å utforske spesifikke attributter for substratet på et senere tidspunkt.
5. Bruk et dissekeringsmikroskop for å se etter nematoder på C-platen. Trykk på feltet Ormer på prøve for å registrere tilstedeværelsen av nematoder på prøven (figur 5F). Trykk på Ja hvis nematoder er til stede på C-platen og trykk på Nei hvis ingen nematoder er til stede.
6. Trykk på Spor hvis bare nematodespor er til stede. Hvis det ikke finnes nematoder, parafilm C-platen og kast den i en biofarebeholder.
   MERK: Snu C-platen over biofare avfallsbeholderen og trykk forsiktig på baksiden av platen for å løsne alle de prøvede substratene. Dette trinnet gjør det lettere å finne og isolere nematoder som kan være under substratet på C-platen.
7. Hvis nematoder er til stede, isolere opptil fem nematoder fra C-platen. For å isolere en nematode, overfør en nematode fra C-platen til en S-plate ved hjelp av et platinatrådplukk. Isoler friske, gravide voksne om mulig. Isoler imidlertid andre stadier hvis voksne ikke blir funnet.
   MERK: Etter isolasjon vil opptil fem S-plater hver ha en enkelt nematode på seg. Hold disse S-platene med isolerte nematoder fra samme C-plate organisert sammen i en fin stabel vekk fra andre S-plater til de er lagt inn i Fulcrum.
8. Trykk på feltet S-merkede plater for å angi S-platen(e) som brukes til denne isolasjonen. Trykk på + nederst til høyre. Trykk på S-etikett og klikk deretter på Skann for å åpne enhetskameraet. Bruk enhetskameraet til å skanne QR-koden for S-etiketten på S-platen.
   MERK: Kontroller at S-etikettkoden samsvarer med koden på platen. Hvis den samsvarer, trykker du på Ferdig. Hvis den ikke gjør det, trykker du på Avbryt og skanner på nytt til den samsvarer, og deretter klikker du på Ferdig. Noen ganger skannes QR-koder for plater i nærheten ved et uhell.
9. Når du har skrevet inn hver S-plate, lagrer du oppføringen med Lagre-knappen øverst til høyre. Oppføringen vil gå tapt hvis den ikke lagres. Trykk på + nederst til høyre for å legge til flere S-merkede plater om nødvendig til alle nematoder isolert fra C-platen er angitt. Etter å ha lagt til alle S-merkede plater for isolasjonsposten, trykker du på < -knappen øverst til venstre for å gå tilbake til isolasjonsopptaksskjermen.
   MERK: For å avbryte en isolasjonspost fordi feil ikke kan løses, klikk på Avbryt øverst til venstre. Dette trinnet åpner en dialogboks der du blir spurt om oppføringen kan forkastes uten å lagre. Hvis ønskelig, klikk på Ja, Forkast.
10. Trykk på Lagre-knappen øverst til høyre når isolasjonsposten har all informasjon lagt til riktig. Deretter parafilm S-platene med isolerte nematoder og sett dem til side i et område utpekt til å holde S-plater med nematoder.
11. Parafilm C-platen og kast den i biofarebeholderen. Trykk på Synkroniser-ikonet for å laste opp alle dataene til Fulcrum.
12. Sorter alle S-platene i alfanumerisk rekkefølge, og legg deretter S-platene i pappesker. Pass på at S-platene er lokk-side ned og parafilmed. Stable opptil fire S-plater i én posisjon i esken, og merk pappesken med prosjektnavn, dato, klokkeslett og et unikt boksnummer.
13. Oppbevar de merkede boksene på RT. Disse isolerer vil bli sjekket for spredning ved 48 timer og igjen ved 168 timer om nødvendig.

5. Eksportere S-plater fra Fulcrum

MERK: Denne delen beskriver hvordan du eksporterer S-etiketter som brukes i isolasjonsprosessen fra Fulcrum-prosjektdatabasen. Disse S-etikettene vil bli brukt til å spore spredningslinjer mens de identifiseres av sekvensidentitet i avsnitt 6-9.

1. Logg på Fulcrum-nettstedet og velg Nematode Isolation-applikasjonen . Klikk på Eksportør fra venstre side av skjermen. Klikk for å velge ønsket prosjekt, og merk av for Nematode Isolation . Klikk Neste for å laste ned en .zip fil som inneholder nematode_isolation_s_labeled_plates.csv-filen.
2. Åpne "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv" -filen og sorter den etter S-etikettkolonnen i stigende rekkefølge (den minste S-etiketten vil være øverst). Merk alle S-etikettene, og kopier dem fra regnearket.
3. Naviger til den ville isolerende genotypingsmalen Google Sheet (wild_isolate_genotyping_template) ved hjelp av en ^nettleser19.
   1. Lag en kopi av dette Google-arket ved å høyreklikke på Genotyping Template-fanen og deretter velge Kopier til nytt regneark alternativet. Velg Åpne regneark for å se det nye Google-arket.
   2. Gi dette nye arket navnet med fulcrum-prosjektnavnet etterfulgt av "wild_isolate_genotyping", for eksempel "2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping".
      MERK: Dette arket kalles genotypingsarket i resten av protokollen.
4. Lim inn S-etikettene som er kopiert fra nematode_isolation_s_labeled_plates.csv s_label-kolonnen, i genotypingsarkkolonnen med tittelen s_label. Se etter 1 i s_label_repeat_error-kolonnen. Verdien 1 i denne kolonnen betyr at S-etiketten dupliseres et sted på genotypingsarket. Hvis dupliseringer oppdages, må du undersøke og korrigere dem før du går videre.
5. Fyll ut kolonnen isolation_box_number for genotypingsarket for alle S-etiketter.

6. Se etter spredning på S-plater

1. Se etter spredende dyr på S-plater 48 timer etter isolasjon (bruk dato og klokkeslett for siste isolasjon på esken fra trinn 4.11 til føringstid).
   MERK: Proliferating nematoder er preget av avkom på S-platen.
2. Hvis en S-plate sprer seg, skriver du inn '1' i proliferation_48 kolonne på genotypingsarket, og flytt deretter S-platen til en boks merket '48 h proliferation, box 1'. Legg maksimalt 88 S-plater i en spredningsboks, og begynn deretter å fylle en ny boks merket '48 h spredning, boks 2'. Forsikre deg om at S-etikettene er organisert i alfanumerisk rekkefølge i de 48 h spredningsboksene.
   MERK: Ikke kast de ikke-proliferaterende S-platene; disse platene vil bli sjekket igjen ved 168 timers etterisolering. Konsolider om ønskelig disse S-platene i numerisk rekkefølge i bokser merket '48 h ikke-spredning, boks X', men husk å registrere når 168 h-kontrollen må forekomme på den nye boksen.
3. Etter å ha identifisert alle de prolifererende S-etikettene ved 48 timer, gå videre til seksjon 7 for S-plater med spredning ved 48 timer.
4. Kontroller S-platene som ikke spredte seg ved 48 timers etterisolering igjen ved 168 timers etterisolering.
   1. Hvis en S-plate nå sprer seg, skriver du inn '1' i proliferation_168 kolonne på genotypingsarket og flytter deretter S-platen til en boks merket '168 h spredning, boks 1'.
   2. Legg maksimalt 88 S-plater i en spredningsboks, og begynn deretter å fylle en ny boks merket '168 h spredning, boks 2'. Pass på å organisere S-etiketter i alfanumerisk rekkefølge i 168 h spredningsbokser.
5. Kast S-platene som ikke har spredning etter 168 timer. Gå videre til seksjon 7 for S-plater med spredning ved 168 timer.

7. Lysis av isofemale linjer

MERK: Dette trinnet vil bruke datafilterverktøyet i Google Regneark for å skrive ut lysis-regneark for S-platene i spredningsboksene. Formålet med lysis-regnearkene er å gi personell de riktige posisjonene for S-etiketter i lysis striperør på benken.

1. Åpne genotypingsarket for det ønskede prosjektet, og merk alle cellene ved å skrive inn Cmd+A. Klikk Data > Opprett et filter for å legge til en filterknapp i hver kolonneoverskrift. Bruk Filter-knappene til å vise bare S-platene som skal genotypes. Hvis for eksempel alle S-platene med spredning ved 48 timer skal lyses: Klikk på Filter-knappen i kolonnen 'proliferation_48' og velg '1'.
2. Når genotyping google-arket er filtrert, kan du se gjennom listen over S-etiketter som vises for å sikre at de er S-etikettene som skal skrives ut på regnearket.
   1. strip_tube_number Skriv inn et unikt tall hver 11.
   2. Angi striperørnumrene for et prosjekt i etterfølgende rekkefølge fra 1 og aldri duplisert. I "strip_tube_position" skriver du inn 2 til 12 for hvert striperørnummer.
      MERK: Bruk 12-rørs striperør til lysis. Den første plasseringen (strip_tube_position 1) vil være kontroll, men kontrollene legges ikke til i lysis-regnearkene (bare strip_tube_positions legges til, 2-12). På lysisstidspunktet vil den positive kontrollstammen 'N2' bli lagt til posisjon 1 av hvert partalls striperør som en positiv kontroll. Ingen ormer legges til posisjon 1 av hvert oddetalls striperør som en negativ kontroll.
3. Filtrer genotyping google-arket videre for å inkludere bare S-etikettene i en spredningsboks som skal lyseres, og velg deretter kolonnene 's_label' gjennom 'lysis_notes'. Skriv ut et lysis-regneark for hver spredningsboks som skal lyseres.
4. Klikk på rullegardinmenyen i Skriv ut-feltet , og velg Merkede celler. Klikk på Neste øverst til høyre, og bruk deretter dialogen til å skrive ut lysis-regnearket for spredningsboksen.
5. Gjenta trinn 7.3-7.5 for å skrive ut et lysis-regneark for hver spredningsboks.
   MERK: Hver spredningsboks har plass til opptil 88 S-plater, som tilsvarer åtte 12-brønns striperør.
6. Forbered 12-brønns striperør for alle prøvene som skal lyses. Merk et striperør med en unik "strip_tube_number" tilordnet i lysis-regnearket. Denne etiketten må skrives på hettestripen og striperøret for å unngå forvirring hvis de skilles. EVEN-striperørene har en positiv kontroll (N2 ormer) i posisjon 1. ODD-stripperørene har en negativ kontroll (ingen ormer) i posisjon 1.
7. Utgjør nok lysisbuffer (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM _MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% gelatin med proteinase K lagt til en endelig konsentrasjon på 0,4 mg / ml) for alle prøvene og tilsett 5% ekstra for rør. Skaler etter behov.
   MERK: Lysisbufferen fremstilles best ved å kombinere alle ingrediensene unntatt proteinase K og fryse i 10-50 ml aliquots ved -20 °C. Tine aliquots og hold ved 4 °C før bruk; umiddelbart før bruk, tilsett proteinase K og bland grundig. Hold lysisbufferen på is mens du arbeider.
8. Ordne S-platene for et bestemt striperør for å bruke det trykte lysis-regnearket som en guide.
9. Løsne ett striperør og tilsett 8 μL lysisbuffer til hver hette med en gjentatt pipettor. Legg lysisbufferen til en stripe med hetter om gangen fordi lysisbufferen vil fordampe hvis den blir igjen ved RT og avdekket. Velg 3-5 dyr fra kildeplatene (S-plate eller N2 lagerplate for positive kontroller) i de riktige hetteposisjonene som er angitt på lysis-regnearket. Registrer notater for en hvilken som helst S-plate med færre enn 5 ormer plukket til lysis i lysis_notes delen av lysis-regnearket.
10. Etter å ha lastet nematoder i hver posisjon av striperøret, plasser hettestripen tilbake på striperøret. Tilpass den merkede hetten (posisjon 1) med det merkede røret (posisjon 1). Når den er avkortet, sentrifugerer du striperøret kort til nematodene er på bunnen av røret.
11. Plasser stripen i -80 °C fryseren til den er helt frossen (minst 10 min). Gjenta trinn 7.9 til 7.11 til alle strimler har nematoder lagt til for lysis. Organiser rørstrimlene i numerisk rekkefølge.
12. Fjern settene med striperør og kjør lysisprogrammet i en termosykler: 1 t ved 60 °C, 15 min ved 95 °C, hold ved 12 °C. Når lysis-programmet er ferdig, snurr du ned prøvene på 300 x g i 15 s ved RT og lagrer lysatene ved -80 °C i opptil 1 uke.
13. Organiser rørstrimlene i numerisk rekkefølge ved hjelp av 96-brønns plateholdere og inkluder en etikett med et spredningsboksnummer, striperørnummerområde, dato og forskernes initialer. Oppdater genotypingsarkkolonnene lysis_date og lysis_notes med informasjon fra lysis-regnearket.

8. PCR av SSU og ITS2 sekvenser

MERK: Denne delen vil gi instruksjoner om hvordan du utfører to separate PCR-er for hver lysede S-plate. Det første primersettet forsterker et fragment på 500 bp av det lille underenhetsgenet 18S rDNA (SSU); oECA1271 = fremoverprimer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = omvendt primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA ¹². Denne PCR brukes til å sjekke kvaliteten på malen DNA. PCR forsterker SSU-regionen for nesten alle nematodearter. Hvis SSU PCR ikke klarer å forsterke, antyder dette resultatet at lysiskvaliteten er dårlig og lysisene må gjentas for denne S-platen. Det andre primersettet forsterker et fragment på 2000 bp av det interne transkriberte avstandsområdet mellom 5,8S- og 28S rDNA-genene (ITS2); oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = omvendt primer GCGGTATTTGCTACTACCAYAMGATCTGC3. ITS2 PCR-produktet er Sanger sekvensert og sekvensen brukes til å identifisere nematoder i Caenorhabditis-slekten til arten nivå etter sekvenslikhet.

1. Bruk filtreringsverktøyet i genotypingsarket til å vise bare S-etikettene som skal brukes for PCR.
   1. Oppdater pcr_plate_number og pcr_well kolonnene i genotypingsarket. For å forhindre nedbrytning av lysismateriale, kjøres SSU- og ITS2 PCR-ene samtidig.
   2. Bruk samme pcr_plate_number for ITS2- og SSU PCR-ene selv om dette er separate reaksjoner i separate plater. De vil bli skilt med 'SSU' eller 'ITS2' etiketter.
2. Tilordne en pcr_plate_number til åtte eller færre striperør (ett striperør per rad på den 96-brønns PCR-platen, ordnet i stigende rekkefølge, for eksempel laveste striperørnummer på toppen). Tilordne deretter en pcr_plate_well til hver S-etikett i striperørene.
   MERK: Stripperørene er ordnet i stigende rekkefølge, med det laveste striperørnummeret tilordnet rad A og det høyeste tallet i rad H. Posisjon 1 av alle striperør er tilordnet kolonne 1. Derfor vil striperør nummer 1, posisjon 1 bli tildelt PCR-plate nummer 1, brønn A01.
3. Etikett 96-brønns PCR-plate(er) for å imøtekomme prøvene som skal brukes til PCR. Merk hver PCR-plate med følgende informasjon: prosjektnavn, PCR-type, PCR-platenummer og dato for PCR (f.eks. 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Merk også platen med striperørnumrene som skal lastes inn i hver rad.
4. Fjern lysismaterialet fra fryseren -80 °C og tine striperørene som inneholder lysismaterialet på isen. Mens lysismaterialet tiner, forberede ITS2 og SSU master blander seg i separate rør på is. SSU- og ITS2 PCR-oppskriftene finnes i supplerende tabell 2.
   MERK: Forbered 100 reaksjoner av PCR master mix for hver 96-brønns plate for å tillate pipetteringsfeil. Bruk en konisk 15 ml eller 50 ml til å holde hovedblandingen inne hvis store volumer skal brukes.
5. Virvel masterblandingen forsiktig til Taq fordeles gjennom blandingen. Når den er blandet, blandes aliquot 38 μL av masterblandingen til de riktige brønnene til PCR-platene på is. Bruk sterile v-bottom troughs til engangsbruk og en 12-brønns flerkanals pipette for å overføre hovedblandingen til PCR-platene.
6. Snurr ned de tinte lysis-striperørene for å fjerne lysismaterialet fra hettene. Fjern forsiktig lokkene på alle stripperørene som skal lastes inn i den første PCR-platen. Bruk en flerkanals pipette med lavt volum (enten 12-brønn eller 8-brønn) for å tilsette 2 μL lysat til riktig brønn i PCR-platen. Rør lysatet forsiktig opp og ned en gang før du fjerner 2 μL.
   MERK: Kontroller tipsene for å sikre at de inneholder lysis før overføringen. Husk å endre tips mellom rader eller kolonner.
7. Dekk PCR-platen med PCR-klebefolie og bruk en rulle til å lage en tett forsegling. Etter at folien er påført, kan du kort spinne ned PCR-platene i en sentrifuge. Hold platen på is til den er klar til å gå i termosykleren.
8. Kjør PCR-ene med riktig termosirkuleringsprogram. Se Supplerende tabell 2 hvis du vil ha mer informasjon om SSU- og ITS2 PCR-programmene.
9. Gjenta trinn 8.4- 8.8 til alle PCR-ene er kjørt.
10. Mens PCR-reaksjonene kjører, hell en 100 ml 1,5% agarose gel. Hver gel vil holde prøver eller en enkelt PCR-plate.
    1. Tilsett 1,5 g agarose i en 500 ml kolbe, tilsett deretter 100 ml 1x TAE-buffer (tilleggstabell 3) og virvle for å blande. Mikrobølgeovn for å oppløse og avkjøle gelen.
    2. Når oppløsningen er avkjølt, tilsett 5 μL 10 mg/ml ethidiumbromidoppløsning og bland for å kombinere. Hell løsningen i et støpebrett med fire 25-brønns kammer slik at gelen kan romme 96 prøver pluss en stige for hver rad i gelen.
       MERK: Ethidiumbromid er en potent mutagen. Ved håndtering av ethidiumbromid, bruk labbelegg, kjemikaliebestandige hansker og kjemiske vernebriller.
11. Like før PCR er ferdig, tilsett 6x lastefargestoff til en engangsbakke og bruk en flerkanals pipette for å legge til 2 μL 6x lastefargestoff til hver brønn av en ny 96-brønns PCR-plate. Denne platen vil bli brukt til å laste prøvene inn i gelen. Lag nok av disse platene til å imøtekomme alle prøvene.
12. Når PCR-ene er ferdige, fjerner du PCR-platene og sentrifugerer dem kort ved 300 x g i 15 s på RT. Oppbevar PCR-platene på is til PCR-produktene kan gå tom for gel.
    1. For å kjøre produktene ut på en gel, bruk en 12-brønns flerkanals pipette for å legge til 5 μL av hver prøve til riktig brønn av en 96-brønns plate som inneholder 2 μL 6x lastefargestoff.
    2. Last deretter 6 μL av denne blandingen inn i hver brønn av en nylig støpt gel. Last 6 μL 1 KB pluss stige inn i den første brønnen i hver rad av gelen.
       MERK: For å fylle gelens brønner, kan det være nødvendig å intersperse rad A og rad B fra PCR-platen i den første raden av gelen. Hvis du vil unngå forvirring, registrerer du gel_number og gel_position i genotypingsarket for hvert PCR-eksempel.
13. Sett et nytt folielokk på den gjenværende PCR-en i platen(e) og oppbevar dem ved 4 °C. Disse reaksjonsproduktene vil bli brukt til sekvensering i trinn 9.
14. Kjør PCR-produktene ut på gelen ved 120 V i 20 minutter. Bilde gelen og registrer hvilke S-etiketter som gir ITS2- og/eller SSU PCR-produkter i kolonnene "pcr_product_its2" og "prc_product_ssu" i genotypingsarket. Merk tilstedeværelsen av et band med en '1'; merk en '0' for ingen band.

9. Identifisere nematoder med Sanger sekvensering og sekvens BLAST

MERK: Denne delen inneholder instruksjoner for sekvensering av ITS2-amlikonene fra S-etikettene, justering av disse sekvensene til National Center for Biotechnology Information (NCBI)-databasen ved hjelp av BLAST-algoritmen, og analyse av BLAST-resultatene for å identifisere nematodene på S-platene.

1. For hver prøve som er ITS2-positiv, bruk det gjenværende ITS2 PCR-produktet for Sanger-sekvensering ved hjelp av fremoverprimeren oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Sørg for at sekvenseringsutdatafilene enkelt kan kobles til en S-etikett ved å registrere kolonnene "sequencing_plate" og "sequencing_well" for hver S-etikett i genotypingsarket.
2. Hent SEQ-utdatafilene for hver S-etikett fra sekvenseringsplattformen. Ordne SEQ-filene for et prosjekt i én enkelt mappe med SEQ-filer for hver gruppe med sekvensering i undermapper.
3. Åpne kommandolinjegrensesnittverktøyet og naviger til den øverste katalogen som inneholder SEQ-filene, ved å skrive inn kommandoen: cd . Hvis den ikke allerede finnes, oppretter du en sammenslått FASTA for alle SEQ-filene ved å skrive inn følgende kommando: for dir in */; do cd $dir; for file in *.seq; do echo ">"$file; cat $file; done >>.. /all_seqs.fa; cd ..; ferdig.
   MERK: Denne koden vil opprette en sammenslått FASTA-fil med navnet 'all_seqs.fa' fra alle .seq-filene i prosjektkatalogen. Denne filen kan brukes i NCBI online nukleotid BLAST-verktøyet for raskt å justere ITS2-sekvensen til hver S-etikett til NCBI sekvensdatabase.
4. I en nettleser navigerer du til NBCI ^{BLAST-nettstedet20} og klikker på Velg fil-knappen . Velg all_seqs.fa-filen som nettopp ble opprettet, og klikk deretter på knappen Noe lignende sekvenser (BLASTn). Klikk på BLAST-knappen nederst på siden for å starte BLAST-søket.
5. Oppdater genotypingsarket med BLAST-resultatene for hver S-etikett. Bruk filterverktøyet for å gjøre det enklere å oppdatere genotyping google-arket. Klikk Data > Opprett et filter for å legge til en filterknapp i hver kolonneoverskrift. Filtrer sequencing_plate kolonnen for å velge sekvenseringsplatene som skal oppdateres med BLAST-resultater.
6. Bruk rullegardinmenyen på resultatsiden for NCBI BLAST til å kontrollere resultatene for hver S-plate ITS2-sekvens (figur 6).
7. Se etter blast-treff. En sekvens-ID i rullegardinlisten med prefikset * har ingen sprengningstreff. For disse S-etikettene skriver du inn 'no hit ' i manual_blast_notes kolonnen i genotypingsarket.
8. Se etter en mulig ny Caenorhabditis arter. Klikk koblingen øverst for å visualisere justeringen (figur 6). Hvis topptreffet er (1) en Caenorhabditis-art , (2) inneholder justeringen mer enn fem uoverensstemmelser i midten av sekvensen, og (3) spørringsdekningen er større enn 50%, antyder dette resultatet at isolasjonen kan være en ny Caenorhabditis-art (figur 7). For disse S-platene kommer inn, arten av den øverste BLAST-hiten i 'species_id' -kolonnen, skriv inn en 1 i 'possible_new_caeno_sp kolonnen', og 'mulig ny Caeno sp.' i 'manual_blast_notes' -kolonnen sammen med prosentidentitet, (f.eks. 'mulig ny Caeno sp. 89% identitet').
9. For S-platesekvenser som BLAST til en Caenorhabditis-art , skriv inn hele slekten og artsnavnet til den øverste BLAST-hiten i 'species_id' -kolonnen. For eksempel'Caenorhabditis elegans'.
10. For S-platesekvenser som BLAST til en ikke-Caenorhabditis-art , skriv bare inn slekten til den øverste BLAST-hiten etterfulgt av 'sp.' i 'species_id' -kolonnen. Denne notasjonen betyr at isolasjonen er en ukjent art i det navngitte slekten. For eksempel Oscheius sp.'
    MERK: ITS2-sekvensen kan ikke brukes til pålitelig identifisering av isolasjoner til artens nivå utenfor Caenorhabditis-slekten3,13.
11. Skriv inn 1 i 'make_strain_name kolonnen' på genotypingsarket hvis 'species_id' = 'Caenorhabditis elegans', 'Caenorhabditis briggsae' eller 'Caenorhabditis tropicalis', OR 'possible_new_caeno_sp' = 1.
12. Navngi stammene med unike navn etter Caenorhabditis nomenklaturkonvensjoner, det vil si en unik laboratoriebetegnelse som består av 2-3 store bokstaver etterfulgt av et tall for hver unike ^stamme23. Skriv inn belastningsnavnene i kolonnen strain_name.
13. Etter at stammer er navngitt, kan de kryopreservere ved hjelp av etablerte protokoller ²⁴.

10. Behandling av innsamlingsdataene med easyFulcrum-pakken i R

MERK: Dette trinnet beskriver hvordan du kobler innsamlingsdataene (C-etikettene) og nematodeisolasjonsdataene (S-etikettene) sammen ved hjelp av easyFulcrum R-pakken. Programvaren inneholder funksjoner som ytterligere vil bli med Fulcrum data med genotyping data fra genotyping arket slik at S-label arter identiteter og belastningsnavn er organisert i en enkelt dataramme.

1. Opprett en ny mappe med navnet på samlingsprosjektet. Ordne mappestrukturen i katalogen slik at den samsvarer med kravene som er beskrevet i R-pakken ^{easyFulcrum15}.
2. Gå til Fulcrum-nettstedet og logg på. Eksporter råprosjektdataene fra Fulcrum-databasen ved hjelp av Fulcrum-nettstedets dataeksportverktøy til venstre og merk av i følgende avmerkingsbokser: prosjekt, inkluder bilder, inkluder GPS-data, feltprøvetaking og isolasjon.
   MERK: Fulcrum-dataene for prosjektet eksporteres som fem kommadelte verdifiler (.csv). De komplette prosjektdataene vil bli slått sammen til en enkelt dataramme ved hjelp av easyFulcrum-pakken i R.
3. Flytt de fem .csv filene som er eksportert fra Fulcrum, til prosjektkatalogen som ble opprettet i trinn 10.1, som beskrevet i easyFulcrum ^vignette21.
4. Åpne en Rstudio-økt og installer easyfulcrum-pakken i R ved å skrive inn følgende kommandoer i R-konsollen 'install.packages("devtools")' og 'devtools::install_github("AndersenLab/easyfulcrum")'.
5. Åpne et nytt R-skript og følg instruksjonene i easyfulcrum-vignetten for å behandle ^{innsamlingsdataene21}.

Representative Results

Denne protokollen har blitt brukt til å samle Caenorhabditis nematoder fra flere steder, inkludert Hawaii og California. Isolasjonssuksessraten for Caenorhabditis nematoder varierer med samlingssted, klima, prøvetakingserfaring og substrattyper som er samplet. Protokollen har blitt brukt til å ta omfattende prøver av Hawaii-øyene, hvor ni innsamlingsprosjekter har blitt gjennomført over flere år og årstider. Isolasjonssuksessratene for selvbetjeningsarter av caenorhabditt er nesten identiske for C. briggsae (162 av 4506 prøver, 3,6%) og C. elegans (163 av 4506 prøver, 3,6%) og mye lavere for C. tropicalis (26 av 4506 prøver, 0,58%)⁸⁸%). Hver av de selvbetjeningsarter er beriket på råtnende frukt- og blomstersubstrater i forhold til de andre substratkategoriene. Prøv råtnende frukt- og blomstersubstrater hvis forskeren prøver å maksimere suksessraten i stedet for å karakterisere substratpreferanser. Suksessraten varierer imidlertid med kvaliteten på substratet som er valgt. For eksempel, blant frukt- og blomstersubstrater, vil de substratene som er for tørre, våte eller friske sannsynligvis ikke gi Caenorhabditis nematoder.

Skalerbarheten til denne innsamlingsprotokollen er tydelig fra antall samlinger et enkelt par forskere kan samle fra naturen. For eksempel, i oktober 2018, var et par forskere som brukte denne innsamlingsprotokollen i stand til å samle totalt over 1000 prøver på 7 dager fra flere steder på to hawaiiske øyer. Dette feltteamet sendte prøvene over natten til laboratoriet, hvor et team på åtte forskere isolerte over 2000 nematoder fra prøvene da de ankom. En viktig fordel med denne protokollen er at den minimerer kostnadene forbundet med prøvetaking på eksterne steder ved å redusere utstyret og personellet som kreves i -feltet. Ved hjelp av denne protokollen kan et lite feltteam fokusere på prøvetaking, mens isolasjonsteamet kan behandle prøvene på hjemmeinstitusjonen ved hjelp av skjøre og tungt utstyr som dissekering av mikroskoper og agarplater for å isolere nematoder. Videre gjør implementeringen av den mobile datainnsamlingsapplikasjonen at alle feltdataene knyttet til prøvene kan kobles direkte til C-etiketten, noe som gjør at isolasjonsteamet kan jobbe uavhengig av feltteamet mens de behandler prøver.

Forskere som bruker denne innsamlingsprotokollen må vurdere innsatsen som kreves for å isolere nematoder før et innsamlingsprosjekt. Isolasjons- og identifikasjonstrinnene er prisbegrensende, og et lite innsamlingsteam kan raskt overvelde isolatorer med prøver. Videre kan laboratorierommet som kreves for å behandle mange samlinger forstyrre pågående forskning (figur 3). I tillegg krever noen isolerte nematoder ekstra innsats for å genotype. For eksempel klarer ca. 2 % av isolasjonene ikke å forsterkes med SSU PCR-primeren som er satt etter det første lysisforsøket, og må lyseres på nytt for å sikre at lysismaterialet er egnet for forsterkning med ITS2-primersettet (figur 8). Videre klarer ikke ca. 3 % av isolasjonene å produsere kvalitetssekvenser etter en innledende runde med Sanger-sekvensering. For disse isolasjonene er det ofte nødvendig med en ny runde med lysis, ITS2 PCR og Sanger-sekvensering, noe som kan øke tiden for isolasjonsteamet. Det er viktig at sekvensidentitet alene ikke er tilstrekkelig bevis for å rettferdiggjøre en ny Caenorhabditis-art (figur 7). For å kunne rettferdiggjøre å heve en isolat som en ny Caenorhabditis-art , må det gjøres ytterligere innsats for å utføre parringseksperimenter og etablere en ^typeprøve13. En formell morfologisk beskrivelse av den innskrevne prøven er også foretrukket, men ikke ^nødvendig3. Sammen tyder disse hensynene på at forskere som tar i bruk denne innsamlingsprotokollen, vil dra nytte av prøvetester av isolasjons- og identifikasjonstrinnene for å sikre at ressursene blir riktig tildelt før et innsamlingsprosjekt begynner. Det er viktig at selv små innsamlingsprosjekter kan dra nytte av denne protokollen fordi prosessen er svært reproduserbar, og dataene kan enkelt revideres for kvalitetskontrollformål på tvers av laboratoriegrupper.

Figur 1: Substrateksempler. (A) En ideell råtnende frukt er vist i midten av bildet (1), frukten er nesten ugjenkjennelig. Mindre rottet frukt er vist i nærheten; unngå å smake på nysnøen (2). (B) En ideelt dekomponert blomst vises øverst (3). Unngå prøvetaking av nysnøsne blomster (4). (C) Det mørke bladavfallet under det øverste laget av tørre blader er ideelt ved prøvetaking for selfing Caenorhabditis nematoder (5). Unngå prøvetaking av tørt bladavfall (6). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Nematode Field Sampling mobilapplikasjon. (A) Startskjermen etter åpning av Nematode Field Sampling-applikasjonen på en Apple-enhet i Fulcrum. Den røde pilen nederst til høyre peker på + -knappen som ble brukt til å opprette en ny samlingspost. (B) Et eksempel på en ny samlingspost som vises på en Apple-enhet. Den røde pilen peker på Prosjekt-feltet øverst på opptaksskjermen for samlingen. Pass på at du velger riktig prosjekt ved prøvetaking i -feltet. Prosjektfeltet bruker som standard det siste prosjektet som ble brukt ved oppretting av etterfølgende samlingsposter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Innsamlingsposer og oppsamlingsplater organisert før du plating ut prøver. Denne illustrasjonen viser prøvene i C-merkede oppsamlingsposer til venstre. Hver oppsamlingspose har en matchende C-merket 10 cm plate på toppen av den. Til høyre er det 10 cm oppsamlingsplater som inneholder prøvemateriale etter at det ble overført fra oppsamlingsposene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: En oppsamlingsplate (C-plate) med riktig overført prøve. En 10 cm C-plate med nedbrytende frukt plassert på kanten av bakteriell plen. C-etiketten er festet til platelokket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Nematode-isolasjonsmobilapplikasjonen. (A) Skjermbildet for applikasjonsvalg i Fulcrum-mobilapplikasjonen. Den røde pilen peker på Nematode Isolation-applikasjonen . (B) Startskjermen etter at du har åpnet Nematode Isolation-applikasjonen på en Apple-enhet i Fulcrum. Den røde pilen nederst til høyre peker på + -knappen som brukes til å opprette en ny isolasjonspost. (C) Et eksempel på en ny isolasjonspost som vises på en Apple-enhet. Den røde pilen peker på Prosjekt-feltet øverst på skjermbildet for isolasjonsposten. Pass på at du velger riktig prosjekt ved isolering. Prosjektfeltet bruker som standard det siste prosjektet som ble brukt ved oppretting av etterfølgende isolasjonsposter. (D) Etter å ha trykket på Velg-feltet under C-etikett, vil brukerne trykke på søkeknappen (rød pil) for å finne C-etiketten de isolerer nematoder fra. (E) Når C-etiketten er valgt, vil brukerne fotografere C-platen ved hjelp av enhetskameraet. (F) Brukere skriver deretter inn om det er nematoder på C-platen eller ikke. S-etiketter legges til isolasjonsposten hvis det er nematoder som skal isoleres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Resultatsiden for NCBI BLAST. (1) Rullegardinmenyen som brukes til å vise BLAST-resultatene for alle sekvenser. (2) Beskrivelsen av gjeldende sekvens valgt fra rullegardinmenyen. I dette tilfellet vises resultatene for S-etikett S-05554. (3) Den øverste BLAST-hiten for S-05554 vises. Den lilla teksten angir at koblingen for å visualisere denne justeringen er klikket. Sørg for å inspisere justeringene for øyet for å identifisere mulige nye Caenorhabditis-arter , se trinn 9.8 ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Visualiseringseksempler for NCBI BLAST-justering. (A) Et eksempel på en IS2-spørringssekvens justert etter en C. kamaaina-emnesekvens . (1) Prosentidentiteten til justeringen (89%), som er lav for en topp BLAST-hit. (2) En uoverensstemmelse mellom spørringen og emnesekvensen (G til A). (3) Et fire basispar gap i subjektsekvensen laget av justeringsalgoritmen; mellomrom i spørringen eller motivet indikerer dårlig justering. (4) Et generalisert område i midten av justeringen med mange uoverensstemmelser og hull. En region som denne antyder at spørringssekvensen kan komme fra en ny Caenorhabditis-art . Vist er et faktisk justeringseksempel på en ny art, C. oiwi, som ble oppdaget i 2017. (B) Et eksempel på en god justering mellom en IS2-spørringssekvens og en emnesekvens. (5) Prosentidentiteten til justeringen (99%), som vanligvis betyr at spørringssekvensen kommer fra en isolering av samme art som motivet. (6) Et sentralt område av justeringen med perfekt identitet. En region som denne antyder at spørringen isolerer sannsynligvis den samme arten som emnet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: SSU- og ITS2 PCR-produkter. Toppgelen viser PCR-produkter generert med SSU primer-settet for 12 representative prøver. En DNA-stige er inkludert til venstre som referanse. SSU PCR-produktene for Caenorhabditis nematoder er ca. 500 bp i lengde. Prøver 2-12 forsterket med SSU primer sett, men prøve en gjorde det ikke. Fraværet av en 500 bp SSU-amplikon for prøve en antyder at lysismaterialet var av dårlig kvalitet og prøven må lyses på nytt. Den nederste gelen viser PCR-produkter generert med ITS2 primer-settet for de samme 12 prøvene som vises i toppgelen. Stigen og prøvene er i samme retning for begge geler. Seks av de 12 prøvene forsterket seg ikke med ITS2 primer-settet. Prøvene med SSU- og ITS2-bånd er Sanger sekvensert og identifisert etter sekvenslikhet ved hjelp av NCBI BLAST-algoritmen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: C-etiketter. En PDF-fil som inneholder 2500 unike C-etiketter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: S-etiketter. En PDF-fil som inneholder 5000 unike S-etiketter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende tabell 1: Feltmaterialer. En pakkeliste over materialer som brukes i feltet til å prøve nematoder. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 2: PCR-oppskrifter og termosirkuleringsforhold. En tabell over PCR oppskrifter og termosycler forhold for ITS2 og SSU PCRs. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Supplerende tabell 3: Oppskrifter på elektroforesebuffer. En oppskrift på 0,5 M pH 8,0 Etylendiamintetraacetic acid solution (EDTA) og TRIS-aceta-EDTA (TAE) bufferløsning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Denne protokollen inneholder kritiske trinn som må utføres med forsiktighet. For eksempel er det viktig at felt- og isolasjonsteamene er nøye med å velge riktig innsamlingsprosjekt i søknaden før de samler prøver fra feltet eller isolerer nematoder fra prøvene i laboratoriet. I tilfelle feil samlingsprosjekt er valgt, korrigeres de feilaktige datapostene best i Fulcrum-databasen ved hjelp av postredigeringsverktøyene på nettet. Denne prosessen kan være kjedelig for mange feilplasserte poster. Databasen beholder imidlertid alle endringer i poster slik at en fullstendig overvåking av samlings- og isolasjonsposter er mulig. De andre kritiske trinnene i denne protokollen innebærer håndtering av prøver fra feltet og nematodene isolert fra disse prøvene. For å sikre at Caenorhabditis nematoder overlever prøvetakings- og forsendelsestrinnene, bør temperaturen på prøvene opprettholdes mellom 4 °C og 25 °C. Temperaturer over 25 °C kan forårsake sterilitet i C. elegans14. Sørg for at prøver overføres fra oppsamlingsposer til oppsamlingsplater innen fem dager når det er mulig for å minimere tapet til nematoder. Etter at nematoder er isolert, er det kritisk at de er genotypet og kryopreservert før de går til grunne. Det er vanskelig å finne levende nematoder på S-plater som er mer enn to til tre uker gamle fordi sopp og bakteriell forurensning kan gjøre S-platene ugjestmilde.

Denne protokollen kan enkelt endres for å imøtekomme ulike typer data som forskere kanskje vil samle inn mens de er i felten. For eksempel er det enkelt å tilpasse programmet 'Nematode field sampling' med nye dataregistreringsfelt ved hjelp av Fulcrums online GUI for applikasjonsredigering. Videre kan dataanalysepakken, easyFulcrum, imøtekomme disse redigeringene når du behandler de nye ^dataene15. En annen endring brukere kan synes er tiltalende er å bruke en annen prøvetakingsmetode i feltet. I stedet for å ta prøver av diskrete substrater, kan forskere ønske å ta prøver av større områder som inneholder flere substrattyper. Disse større prøvene behandles best i laboratoriet ved hjelp av Baermann-trakten eller skuffutvinningsmetodene13. Det er viktig at bruk av C-etiketter og S-etiketter fortsatt gjelder for disse teknikkene og er derfor kompatible med mobilapplikasjoner.

De primære begrensningene i denne protokollen er knyttet til håndteringstiden til nematoder før isolasjon i laboratoriet. For det første gjør oppholdstiden mellom prøveinnsamling og nematodeisolasjon det umulig å registrere utviklingsstadiene av nematoder på en gitt prøve på innsamlingstidspunktet. For det andre er hyppigheten av menn og outcrossing i naturen viktige evolusjonære spørsmål for selvbestemt Caenorhabditis ^nematoder10. Denne metoden er ikke godt egnet til å ta opp disse spørsmålene fordi nematoder sannsynligvis har gått gjennom flere generasjoner før isolasjon. Forsinket isolasjon betyr at direkte bevis på mannlig frekvens i naturen er umulig. Videre betyr multigenerasjonsforsinkelsen under genotypingstrinnene at genomiske bevis på outcrossing (heterozygositet) vil bli erodert før en nematodestamme kan sekvenseres. For å identifisere heterozygositet i naturen, brukes avkomene produsert av en nematode direkte isolert fra naturen til ^{sekvensering2}. En annen potensiell begrensning av denne protokollen er at den er partisk mot identifisering av selvbetjening Caenorhabditis. Dette skyldes at isolerte nematoder av selvbestemte arter har større sjanse for å spre seg enn obligatoriske outcrossers, som bare vil spre seg hvis en befruktet kvinne er isolert.

Denne samlingsmetoden er basert på eksisterende samlingsprotokoller13,14. Den viktigste utviklingen av denne teknikken er bruk av mobilteknologi og tilpasset programvare for å lette organiseringen av store mengder økologiske og molekylære data knyttet til store innsamlingsprosjekter. De økologiske dataene som genereres ved hjelp av denne innsamlingsprotokollen, kan brukes til å ta opp fremragende spørsmål for naturlige populasjoner av Caenorhabditis-arter. For eksempel har data generert med denne metoden blitt brukt til å oppdage nisjepreferanser for arten over Hawaii-øyene. Videre, ved å sekvensere genomene til kryopreserverte nematoder, kan forskere undersøke hvordan mønstre av genetisk variasjon er korrelert med økologiske data. Forskning av denne typen kan avdekke signaturer av lokal tilpasning i Caenorhabditis populasjoner og gi viktig innsikt i relevansen av genetisk variasjon i naturlige ^{sammenhenger8}. For å få en funksjonell forståelse av mange gener i Caenorhabditis nematoder, er det sannsynligvis nødvendig med økologiske ^studier11. Selv for C. elegans mangler en stor brøkdel av gener funksjonelle merknader, til tross for at det er det første multicellulære dyret som skal sekvenseres og et av de mest grundig studerte dyrene på jorden. Denne innsamlingsprotokollen ble utviklet for å bidra til å adressere dette kunnskapsgapet ved å legge til rette for innsamling av ville Caenorhabditis nematoder og studiet av deres økologi og naturlige genetiske mangfold.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive labels	Avery	61533	Printing the C-labels and S-labels
Agarose	Thomas Scientific	C748D75	agarose gel preparation
Backpack			A backpack for each team member to hold equipment, samples, food, and water for the day.
Cardboard boxes	Fisher Scientific	AS261	Storage of S-plates
Centrifuge	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Collection bags	Zip-lock	NA	Collection of substrates
Digital temperature/humidity meter	Preciva	HT-86	Measurement of ambient temperature and humidity
Disecting scope	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Disposible reservoirs	USA Scientific	1306-1010	Aliquoting PCR master mixes and loading dye
DNA ladder, 1 KB plus	Thermo Scientific	SM0243	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
dNTPs	Thomas Scientific	CB4430-2	PCR master mix component
easyFulcrum R package	NA	NA	An R package for processing collection data http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html
EDTA solution (0.5 M pH 8.0)	NA	NA	See supplemental table 3 for recipe
Ethanol (95%)	NA	NA	Plating out samples, spoon sterilization
Ethidium bromide solution (10 mg/mL)	VWR	97064-602	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
External battery charger for mobile device	NA	NA	External battery charger and charging cable for iPhone or Android
Flask (500 mL)	Fisher Scientific	FB501500	agarose gel preparation
Food	NA	NA	Pack accordingly
Gel electrophoresis apparatus	Thermo Scientific	B2	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel loading dye, 6x	NEB	B7022S	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
ITS2 primer set	NA	NA	oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC
ITS2 sequencing primer	NA	NA	oECA306 = forward primer CACTTTCAAGCAACCCGAC
Lysis buffer	NA	NA	Nematode lysis, see protocol for recipe
Microwave	NA	NA	agarose gel preparation
Mobile device	NA	NA	Charged phone in airplane mode. The Fulcrum app GPS positions are inaccurate compared to the GPS positions extracted from pictures. This setting ensures that you use less power and get more precise GPS measurements.
NGMA plates, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713	C-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
NGMA plates, 3.5 cm	Greiner Bio-One	5662-7102Q	S-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
Non-contact infrared thermometer	Etekcity	B00837ZGRY	Measurement of substrate temperature
Paper towels	NA	NA	Paper towels for absorbing excess moisture in a bagged sample.
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Plate sealing
PCR adhesive foil	VWR	60941-126	PCR adhesive foil
PCR buffer (10x)	Thomas Scientific	CB3702-7	PCR master mix component
PCR plates (96-well)	Thomas Scientific	1149K04	SSU and ITS2 PCRs
Pencil	NA	NA
Plastic spoons	NA	NA	Plating out samples
Platinum pick	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Pre-labeled ziplock collection bags	NA	NA	Bundles of zip-lock plastic bags pre-labelled with C-label barcodes. Each bundle should contain 25 barcoded bags wrapped with a rubber band.
Proteinase K	Sigma	3115879001	Nematode lysis, added to lysis buffer just prior to use
R software	NA	NA	R software: A language and environment for statistical computing https://www.R-project.org/
Soft cooler bag and ice pack	NA	NA	Collection coolers and cooler packs to keep samples cool when ambient temperature is above 25 °C.
Spare batteries	NA	NA	Extra batteries for sampling equipment
SSU primer set	NA	NA	oECA1271 = forward primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = reverse primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA
Strip tube caps (12-well)	Thomas Scientific	1159V29	Nematode lysis
Strip tubes (12-well)	Thomas Scientific	1159V31	Nematode lysis
TAE buffer (1x)	NA	NA	Visualizing SSU and ITS2 PCR products. See supplemental table 3 for recipe
Taq polymerase	Thomas Scientific	C775Y45	PCR master mix component
Thermocycler	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Water	NA	NA	Pack accordingly