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Biology

वृद्धि कारक मध्यस्थता एकीकृत यांत्रिकी और आसंजन की मात्रा निर्धारित करने के लिए तनाव गेज टीथर जांच

Published: February 11, 2022 doi: 10.3791/63529
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cell, Developmental, and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

Summary

टीजीटी सतह विकास कारक-एकीकृत क्रॉसस्टॉक का अध्ययन करने के लिए एक अभिनव मंच है। लचीला जांच डिजाइन, आसंजन लिगैंड की विशिष्टता, और उत्तेजना स्थितियों का सटीक मॉडुलन ईजीएफआर-इंटीग्रिन इंटरप्ले के मजबूत मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है। परिणाम ईजीएफआर को 'मैकेनो-ऑर्गनाइजर' ट्यूनिंग इंटीग्रिन यांत्रिकी के रूप में उजागर करते हैं, जो फोकल आसंजन असेंबली और सेल प्रसार को प्रभावित करते हैं।

Abstract

बहुकोशिकीय जीव आसंजन, प्रसार, प्रवासन और भेदभाव सहित कई कार्यों को व्यवस्थित करने के लिए आसपास के बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में झिल्ली रिसेप्टर्स और संज्ञानात्मक लिगेंड के बीच बातचीत पर भरोसा करते हैं। यांत्रिक बलों को आसंजन रिसेप्टर इंटीग्रिन के माध्यम से सेल से ईसीएम में लिगेंड तक प्रेषित किया जा सकता है। इन सेल-जनित बलों की मात्रा और स्थानिक संगठन को एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) सहित विकास कारक रिसेप्टर्स द्वारा संशोधित किया जा सकता है। सेल यांत्रिकी में क्रॉसस्टॉक-मध्यस्थता परिवर्तनों को मापने और उन्हें फोकल आसंजन, सेलुलर आकृति विज्ञान और सिग्नलिंग से संबंधित करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध उपकरण सीमित हैं। डीएनए-आधारित आणविक बल सेंसर जिसे तनाव गेज टीथर (टीजीटी) के रूप में जाना जाता है, को इन परिवर्तनों को मापने के लिए नियोजित किया गया है। टीजीटी जांच अंतर्निहित बल थ्रेसहोल्ड को संशोधित करने और विवर्तन-सीमित स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर पूरे अनुयायी सेल सतह पर पिकोनेवटन स्केल रिसेप्टर बलों की रिपोर्ट करने की उनकी क्षमता में अद्वितीय हैं। यहां उपयोग की जाने वाली टीजीटी जांच रिसेप्टर-लिगैंड बलों द्वारा डीएनए डुप्लेक्स के अपरिवर्तनीय पृथक्करण पर निर्भर करती है जो फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न करती है। यह सेल के संचयी एकीकृत तनाव (बल इतिहास) की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है। यह आलेख एकीकृत यांत्रिकी और आसंजन गठन पर ईजीएफआर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए टीजीटी को नियोजित करने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। टीजीटी यांत्रिक संवेदन मंच की असेंबली व्यवस्थित रूप से विस्तृत है और छवि बलों, फोकल आसंजन और सेल प्रसार की प्रक्रिया को रेखांकित किया गया है। कुल मिलाकर, जांच के अंतर्निहित बल थ्रेसहोल्ड, आसंजन लिगैंड, और उत्तेजना के लिए नियोजित विकास कारक के प्रकार और एकाग्रता को संशोधित करने की क्षमता इसे एकीकृत-मध्यस्थता बलों को विनियमित करने में विविध झिल्ली रिसेप्टर्स के परस्पर क्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मजबूत मंच बनाती है।

Introduction

कोशिकाओं में यांत्रिक बलों को समझने, उत्पन्न करने और प्रतिक्रिया करने की आंतरिक क्षमता होती है, जिससे सेलुलर फेनोटाइप में परिवर्तन होता है और स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट 1,2 का रीमॉडेलिंग होता है। आसंजन, प्रवासन, प्रसार, भेदभाव और घाव भरने सहित सेल व्यवहार के कई पहलुओं को विनियमित करने में बल महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं 3,4. एक कोशिका और माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच द्वि-दिशात्मक यांत्रिक विनिमय में विपथन कैंसर सहित रोगग्रस्त अवस्थाओं को जन्म दे सकताहै 5. कई झिल्ली रिसेप्टर्स सेल-मैट्रिक्स होमियोस्टेसिस को बनाए रखने में शामिल हैं; इनमें से, इंटीग्रिन और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) में मजबूत तालमेल 6,7 है। शास्त्रीय रूप से, इंटीग्रिन माइक्रोएन्वायरमेंट और इंट्रासेल्युलर साइटोस्केलेटन के बीच यांत्रिक लिंक स्थापित करते हैं जबकि ईजीएफआर सेल विकास, प्रसार और अस्तित्व 8,9 को नियंत्रित करता है। ईजीएफआर एक उच्च अध्ययन चिकित्सीय लक्ष्य है, जो इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग को सुविधाजनक बनाने वाले आउट-इन विनियमन पर केंद्रित है। ईजीएफआर-इंटीग्रिन क्रॉसस्टॉक को आनुवंशिक और जैव रासायनिक रूप से कैंसर10,11 सहित कई बीमारियों की प्रगति को विनियमित करने के लिए स्थापित किया गया है। जबकि अध्ययन ईजीएफआर-इंटीग्रिन इंटरप्ले के अस्तित्व का संकेत देते हैं, परिणामों को प्लाज्मा झिल्ली 7,12,13,14 से दूर सिग्नलिंग मार्गों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। सेल यांत्रिकी पर ईजीएफआर, या अन्य विकास कारकों का प्रभाव सेलुलर बलों और सिग्नलिंग परिणामों को मापने के लिए उपकरणों की कमी के कारण काफी हद तक अस्पष्टीकृत रहता है। चुनौती इन समानांतर सिग्नलिंग प्रतिमानों के बीच संचार का अध्ययन करने और सेल यांत्रिकी में उनके विशिष्ट योगदान को मापने के लिए उपयुक्त उपकरणों की पहचान करने में निहित है।

सेल आसंजन रिसेप्टर्स द्वारा उत्पन्न बलों को मापने के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, और पाठक को इन तकनीकों15,16 की गहन समीक्षा के लिए निर्देशित किया गया है। संक्षेप में, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और सूक्ष्म स्तंभ सरणी का पता लगाने नैनोन्यूटन (एनएन) बलों का अनुमान लगाने के लिए एक अंतर्निहित सब्सट्रेट के विरूपण पर भरोसा करते हैं, व्यक्तिगत रिसेप्टर बलों17,18 से अधिक परिमाण का एक क्रम। एएफएम और ऑप्टिकल चिमटी सहित एकल-अणु तकनीक, एकल प्रोटीन पिकोनेवटन (पीएन) बलों के प्रति संवेदनशील हैं, लेकिन एक समय में केवल एक रिसेप्टर को मापते हैं और अच्छे (या किसी भी) स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की पेशकश नहीं करते हैं। डीएनए आधारित आणविक तनाव जांच और तनाव गेज टीथर (टीजीटी) जांच विवर्तन-सीमित (या बेहतर) स्थानिक संकल्प के साथ पीएन बल संकल्प प्रदान करते हैं, जिससे उन्हें फाइब्रोब्लास्ट, कैंसर कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित विभिन्न सेल प्रकारों से एकल-कोशिका बलों19,20 का अध्ययन करने में एक अनूठी भूमिका मिलती है 21,22,23,24 . जबकि आणविक तनाव जांच में एक विस्तारयोग्य "वसंत" तत्व होता है, जो वास्तविक समय इमेजिंग के लिए आदर्श होता है, टीजीटी जांच अपरिवर्तनीय रूप से टूट जाती है, फ्लोरोसेंट "बल इतिहास" को पीछे छोड़ देती है। टीजीटी अतिरिक्त रूप से अंतर्निहित सब्सट्रेट के तनाव थ्रेसहोल्ड को संशोधित करते हैं; समान रासायनिक रचनाओं के साथ जांच की एक श्रृंखला लेकिन विभिन्न टूटना बलों, या तनाव सहिष्णुता (टीटोल), फोकल आसंजन गठन और सेल प्रसार के लिए आवश्यक न्यूनतम तनाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। टीजीटी जांच में दो पूरक डीएनए किस्में होती हैं, एक सतह पर लंगर डाले हुए और दूसरा सेल को एक लिगैंड पेश करता है। यदि एक रिसेप्टर लिगैंड को बांधता है और जांच के टीटोल से अधिक बल लगाता है, तो किस्में अलग हो जाएंगी। टीटोल को आदर्श परिस्थितियों में 2 एस अंतराल में 50% जांच को तोड़ने के लिए आवश्यक निरंतर बल के रूप में परिभाषित किया गया है। "टर्न-ऑन" टीजीटी जांच में, शीर्ष स्ट्रैंड पर एक क्वेंचर को नीचे स्ट्रैंड पर फ्लोरोफोर से अलग किया जा सकता है। केवल जहां टीजीटी जांच टूट गई है, संभवतः टीटोल से अधिक या बराबर बलों द्वारा, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्पन्न किया जाएगा। टीजीटी जांच को भी तय किया जा सकता है, जिससे जैविक प्रणालियों के आसान हेरफेर और कई स्थितियों के परीक्षण की अनुमति मिलती है। इन कारणों से, इस काम में टीजीटी जांच का उपयोग किया गया था।

टीजीटी जांच को यह अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया था कि सक्रिय ईजीएफआर21 द्वारा एकीकृत-निर्भर सेल आसंजन और यांत्रिक बलों को कैसे संशोधित किया जाता है। इस काम ने ईजीएफआर को 'मैकेनो-आयोजक' के रूप में स्थापित किया, फोकल आसंजन संगठन और तनाव पीढ़ी को ट्यून किया। इसके अतिरिक्त, यह पाया गया कि ईजीएफ उत्तेजना ने फोकल आसंजनों के वितरण और परिपक्वता और बढ़ी हुई सेल प्रसार को प्रभावित किया। इस दृष्टिकोण का उपयोग भविष्य के अध्ययनों में यह जांचने के लिए किया जा सकता है कि विकास कारक ट्यूमर प्रगति और गतिशीलता में यांत्रिक बलों को कैसे प्रभावित करते हैं। जबकि मेसेनकाइमल संक्रमण के उपकला को विनियमित करने में ईजीएफआर-इंटीग्रिन क्रॉसस्टॉक की भूमिका स्थापित की गई है, इस प्रक्रिया में यांत्रिक बलों की भूमिका अंडर-एक्सप्लोर की गईहै 10.

यहां, 56 पीएन टीजीटी जांच के संश्लेषण और विधानसभा, ग्लास कवरलिप्स पर टीजीटी सतहों की पीढ़ी, टीजीटी सतह पर कॉस -7 कोशिकाओं के आवेदन और ईजीएफ के साथ उत्तेजना, फिक्सेशन, और फालोइडिन के साथ कोशिकाओं के धुंधला होने, और एक एंटी-पैक्सिलिन एंटीबॉडी, उच्च-रिज़ॉल्यूशन कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) और प्रतिबिंब हस्तक्षेप को कवर करने वाले इन प्रयोगों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है और छवि परिमाणीकरण। यह प्रोटोकॉल, हालांकि कॉस -7 कोशिकाओं के ईजीएफ उत्तेजना की जांच करने के लिए लिखा गया है, कई टीजीटी आधारित प्रयोगों के लिए आसानी से अनुकूलनीय है। विभिन्न लिगेंड, टीटोल, सेल प्रकार, उत्तेजना पैरामीटर, निर्धारण के बाद लेबल किए गए प्रोटीन, और मात्रात्मक विश्लेषण को आसानी से प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जिससे यह प्रोटोकॉल मजबूत और व्यापक रूप से उपयोगी हो जाता है।

Protocol

1. टीजीटी ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड तैयारी

नोट: ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच संश्लेषण का विवरण यहां उल्लिखित है। कृपया ध्यान दें कि कस्टम संश्लेषण के लिए कुछ संशोधनों और शुद्धिकरण चरणों को आउटसोर्स किया जा सकता है।

  1. साइक्लो के प्राथमिक अमाइन को सक्रिय करें [आर्ग-ग्ली-एएसपी-डी-फे-लिस (पीईजी-पीईजी)] पेप्टाइड एजाइड-एनएचएस लिंकर के साथ जैसा कि झांग एट अल22 द्वारा वर्णित है, 10 μL डाइमिथाइलफॉर्मामाइड की अंतिम मात्रा में 1: 1.5 अनुपात (100:150 एनमोल) में मिश्रण करके। कार्बनिक आधार ट्राइथाइलमाइन के 0.1 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए सेते हैं।
  2. मिनट की प्रवाह दर और 0.5% / मिनट की ढाल पर सेट 10% विलायक बी की प्रारंभिक स्थिति के साथ 0.1 एम टीईएए (विलायक ए) और 100% एसिटोनाइट्राइल (विलायक बी) का उपयोग करके रिवर्स चरण एचपीएलसी द्वारा उत्पाद को शुद्ध करें। एल्यूटेड चोटियों (203 एनएम पर अवशोषण) को मिलाएं और माल्डी-टीओएफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा सत्यापित करें। उत्पाद सीआरजीडीएफके-एजाइड है।
  3. टीजीटी शीर्ष स्ट्रैंड उत्पन्न करने के लिए, 5 एमएम सफ़ेट बफर्ड सलाइन (पीबीएस) के 100 μL में 2: 1 अनुपात (200 μM: 100 μM) में सीआरजीडीएफके-एजाइड और अल्काइन -21-बीएचक्यू 2 ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड (टीजीटी टॉप स्ट्रैंड: 5एचईएटीएटीसीसीसीएजीएटीजी / 3BHQ_2) को मिलाएं। प्रतिक्रिया को कमरे के तापमान (आरटी) पर न्यूनतम 4 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगे बढ़ने की अनुमति दें।
  4. अतिरिक्त डाई, उप-उत्पादों, कार्बनिक विलायक और अनियंत्रित अभिकर्मकों को हटाने के लिए पी 2 डीसाल्टिंग जेल के माध्यम से मिश्रण को संसाधित करें। 1 मिनट के लिए 18,000 एक्स जी पर कताई करके पूर्व हाइड्रेटेड पी 2 जेल के 650 μL के साथ अपकेंद्रित्र स्तंभ तैयार करें। प्रवाह-थ्रू तरल को त्यागें और प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें। 1 मिनट के लिए 18,000 एक्स जी पर फिर से स्पिन करें और प्रवाह-थ्रू इकट्ठा करें। अल्ट्राप्योर पानी के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण को 300 μL की अंतिम मात्रा में लाएं।
    नोट: 6 घंटे के लिए पानी के साथ पी 2 जेल को पूर्व-हाइड्रेट करें।
  5. रिवर्स-फेज एचपीएलसी द्वारा डीसाल्टेड प्रतिक्रिया मिश्रण को शुद्ध करें। इस शुद्धिकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले कार्बनिक सॉल्वैंट्स में एच2ओ (विलायक ए) और 100% एमईसीएन (विलायक बी, या मोबाइल चरण) में 0.1 एम टीईएए शामिल हैं।
    1. मिश्रण को इंजेक्ट करने से पहले, 1% / मिनट के ढाल के साथ 10% विलायक बी की प्रारंभिक स्थिति के साथ कॉलम को संतुलित करें। मिनट के लिए प्रवाह दर समायोजित करें। एक 500 μL इंजेक्शन सुई के साथ एचपीएलसी लूप में प्रतिक्रिया मिश्रण इंजेक्ट करें।
    2. डीएनए के लिए 260 एनएम और बीएचक्यू 2 क्वेंचर के लिए 560 एनएम पर चोटी अवशोषण की कल्पना करके उत्पाद एकत्र करें। वैक्यूम केन्द्रापसारक सांद्रता में रात भर एल्यूटेड उत्पाद को सुखाएं।
  6. मा एट में वर्णित के रूप में सीवाई 3 बी-एनएचएस एस्टर के लिए कुछ टीजीटी नीचे स्ट्रैंड के लिए न्यूक्लियोफिलिक प्रतिस्थापन को नियोजित करें। अल 25. डीएमएसओ के 10 μL में पूर्व भंग 56 पीएन टीजीटी नीचे स्ट्रैंड (5Biosg / टीटीटीटीटी / आईयूनामएम / सीजीसीएसीटीसीटीजीजीएटीएटीटीसीटीटी) के 100 μM को Cy3B-एनएचएस एस्टर के 50 μG के साथ मिलाएं। इस मिश्रण के पीएच को 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ 9 में समायोजित करें और अंतिम मात्रा को 1 एक्स पीबीएस के साथ 100 μL तक लाएं। आरटी पर रात भर प्रतिक्रिया मिश्रण सेते हैं।
  7. पी 2 जेल निस्पंदन और रिवर्स-चरण एचपीएलसी का उपयोग करके मिश्रण को क्रमिक रूप से शुद्ध करें ताकि अनियंत्रित अभिकर्मकों, लवण और कार्बनिक सॉल्वैंट्स को अलग किया जा सके (चरण 1.4 और 1.5 में वर्णित)।
  8. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260 एनएम पर उनके अवशोषण को रिकॉर्ड करके शुद्ध ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड-डाई संयुग्मों की एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
  9. मालदी-टीओएफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा शुद्ध उत्पादों को चिह्नित करें। ताजा मालदी मैट्रिक्स तैयार करने के लिए अतिरिक्त 3-हाइड्रॉक्सीपिकोलिनिक एसिड को टीए 50 विलायक (50:50 वी / वी एसिटोनिट्राइल और डीडीएच2ओ में 0.1% टीएफए) में भंग करें। लेबल किए गए उत्पादों के लिए अनुमानित और मापा आणविक भार हैं: सीआरजीडीएफके -1-बीएचक्यू 2 - 8157.9 (गणना), 8160.1 (पाया गया); सीवाई 3 बी लेबल 56 पीएन टीजीटी - 10272.7 (गणना), 10295.8 (पाया गया)।
  10. 30-50 μM के बीच एक एकाग्रता पर न्यूक्लियस मुक्त पानी में अलग से ऊपर और नीचे किस्में भंग. स्टॉक संदूषण से बचने के लिए DNase मुक्त विंदुक युक्तियों का प्रयोग करें। अल्पकालिक अनुप्रयोगों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या दीर्घकालिक अनुप्रयोगों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की स्थिरता बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों से प्रभावित नहीं होती है।

2. सतह की तैयारी

पहला दिन:

  1. एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन रैक में 25 मिमी ग्लास कवरलिप्स (8 तक) रखें। रैक को 200 प्रूफ इथेनॉल के 40 एमएल युक्त 50 एमएल बोरोसिलिकेट बीकर में रखें। आरटी (चित्रा 1 ए) पर 10-15 मिनट के लिए 35 किलोहर्ट्ज की ऑपरेटिंग आवृत्ति पर प्रवेश करने और सोनिकेट करने से पानी से बचने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ बीकर को कवर करें।
  2. पाइरेक्स बीकर में 3: 1 अनुपात में सल्फ्यूरिक एसिड और हाइड्रोजन पेरोक्साइड को मिलाकर तैयार पिरान्हा समाधान के 40 मिलीलीटर के साथ 50 मिलीलीटर बीकर भरें। एक ग्लास पिपेट के साथ हिलाओ। कवरस्लिप रैक को बीकर में स्थानांतरित करें और कवरस्लिप सतह (चित्रा 1 बी) खोदने के लिए धूआं हुड में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
    नोट: एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और चश्मे सहित पूर्ण पीपीई पहनें, और रासायनिक धूआं हुड में काम करें। समाधान के ओवरहीटिंग को रोकने के लिए धीरे-धीरे एसिड में हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ें।
  3. नक़्क़ाशी के बाद, अल्ट्राप्योर पानी के साथ एक बीकर में कवरस्लिप रैक को स्थानांतरित करने के लिए चिमटी का उपयोग करें। एसिड (चित्रा 1 सी) को पूरी तरह से बेअसर करने के लिए 15 एस अंतराल पर इस चरण को छह बार दोहराएं।
    नोट: एसिड अपशिष्ट कंटेनर में त्यागने से पहले रात भर रासायनिक धूआं हुड में पिरान्हा समाधान छोड़ दें।
  4. कांच की सतह पर बिना किसी पैटर्न या धूल के कणों के साथ सतहों को साफ दिखने के लिए कवरलिप्स का नेत्रहीन निरीक्षण करें। यदि पैटर्न या धूल का पता लगाया जाता है तो चरण 2.1-2.4 दोहराएँ।
    नोट: पानी में इलाज कवरलिप्स डुबकी और उन्हें लंबवत हटाने के द्वारा सतह हाइड्रोफिलिसिटी का परीक्षण करें। उपचारित कवरलिप्स पर पानी पैच बनाने वाले अनुपचारित कवरलिप्स की तुलना में यंग के छल्ले बनाने के लिए एक समान शीट के रूप में कम हो जाता है।
  5. कवरस्लिप रैक को 200 सबूत इथेनॉल के साथ एक बीकर में स्थानांतरित करें और कार्बनिक विलायक के लिए सतहों को संतुलित करने के लिए 15 एस के लिए दो बार धो लें। कवरलिप्स (चित्रा 1 डी) को सिलेनाइज करने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए 3% एपीटीईएस के साथ कवरस्लिप रैक को 200 प्रूफ इथेनॉल समाधान में स्थानांतरित करें। पैराफिन फिल्म के साथ बीकर को कवर करें।
    नोट: एपीटीईएस जमाव पैरामीटर सतह की सफाई विधि, विलायक पानी की सामग्री, एपीटीईएस एकाग्रता, इनक्यूबेशन समय और एनीलिंग के लिए तापमान के आधार पर भिन्न होते हैं।
  6. 200 सबूत इथेनॉल समाधान के साथ एक साफ बीकर में रैक विसर्जित करें। 15 एस प्रत्येक (चित्रा 1 ई) के लिए इस धोने को तीन बार दोहराएं।
  7. कम निकास दबाव के साथ नाइट्रोजन (एन2) गैस का उपयोग करके कवरलिप्स को सुखाएं। कवरलिप्स को 10 सेमी पॉलीस्टाइनिन डिश में रखें, जिसके अंदर पैराफिन फिल्म का एक टुकड़ा फ्लैट रखा गया है। सुनिश्चित करें कि कवरलिप्स सूखे और अलग हैं (चित्रा 1 एफ)।
  8. पैराफिन फिल्म पर रखे गए चार कवरलिप्स में डीएमएसओ में 2 मिलीग्राम / एमएल एनएचएस-बायोटिन समाधान के 100 μL जोड़ें। शीर्ष पर अन्य चार कवरलिप्स के साथ एक "सैंडविच" सेट करें (बीच में कार्यात्मक समाधान के साथ एक दूसरे की ओर दो कवरलिप्स का सामना करना पड़ रहा है) और 4 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1 जी) पर रात भर पकवान सेते हैं।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर, एनएचएस अभिकर्मक अधिक स्थिर है, जो समान सतह कार्यात्मकता की सुविधा प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, सैंडविच अभिकर्मकों को संरक्षित करता है। सैंडविच में अतिरिक्त समाधान जोड़ने से बचें क्योंकि यह लीक हो सकता है और कवरलिप्स को फिसलने का कारण बन सकता है।

दूसरा दिन:

  1. 4 डिग्री सेल्सियस से पकवान निकालें और सैंडविच कवरलिप्स को अलग करें। चित्रा 2 ए में दिखाए गए अनुसार एक दूसरे का सामना करने वाली लेपित सतह के साथ रैक में पर्ची ओरिएंट करें। उन्हें 15 एस प्रत्येक के लिए तीन बार 200 सबूत इथेनॉल समाधान के साथ धो लें। एन2 गैस के साथ सूखें और उन्हें इसके अंदर एक पैराफिन फिल्म के साथ एक नए पकवान में रखें।
    नोट: संकेत के रूप में कवरलिप्स उन्मुख कार्यात्मक सतह की पहचान करने में मदद करता है।
  2. कवरलिप्स को जलीय चरण में वापस संतुलित करने के लिए तीन बार 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें। वी) में 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 800 μL को कवरलिप्स में से प्रत्येक में जोड़ें और सतह को निष्क्रिय करने और बाद के कार्यात्मक अभिकर्मकों (चित्रा 2 बी) के गैर-विशिष्ट बंधन को अवरुद्ध करने के लिए 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  3. इनक्यूबेशन बाद, कवरलिप्स को 1एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ तीन बार धो लें। कवरलिप्स (चित्रा 2 सी) को कार्यात्मक बनाने के लिए 45-60 मिनट के लिए आरटी पर 1 एक्स पीबीएस में स्ट्रेप्टाविडिन के 1 μg / एमएल के 800 μL जोड़ें।
    नोट: निष्क्रियता दक्षता (वैकल्पिक) को सत्यापित करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन के बिना एक कवरस्लिप बनाए रखें। प्रयोगात्मक स्थितियों का उपयोग करके 10 एनएम बायोटिनिलेटेड अणुओं और छवि जोड़ें। यह सतह की तीव्रता कैमरे के अंधेरे शोर के करीब होनी चाहिए।
  4. चरण 2.11 के साथ-साथ, थर्मोसाइक्लर का उपयोग करके पीसीआर ट्यूब में 1 एम एनएसीएल के 100 μL में 50 एनएम की अंतिम एकाग्रता पर टीजीटी जांच (ऊपर: 1: 1 दाढ़ अनुपात पर नीचे स्ट्रैंड) को इकट्ठा करें। 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर किस्में अलग करें, और धीरे-धीरे तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस तक कम करके और इसे 25 मिनट (चित्रा 2 डी) के लिए बनाए रखकर एनील करें। प्रकाश के लिए टीजीटी जांच के विस्तारित जोखिम से बचें।
  5. स्ट्रेप्टाविडिन इनक्यूबेशन के बाद, कवरलिप्स को तीन बार धोने के लिए 1 एक्स पीबीएस का उपयोग करें। कवरलिप्स में से चार के लिए पूर्व इकट्ठे टीजीटी जांच के 100 μL जोड़ें और जांच का सामना करना पड़ कार्यात्मक पक्ष के साथ शेष 4 कवरलिप्स का उपयोग कर सैंडविच बनाने के लिए (आठ सतहों संकरित टीजीटी जांच के चार ट्यूबों की आवश्यकता होती है)। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर और सतह (चित्रा 2 ई) के लिए जांच बाध्यकारी की अनुमति देने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. इनक्यूबेशन बाद, सैंडविच को अलग करें और कवरलिप्स को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धो लें। टीजीटी सतहें अब इमेजिंग के लिए तैयार हैं। सावधानीपूर्वक कवरलिप्स को प्रीक्लीन इमेजिंग कक्षों में इकट्ठा करें और सतहों को हाइड्रेटेड रखने के लिए 1 एक्स पीबीएस जोड़ें (चित्रा 2 एफ)।
    नोट: कक्षों को ओवरटाइट करने से सतह दरार हो जाएगी। सतहों के सूखने से बचें।

3. सेल की तैयारी और धुंधला

  1. कॉस -7 यांत्रिकी, आसंजन और सेल प्रसार पर एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) उत्तेजना के प्रभाव की जांच करने के लिए, 2 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ कॉस -7 कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें। एचबीएसएस के साथ धोने और 5 मिनट के लिए 800 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके ट्रिप्सिन को बेअसर करें। न्यूट्रलाइजेशन चरण को एक बार फिर दोहराएं।
  2. दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में इकट्ठे टीजीटी सतहों पर 4 x 104 कोशिकाओं के घनत्व पर प्लेट कोशिकाएं ईजीएफ के बिना 50 एनजी / कोशिकाओं को एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (चित्रा 3 ए) में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए फैलाने की अनुमति दें।
    नोट: विकास कारकों से उत्तेजना से बचने के लिए कोशिकाओं को सीरम के बिना डीएमईएम में ऊष्मायन किया जाता है। एमएल का स्टॉक बनाने के लिए ईजीएफ को 10 एमएम एसिटिक एसिड में पतला किया जाता है। इसका उपयोग इमेजिंग प्रयोगों के लिए डीएमईएम में 50 एनजी / एमएल पर किया जाता है।
  3. इनक्यूबेशन के बाद, 1x पीबीएस के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोने और आरटी (चित्रा 3 बी) पर 12 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 2 एमएल के साथ ठीक करें।
    नोट: सभी इनक्यूबेशन कदम समाधान के समान प्रसार के लिए ~ 35 आरपीएम पर एक रोटरी शेकर पर किए जाते हैं। टीजीटी सतहों को इमेजिंग के लिए तैयार होने तक उन्हें कवर करके प्रकाश से बचाएं।
  4. वैकल्पिक रूप से, पैराफॉर्मलडिहाइड से जुड़े ऑटोफ्लोरेसेंस को बुझाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 1 एक्स पीबीएस में 50 एमएम एनएच4सीएल के साथ कवरलिप्स को सेते हैं और 5 मिनट के अंतराल (चित्रा 3 बी) पर 1 एक्स पीबीएस के साथ तीन बार धोते हैं।
  5. बफर ए (1 एक्स पीबीएस, 5% सामान्य घोड़ा सीरम, 5% सामान्य बकरी सीरम, 1% बीएसए, 0.025% ट्राइटन एक्स -100) जोड़ें और कोशिकाओं को अवरुद्ध और पारगम्य बनाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। 5 मिनट के अंतराल (चित्रा 3 बी) पर 1 एक्स पीबीएस के साथ तीन बार धो लें।
  6. एक आर्द्रता कंटेनर में कवरलिप्स के साथ इमेजिंग कक्षों प्लेस। अवरुद्ध बफर (1एक्स पीबीएस, 5% सामान्य घोड़ा सीरम, 5% सामान्य बकरी सीरम, 1% बीएसए, 0.005% ट्राइटन एक्स -100) में 1:250 पर प्राथमिक एंटी-पैक्सिलिन एंटीबॉडी (फोकल आसंजन मार्कर) को पतला करें। 37 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 3 बी) पर 2 घंटे के लिए कवरस्लिप प्रति प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200 μL के साथ सेते हैं।
    नोट: सतहों को सूखने न दें।
  7. 5 मिनट के अंतराल पर 1x पीबीएस के साथ कवरलिप्स को पांच बार धोएं और उन्हें आर्द्रता कंटेनर में वापस करें। 1:800 कमजोर पड़ने पर डाई संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ एक साथ लेबल कोशिकाओं और कवरस्लिप अवरुद्ध बफर के 200 μL में 1:400 कमजोर पड़ने पर डाई संयुग्मित फालोइडिन (एक्टिन) । 60 मिनट (चित्रा 3 बी) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  8. 5 मिनट के अंतराल पर 1x पीबीएस के साथ सतहों को पांच बार धो लें और इमेजिंग (चित्रा 3 बी) के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: संकेत गिरावट से बचने के लिए सतह की तैयारी के 3 दिनों के भीतर छवि नमूने।

4. छवि अधिग्रहण

  1. 488, 561, और 647 टीआईआरएफ उत्तेजना, आरआईसीएम उत्तेजना, एक आदर्श फोकस सिस्टम और एक डिजिटल कैमरा के साथ एक उल्टे माइक्रोस्कोप पर एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (1.49) के साथ एक तेल विसर्जन 60x उद्देश्य का उपयोग करें।
    1. उद्देश्य के लिए तेल जोड़ें, नमूना कक्ष के कवरस्लिप तल को साफ करें, और नमूना को मंच पर रखें। एक सेल पर ध्यान केंद्रित करें और सही फोकस संलग्न करें।
  2. एपिफ्लोरेसेंस उत्तेजना के साथ माइक्रोस्कोप को आरआईसीएम इमेजिंग मोड में रखें और उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक जीएफपी फिल्टर घन हटा दिया गया है। एपीआई-रोशनी एपर्चर डायाफ्राम को बंद और केंद्रित करके आरआईसीएम को संरेखित करें।
  3. लेजर उत्तेजना और एक क्वाड-पास टीआईआरएफ फिल्टर क्यूब के साथ टीआईआरएफ मोड में माइक्रोस्कोप रखो। कमरे की छत पर एक छोटे से स्थान पर 488 एनएम लेजर पर ध्यान केंद्रित करें और लाइव मोड में कैमरे पर प्रतिदीप्ति की निगरानी करते हुए महत्वपूर्ण कोण से पहले तक घटना के कोण को बढ़ाएं। महत्वपूर्ण कोण पार होने पर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और एक एकल इन-फोकस विमान में तेज कमी का निरीक्षण करें।
    नोट: टीआईआरएफ सेल के भीतर से आउट-ऑफ-फोकस प्रतिदीप्ति को खत्म करते हुए खुले टीजीटी जांच और फोकल आसंजन को उजागर करने वाले नमूना-कवरस्लिप इंटरफ़ेस के निकटतम एक पतले क्षेत्र (~ 100 एनएम) को उत्तेजित करता है। यदि टीआईआरएफ उपलब्ध नहीं है, तो एपीआई-प्रतिदीप्ति का उपयोग किया जा सकता है; हालाँकि, सिग्नल-टू-शोर अनुपात कम होगा।
  4. आरआईसीएम का उपयोग करके कैमरे के "लाइव" मोड का उपयोग करके इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की पहचान करें।
  5. एक्टिन (640 एनएम पूर्व), एकीकृत तनाव (561 एनएम पूर्व), और पैक्सिलिन (488 एनएम पूर्व) की आरआईसीएम छवि और टीआईआरएफ छवियों को प्राप्त करें। 200 एमएस के एक्सपोजर समय का उपयोग करके क्रमिक रूप से छवियां प्राप्त करें।
    नोट: एक्सपोज़र समय उद्देश्य, लेजर पावर, उत्सर्जन फिल्टर और कैमरा संवेदनशीलता सहित कई कारकों पर निर्भर है। सिग्नल पृष्ठभूमि से कम से कम 2x अधिक होना चाहिए। पृष्ठभूमि लगभग 1000 एयू है इसलिए सिग्नल कम से कम 2000-3000 एयू होना चाहिए।
  6. कम से कम 30 कोशिकाओं के लिए 4.4-4.5 दोहराएं। कवरलिप्स बदलें, फ़ोकस करें, और 4.4-4.5 दोहराएं।

5. डेटा विश्लेषण

नोट: फिजी सॉफ्टवेयर और सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण का उपयोग कर मात्रात्मक छवि विश्लेषण करें।

  1. एक कक्ष के लिए छवि सेट खोलें।
  2. इमेजजे फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करके आरआईसीएम छवि में सेल की सीमा का पता लगाकर सेल क्षेत्र (आरआईसीएम मास्क) का मुखौटा बनाएं। आरओआई प्रबंधक (आरओआई प्रबंधक के > > उपकरणों का विश्लेषण करें) (चित्रा 4ए 1,2) के लिए ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) को सहेजें।
  3. एकीकृत तनाव छवि में सेल के बाहर एक प्रतिनिधि क्षेत्र चुनें और कम से कम 200 x 200 पिक्सेल का आरओआई खींचें। आरओआई से किसी भी अन्य कोशिकाओं या फ्लोरोसेंट मलबे को बाहर रखें। उपाय उपकरण (विश्लेषण > माप) (चित्रा 4ए 3) का उपयोग आरओआई में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को मापें।
  4. तनाव छवि (घटाने के > गणित > प्रक्रिया) (चित्रा 4ए 4) से चरण 5.2 में प्राप्त औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएं।
  5. सेल पदचिह्न के भीतर तनाव संकेत को परिभाषित करने के लिए चरण 5.2 में स्थापित आरआईसीएम मास्क का उपयोग करें (आरओआई प्रबंधक > मास्क लागू > का चयन करें > बाहर संपादित > साफ़ करें) (चित्रा 4ए 5)।
  6. ऑटो थ्रेसहोल्डिंग के लिए हुआंग की विधि का उपयोग करके तनाव छवि के लिए एक थ्रेशोल्ड मास्क बनाएं (छवि > > थ्रेसहोल्ड समायोजित करें) (चित्रा 4ए 6)। सुनिश्चित करें कि थ्रेसहोल्ड मास्क उत्पन्न एकीकृत तनाव के लिए क्षेत्र का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करता है। अंगूठे के एक नियम के रूप में, दहलीज को 2x औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर सेट करें।
  7. थ्रेशोल्ड तनाव मुखौटा का चयन बनाएं (> चयन > संपादित करें) (चित्रा 4ए 7)।
  8. चरण 5.4 में उत्पन्न तनाव छवि पर चयनित मुखौटा स्थानांतरण और खुली जांच की एकीकृत तीव्रता को मापें (आरओआई प्रबंधक > चयन करें (तनाव मास्क) > विश्लेषण > माप > रॉइंटडेन) (चित्रा 4 सी)।
  9. आरआईसीएम मास्क (आरओआई प्रबंधक > चयन (आरआईसीएम मास्क) से सेल मॉर्फोमेट्रिक गुण क्षेत्र, परिपत्रता और पहलू अनुपात को मापें > मास्क लागू करें > > माप का विश्लेषण करें) (चित्रा 4 बी)।
  10. यांत्रिक टूटना घनत्व को मापें, तनाव मुखौटा छवि का चयन करके और आरआईसीएम मास्क (आरओआई प्रबंधक > चयन (आरआईसीएम मास्क) लागू करके > माप > >% क्षेत्र) (चित्रा 4 सी) > विश्लेषण करके टूटी हुई जांच के साथ सेल पदचिह्न के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया है।
  11. सांख्यिकी सॉफ्टवेयर में आगे विश्लेषण और दृश्य के लिए माप निर्यात करें।
  12. प्रत्येक सेल के लिए 5.1-5.11 दोहराएं।

Representative Results

टर्न-ऑन टीजीटी जांच का उपयोग कॉस -7 कोशिकाओं में एकीकृत-मध्यस्थता सेल यांत्रिकी और आसंजन गठन पर लिगैंड-सक्रिय एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) के प्रभाव की जांच करने के लिए कियागया था। जांच लिगैंड चक्रीय आर्ग-ग्लाई-एएसपी-फे-लिस (सीआरजीडीएफके) 21,23,25,26 प्रस्तुत करती है, जो इंटीग्रिन हेटरोडिमर αVβ3 के लिए चयनात्मक है, जिसमें α5β1 इंटीग्रिन27,28,29,30 के लिए केवल एक छोटी सी आत्मीयता है। टीजीटी जांच में बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन बाइंडिंग का उपयोग करके नीचे स्ट्रैंड के माध्यम से ग्लास कवरस्लिप सतह पर कार्यात्मक एक डुप्लेक्स डीएनए शामिल है। शीर्ष स्ट्रैंड इंटीग्रिन लिगैंड प्रदर्शित करता है और कोशिका झिल्ली (चित्रा 5 ए) पर संज्ञानात्मक इंटीग्रिन रिसेप्टर को बांधने के लिए उपलब्ध है। नीचे के स्ट्रैंड को फ्लोरोफोर के साथ लेबल किया जाता है और शीर्ष स्ट्रैंड को क्वेंचर के साथ लेबल किया जाता है, जिससे डुप्लेक्स टीजीटी बरकरार होने पर न्यूनतम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति होती है। यदि एक इंटीग्रिन लिगैंड को बांधता है और जांच के टीटोल से बड़े परिमाण के साथ एक बल लागू करता है, तो डीएनए डुप्लेक्स प्रतिदीप्ति (चित्रा 5 ए) के लिए अग्रणी अलग हो जाएगा। कोई भी टीजीटी जांच जो यांत्रिक बल द्वारा नहीं टूटी है, गैर-फ्लोरोसेंट रहेगी। यह बल चयनात्मक टर्न-ऑन प्रतिदीप्ति विवर्तन-सीमित रिज़ॉल्यूशन पर पीएन स्केल इंटीग्रिन-जेनरेटेड बलों के व्यवस्थित और मात्रात्मक मानचित्रण की अनुमति देता है। टीजीटी जांच अतिरिक्त रूप से सब्सट्रेट के तनाव सीमा को संशोधित करती है।

यहां दिखाया गया है कि 56पीएन के टी टोल के साथ टीजीटी सतह का एक प्रतिनिधि उदाहरण है। सीओएस -7 कोशिकाओं को सेल आसंजन और इंटीग्रिन यांत्रिकी (चित्रा 5 ए, बी) पर लिगैंड उत्तेजना के साथ ईजीएफआर सक्रियण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए ईजीएफ उत्तेजना के साथ या बिना इस टीजीटी सतह पर चढ़ाया गया था। कोशिकाओं को फोकल आसंजन वितरण (पैक्सिलिन) और साइटोस्केलेटन (एफ-एक्टिन) (चित्रा 5 बी) के संगठन को प्रदर्शित करने के लिए 60 मिनट, फिक्स्ड और इम्यूनो-दाग के लिए टीजीटी सतहों पर ईजीएफ के साथ या बिना ऊष्मायन किया गया था। कोशिकाओं को तब आरआईसीएम और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया गया था। जैसा कि आरआईसीएम छवि में स्पष्ट रूप से देखा गया है, 56 पीएन टीजीटी सतह पर फैलने वाले कॉस -7 सेल को उत्तेजना के बिना ईजीएफ उत्तेजना के साथ काफी बढ़ाया गया था। यह आरआईसीएम छवि (चित्रा 5 सी) से सेल-सब्सट्रेट संपर्क क्षेत्र के आकार को मापकर प्रत्येक स्थिति में 50 कोशिकाओं के लिए मात्रा निर्धारित की गई थी। ईजीएफ के साथ उत्तेजना के परिणामस्वरूप एक अधिक परिपत्र आकृति विज्ञान, कॉस -7 कोशिकाओं के प्रतिनिधि अपने प्राकृतिक शारीरिक वातावरण (चित्रा 5 डी) में फैल रहे हैं और बढ़ रहे हैं। खुली जांच से प्रतिदीप्ति ईजीएफ उत्तेजना के साथ भी अधिक है जैसा कि तनाव प्रतिदीप्ति छवि में देखा गया है। खुली जांच की एकीकृत तीव्रता, जो खुली जांच की संख्या के लिए आनुपातिक है, बिना (चित्रा 5 बी, ई) की तुलना में ईजीएफ उत्तेजना के साथ बहुत अधिक थी। यह सभी रिसेप्टर-लिगैंड सगाई का प्रतिनिधित्व है जहां इंटीग्रिन ने टीटोल (56 पीएन) से अधिक बल लागू किया।

पैक्सिलिन के साथ धुंधला होने से पता चला है कि वितरण, संख्या, परिपक्वता (आकार), और फोकल आसंजन का संगठन भी ईजीएफ उत्तेजना से प्रभावित था। ईजीएफ उत्तेजित कोशिकाओं में फोकल आसंजन बिना किसी ईजीएफ नियंत्रण की तुलना में अधिक परिपक्व और रेडियल रूप से उन्मुख दिखाई दिए। एफ-एक्टिन साइटोस्केलेटल संगठन को ईजीएफ उत्तेजना के साथ भी बढ़ाया गया था, जैसा कि फालोइडिन धुंधला (चित्रा 5 बी) द्वारा मूल्यांकन किया गया था। ये गुणात्मक आकलन दोनों उपचार समूहों से छवियों की दृश्य तुलना द्वारा किए गए थे। फोकल आसंजन का मात्रात्मक विश्लेषण किया जा सकता है लेकिन इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है। इस प्रयोग में, टीजीटी सतह ने सेल प्रसार, एकीकृत यांत्रिकी और फोकल आसंजन गठन पर ईजीएफआर सक्रियण के प्रभाव को व्यवस्थित रूप से विस्तारित करने के लिए एक मंच प्रदान किया।

Figure 1
चित्रा 1: टीजीटी सतह की तैयारी के दिन 1 के लिए योजनाबद्ध। (ए) कवरलिप्स को साफ करें। (बी) कवरस्लिप सतह को खोदना। (सी) पिरान्हा समाधान को बेअसर करें। (डी) प्रतिक्रियाशील अमाइन समूह बनाने के लिए सतह को सिलेनाइज करें। (ई) कवरलिप्स को कार्बनिक चरण में संतुलित करें। (एफ) एक निष्क्रिय गैस के साथ कवरलिप्स को सुखाएं। (जी) सतह अमाइन समूहों को बायोटिनाइलेट करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: टीजीटी सतह की तैयारी के दिन 2 के लिए योजनाबद्ध( ए) पहले दिन से किसी भी अवशिष्ट बायोटिन को हटाने के लिए कवरलिप्स को साफ और सूखा दें। (बी) बाद के चरणों में अभिकर्मक के गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए बीएसए के साथ निष्क्रिय करें। (सी) स्ट्रेप्टाविडिन के साथ कवरलिप्स को कार्यात्मक बनाएं। (डी) थर्मो साइक्लर में जांच को हाइब्रिड करें। (ई) कवरलिप्स के लिए संश्लेषित जांच लागू करें (एफ) सेल इमेजिंग चैंबर में कवरस्लिप इकट्ठा करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सामान्य वर्कफ़्लो पूरे प्रयोगात्मक सेटअप में व्यापक चरणों को उजागर करता है( ए) ईजीएफ उत्तेजना के साथ या बिना बेसल मीडिया (डीएमईएम) में टीजीटी सतह पर सेल टुकड़ी और चढ़ाना के लिए प्रक्रिया। (बी) टीजीटी सतह पर निर्धारण और इम्यूनो-धुंधला पोस्ट-अटैचमेंट और प्रसार में शामिल चरणों का फ्लोचार्ट। (सी) पोस्ट-धुंधला, कोशिकाओं को आरआईसीएम और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी के साथ एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डेटा प्रोसेसिंग और मात्रात्मक विश्लेषण का उदाहरण( ए) आरआईसीएम और तनाव छवि परिमाणीकरण के लिए फिजी (इमेजजे) में नियोजित विश्लेषण पाइपलाइन का चरण-दर-चरण टूटना। (बी) उपरोक्त पाइपलाइन का उपयोग करके विश्लेषण किए गए सेल मॉर्फोमेट्रिक परिणामों के लिए एक प्रतिनिधि उदाहरण। (सी) उपर्युक्त पाइपलाइन का उपयोग करके विश्लेषण किए गए सेल यांत्रिक परिणामों के लिए प्रतिनिधि उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: एक टीजीटी प्रयोग से उदाहरण डेटा. (ए) कोशिका झिल्ली-टीजीटी सतह इंटरफ़ेस पर संपर्क क्षेत्र को उजागर करने वाला आरेख। इनसेट (दाएं) या (बाएं) ईजीएफ उत्तेजना के बिना अपने संज्ञानात्मक लिगैंड सीआरजीडीएफके के साथ बातचीत करने वाले इंटीग्रिन को प्रोजेक्ट करता है। (बी) 56 पीएन टीजीटी सतह पर फैली सीओएस -7 कोशिकाओं की आरआईसीएम और टीआईआरएफ छवियां। छवियों को ईजीएफ उत्तेजना के साथ या बिना 60 मिनट पोस्ट-चढ़ाना प्राप्त किया जाता है। व्यक्तिगत आरआईसीएम (अधिग्रहित के रूप में), एकीकृत तनाव (ग्रेस्केल), पैक्सिलिन (नारंगी गर्म), और एफ-एक्टिन (नीले-हरे) छवियों को दोनों उत्तेजना स्थितियों के लिए ओवरले के साथ दिखाया गया है। स्केल बार: 10 μm. इनसेट एक ज़ूम-इन आरओआई (ब्याज का क्षेत्र) पर प्रकाश डालता है जो पैक्सिलिन द्वारा चिह्नित आसंजन गठन की साइटों पर उत्पन्न एकीकृत तनाव के कोलोकलाइजेशन और एक्टिन द्वारा चिह्नित अंतर्निहित उपकोशिकीय साइटोस्केलेटल संगठन का विवरण देता है। स्केल बार: 5 μm. (सी-ई) ईजीएफ उत्तेजना के साथ या बिना कॉस -7 कोशिकाओं के लिए प्रसार क्षेत्र (आरआईसीएम सेल पदचिह्न) (सी), परिपत्रता (डी), और एकीकृत तनाव (ई) के लिए स्कैटर भूखंड। सलाखों का मतलब एसडी ± इंगित करता है। समूहों के बीच मतभेदों का मूल्यांकन छात्र के टी-टेस्ट के साथ सांख्यिकीय रूप से किया गया था; पी < 0.0001। एन = तीन स्वतंत्र प्रयोगों में 50 कोशिकाओं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: विभिन्न संभावित समस्याओं के साथ उदाहरण टीजीटी सतहों। (ए) सेल आसंजन से पहले बुझी हुई जांच के साथ एक आदर्श टीजीटी सतह की तनाव और आरआईसीएम छवियां। (बी) टीजीटी सतह की तनाव और आरआईसीएम छवियां जहां टीजीटी जांच में शीर्ष स्ट्रैंड (क्वेंचर) का अभाव होता है। तनाव छवि नीचे के स्ट्रैंड में खुले फ्लोरोफोर से समान प्रतिदीप्ति दिखाती है। (सी) एक आदर्श टीजीटी सतह पर फैली कोशिकाओं के लिए तनाव और आरआईसीएम छवियां। (डी) सीमित निष्क्रियता या अपमानित जांच के साथ खराब तरीके से बनाई गई टीजीटी सतह पर फैली कोशिकाओं के लिए तनाव और आरआईसीएम छवियां। (ई) सीआरजीडीएफके लिगैंड के साथ एक आदर्श सतह पर चढ़ाया कोशिकाओं के लिए तनाव, आरआईसीएम, और ब्राइटफील्ड छवियां जो सीआरजीडीएफके-इंटीग्रिन इंटरैक्शन का संकेत देती हैं, सेल लगाव और तनाव पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं। (एफ) टीजीटी पर सीआरजीडीएफके लिगैंड के बिना सतह पर चढ़ाया कोशिकाओं के लिए तनाव, आरआईसीएम और ब्राइटफील्ड छवियां। जबकि कोशिकाएं ब्राइटफील्ड छवि में दिखाई देती हैं, कोई सेल लगाव या उत्पन्न एकीकृत तनाव नहीं देखा जाता है। स्केल बार: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ऊपर उल्लिखित विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रिया के साथ, कोई भी सेल लगाव के दौरान अनुयायी कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न सेल आकृति विज्ञान और एकीकृत तनाव को मापने के लिए टीजीटी सतहों को तैयार कर सकता है और ईजीएफ के साथ उपचार के बाद फैल सकता है। सरल प्रयोगात्मक सेटअप के साथ सीधी जांच डिजाइन और संश्लेषण और सतह की तैयारी ने ईजीएफआर और इंटीग्रिन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक स्थिर मंच प्रदान किया। कुल मिलाकर, परिणाम मान्य करते हैं कि ईजीएफआर का लिगैंड-निर्भर सक्रियण सेल प्रसार को बढ़ाता है, एकीकृत रिसेप्टर्स के बल-असर गुणों को ट्यून करता है, और फोकल आसंजन संगठन और परिपक्वता को बढ़ावा देता है। टीजीटी जांच का उपयोग करके प्राप्त परिणाम व्यापक परिकल्पना का समर्थन करते हैं कि ईजीएफआर जैसे विकास कारक, 'मैकेनो-आयोजकों' के रूप में कार्य करते हैं, एकीकृत तनाव की मात्रा और स्थानिक संगठन को बढ़ाते हैं और फोकल आसंजनों के अभिविन्यास और यांत्रिकी को विनियमित करते हैं।

टीजीटी सतह पर आवेदन करने पर, कोशिकाएं इंटीग्रिन (αVβ3) रिसेप्टर्स के रूप में भूमि, संलग्न और फैलती हैं और सीआरजीडीएफके लिगैंड से बंधती हैं। ऐसा करने में टीजीटी जांच को यांत्रिक रूप से तोड़ा जा सकता है, जिससे लिगैंड सगाई की साइट पर प्रतिदीप्ति उत्पन्न होती है। रीडआउट सतह के साथ बातचीत करने वाले सेल का संचयी "बल इतिहास" है। टीजीटी सतहों के साथ कुछ सामान्य मुद्दे हैं जो इन प्रयोगों के दौरान मौजूद हो सकते हैं। उच्च सतह पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति (चित्रा 6 ए, बी), पैची सतह उपस्थिति, तनाव संकेत उत्पन्न करने के लिए कोशिकाओं की विफलता (चित्रा 6 सी, डी), और फैलाने के लिए कोशिकाओं की विफलता (चित्रा 6 ई, एफ) टीजीटी जांच या सतह संश्लेषण के साथ तकनीकी कमियों के कारण हो सकती है। इन सामान्य समस्याओं के समाधान तालिका 1 में प्रस्तुत किए गए हैं।

टीजीटी जांच का सीधा डिजाइन सेल जीवविज्ञानियों को केवल विशिष्ट लिगेंड और उत्तेजना प्रदान करके अन्य सेल सतह रिसेप्टर्स से हस्तक्षेप के बिना अलगाव में विशिष्ट विकास कारक-एकीकृत सिग्नलिंग परिणामों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, टीजीटी जांच पीएन संवेदनशीलता पर सेल आसंजन के दौरान व्यक्तिगत इंटीग्रिन रिसेप्टर्स को रेखांकित करने वाले तनाव थ्रेसहोल्ड की जांच की अनुमति देती है। वैकल्पिक दृष्टिकोण निश्चित नमूनों में उच्च स्थानिक संकल्प के साथ व्यक्तिगत रिसेप्टर्स द्वारा लगाए गए बलों की रिपोर्ट करने में विफलरहते हैं 31. कर्षण बल माइक्रोस्कोपी केवल एनएन बलों के प्रति संवेदनशील है, व्यक्तिगत एकीकृत रिसेप्टर्स15 द्वारा लागू बलों की तुलना में अधिक परिमाण का एक क्रम, और आणविक तनाव जांच पीएन बलों को मापते हैं, लेकिन क्योंकि वे प्रतिवर्ती हैं, वे मजबूती से निर्धारण का सामना नहीं करते हैं। इन कारणों से, टीजीटी जांच विकास कारक-एकीकृत बातचीत के यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक उपकरण है।

टीजीटी जांच से जुड़ी कई तकनीकी बारीकियां हैं जिन्हें प्रयोग डिजाइन करने से पहले विचार किया जाना चाहिए। तनाव छवि समय में एक स्नैपशॉट है, जो बल इतिहास का प्रतिनिधित्व करती है और किसी भी समय बिंदु पर रिसेप्टर-लिगैंड सगाई का संकेतक नहीं है। चूंकि सिग्नल पीढ़ी जांच पृथक्करण पर निर्भर है, टीजीटी प्रतिदीप्ति रिसेप्टर-लिगैंड सगाई से सक्रिय तनाव के तहत नहीं खुली जांच से परिणाम है। इसका मतलब है कि टीजीटी सतह पर प्राप्त एकीकृत तनाव के लिए रीडआउट प्रकृति में ऐतिहासिक और संचयी है जहां टीटोल से बड़े बल थे; टीटोल से कम वर्तमान रिसेप्टर-लिगैंड बलों के स्थान19,32 की सूचना नहीं दी गई है। क्योंकि टीजीटी टूटना रिसेप्टर-लिगैंड सगाई की समाप्ति में परिणाम देता है, सेल प्रसार इंटीग्रिन-लिगैंड इंटरैक्शन के कारण होता है जो टी टोल से कम बलोंका अनुभव करता है। इसलिए उपयोगकर्ता को इंटीग्रिन-आधारित आसंजनों से जुड़े यांत्रिक परिणामों का अनुमान लगाने के लिए समय पोस्ट-चढ़ाना को परिभाषित करते समय सावधान रहना चाहिए। अंत में, टी टोल के अर्थपर विचार किया जाना चाहिए। यहां नियोजित टीजीटी जांच में 56 पीएन का टीटोल होता है, जहां टी टोल 2 एसके लिए लागू होने पर 50% जांच को तोड़ने के लिए आवश्यक निरंतर बल है। जटिल जैविक प्रणालियों पर विचार करते समय, टीजीटी संभवतः अलग-अलग समय निर्भरता के साथ एक विषम और विविध बल ग्रेडेशन का अनुभव करते हैं। यदि टीजीटी को टी टोल से बड़े बलों द्वारा तोड़ दिया जाताहै, तो प्रतिदीप्ति कुल तनाव का कम अनुमान होगा। वैकल्पिक रूप से, लंबी अवधि के लिए लागू टीटोल के नीचे बल कम समय के लिए लागू उच्च थ्रेशोल्ड बलों के समान संख्या में जांच को तोड़ सकते हैं। इन दोनों परिदृश्यों के परिणामस्वरूप एक ही प्रतिदीप्ति तीव्रता रीडआउट हो सकता है, जिससे टीजीटी जांच33,34 का उपयोग करके सटीक तनाव परिमाण या गतिशीलता को हल करना मुश्किल हो जाता है।

कुल मिलाकर, विकास कारक उत्तेजना के साथ एकीकृत तनाव का आकलन आंतरिक नियंत्रणों के साथ प्रयोगों को डिजाइन करके, अन्य मैट्रिक्स-लेपित सतहों पर प्रोफाइल फैलाने की तुलना करके, विकास कारक उत्तेजना की उपस्थिति या अनुपस्थिति में कोशिकाओं में टीजीटी प्रतिदीप्ति के समानांतर आकलन करके और विभिन्न टीटोल के साथ टीजीटी का उपयोग करके सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। . टीजीटी इंटीग्रिन रिसेप्टर्स, फोकल आसंजन गतिशीलता और सेल प्रसार के यांत्रिकी को विनियमित करने में विकास कारक सिग्नलिंग की भूमिका की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न टी टोल, विभिन्न लिगेंड, विभिन्न सेल प्रकार, या विभिन्न उत्तेजना स्थितियों के साथ जांच का उपयोग करके कई टीजीटी-आधारित प्रयोगों के लिए एक टेम्पलेटके रूप में किया जा सकता है। ब्याज के किसी भी प्रोटीन को निर्धारण के बाद लेबल किया जा सकता है, और किसी भी प्रकार के मात्रात्मक छवि विश्लेषण को लागू किया जा सकता है। इस प्रकार, हम कई टीजीटी प्रयोगों के लिए एक टेम्पलेट प्रस्तुत करते हैं।

टीजीटी जांच का उपयोग इंटीग्रिन का अध्ययन करने तक सीमित नहीं है, लेकिन लिगैंड को संशोधित करके विभिन्न सेल प्रकारों में सेल झिल्ली रिसेप्टर्स की एक विविध सरणी तक बढ़ाया जा सकता है। टीजीटी जांच का उपयोग विभिन्न रिसेप्टर सिग्नलिंग कैस्केड को विनियमित करने में बलों की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया है, जिसमें भ्रूण के विकास और न्यूरोजेनेसिस35 में नॉच रिसेप्टर यांत्रिकी की यांत्रिक भूमिका की पहचान करना, बी सेल रिसेप्टर्स36 द्वारा एंटीजन की पहचान और आंतरिककरण की मध्यस्थता करने वाली ताकत, और सिग्नल ट्रांसफर 37 की ताकत और विशिष्टता को बढ़ावा देने के लिए बलों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए टी-सेल सतह रिसेप्टर्स की यांत्रिक सबूत पढ़ने की क्षमताशामिल है। . साथ में, ये निष्कर्ष विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग्स में टीजीटी जांच की विशाल क्षमता को उजागर करते हैं।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक फलदायी चर्चाओं और आलोचनाओं के लिए मैथेस प्रयोगशाला के सदस्यों को पहचानना चाहते हैं। हम एनएसएफ कैरियर 1832100 और एनआईएच आर 01 जीएम 131099 से एएलएम को वित्त पोषण स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane Millipore Sigma 440140 Surface Preparation
3-hydroxypicolinic acid (3-HPA) Millipore Sigma 56197 Maldi-TOF-MS matrix
Acetic Acid, Glacial Fisher Scientific A38S Diluting EGF
Acetonitrile (HPLC) Fisher Scientific A998SK Oligonucleotide Preparation
Alexa Fluor 488 Phalloidin Cell Signaling Technology 8878S Immunocytochemistry
Ammonium Chloride Fisher Scientific A687 Immunocytochemistry
Anti-Paxillin antibody [Y113] Abcam ab32084 Immunocytochemistry
BD Syringes only with Luer-Lok BD bioscience 309657 Surface Preparation
Bio-Gel P-2 Bio-Rad 1504118 Oligonucleotide Preparation
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder Fisher Scientific BP9703100 Surface Preparation
Cos-7 cells ATCC CRL-1651 Cell Culture, Passage numbers 11-20
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784 Surface Preparation
c(RGDfK(PEG-PEG)), PEG=8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid Vivitide PCI-3696-PI Oligonucleotide Preparation
Cy3B NHS ester GE Healthcare PA63101 Oligonucleotide Preparation
Dimethylformamide Millipore Sigma PHR1553 Oligonucleotide Preparation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013C Cell Culture
Epidermal Growth Factor human EGF Millipore Sigma E9644 Cell Culture
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22032601 Surface Preparation
Falcon Standard Tissue Culture Dishes Fisher Scientific 08-772E Surface Preparation
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific 10-438-026 Cell Culture
Flurobrite DMEM Fisher Scientific A1896701 Cell Culture
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21244 Immunocytochemistry
Goat Serum Fisher Scientific 16-210-064 Immunocytochemistry
Hank’s balanced salts (HBSS) Fisher Scientific 14-170-161 Cell Culture
Horse Serum Fisher Scientific 16050130 Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-500 Surface Preparation
Nanosep MF centrifugal devices Pall laboratory ODM02C35 Oligonucleotide Preparation
NHS-azide Fisher Scientific 88902 Oligonucleotide Preparation
Nitrogen Gas Cylinder Airgas Surface Preparation
No. 2 round glass coverslips - 25 mm VWR 48382-085 Surface Preparation
Parafilm M Laboratory Film Fisher Scientific 13-374-10 Surface Preparation
Paraformaldehyde 16% Fisher Scientific 50-980-487 Immunocytochemistry
PBS, 1X Fisher Scientific 21-030-CV Surface Preparation/Immunocytochemistry
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Fisher Scientific 15-070-063 Cell Culture
PYREX Low Form Griffin Beakers Fisher Scientific 02-540G Surface Preparation
Sodium Ascorbate Fisher Scientific 18-606-310 Oligonucleotide Preparation
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233 Oligonucleotide Preparation
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358 Surface Preparation
Streptavidin Fisher Scientific 434301 Surface Preparation
Sulfo-NHS-LC-Biotin Fisher Scientific 21335 Surface Preparation
Sulfuric Acid Fisher Scientific A300-500 Surface Preparation
TEAA Fisher Scientific NC0322726 Oligonucleotide Preparation
Triethylamine Millipore Sigma 471283 Oligonucleotide Preparation
Trifluoroacetic Acid (TFA) Fisher Scientific PI28901 Oligonucleotide Preparation
THPTA Fisher Scientific NC1296293 Oligonucleotide Preparation
Triton X 100 Detergent Surfact Ams Solution Fisher Scientific 85111 Immunocytochemistry
Water, DNA Grade, DNASE, Protease free Fisher Scientific BP24701 Oligonucleotide Preparation
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm Agilent 653950-702 Oligonucleotide Preparation
High-performance liquid chromatography Agilent 1100 Oligonucleotide Preparation
Low Speed Orbital Shaker Fisher Scientific 10-320-813 Immunocytochemistry
Matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS) Voyager STR Oligonucleotide Preparation
Molecular Probes Attofluor Cell Chamber Fisher Scientific A7816 Surface Preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Oligonucleotide Preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope pe Nikon Microscopy
Nikon Perfect Focus System Nikon Microscopy
NIS Elements software Nikon Microscopy
ORCA-Flash4.0 V3 Digital CMOS camera Hamamatsu Microscopy
Quad band TIRF 405/488/561/647 cube CHROMA Microscopy
RICM Cube CHROMA Microscopy
SOLA v-nIR Light Engine Lumencor Microscopy
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 Incubator Fisher Scientific Cell Culture
VWR 75D Ultrasonic Cleaner VWR 13710 Surface Preparation
Data Analysis Use
Fiji (Image J) https://imagej.net/software/fiji/downloads Quantitative Analysis
Graph Pad Prism Graph Pad Statistical Analysis
Oligo name 5'modification/ 3' modification Sequence (5' to 3') Use
Alkyne-21-BHQ2 5' Hexynyl/ 3' BHQ_2 GTGAAATACCGCACAGATGCG Top strand TGT probe
56 pN TGT 5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT Bottom strand TGT probe
12 pN TGT 5' AmMC6/ 3' BioTEG CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT Bottom strand TGT probe

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References

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वृद्धि कारक मध्यस्थता एकीकृत यांत्रिकी और आसंजन की मात्रा निर्धारित करने के लिए तनाव गेज टीथर जांच
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Rao, T. C., Mattheyses, A. L. Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion. J. Vis. Exp. (180), e63529, doi:10.3791/63529 (2022).

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