Summary
I dette manuskriptet er subkonjunktival injeksjon vist som en gyldig vektorleveringsmetode for okulært vev hos mus ved bruk av et injeksjonssystem bestående av en infusjons-/uttakssprøytepumpe og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Dette injeksjonssystemet kan også tilpasses andre intraokulære administrasjonsveier.
Abstract
Okulære sykdommer inkluderer et bredt spekter av arvelige genetiske og ervervede lidelser som er tiltalende mål for lokal legemiddellevering på grunn av deres relativt enkle tilgjengelighet via flere administrasjonsveier. Subkonjunktival (SCJ) injeksjoner gir fordeler i forhold til andre intraokulære administrasjonsveier, da de er enkle, trygge og vanligvis utføres i poliklinisk innstilling. SCJ-injeksjoner hos små dyr krever vanligvis hjelp fra et operasjonsmikroskop på grunn av øyets størrelse. Tidligere arbeid har vist at SCJ-injeksjon av spesifikke adeno-assosierte virus (AAV) serotyper er en gyldig genleveringsstrategi for målrettet transduksjon av okulær overflate, øyemuskel, hornhinnen og optisk nerve, noe som gir en potensiell tilnærming til behandling av mange okulære sykdommer.
Her presenteres en detaljert protokoll for SCJ-injeksjoner i en musemodell ved hjelp av et injeksjonssystem som består av en programmerbar infusjons-/uttakssprøytepumpe (som muliggjør konsekvent og presis injeksjonshastighet og -trykk) og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Injeksjonssystemet er også tilpasningsdyktig for andre intraokulære administrasjonsveier som intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner hos små dyr. Selv om levering av adenoassosierte virale vektorer for okulære genterapistudier er beskrevet, kan protokollen her også tilpasses for en rekke oftalmiske løsninger i små dyremodeller. De viktigste praktiske trinnene i administrasjonsveien, oppsett for injeksjonsplattformen, tilberedning av injeksjonen og tips fra direkte erfaring vil bli diskutert i detalj. I tillegg vil vanlige valideringsteknikker for AAV-leveringsbekreftelse til ønsket vev også bli kort diskutert.
Introduction
Okulære sykdommer omfatter et bredt spekter av både genetiske og ervervede lidelser. I 2015 var anslagsvis 36 millioner mennesker juridisk blinde over hele verden, og over 1 milliard mennesker lider av minst et visst nivå av synshemming, noe som understreker behovet for å oppskalere lindringsarbeidet på alle nivåer1. De viktigste metodene for å levere okulære medisiner inkluderer både lokal og lokal administrasjon, for eksempel øyedråper eller subkonjunktival (SCJ), intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner. Selv om ikke-invasiv topisk terapi er den vanligste leveringsmetoden for oftalmiske legemidler og er mye brukt for mange fremre segmentforstyrrelser, gir tilstedeværelsen av hornhindeanatomiske barrierer en utfordring for biotilgjengelighet, biodistribusjon og effekt av lokalt administrerte stoffer, noe som tyder på at det kanskje ikke er den beste kandidatbehandlingsruten for mange sykdommer i det indre øyet. Lokal injeksjon i det spesifikke okulære rommet som er berørt av sykdommen, vil sannsynligvis være en mer effektiv ogmålrettet tilnærming til legemiddellevering. Bivirkninger som følge av gjentatte injeksjoner kan imidlertid komplisere administrasjonsstrategier. Ideelt sett bør en behandling opprettholde langsiktig terapeutisk effekt etter en enkelt administrering. Dermed er genterapi et lovende alternativ for å minimere antall nødvendige injeksjoner og gi vedvarende transgenuttrykk for behandling av okulær sykdom 3,4.
Tallrike virale og ikke-virale vektorer er tilgjengelige for genterapi; AAV-vektorer er imidlertid av stor interesse på grunn av deres utmerkede sikkerhetsprofil. AAV er et lite, enkeltstrenget, ikke-innhyllet DNA-virus som opprinnelig ble oppdaget som en forurensning av et adenoviruspreparat i 1965 av Atchison et al.5,6 AAV ble senere konstruert som en effektiv virusvektor for genlevering på 1980-tallet og har blitt den foretrukne genterapivektoren for mange sykdommer, inkludert okulære lidelser, i løpet av de siste tiårene. Den mest bemerkelsesverdige av disse er det første kommersielt tilgjengelige genterapimedikamentet, voretigene neparvovec, som ble godkjent av USA Food and Drug Administration for å behandle Lebers medfødte amaurose, en sjelden bakre øyesykdom. Selv om voretigene neparvovec har lykkes med å overvinne barrierer for klinisk utvikling, gjenstår utfordringer for kommersialisering av ytterligere okulære genterapier. For eksempel administreres voretigene neparvovec til pasienter som beholder levedyktige retinale celler via subretinal injeksjon. Dermed er pasienter med mer avanserte former for sykdommen som mangler levedyktige retinale celler, ikke kvalifisert for behandling, da det ikke ville gi noen klinisk fordel. I tillegg ble det observert kjente komplikasjoner forbundet med subretinal injeksjonsprosedyre, inkludert øyebetennelse, grå stær, retinal tåre, makulopati og smerte 7,8. Andre bekymringer knyttet til denne prosedyren inkluderer muligheten for blødning, retinal detachment, endofthalmitis og tilbakekalling av okulær immun privilegert status gjennom øyevev ødeleggelse 9,10,11,12. Dermed har innsatsen for å utforske mindre invasive genleveringsruter som SCJ-injeksjon blitt stadig viktigere 13,14,15,16,17.
Konjunktivene er en tynn membran som inneholder 3-5 lag med celler og forbinder det fremre øyet med det indre øyelokket. SCJ-injeksjoner brukes klinisk for oftalmisk legemiddellevering til både fremre og / eller bakre segmenter av øyet for behandling av okulære sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon, glaukom, retinitt og bakre uveitt18,19. De er relativt enkle å utføre, brukes rutinemessig for oftalmisk legemiddellevering i en poliklinisk innstilling20, noe smertefri, kompromitterer ikke okulært immunprivilegium, og tillater administrerte legemidler å spre seg gjennom en stor periorbital region som omfatter optisk nerve. Derfor er SCJ-injeksjoner en attraktiv administrasjonsmåte for AAV-genterapiapplikasjoner. Naturlige AAV-serotyper administrert via SCJ-injeksjon hos mus har tidligere blitt karakterisert for sikkerhet, transduksjonseffektivitet, serumimmunogenisitet, biodistribusjon og vevsspesifisitet13,16,21. Disse dataene viste at genlevering til individuelle okulære vev via SCJ-administrasjon er en formell mulighet.
Denne rapporten beskriver en enkel og tilpasningsdyktig protokoll for SCJ-injeksjon for å levere AAV-vektorer i en musemodell. For å sikre reproduserbarheten av denne tilnærmingen beskrives et injeksjonssystem som består av et stereomikroskop, en programmerbar infusjons-/uttakssprøytepumpe (som muliggjør konsekvent og presis injeksjonshastighet og -trykk) og en gasstett avtakbar sprøyte kombinert med mikroinjeksjonsnåler. Dette systemet er tilpasningsdyktig for andre intraokulære administrasjonsveier som intrastromale, intrakamerale, intravitreale og subretinale injeksjoner hos små dyr. I tillegg brukes ofte et fluoresceinfargestoff for å tillate visualisering av AAV-injeksjonsstedet. De viktigste praktiske trinnene i administrasjonsveien, oppsett for injeksjonsplattformen, tilberedning av injeksjonen og tips fra direkte erfaring vil bli diskutert i detalj. Til slutt vil vanlige valideringsteknikker for bekreftelse av AAV-levering til ønsket vev bli kort diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med forskriftene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved University of North Carolina på Chapel Hill. Bruken av AAV-vektorer er en biohazard risiko for biosikkerhet nivå 1. Bruk riktig personlig verneutstyr, inkludert laboratoriefrakk, hansker og vernebriller ved håndtering av AAV. For eksperimentet som er beskrevet her, ble en rekombinant AAV-vektor pakket med serotype 8-kapsiden og koding av en generisk allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promotor som kontrollerer ekspresjonen av grønt fluorescensprotein (GFP) benyttet.
1. AAV vektorhåndtering og lagring
- Oppbevar viruset i en -80 °C fryser i 100 μL aliquots i silikoniserte eller lavretensjonsmikrosentrifugerør.
- Tine alle vektorlagerløsninger på is før bruk.
MERK: Fargestoffer som natriumfluoresceinoppløsning (ved en endelig konsentrasjon på 0,1-2%) blandes ofte med AAV-vektorene for å visualisere den injiserte løsningen. I tillegg bidrar visualisering av injiserte oppløsninger til å oppdage luftbobler og overvåke AAV-distribusjon og/eller lekkasje etter injeksjon.
2. Subkonjunktival (SCJ) injeksjon
- Monter injeksjonssystemet.
- For å montere injeksjonssystemet, plasser et stereomikroskop og en sprøytepumpe i et biosikkerhetsskap.
MERK: En infusjonspumpe er nødvendig for å utføre injeksjoner med høy presisjon. Her benyttes en standard infuse/withdraw-programmerbar sprøytepumpe (se materialtabellen), som inkluderer et tett grep og en sikker sprøyteklemme for sprøyter som varierer i volum fra 0,5 μL til 60 ml. Denne pumpen tilbyr også forbedret strømningsytelse med høy nøyaktighet og jevne strømningshastigheter fra 1,28 pl / min til 88,28 ml / min. - Skjær polyetylenslangen til en lengde på ca. 50 cm (se materialtabellen).
- Sett navenden av en 36 G nål inn i en av endene av slangen.
MERK: Skyv nålenavenden inn i røret i ~ 3 mm for å sikre at det ikke oppstår lekkasje. 36 G kanylen brukes til den påfølgende SCJ-injeksjonen. Kanyler mellom 32 G og 36 G er de mest brukte størrelsene for SCJ-injeksjoner. Bruk av hemostat for å hjelpe dette trinnet anbefales på det sterkeste for å unngå potensiell risiko for skarp skade. - Fyll en engangs 3 ml sprøyte med sterilt vann; Stikk denne engangssprøyten inn i siden av røret overfor nålen og skyll vannet gjennom slangen/nålen. Gjenta dette trinnet med 70% alkohol.
- Gjenta trinn 2.1.4 tre ganger til, vekslende spyling med sterilt vann og 70% alkohol, for å desinfisere slangen og sikre at det ikke observeres lekkasjer, tresko eller skader gjennom slangen.
- Bruk engangssprøyten på 3 ml til å fylle slangen med sterilt vann og la slangen være festet til engangssprøyten.
- Plasser et stykke parafilm på benkoverflaten og legg til et basseng med sterilt vann til det (~ 1 ml). Senk den delen av slangen som er koblet til nålen i bassenget med sterilt vann. Trekk engangssprøyten ut fra røråpningen i motsatt ende for å hindre at luft kommer inn i slangen/kanylesystemet når sprøyten fjernes. La den delen av slangen som er koblet til nålen være nedsenket i vannbassenget.
MERK: Utfør prosedyrene 2.1.4 til 2.1.7 i en laminær hette. - Fyll en 10 μL Hamilton sprøyte/nål med sterilt vann og unngå luft i sprøyten. Koble Hamilton-sprøyten/nålen til den gjenværende åpne enden av slangen ved å senke slangen og nålespissen på Hamilton-sprøyten ned i bassenget med sterilt vann på parafilmen.
- Trykk på den raske reverseringsknappen på pumpeskjermen for å flytte skyveblokken til den omtrentlige lengden på sprøyten. Skru av klemmeknappene for braketten for å løsne festebrakettene på skyveren og sprøyteholderblokkene. Legg Hamilton-sprøyten på sprøyteholderblokken og fest sprøyten i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: For å feste sprøyten skal sprøytesylinderklemmen være tett mot sprøytesylinderen. Du må imidlertid ikke stramme for mye, spesielt når du bruker glasssprøyter. Sprøytestemplet skal festes av festebraketten for skyveblokken. - Juster parametrene i skjermbildet for pumpeinnstillinger.
- Trykk på Force-knappen , og sett kraftnivået til 30%. Godta endringene for å gå tilbake til innstillingsskjermen .
- Trykk på hurtigstartknappen og velg Metode | Infuse/withdraw.
- For sprøyten velger du Hamilton 1700, glass, 10 μL. Velg infusjons - og oppløsningshastighet og injeksjonsvolum.
MERK: Kraftnivået stilles inn avhengig av sprøytetype/materiale/kapasitet/produsenter. Se fabrikkprodusentens instruksjoner for foreslått kraft for hver sprøyte. Injeksjonshastigheten som ble brukt i dette eksperimentet var 200 nL / s. SCJ-injeksjoner er relativt trygge, og det er mindre bekymring for induksjon av forhøyet intraokulært trykk (IOP) som følge av injeksjonen. En lavere injeksjonshastighet er ofte ønskelig for visse applikasjoner for å unngå tilbakeløp i nålen og opprettholde konsistens i injeksjoner blant dyr.
- Løs ut vannet fra Hamilton-sprøyten, men la slangen og injeksjonsnålen være full av vann. Trekk Hamilton-sprøyten litt tilbake ved å trykke på Reverser-knappen for å introdusere en liten luftboble i slangen/nålen.
MERK: Luftboblen vil fungere som en barriere mellom vannet i røret og det terapeutiske legemidlet (i dette tilfellet AAV), og sikrer nøyaktigheten av den administrerte dosen. - Trekk ut viruset ved å plassere injeksjonsnålen i en aliquot av virusstammen. Sørg for at det forblir en synlig luftboble mellom viruset og vannet i slangen.
MERK: AAV-vektorer kan binde seg til plastslangen og metallnålen, noe som fører til tap av virus og/eller unøyaktige doseringsregimer. For å sikre strenghet, reproduserbarhet og en nøyaktig dose AAV anbefales det derfor å forhåndssupplere overflatene som senere kommer i kontakt med AAV. For å belegge slangen/nålsystemet med viruset, trekk virusvektorløsningen inn i slangen/nålen og inkuber den ved romtemperatur i 10 minutter for å muliggjøre metning av virusbinding til veggen på nålen og/eller slangen. Kast viruset.
- For å montere injeksjonssystemet, plasser et stereomikroskop og en sprøytepumpe i et biosikkerhetsskap.
- Virus injeksjon
- Bedøv musen med inhalert anestesi (isofluran) eller intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin / acepromazin. Bekreft det kirurgiske anestesiplanet ved mangel på respons på faste tåklemmer.
MERK: Bruk kvinnelige og / eller mannlige C57BL / 6J eller BALB / c mus som er minst 6 uker gamle. Dosen av ketamin/xylazin/acepromazin er som følger: ketamin 70 mg/kg, xylazin 7 mg/kg og acepromazin 1,5 mg/kg. - Påfør aktuell anestesi til øyet som vil motta injeksjonen.
MERK: Bruk 0,1% proparakainhydroklorid og / eller tetrakainhydroklorid oftalmisk løsning (0,5%) for aktuell anestesi. - Påfør aktuell salve på det andre øyet som ikke vil motta en injeksjon for å forhindre tørrhet og skade.
- Plasser musen på det mikroskopiske stadiet og eksponer museøyet under stereomikroskopet.
- Plasser to fingre på øyelokket og trekk det litt bort fra musens øye for å eksponere bindehinden, som er den indre membranen som forbinder øyelokket med scleraen.
- Ta tak i bindehinden med tang.
- Slipp øyelokket og hold nålen med skråkanten vendt oppover ved hjelp av den dominerende hånden.
- Sett nålen inn i bindehinden. Sett nålen til skråkanten er helt dekket av konjunktivmembranen. Legg nålen mot kloden.
MERK: Siden bindehinden er en klar membran, er nålespissen/skråkanten lett synlig. - Start injeksjonen ved å trykke på Start-knappen ved hjelp av fotbryteren.
MERK: Bevegelsen av luften og Hamilton-stempelet er synkronisert; Enhver forsinkelse indikerer overflødig luft i injeksjonssystemet eller muligens en løs forbindelse mellom slangen, kanylen og/eller sprøytekomponentene. - Etter at injeksjonen er ferdig, hold nålen på plass i 10 s før du trekker nålen ut av bindehinden for å redusere sjansene for tilbakestrømning.
MERK: Det er vanlig at en bleb vises på stedet for SCJ-injeksjonen. Slike blebs forsvinner normalt helt innen få timer etter injeksjon. - Sett en dråpe av den aktuelle smøremiddelgelen på musens øyne for å forhindre okulær tørrhet / skade, og legg deretter musen på en varmepute for å komme seg.
- Utfør okulære undersøkelser som tåreproduksjon, IOP og spaltelampeundersøkelse i forbindelse med hornhindefluoresceinfarging for å vurdere okulære abnormiteter etter injeksjonen.
MERK: Tåreproduksjon måles ved en fenolrød trådtest, og en tonometer brukes ofte til å undersøke IOP i museøyet. Det er rapportert at noen intraokulære injeksjoner, som intravitreale injeksjoner, kan føre til en signifikant økning i IOP; IOP-endringer etter SCJ-injeksjon er imidlertid ikke åpenbare 13,22,23,24.
- Bedøv musen med inhalert anestesi (isofluran) eller intraperitoneal injeksjon av ketamin / xylazin / acepromazin. Bekreft det kirurgiske anestesiplanet ved mangel på respons på faste tåklemmer.
- AAV biodistribusjon og transduksjonseffektivitetsundersøkelse etter subkonjunktival injeksjon
- For å undersøke viral genombiodistribusjon og / eller transduksjonsprofil av AAV-vektorer levert via SCJ, avlive musene ved AVMA-godkjent metode.
MERK: I dette eksperimentet ble musene ofret 8 uker etter injeksjonen. - For biodistribusjon og transgen ekspresjon i målrettede okulære rom, dissekere det relevante vevet av interesse som øyelokkene, hornhinnen, bindehinden, øyemuskelen, netthinnen og optisk nerve. Flash-frys alt vev og oppbevares ved -80 °C. For å undersøke helkropps AAV-biodistribusjon samler man organer som submandibulære lymfeknuter og lever, og flashfryser og lagrer dem ved -80 °C.
- Ved hjelp av et DNA / RNA-ekstraksjonssett samler du gDNA og RNA fra samme prøve for å undersøke henholdsvis transgenuttrykk og AAV-biodistribusjon. Hvis bare vektorbiodistribusjon er ønsket, bruk et DNA-ekstraksjonssett for å trekke ut gDNA.
- Utfør standard qPCR og RT-qPCR for å bestemme AAV-vektorbiodistribusjon og cDNA-overflod ved hjelp av vektortransgenespesifikke primere / sonder13,25.
- For histologianalyse, fikse øynene, legge dem inn i paraffin og seksjonere dem med en tykkelse på 5 μm. Utfør standard immunfluorescensfarging for å avsløre transgenuttrykk26.
- For å undersøke viral genombiodistribusjon og / eller transduksjonsprofil av AAV-vektorer levert via SCJ, avlive musene ved AVMA-godkjent metode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oppløsning injisert i subkonjunktivalrommet presenterer som en bleb avhengig av injeksjonsvolumet.
I dette eksperimentet ble 7 μL AAV (7 × 109 virale genomer (vg) / øye) blandet med fluorescein ved en endelig konsentrasjon på 0,1% injisert med en 36 G nål under et stereomikroskop, og injeksjonshastigheten / trykket ble holdt konstant ved hjelp av en programmerbar sprøytepumpe ved 1 μL / s. En bleb kan vises ved injeksjon (pil). En mikroskopisk oversikt over administrering av AAV-vektorer til murine SCJ-rommet er vist i figur 1.
Stoffer injisert i subkonjunktivalrommet diffunderer rundt øyets verden og fordeles gjennom periokulært vev.
For å definere fordelingen av AAV administrert via SCJ-injeksjon, ble 7 μL fortynnet India-blekk injisert i subkonjunktivrommet til en 10 måneder gammel mus etter bedøvelse. Ingen blødning, lekkasje eller tilbakestrømning ble oppdaget under eller etter SCJ-injeksjonen. Tretti minutter etter injeksjonen ble det okulære og omkringliggende vevet høstet og deretter farget med Hematoxylin og Eosin (H &E) for å visualisere fordelingen av India-blekk. De representative sagittalseksjonene som er avbildet i figur 2, viser at spredningen av India-blekk hovedsakelig skjedde ved siden av de ekstraokulære musklene, i den ytre overflaten av scleraen og det periokulære løse bindevevet (figur 2).
Selvkomplementær AAV8 transduserer vellykket hornhinnen og periokulære muskler etter SCJ.
For å bestemme transduksjonsprofilen til selvkomplementær AAV8 ved åtte uker etter injeksjon, ble GFP-overflod i helklodens tverrsnitt undersøkt via immunfluorescensfarging ved bruk av et anti-GFP-antistoff ved en fortynning på 1:500. Bildene er tatt i fluorescensmikroskop (figur 3). Disse resultatene viste at AAV-vektorer administrert via SCJ-injeksjon effektivt transduserer de periokulære musklene bakre til øyet og hornhinnen.
Rikelig vektorgenom og transgenuttrykk i forskjellige øyerom etter SCJ-injeksjon
For kvantitativt å analysere vektorbiofordelingen og transgenuttrykket ble vektorgenomkopinumre i forskjellige øyerom og organer som lever og hjerte undersøkt ved qPCR (figur 4A), mens transgenuttrykket ble testet ved qRT-PCR (figur 4B). Disse resultatene tyder på at SCJ-injeksjon av AAV8 resulterer i transgene uttrykk i øyelokk, bindehinde, hornhinnen og optisk nerve.
Figur 1: Mikroskopisk visning av AAV-vektoradministrasjon i murine SCJ-rommet. For å tillate visualisering av dannelsen av en bleb under prosedyren, ble 1% fluorescein direkte tilsatt til AAV-vektorpreparatet. Bilder ble tatt med et digitalt kamera festet til et stereomikroskop. (A) Representativt bilde av et ikke-injisert øye; (B) representativt bilde av et injisert øye. Pilen indikerer den injiserte AAV-oppløsningen som inneholder fluorescein i SCJ-rommet. Forkortelser: AAV = Adeno-assosiert virus; SCJ = subkonjunktiv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: H&E-farging av Indias blekkfordeling (pil) etter SCJ-injeksjon i museøyet. Sagittal deler av et øye injisert med India blekk presenteres; 7 μL India blekk ble injisert på det angitte stedet. *, injeksjonssted. Skala bar = 500 μm. Forkortelser: SCJ = subconjunctival; H&E = hematoksylin og eosin; C = hornhinnen; Jeg = iris; L = linse; R = Netthinnen; E = øyelokk; H = Harderian kjertel; M = muskel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative GFP-histologibilder av selvkomplementær AAV8 etter SCJ-injeksjon. Transduksjon av hornhinnen (A) og øyemusklene (B) etter injeksjon av SCJ. GFP-ekspresjon (grønn) ble visualisert via immunostaining i parafin-innebygde vevsseksjoner med et anti-GFP-antistoff. Kjerner ble farget med DAPI (blå). Skalabar = 100 μm (øyemuskel), 20 μm (hornhinnen). Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; AAV = adeno-assosiert virus; SCJ = subkonjunktival; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantitativ analyse av vektorbiodistribusjon og transgenuttrykk. (A) Vektorbiodistribusjon i øyerom (øyelokk, bindehinde, hornhinnen, optisk nerve og netthinnen) og andre organer (lever og hjerte) etter SCJ presenteres som vektorgenomkopinummer / μg av vertsgenom-DNA. (B) GFP overflod bestemt av qRT-PCR presenteres som vektor cDNA kopi nummer / vert transkripsjon. Dette tallet er endret fra 13. Forkortelser: SCJ = subconjunctival; qRT-PCR = kvantitativ revere-transkripsjon PCR; GFP = grønt fluorescerende protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AAV-mediert genterapi har et stort potensial for behandling av øyesykdommer. Nåværende okulær genterapi er avhengig av to store lokale administrasjonsveier, intravitreale og subretinale injeksjoner. Dessverre er begge rutene invasive og kan forårsake alvorlige komplikasjoner, inkludert retinal detachment, kataraktdannelse og endofthalmitis. Dermed er undersøkelsen av relativt mindre invasive ruter, som SCJ-injeksjon, av stor interesse.
Selv om denne teknikken er relativt enkel og betydelig mindre invasiv, er det flere viktige aspekter ved AAV-levering som må fremheves. Det anbefales at AAV-vektoren lagres ved -80 °C i aliquots av ønsket volum (100 μL her) i silikoniserte eller lavretensjonsmikrosentrifugerør for å unngå flere fryse-tine-sykluser og forhindre reduksjon i viral titer. Vektoren som ble brukt i dette eksperimentet ble lagret ved -80 ° C i ~ 6 år uten et signifikant tap av titer. I tillegg kan kjøretøyets sammensetning påvirke vektorens stabilitet. I dette eksperimentet var viruskjøretøyet PBS med 350 mM NaCl + 5% D-sorbitol. Titeren av viruset som ble brukt i denne studien var 5,1 × 10 9 vg/μL (bestemt ved qPCR), og totalt 7 × 109 vg/øye ble administrert. Imidlertid er et område på 1 × 108-1 × 1010 vg / øye hensiktsmessig, avhengig av målrettet vev og transgen.
SCJ-injeksjoner er relativt mindre restriktive med hensyn til administrert volum (1-100 μL for en mus). Imidlertid antas volumforskjeller å spille en rolle i AAV-biodistribusjon og transduksjon, og større injeksjonsvolumer har angivelig blitt brukt til å lage en konjunktiv arrdannelsesmodell27. Et viktig aspekt er konjunktivenes vaskulære natur, noe som kan føre til betydelig systemisk clearance av AAV-vektoren, og dermed resultere i generering av nøytraliserende antistoffer mot AAV-vektoren. Pågående forskning studerer aktivt potensielle strategier for å redusere systemisk clearance av terapeutiske vektorer fra AAV.
I tillegg er in vivo-distribusjonen etter SCJ-injeksjon en kritisk vurdering for potensiell anvendelse av denne injeksjonsveien. I den gjeldende protokollen undersøkes fordelingen ved hjelp av et fargestoff (India-blekk) på ett tidspunkt i stedet for flere tidspunkter eller i sanntid. Selv om disse dataene gir en indikasjon på hvordan AAV-vektoroppløsningen sprer seg umiddelbart etter injeksjonen, kan fordelingen og de kinetiske egenskapene til AAV-vektoren og andre substanser variere betydelig over tid. Selv om biodistribusjonen av AAV-vektoren ble oppdaget i forskjellige øyekamre ved qPCR, som nevnt i metodeseksjonen ovenfor ved det eksperimentelle endepunktet, ideelt sett ville en teknikk som kunne overvåke handelen med terapeutiske reagenser gjennom øyet i sanntid bli brukt; Dette er imidlertid ofte utfordrende i praksis. Til slutt kan AAV-transduksjonsprofilen observert hos mus etter SCJ-injeksjon variere i menneskelige øyne på grunn av den åpenbare størrelsen, anatomiske og fysiologiske forskjeller mellom et museøye og et menneskelig øye.
Retinale sykdommer er også et viktig mål for genterapi28; Dermed er avgjørelsen av om AAV administrert via SCJ-injeksjon kan nå retinalvevet verdt ytterligere undersøkelse13,17,29. Tidligere studier har vist at nanopartikler administrert via SCJ-injeksjoner kan nå den indre netthinnen. De spesifikke smuglerveiene er imidlertid uklare. Distribusjonsdataene for India-blekk (figur 2) viser at det meste av løsningen sprer seg inn i det periokulære bindevevet, noe som indikerer at AAV kan nå den indre netthinnen gjennom periokulær permeasjon ved å trenge inn i sclera, choroid og retinal pigmentert epitel.
Hornhinnenes transduksjonsdata presentert i figur 3A antyder at AAV injisert i SCJ-rommet kan trenge inn i sclera og hornhinnen. Dette antyder videre at AAV-administrering via SCJ-injeksjon kan nå det fremre kammeret eller til og med de bakre og glassaktige kamrene, selv om en betydelig høyere dose kan være nødvendig for å oppnå ønskelige effekter i netthinnen30. Likevel er SCJ-injeksjon en av de enkleste okulære administrasjonsveiene og har stort løfte om AAV-levering for å behandle flere okulære sykdommer, inkludert, men ikke begrenset til, okulære overflatesykdommer som limbal stamcellemangel, tørr øyesykdom og / eller sykdommer i okulære muskler, som oculopharyngeal muskeldystrofi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Forfatterne takker Vector Core ved University of North Carolina for å gi scAAV8-GFP-vektorene som ble brukt i denne studien, CGIBD Histology Core, og laboratoriet til Dr. Brian C. Gilger for deres hjelp med de kliniske vurderingsaspektene ved denne studien. Denne studien ble støttet av Pfizer-NC Biotech Distinguished Postdoctoral Fellowship og en karriereutviklingspris fra American Society of Gene & Cell Therapy og Cystic Fibrosis Foundation. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til American Society of Gene & Cell Therapy eller Cystic Fibrosis Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 36 G NanoFil Needles | World Precision Instruments | NF36BV-2 | |
| AAV vector | University of North Carolina at Chapel Hill | / | |
| Acepromazine | Henry Schein | NDC 11695-0079-8 | |
| anti-GFP antibody | AVES labs Inc. | ||
| Digital camera | Cannon | Cannon EOS T5i | |
| DNA/RNA extraction kit | Qiagen | 80204 | |
| Forceps | Fine Science Tools | F6521 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7654-01 | |
| India ink | StatLab | NC9903975 | |
| Ketamine hydrochloride injection solution | Henry Schein | NDC 0409-2051-05 | |
| Moisture-resistant film | Parafilm | 807-6 | |
| Polyethylene tubing | Becton Dickinson and Company | 427401 | |
| Proparacaine 0.1% | Bausch Health US | NDC 24208-730-06 | |
| Rebound tonometer | Tonovet | / | |
| Sodium fluorescein solution | Sigma-Aldich | 46960 | |
| Standard Infuse/Withdraw Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Bioscience | 70-4504 | |
| Stereo microscopye | Leica | Mz6 | |
| Tetracaine Hydrochloride Ophthalmic Solution 0.5% | Bausch and Lomb | Rx only | |
| Topical ointment | GenTeal | NDC 0078-0429-47 | |
| Xylazine | Akorn | NDC 59399-110-20 | |
| Zone-Quick Phenol Red Thread Box 100 Threads | ZONE-QUICK | PO6448 |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (9), 888-897 (2017).
- Swetledge, S., Jung, J. P., Carter, R., Sabliov, C. Distribution of polymeric nanoparticles in the eye: implications in ocular disease therapy. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 10 (2021).
- Petit, L., Khanna, H., Punzo, C. Advances in gene therapy for diseases of the eye. Humam Gene Therapy. 27 (8), 563-579 (2016).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M.
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. Electron microscopy of adenovirus-associated virus (AAV) in cell cultures. Virology. 29 (2), 353-357 (1966).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal injection: a review on the novel route of therapeutic delivery for vitreoretinal diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Gaudana, R., Jwala, J., Boddu, S. H., Mitra, A. K. Recent perspectives in ocular drug delivery. Pharmacological Research. 26 (5), 1197-1216 (2009).
- Amado, D., et al. Safety and efficacy of subretinal readministration of a viral vector in large animals to treat congenital blindness. Science Translational Medicine. 2 (21), (2010).
- Li, Q., et al. Intraocular route of AAV2 vector administration defines humoral immune response and therapeutic potential. Molecular Vision. 14, 1760-1769 (2008).
- Ausayakhun, S., Yuvaves, P., Ngamtiphakom, S., Prasitsilp, J. Treatment of cytomegalovirus retinitis in AIDS patients with intravitreal ganciclovir. Journal of Medical Association of Thailand. 88, 15-20 (2005).
- Miyadera, K., et al. Intrastromal gene therapy prevents and reverses advanced corneal clouding in a canine model of mucopolysaccharidosis I. Molecular Therapy. 28 (6), 1455-1463 (2020).
- Song, L., et al. Serotype survey of AAV gene delivery via subconjunctival injection in mice. Gene Therapy. 25 (6), 402-414 (2018).
- Cheng, H. C., Yeh, S. I., Tsao, Y. P., Kuo, P. C. Subconjunctival injection of recombinant AAV-angiostatin ameliorates alkali burn induced corneal angiogenesis. Molecular Vision. 13, 2344-2352 (2007).
- Veneziale, R. W., et al. SCH 412499: biodistribution and safety of an adenovirus containing P21(WAF-1/CIP-1) following subconjunctival injection in Cynomolgus monkeys. Cutaneous and Ocular Toxicology. 26 (2), 83-105 (2007).
- Liu, G. S., et al. Gene delivery by subconjunctival injection of adenovirus in rats: a study of local distribution, transgene duration and safety. PLoS One. 10 (12), 0143956 (2015).
- Igarashi, T., et al. Direct comparison of administration routes for AAV8-mediated ocular gene therapy. Current Eye Research. 38 (5), 569-577 (2013).
- Gaudana, R., Ananthula, H. K., Parenky, A., Mitra, A. K.
- Short, B. G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations. Toxicologic Pathology. 36 (1), 49-62 (2008).
- Stevens, S.
- Song, L., Bower, J. J., Hirsch, M. L. Preparation and administration of adeno-associated virus vectors for corneal gene delivery. Methods in Molecular Biology. 2145, 77-102 (2020).
- de Vries, V. A., Bassil, F. L., Ramdas, W. D. The effects of intravitreal injections on intraocular pressure and retinal nerve fiber layer: a systematic review and meta-analysis. Scientific Reports. 10 (1), 13248 (2020).
- Hartman, R. R., Kompella, U. B. Intravitreal, subretinal, and suprachoroidal injections: evolution of microneedles for drug delivery. Journal of Ocular Pharmacology and Theraputics. 34 (1-2), 141-153 (2018).
- Nuzzi, R., Scalabrin, S., Becco, A. Reduction of intraocular pressure spikes due to intravitreal bevacizumab injections by scleral indentation with cotton swab or digital ocular massage: innovative techniques compared. Clinical Ophthalmology. 14, 2533-2541 (2020).
- Crabtree, E., et al. AAV-mediated expression of HLA-G1/5 reduces severity of experimental autoimmune uveitis. Scientific Reports. 9 (1), 19864 (2019).
- Song, L., et al. Gene delivery to human limbal stem cells using viral vectors. Human Gene Therapy. 30 (11), 1336-1348 (2019).
- Reichel, M. B., et al. New model of conjunctival scarring in the mouse eye. British Journal of Ophthalmology. 82 (9), 1072-1077 (1998).
- Barnard, A. R., Rudenko, A. N., MacLaren, R. E. Vector shedding and immunogenicity sampling for retinal gene therapy. Methods in Molecular Biology. 1715, 359-371 (2018).
- Gilger, B. C., et al. A fixed-depth microneedle enhances reproducibility and safety for corneal gene therapy. Cornea. 39 (3), 362-369 (2020).
- Cheruvu, N. P., Kompella, U. B. Bovine and porcine transscleral solute transport: influence of lipophilicity and the Choroid-Bruch's layer. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (10), 4513-4522 (2006).
